药 物 生 物 技 术
342PharmaceuticalBiotechnology 2005,12(5):342～346
免疫亲和层析技术及其医药应用进展
应国清,王玉姣,易 喻,俞志明,石陆娥
(浙江工业大学药学院,浙江杭州310014)
*
摘 要 综述了免疫亲和层析技术的发展现状,包括层析介质、层析剂制备方法、洗脱方法等的最新进展,以及免疫亲和层析技术在制药领域和临床方面的应用,包括抗体和抗原的纯化、临床检测、免疫分析等。
关键词 免疫亲和层析;抗原;抗体;免疫
中图分类号:Q65 文献标识码:A 文章编号:1005-8915(2005)04-342-05
抗原和抗体的作用具有高度的专一性,并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到层析剂上,便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。20世纪50年代初,Campbell等运用固定化在纤维素上的抗体分离得到了抗原。接着,这种方法又被扩展运用到许多不同类型的抗原以及抗体片段。20世纪70年代末,单克隆抗体的发现在很多方面加速了免疫亲和层析法的发展。近20～30年间随着层析剂和固定化方法的发展,免疫亲和层析法在生命科学中已成为一种非常有价值的工具。重组蛋白(包括重组抗体)的生产,也给这种方法的运用提供了便利条件。1 纯化抗体和抗原
在蛋白质纯化中运用免疫亲和层析法(immuno-affini-tychromatography,IAC)是非常有效的方法,一般纯化倍数可达到1000～10000。1.1 层析介质的选择
传统的IAC操作中,通常用糖类介质(如琼脂糖、纤维素等)或合成的有机支持物(如丙烯酰胺聚合物、共聚物及其衍生物,聚甲基丙烯酸酯衍生物和聚醚砜),也有许多市售的此类介质,例如:AffinicaAgarose/PolymetricSupports(SchleicherandSchuell),Sepharose/Superose/Sephacryl(Pharmacia)等,其中交联琼脂糖凝胶具备理想载体的多数特点,因此最常用。
关于新型载体的报道,如Methal[1]用戊二醛活化脱乙酰壳多糖(alginate-chitosan)凝胶颗粒与抗半抗原(anti-hapten)IgG交联。Kerstin[2]也选取了脱乙酰壳多糖作为固定重组抗体的载体。Joseph[3]运用硝化纤维素(nitrocel-lulose)颗粒作为固相支持物。周冬梅[4]用甲基丙烯酸缩水甘油酯将纤维素与丙烯酸甘油酯类化合物结合,以这种附
图1 免疫亲和柱的制备方法二(“夹心”式层析剂)着分散的纤维素纤维的膜作为HPLC的固定相,分析血清中的IgG和由免疫山羊产生的多克隆抗体,只需要2.5min,通过加速流动相流动速率,分析过程可以在30s内完成。
1.2 亲和吸附剂的制备
固定化抗原通常是运用温和的固定化条件以保持抗原的天然构象,利用蛋白抗原表面氨基、羟基或硫醇与支持物交联。在非蛋白抗原或小分子半抗原的情况下,需要特殊的化学试剂。
制备抗体柱的一种方法是抗体首先结合到介质上。通常的共价法固定随机地结合抗体的3个片段,即Fc、Fab-1、Fab-2,被固定化后的抗体只有一部分保持与抗原结合的活力,且抗体中的Fc片段为结合位点,而不属于识别位点。
第二种方法的前提是所固定的抗体具有两个空间上分离的活性部位以便该抗体能同时与两种抗原结合。如图1[5]所示:首先,将抗原固定到介质上,然后结合上相应的抗体,由于二价抗体分子的一个活性部位是自由的,这种介质-抗原-抗体复合物就可以用来纯化抗原。这种夹心式层析剂的最大优点在于不必进行抗体的纯化与固定化
。
*收稿日期:2004-12-02 修回日期:2004-12-31
作者简介:应国清,1965年生,男,教授,研究方向为酶的固定化及修饰、生物制药、生化分离工程等通讯作者:应国清,0571-88320803,[email protected]
应国清等:免疫亲和层析技术及其医药应用进展
另一方法是将抗体结合到已被固定的蛋白A或蛋白G小珠上,由于蛋白A或蛋白G结合在抗体的Fc区,所以结合抗原的部位获得充分暴露,从而易于接近,由于空间上分离的两个不同活性部位的存在,抗体能同时与两种抗原结合。该法的缺点是在洗脱抗原的过程中这种蛋白A-抗体的复合物有可能会解离。
Kerstin[2]介绍了一种固定重组抗体的方法,构建了一个表达具有多个脱乙酰壳多糖结合部位(CBD)的scFV片段融合蛋白的质粒,因此可以直接将溶菌粗提液固定于成本较低的脱乙酰壳多糖珠粒上,该法的优点在于充分利用了现代信息库技术,运用了易于在E.coli中大量表达的scFV片段,而不像单克隆抗体的生产既费时,成本又高;利用scFV片段的CBD,scFV融合蛋白的偶联不需要固定化操作,这就意味着抗体的结合量不会有所损失;在偶联之前不需要其他的纯化步骤。1.3 纯化步骤
利用固定化抗原(或抗体)纯化相应的配体,一般包括3个步骤,首先用中性的缓冲溶液平衡亲和柱,让含有相应配体的溶液通过亲和柱。其次是洗去非特异性吸附蛋白,在标准操作中,应该用同样的缓冲液洗去非特异性结合的蛋白,但如果要达到更好的效果,可以用偏酸(pH值5.5)或偏碱(pH值8.5)的缓冲溶液洗柱子。最后是抗体(或抗原)的洗脱,抗体通常用pH值为2.0～2.2的缓冲溶液洗脱,为了保持抗体的天然构象,缓冲液的pH值也可以用1mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.0)调整。
为了达到更好的纯化结果,可以调整标准的操作条件,比如要仔细研究洗去非特异性吸附蛋白的条件(如运
表1 IAC在纯化抗原和抗体中的应用
被纯化的物质应用
肿瘤治疗研究:
神经胶质瘤HACN-35肺癌相关蛋白临床检测研究:
第4代HIV快速诊断试剂精子膜抗原
能识别吗啡的ScFv及双功能抗体片断重组毒素:
猪瘟病毒(CSFV)结构糖蛋白E2重组毒素EGF-PE40
其它:
重组人促红细胞生成素(rhEPO)二肽酶Ⅳ(DPPIV/CD26)褪黑激素
[参考文献]
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用的pH值,盐浓度,或有机添加物等);抗原(或抗体)的最佳洗脱条件必须使失活量达到最小,例如Jose[6]在洗脱结合在亲和柱上的重组人干扰素(rIFN-α)时,测试了不同洗脱液的洗脱效果,证实含有脲的洗脱剂最佳,这是因为低含量的脲不仅改变了抗原-抗体之间的结合力,并且避免了INF分子的聚集;另外,在亲和吸附剂的制备过程中要达到抗体与抗原的结合力达到最高,例如VladimirI[5]系统研究了用CNBr活化的琼脂糖凝胶固定蛋白抗原时,抗原的固定化程度对层析柱结合力的影响,在活化剂用量小于100mgCNBr/(ml凝胶)时,抗原的结合量随着活化剂用量的增大而增大,之后抗原的结合量基本不变,这可能是因为抗原分子的多位点结合导致了构象的改变,从而减弱抗原与抗体活性部位的结合,而且琼脂糖凝胶的活化剂用量在70～150mgCNBr/(ml凝胶)时,可以用较温和的条件洗脱抗体。有时,也可以运用一些适当的添加剂,如陈章林[7]在纯化HBsAg时,在稀释的血清中加入了0.2%福尔马林和0.02%叠氮钠,在进行长时间热灭活过程中防止了微生物分解HBsAg,从而达到既消除HBV的感染性又保存HBsAg免疫活性,福尔马林和叠氮钠在亲和吸附后通过洗涤亲和层析柱而得到彻度清除,不会影响纯HBsAg以后的应用。1.4 应用
近几年来,国内外有不少应用免疫亲和层析法纯化抗原(或抗体)的研究报告,纯化后的抗原(或抗体)为疾病的治疗、诊断、以及揭示发病机理等方面都提供了可靠的依据,仅选取了部分文章概括如表1所示:
应用HAC诱导的免疫反应治疗神经胶质细胞瘤 [8]研究它们在恶性肿瘤细胞生物学行为中的作用 [9]可同时检测HIV抗体及p24抗原 [10]
显示免疫性不孕症患者 [11]毒品监测 [12]
在CSFV抗原变异、基因工程疫苗及诊断试剂的研究与开发等方面具有十分重要的意义 [13]
特异性杀伤某些上皮细胞异化引发的过度表达人表皮因子受体(EGFR)的细胞 [14]
治疗肾衰后引起的贫血 [15]
研究DPPIV/CD26在生物活性肽中的重要调节功能 [16]
临床上作为生物反应调节剂的辅助药物用于治疗晚期肾癌 [17]
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药物生物技术第12卷第5期
续 表
被纯化的物质应用
单链尿激酶型纤溶酶原激活剂β-乳球蛋白
[参考文献]
第二代溶栓药物,可以克服尿激酶使用过程中非特异性地激活全身纤溶系统所造成的出血倾向问题 [18]应用免疫亲和层析法对β-乳球蛋白进行定量,控制相关生物制药产品的质量 [19]
应用IAC分析的最简单方法就是将待测产物吸附于带
2 免疫亲和层析(IAC)在分析检测中的应用
在生物学或非生物学样品的分析中,越来越多地使用了IAC来制备被分析样品或进行检测。2.1 IAC在直接检测中的应用
固定化抗体的亲和柱上,洗脱流出液直接进入检测器,这种方法的优点是操作简单、快速、准确,表2[20]例举了一些应用HPIAC(High-performanceimmunoaffinitychromatograph)检测的例子:
表2 HPIAC检测举例
被分析的物质
Anti-idiotypicantibodies(个体基因型抗体)AntithrombinⅢ(抗凝血酶Ⅲ)Fibrinogen(血纤维蛋白原)Glucosetetrasaccharide(葡萄四糖)Glutaminesynthetase(谷氨酰氨合成酶)
Granulocytecolonystimulatingfactor(粒细胞集落刺激因子)Humanserumalbumin(人血清白蛋白)IgGIgE
Interferon(干扰素)Interleukin-2(白介素-2)β2-Microglobulin(β2-小球蛋白)
Tissue-typeplasminogenactivator(组织型纤维溶酶原激活剂)Transferrin(转铁蛋白)
如表2所示,针对糖类物质,常用电流脉冲检测法(pulsed-amperometricdetection,PAD),而对蛋白溶液,通常是应用210～215nm或者是280nm处的紫外吸收法(UVabsorbence)来检测。这种方法得到的色谱图一般包括两个峰,第一个峰代表非特异性吸附的物质,第二个峰代表了被分析的物质,而且第二个峰的保留时间可以通过控制加入洗脱剂的时间而改变。
2.2 通过IAC提取待测样品(immunoextraction)后再进行检测
这种方法就是先使一种或多种特定的溶质从样品中转移,然后用另一种检测方法来鉴定。该法的操作流程与3.1相似,不同的是将免疫亲和柱与其它定量方法结合起来。
有些情况下,洗脱部分不经过其它处理就用另一种检测方法进行检测,例如,国际标准ISO14501[21]中,亲和柱含有特性的抗体键合在固体支持物上,当样品通过抗体亲
检测方法
紫外吸收法荧光法紫外吸收法PAD/放射性标记法紫外吸收法/酶法检测荧光法紫外吸收法紫外吸收法紫外吸收法/ElISA紫外吸收法荧光法/受体分析法紫外吸收法/EIA荧光法紫外吸收法
血清
样品
细胞培养液血浆血清,尿液细菌抽提物血浆,CSF血清,尿液脑脊髓液(CSF)血浆,血清
血浆/血清,尿液,CSF样品组织血浆细胞培养液血清
和柱时,抗体选择性地与所有存在的黄曲霉毒素M1(抗原)结合,而形成抗体-抗原复合体;停留在亲和柱上的所有其它样品基质用水清洗掉;然后用淋洗液将亲和柱上的黄曲霉毒素M1洗脱下来,收集好洗脱液。洗脱液中的黄曲霉毒素M1含量用带有荧光检测器的高效液相色谱仪(HPLC)进行测定。
更多的情况下,为了改善检测的灵敏度或样品的物理特性(比如,在用GC分析之前,增加样品的挥发性能),通常收集洗脱液后进一步处理样品,使之更便于检测(如先进行干燥,然后用另一种溶剂重新溶解)。表3[20]给出了一些利用HPLC和GC进行定量的例子。
表中缩写字母如下所示:ECD(electroncapturedetec-tor);ESI-MS(electrosprayionizationmassspectrometry);GC-MS(gaschromatography/massspectrometry);RPLC(reversed-phaseliquidchromatography)。
应国清等:免疫亲和层析技术及其医药应用进展
表3 通过IAC提取待测样品后再利用HPLC和GC进行定量举例
被分析的物质
Immunoextraction/HPLCHumanchorionicgonadotropin(人绒毛膜促进腺激素)Oxytocin(催产素)Immunoextraction/GCChloramphenicol(氯霉素)Dexamethasone(地塞米松)Estrogens(雌激素)Prostaglandins(前列腺素)
GC-ECDGC-MSGC-MSGC-MS
尿液,样品组织
尿液血浆,尿液尿液
RPLC-coulometryRPLC-ESI-MS
尿液
检测方法
样品
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含量。此处标记包括酶、荧光标记、脂质体等,可以通过测量未被结合的或洗脱下来的标记物的量来达到检测目的。2.3.2 夹心式免疫分析(sandwichimmunoassays) 这种方法需要两种不同类型的抗体,一种结合到固相介质中用来从样品中结合待测物,另一种抗体包含了易测的标记,在结合前或结合后加到待测物中,作用是给待测物加上标记以便于定量。此法最大的优点是,被结合的标记物直接与样品中待测物的含量成正比,而且运用两种抗体提高了选择性。缺点是要求待测物同时与两种抗体结合,因此要求待测物的浓度较高。
2.3.3 单一位点免疫分析(one-siteimmunoassays) 样品先与已知量的过量带标记的抗体或Fab片段混合,结合后将该混合物注入固定化有待测物的类似物的柱子上,柱子会结合未被样品结合的抗体/Fab片段,而结合有待测物的抗体/Fab片段则流出柱子,通过观察流出的抗体/Fab片段的量就可以直接得到样品中待测物的含量。此法与竞争性结合免疫分析法一样,既可测定高浓度样品,又可测定低浓度样品;与夹心式免疫分析法一样,可直接测定待测物的含量;而且因为固定化的是待测物的类似物,柱子的再生条件不用受太多限制。但是每测定一次样品,必需制备一根固定化有待测物的类似物的柱子。
2.4 IAC在柱后免疫监测(Postcolumnimmunodetection)中的应用
上述提到的各种形式IAC的应用也可以用于监测其它色谱柱的流出液中特殊成分的存在,这种方法常称为免疫监测(immunodetection),通常需要柱后反应器,在HPLC柱的出口处连接固定化抗体或抗原柱,Irth等[23]的一篇文章中描述了这种方法的应用。3 展 望
和其它亲和层析技术一样,免疫亲和层析技术的最大
国内,刘尚义[22]等将专一性较高的固相免疫亲和层析与生物质谱分析相结合,建立了血清中蛋白质药物的分离提取和鉴定方法,并成功地鉴定了给药猕猴血清中重组人内皮抑制素,为体内蛋白质药物的代谢物和蛋白结合物分离鉴定奠定了基础。
2.3 IAC在免疫分析(chromatographic/flow-injectionim-muno-assay)中的应用
当待测物本身不能提供可检测信号的情况下,通过免疫分析法中的抗体标记或待测物的类似物标记可以达到检测的目的。
表4[20] IAC在免疫分析中的应用举例
被检测的物质
标记/检测方法
样品含水标准物
血清血清血清含水标准物
血清细胞培养液
血清含水标准物
Competitivebindingimmunoassays
促肾上腺素皮质激素荧光素/荧光法人绒毛膜促性腺激素人IgG
辣根过氧化物酶/吸光度法
葡萄糖氧化酶/荧光法荧光素/荧光法
胰岛素茶碱Sandwich干扰素人IgG
One-siteimmunoassays17-β-雌二醇
脂质体/荧光法碱性磷酸酯酶/热导检测法脂质体/荧光法
immunoassays葡萄糖氧化酶/电化
学检测法
吖啶酯/化学发光法
优点在于,利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度的活性物质,该技术不但能用来分离一些在生物材料中含量极微的物质,而且可以分离那些性质十分相似的生化物质。但免疫亲和层析也有一些缺点,主要是载体(如琼脂糖)价格昂贵,机械强度低;配基制备困难,如单克隆抗体制备即费时,成本又高,有的配基本身需要分离纯化;抗体一般是大分子物质,在洗脱过程中容易失活等等。因此,新型载体的研究开发,如何通过简单的方法得到配基(抗原或抗体)以及如何保证它们在纯化过程中的活性,将是免疫亲和层析的重要发展方向。
参考文献
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2.3.1 竞争性结合免疫分析(competitivebindingimmu-noassays) 这是最常用的一种方式,基本原理如下:在有一定量抗体的存在下,将含有待测物的样品和待测物的类似物(带有标记)混合,因为抗体的量是有限的,样品与带标记的类似物分子会竞争结合到抗体上,测量结合前后被标记类似物的量,然后在没有加样品的情况下测出带标记类似物的最大结合量,随着样品量的增加,带标记类似物的结合量就会减少,这样就可以间接测出样品中待测物的
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药物生物技术第12卷第5期
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ProgressonImmunoaffinityChromatographyanditsMedicalApplica-tion
YINGGuo-qing,WANGYu-jiao,YIYu,YUZhi-ming,SHILu-e
(Schoolofpharmacy,ZhejiangUniversityoftechnology,Hangzhou310013,China)
Abstract AreviewaboutnewprogressinIAC(immuno-affinitychromatography)technologyanditsapplicationinpharmaceuticandclinicalaspectispresented.Theformerimposesontheimmuno-absorb-ents,themethodofimmobilization,andtheelutionconditionwhilethelatterconcernstheisolationofantigenandantibody,theclinicaltest,immunoassaysandsoon.
Keywords Immuno-affinitychromatography,Antigen,Antibody,Immunity
药 物 生 物 技 术
342PharmaceuticalBiotechnology 2005,12(5):342～346
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摘 要 综述了免疫亲和层析技术的发展现状,包括层析介质、层析剂制备方法、洗脱方法等的最新进展,以及免疫亲和层析技术在制药领域和临床方面的应用,包括抗体和抗原的纯化、临床检测、免疫分析等。
关键词 免疫亲和层析;抗原;抗体;免疫
中图分类号:Q65 文献标识码:A 文章编号:1005-8915(2005)04-342-05
抗原和抗体的作用具有高度的专一性,并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到层析剂上,便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。20世纪50年代初,Campbell等运用固定化在纤维素上的抗体分离得到了抗原。接着,这种方法又被扩展运用到许多不同类型的抗原以及抗体片段。20世纪70年代末,单克隆抗体的发现在很多方面加速了免疫亲和层析法的发展。近20～30年间随着层析剂和固定化方法的发展,免疫亲和层析法在生命科学中已成为一种非常有价值的工具。重组蛋白(包括重组抗体)的生产,也给这种方法的运用提供了便利条件。1 纯化抗体和抗原
在蛋白质纯化中运用免疫亲和层析法(immuno-affini-tychromatography,IAC)是非常有效的方法,一般纯化倍数可达到1000～10000。1.1 层析介质的选择
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关于新型载体的报道,如Methal[1]用戊二醛活化脱乙酰壳多糖(alginate-chitosan)凝胶颗粒与抗半抗原(anti-hapten)IgG交联。Kerstin[2]也选取了脱乙酰壳多糖作为固定重组抗体的载体。Joseph[3]运用硝化纤维素(nitrocel-lulose)颗粒作为固相支持物。周冬梅[4]用甲基丙烯酸缩水甘油酯将纤维素与丙烯酸甘油酯类化合物结合,以这种附
图1 免疫亲和柱的制备方法二(“夹心”式层析剂)着分散的纤维素纤维的膜作为HPLC的固定相,分析血清中的IgG和由免疫山羊产生的多克隆抗体,只需要2.5min,通过加速流动相流动速率,分析过程可以在30s内完成。
1.2 亲和吸附剂的制备
固定化抗原通常是运用温和的固定化条件以保持抗原的天然构象,利用蛋白抗原表面氨基、羟基或硫醇与支持物交联。在非蛋白抗原或小分子半抗原的情况下,需要特殊的化学试剂。
制备抗体柱的一种方法是抗体首先结合到介质上。通常的共价法固定随机地结合抗体的3个片段,即Fc、Fab-1、Fab-2,被固定化后的抗体只有一部分保持与抗原结合的活力,且抗体中的Fc片段为结合位点,而不属于识别位点。
第二种方法的前提是所固定的抗体具有两个空间上分离的活性部位以便该抗体能同时与两种抗原结合。如图1[5]所示:首先,将抗原固定到介质上,然后结合上相应的抗体,由于二价抗体分子的一个活性部位是自由的,这种介质-抗原-抗体复合物就可以用来纯化抗原。这种夹心式层析剂的最大优点在于不必进行抗体的纯化与固定化
。
*收稿日期:2004-12-02 修回日期:2004-12-31
作者简介:应国清,1965年生,男,教授,研究方向为酶的固定化及修饰、生物制药、生化分离工程等通讯作者:应国清,0571-88320803,[email protected]
应国清等:免疫亲和层析技术及其医药应用进展
另一方法是将抗体结合到已被固定的蛋白A或蛋白G小珠上,由于蛋白A或蛋白G结合在抗体的Fc区,所以结合抗原的部位获得充分暴露,从而易于接近,由于空间上分离的两个不同活性部位的存在,抗体能同时与两种抗原结合。该法的缺点是在洗脱抗原的过程中这种蛋白A-抗体的复合物有可能会解离。
Kerstin[2]介绍了一种固定重组抗体的方法,构建了一个表达具有多个脱乙酰壳多糖结合部位(CBD)的scFV片段融合蛋白的质粒,因此可以直接将溶菌粗提液固定于成本较低的脱乙酰壳多糖珠粒上,该法的优点在于充分利用了现代信息库技术,运用了易于在E.coli中大量表达的scFV片段,而不像单克隆抗体的生产既费时,成本又高;利用scFV片段的CBD,scFV融合蛋白的偶联不需要固定化操作,这就意味着抗体的结合量不会有所损失;在偶联之前不需要其他的纯化步骤。1.3 纯化步骤
利用固定化抗原(或抗体)纯化相应的配体,一般包括3个步骤,首先用中性的缓冲溶液平衡亲和柱,让含有相应配体的溶液通过亲和柱。其次是洗去非特异性吸附蛋白,在标准操作中,应该用同样的缓冲液洗去非特异性结合的蛋白,但如果要达到更好的效果,可以用偏酸(pH值5.5)或偏碱(pH值8.5)的缓冲溶液洗柱子。最后是抗体(或抗原)的洗脱,抗体通常用pH值为2.0～2.2的缓冲溶液洗脱,为了保持抗体的天然构象,缓冲液的pH值也可以用1mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.0)调整。
为了达到更好的纯化结果,可以调整标准的操作条件,比如要仔细研究洗去非特异性吸附蛋白的条件(如运
表1 IAC在纯化抗原和抗体中的应用
被纯化的物质应用
肿瘤治疗研究:
神经胶质瘤HACN-35肺癌相关蛋白临床检测研究:
第4代HIV快速诊断试剂精子膜抗原
能识别吗啡的ScFv及双功能抗体片断重组毒素:
猪瘟病毒(CSFV)结构糖蛋白E2重组毒素EGF-PE40
其它:
重组人促红细胞生成素(rhEPO)二肽酶Ⅳ(DPPIV/CD26)褪黑激素
[参考文献]
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用的pH值,盐浓度,或有机添加物等);抗原(或抗体)的最佳洗脱条件必须使失活量达到最小,例如Jose[6]在洗脱结合在亲和柱上的重组人干扰素(rIFN-α)时,测试了不同洗脱液的洗脱效果,证实含有脲的洗脱剂最佳,这是因为低含量的脲不仅改变了抗原-抗体之间的结合力,并且避免了INF分子的聚集;另外,在亲和吸附剂的制备过程中要达到抗体与抗原的结合力达到最高,例如VladimirI[5]系统研究了用CNBr活化的琼脂糖凝胶固定蛋白抗原时,抗原的固定化程度对层析柱结合力的影响,在活化剂用量小于100mgCNBr/(ml凝胶)时,抗原的结合量随着活化剂用量的增大而增大,之后抗原的结合量基本不变,这可能是因为抗原分子的多位点结合导致了构象的改变,从而减弱抗原与抗体活性部位的结合,而且琼脂糖凝胶的活化剂用量在70～150mgCNBr/(ml凝胶)时,可以用较温和的条件洗脱抗体。有时,也可以运用一些适当的添加剂,如陈章林[7]在纯化HBsAg时,在稀释的血清中加入了0.2%福尔马林和0.02%叠氮钠,在进行长时间热灭活过程中防止了微生物分解HBsAg,从而达到既消除HBV的感染性又保存HBsAg免疫活性,福尔马林和叠氮钠在亲和吸附后通过洗涤亲和层析柱而得到彻度清除,不会影响纯HBsAg以后的应用。1.4 应用
近几年来,国内外有不少应用免疫亲和层析法纯化抗原(或抗体)的研究报告,纯化后的抗原(或抗体)为疾病的治疗、诊断、以及揭示发病机理等方面都提供了可靠的依据,仅选取了部分文章概括如表1所示:
应用HAC诱导的免疫反应治疗神经胶质细胞瘤 [8]研究它们在恶性肿瘤细胞生物学行为中的作用 [9]可同时检测HIV抗体及p24抗原 [10]
显示免疫性不孕症患者 [11]毒品监测 [12]
在CSFV抗原变异、基因工程疫苗及诊断试剂的研究与开发等方面具有十分重要的意义 [13]
特异性杀伤某些上皮细胞异化引发的过度表达人表皮因子受体(EGFR)的细胞 [14]
治疗肾衰后引起的贫血 [15]
研究DPPIV/CD26在生物活性肽中的重要调节功能 [16]
临床上作为生物反应调节剂的辅助药物用于治疗晚期肾癌 [17]
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药物生物技术第12卷第5期
续 表
被纯化的物质应用
单链尿激酶型纤溶酶原激活剂β-乳球蛋白
[参考文献]
第二代溶栓药物,可以克服尿激酶使用过程中非特异性地激活全身纤溶系统所造成的出血倾向问题 [18]应用免疫亲和层析法对β-乳球蛋白进行定量,控制相关生物制药产品的质量 [19]
应用IAC分析的最简单方法就是将待测产物吸附于带
2 免疫亲和层析(IAC)在分析检测中的应用
在生物学或非生物学样品的分析中,越来越多地使用了IAC来制备被分析样品或进行检测。2.1 IAC在直接检测中的应用
固定化抗体的亲和柱上,洗脱流出液直接进入检测器,这种方法的优点是操作简单、快速、准确,表2[20]例举了一些应用HPIAC(High-performanceimmunoaffinitychromatograph)检测的例子:
表2 HPIAC检测举例
被分析的物质
Anti-idiotypicantibodies(个体基因型抗体)AntithrombinⅢ(抗凝血酶Ⅲ)Fibrinogen(血纤维蛋白原)Glucosetetrasaccharide(葡萄四糖)Glutaminesynthetase(谷氨酰氨合成酶)
Granulocytecolonystimulatingfactor(粒细胞集落刺激因子)Humanserumalbumin(人血清白蛋白)IgGIgE
Interferon(干扰素)Interleukin-2(白介素-2)β2-Microglobulin(β2-小球蛋白)
Tissue-typeplasminogenactivator(组织型纤维溶酶原激活剂)Transferrin(转铁蛋白)
如表2所示,针对糖类物质,常用电流脉冲检测法(pulsed-amperometricdetection,PAD),而对蛋白溶液,通常是应用210～215nm或者是280nm处的紫外吸收法(UVabsorbence)来检测。这种方法得到的色谱图一般包括两个峰,第一个峰代表非特异性吸附的物质,第二个峰代表了被分析的物质,而且第二个峰的保留时间可以通过控制加入洗脱剂的时间而改变。
2.2 通过IAC提取待测样品(immunoextraction)后再进行检测
这种方法就是先使一种或多种特定的溶质从样品中转移,然后用另一种检测方法来鉴定。该法的操作流程与3.1相似,不同的是将免疫亲和柱与其它定量方法结合起来。
有些情况下,洗脱部分不经过其它处理就用另一种检测方法进行检测,例如,国际标准ISO14501[21]中,亲和柱含有特性的抗体键合在固体支持物上,当样品通过抗体亲
检测方法
紫外吸收法荧光法紫外吸收法PAD/放射性标记法紫外吸收法/酶法检测荧光法紫外吸收法紫外吸收法紫外吸收法/ElISA紫外吸收法荧光法/受体分析法紫外吸收法/EIA荧光法紫外吸收法
血清
样品
细胞培养液血浆血清,尿液细菌抽提物血浆,CSF血清,尿液脑脊髓液(CSF)血浆,血清
血浆/血清,尿液,CSF样品组织血浆细胞培养液血清
和柱时,抗体选择性地与所有存在的黄曲霉毒素M1(抗原)结合,而形成抗体-抗原复合体;停留在亲和柱上的所有其它样品基质用水清洗掉;然后用淋洗液将亲和柱上的黄曲霉毒素M1洗脱下来,收集好洗脱液。洗脱液中的黄曲霉毒素M1含量用带有荧光检测器的高效液相色谱仪(HPLC)进行测定。
更多的情况下,为了改善检测的灵敏度或样品的物理特性(比如,在用GC分析之前,增加样品的挥发性能),通常收集洗脱液后进一步处理样品,使之更便于检测(如先进行干燥,然后用另一种溶剂重新溶解)。表3[20]给出了一些利用HPLC和GC进行定量的例子。
表中缩写字母如下所示:ECD(electroncapturedetec-tor);ESI-MS(electrosprayionizationmassspectrometry);GC-MS(gaschromatography/massspectrometry);RPLC(reversed-phaseliquidchromatography)。
应国清等:免疫亲和层析技术及其医药应用进展
表3 通过IAC提取待测样品后再利用HPLC和GC进行定量举例
被分析的物质
Immunoextraction/HPLCHumanchorionicgonadotropin(人绒毛膜促进腺激素)Oxytocin(催产素)Immunoextraction/GCChloramphenicol(氯霉素)Dexamethasone(地塞米松)Estrogens(雌激素)Prostaglandins(前列腺素)
GC-ECDGC-MSGC-MSGC-MS
尿液,样品组织
尿液血浆,尿液尿液
RPLC-coulometryRPLC-ESI-MS
尿液
检测方法
样品
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含量。此处标记包括酶、荧光标记、脂质体等,可以通过测量未被结合的或洗脱下来的标记物的量来达到检测目的。2.3.2 夹心式免疫分析(sandwichimmunoassays) 这种方法需要两种不同类型的抗体,一种结合到固相介质中用来从样品中结合待测物,另一种抗体包含了易测的标记,在结合前或结合后加到待测物中,作用是给待测物加上标记以便于定量。此法最大的优点是,被结合的标记物直接与样品中待测物的含量成正比,而且运用两种抗体提高了选择性。缺点是要求待测物同时与两种抗体结合,因此要求待测物的浓度较高。
2.3.3 单一位点免疫分析(one-siteimmunoassays) 样品先与已知量的过量带标记的抗体或Fab片段混合,结合后将该混合物注入固定化有待测物的类似物的柱子上,柱子会结合未被样品结合的抗体/Fab片段,而结合有待测物的抗体/Fab片段则流出柱子,通过观察流出的抗体/Fab片段的量就可以直接得到样品中待测物的含量。此法与竞争性结合免疫分析法一样,既可测定高浓度样品,又可测定低浓度样品;与夹心式免疫分析法一样,可直接测定待测物的含量;而且因为固定化的是待测物的类似物,柱子的再生条件不用受太多限制。但是每测定一次样品,必需制备一根固定化有待测物的类似物的柱子。
2.4 IAC在柱后免疫监测(Postcolumnimmunodetection)中的应用
上述提到的各种形式IAC的应用也可以用于监测其它色谱柱的流出液中特殊成分的存在,这种方法常称为免疫监测(immunodetection),通常需要柱后反应器,在HPLC柱的出口处连接固定化抗体或抗原柱,Irth等[23]的一篇文章中描述了这种方法的应用。3 展 望
和其它亲和层析技术一样,免疫亲和层析技术的最大
国内,刘尚义[22]等将专一性较高的固相免疫亲和层析与生物质谱分析相结合,建立了血清中蛋白质药物的分离提取和鉴定方法,并成功地鉴定了给药猕猴血清中重组人内皮抑制素,为体内蛋白质药物的代谢物和蛋白结合物分离鉴定奠定了基础。
2.3 IAC在免疫分析(chromatographic/flow-injectionim-muno-assay)中的应用
当待测物本身不能提供可检测信号的情况下,通过免疫分析法中的抗体标记或待测物的类似物标记可以达到检测的目的。
表4[20] IAC在免疫分析中的应用举例
被检测的物质
标记/检测方法
样品含水标准物
血清血清血清含水标准物
血清细胞培养液
血清含水标准物
Competitivebindingimmunoassays
促肾上腺素皮质激素荧光素/荧光法人绒毛膜促性腺激素人IgG
辣根过氧化物酶/吸光度法
葡萄糖氧化酶/荧光法荧光素/荧光法
胰岛素茶碱Sandwich干扰素人IgG
One-siteimmunoassays17-β-雌二醇
脂质体/荧光法碱性磷酸酯酶/热导检测法脂质体/荧光法
immunoassays葡萄糖氧化酶/电化
学检测法
吖啶酯/化学发光法
优点在于,利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度的活性物质,该技术不但能用来分离一些在生物材料中含量极微的物质,而且可以分离那些性质十分相似的生化物质。但免疫亲和层析也有一些缺点,主要是载体(如琼脂糖)价格昂贵,机械强度低;配基制备困难,如单克隆抗体制备即费时,成本又高,有的配基本身需要分离纯化;抗体一般是大分子物质,在洗脱过程中容易失活等等。因此,新型载体的研究开发,如何通过简单的方法得到配基(抗原或抗体)以及如何保证它们在纯化过程中的活性,将是免疫亲和层析的重要发展方向。
参考文献
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2.3.1 竞争性结合免疫分析(competitivebindingimmu-noassays) 这是最常用的一种方式,基本原理如下:在有一定量抗体的存在下,将含有待测物的样品和待测物的类似物(带有标记)混合,因为抗体的量是有限的,样品与带标记的类似物分子会竞争结合到抗体上,测量结合前后被标记类似物的量,然后在没有加样品的情况下测出带标记类似物的最大结合量,随着样品量的增加,带标记类似物的结合量就会减少,这样就可以间接测出样品中待测物的
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药物生物技术第12卷第5期
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ProgressonImmunoaffinityChromatographyanditsMedicalApplica-tion
YINGGuo-qing,WANGYu-jiao,YIYu,YUZhi-ming,SHILu-e
(Schoolofpharmacy,ZhejiangUniversityoftechnology,Hangzhou310013,China)
Abstract AreviewaboutnewprogressinIAC(immuno-affinitychromatography)technologyanditsapplicationinpharmaceuticandclinicalaspectispresented.Theformerimposesontheimmuno-absorb-ents,themethodofimmobilization,andtheelutionconditionwhilethelatterconcernstheisolationofantigenandantibody,theclinicaltest,immunoassaysandsoon.
Keywords Immuno-affinitychromatography,Antigen,Antibody,Immunity