基因工程抗体研究进展及临床应用
摘要：基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体，近年来随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续问世，本文详细介绍了基因工程抗体的研究进展，概述了基因工程抗体在临床方面的明显优势和应用潜力。
抗体在生物医学领域中的应用极为广泛,其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等3个发展阶段。由于单克隆抗体的高度特异性,使其在细胞生物学、基础医学、临床诊断及其他领域得到广泛应用。为了克服大分子单克隆抗体的缺点,人们利用基因工程技术制备了人鼠杂交和完全人源化的抗体,以生产更加有效的抗体诊断及治疗制剂,越来越多地被用于临床医学和临床研究,这类抗体被称为第三代抗体。目前,构建基因工程重组抗体及其片段已逐渐成为设计高亲和性、以蛋白为基础的靶向诊断和治疗用生物制品的趋势。
1.基因工程抗体概述
基因工程抗体,即应用基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中,在适当的宿主中表达并折叠成有功能的一种抗体分子。基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。此技术的基本原理是,首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA,逆转录成cDNA,再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因,按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中,并在适当的细胞中表达并折叠成有功能的抗体
分子,筛选出高表达的细胞株,再用亲和层析等手段纯化抗体片段。基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分,保留原有抗体的亲和力和特异性。借助于基因工程技术,既可以对完整抗体,又可以对抗体片段进行改造。 2抗体类型
基因工程抗体按分子结构可以分为嵌合抗体、重构抗体、单链抗体及单域抗体等。其中以嵌合抗体研究的较多，技术也较为成熟。而单链抗体、单区抗体等小分子抗体，具有结构简单、分子小、免疫源性低的优点，但其临床应用前景十分广阔。抗体基因组文库技术的出现，从根本上改变了单抗的制备流程，操作简便、成本低、产量大，被称为抗体发展史上的一次革命。下面我们分类加以介绍。
2.1完整抗体
此类抗体结构与天然抗体相似，具有完整的轻链和重链，只是将抗体中部分鼠源性成分人源化，从而降低其免疫源性。
2.1.1嵌合抗体在基因水平上连接鼠抗体可变和人抗体稳定区，插入表达质粒在转染细胞表达所产生的抗体，称之为嵌合抗体。由于嵌合抗体中含有75%～80%人源性成分，只有20%鼠源性成分，故可以大大减少注入人体后产生的免疫反应。目前国外已制备出多种可用于肿瘤导向治疗的嵌合抗体，部分已进入Ⅱ期临床阶段。
2.1.2重构抗体 重构抗体是在嵌合抗体的基础上发展起来的。因为CDR的结构是不依赖FR的，假如将人抗体可变区的CDR改换成小鼠单抗的CDR，使其变为具有小鼠单抗特异性的人源抗体，这就是所谓的重构抗体。重构抗体的设想是用互补性决定区（CDR）移植的方法将鼠源单抗重新构建为人源单抗。但由于人-鼠嵌合抗体的可变区仍保留着小鼠抗体成分，因而不能完全克服其在人体内的免疫原性，从而使其应用受到了限制。
2.2亚单位抗体
亚单位子抗体是利用重组DNA技术，通过细菌表达决定抗体特异性的结构域所得到的，因其大小只有完整IgG分子的l/6～l/2，故也称之为小分子抗体。根据小分子抗体结构的特点，又可分为以下4种类型。
2.2.1单链抗体 单链抗体（Single chain antibody，scFv）是指在重链V区cDNA5’端与轻链V区cDNA5’端之间用一寡聚核甘酸连接，在大肠杆菌中表达成一单链多肽，并在细菌体内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体，大小仅为完整IgG的l/6。单链抗体的独特组成是其多肽接头，多肽接头可设计为具有特殊功能的位点，如金属螯合、连接毒素或药物等，以用于影像和临床治疗。
2.2.2双链抗体 通过缩短单链抗体间的接头，可以使V H V L之间形成配对，这就是双链抗体这种抗体比单链抗体在抗原识别和结合方面性能更好，在免疫诊断和免疫治疗方面前景广阔。
2.2.3 F（ab’） 将重链的V区和C Hl的cDNA与完整的轻链cDNA连接在一起，在细菌的启动子控制下在大肠杆菌中表达为Fab，其具有抗体的活性，而大小为完整IgG的l/3。另外，因为其不含有Fc段、分子量小、抗原性低，故在肿瘤治疗上有其优越性。
2.2.4单域抗体 Ward等1989年发现单独的V H区也具有与抗原结合的能力，且保持了完整抗体的特异性，称其单域抗体。单域抗体大小只有完整IgG分子的1/12，更比较容易穿入细胞，到达完整抗体不能接近的部位。
2.3多价抗体
传统的抗体只能结合单一特异性的抗原分子，而多价抗体的多个抗原结合位点具有不同的特异性，能够结合不同的抗原分子。研究较为深入的多价抗体是双特异性抗体，现在已有至少9种双特异性抗体进行了临床试验，在一些病例中已取得效果。
2.4抗体基因组文库
抗体库是近些年出现的一门新技术，1989年Ward等首次报道了全套抗体组合库的构建，其制备的步骤为:抗体基因的获得，抗体库的构建，对库进行筛选，并在适当载体上表达。在20世纪90年代，噬菌体表面展示技术的出现推动了抗体基因组文库的发展，将抗体基因与单链噬菌体的外表蛋白融合并表达于噬菌体的表面，以固相化的抗原吸附相应的噬菌体抗体，经多次”吸附-洗脱-扩增”即可获得所需抗体。抗体库技术省去了细胞融
合步骤，避免因杂交瘤不稳定而需反复克隆的繁琐程序，省时省力;扩大了筛选容量，杂交瘤技术一般筛选能力在上千个克隆以内，而抗体库可筛选10 6个克隆;可在原核系统中表达，生长迅速，成本低;因直接克隆到抗体基因，便于进一步构建各种基因工程抗体;从根本上改变了单抗的制备流程，在生物技术研究及开发中，成为众所瞩目的热点之一，日前我国已建成迄今为止世界上第1个针对SARS的基因工程抗体库。
3.基因工程抗体的临床应用
基因工程抗体构建形式灵活多样，不仅能通过减少抗体中的鼠源成分降低免疫原性，而且可以将抗体的部分片段与其它功能性分子连接，使抗体除了与抗原结合外，还能发挥其他效应分子的生物学作用。基因工程抗体在医学领域的许多方面都极具应用潜力，尤其在诊断和治疗肿瘤性疾病及抗感染方面优势明显。
3.1在肿瘤性疾病诊疗方面的应用 以标记抗体注入人体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合的放射浓集称放射免疫显像，显像效果受抗体亲和力、特异性、半衰期和组织穿透力等因素影响。同时，用鼠源单抗会引起人抗鼠抗体反应，改变抗体药物代谢动力学而导致显像失败，并产生副作用。用基因工程抗体可解决上述问题，而且基因工程抗体中如单链抗体、F（ab’）等，分子量小、能很快清除、组织穿透力强，显像本底低，更加适合放射免疫显像。恶性肿瘤的导向治疗是通过重组技术将抗肿瘤相关抗原的抗体，与毒性蛋白如绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒素等，或是细胞因子如白介素、肿
瘤坏死因子、等融合形成的重组毒素或免疫毒素可将细胞杀伤效应引导到肿瘤部位，对肿瘤细胞进行直接杀伤或调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞。
3.2基因工程抗体的抗感染作用 预防和治疗感染性疾病常用的药是疫苗和抗生素，但对于如SARS、AIDS等难以获得相应疫苗或疫苗效果不理想的病毒感染，目前仍缺乏有效的治疗方法。在这一方面，基因工程抗体应用前景十分广阔。如在治疗AIDS方面，利用抗体工程技术已成功地制备出HIV病毒整合菌的单链抗体ScAb2-19，对HIV病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用，并可望成为AIDS基因治疗的有效手段。
3.3基因工程抗体在器官移植中的应用 移植排斥反应是器官移植的主要障碍之一。随着病人长期存活率的提高，他们将面临真菌感染、病毒感染和肿瘤等危险。基因工程抗体在这一领域也崭露头角，其中抗CD3及抗IL-2基因工程抗体的研究较为多见。目前，Murmonab CD3和Anti-IL-2R已被FDA批准用于预防器官移植排斥反应并取得了较好的疗效。基因工程抗体不仅在上述疾病中有着重要的应用，而且在自身免疫性疾病、中毒性疾病、变态反应性疾病等的治疗方面也显示出独特的优势。
4.基因工程抗体的应用前景
全人源抗体的研究在近30年中得到了极大的发展,目前全球已有500余种诊断和治疗用的单克隆抗体投放市场,100多种用于临床研究。全人源抗体在医学领域的许多方面都极具应用潜力,如病毒感染、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、中风等疾病治疗,尤其在诊断和治疗肿瘤疾病及抗感
染方面优势明显。但是全人源抗体的研究仍有许多问题等待解决,如抗体亲和力的成熟、全人源杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性、抗体的大规模生产等。随着制备技术的完善和成熟,全人源抗体必将成为当今以及未来生命科学及生物技术的研究热点和产业化增长点。
基因工程抗体研究进展及临床应用
摘要：基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体，近年来随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续问世，本文详细介绍了基因工程抗体的研究进展，概述了基因工程抗体在临床方面的明显优势和应用潜力。
抗体在生物医学领域中的应用极为广泛,其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等3个发展阶段。由于单克隆抗体的高度特异性,使其在细胞生物学、基础医学、临床诊断及其他领域得到广泛应用。为了克服大分子单克隆抗体的缺点,人们利用基因工程技术制备了人鼠杂交和完全人源化的抗体,以生产更加有效的抗体诊断及治疗制剂,越来越多地被用于临床医学和临床研究,这类抗体被称为第三代抗体。目前,构建基因工程重组抗体及其片段已逐渐成为设计高亲和性、以蛋白为基础的靶向诊断和治疗用生物制品的趋势。
1.基因工程抗体概述
基因工程抗体,即应用基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中,在适当的宿主中表达并折叠成有功能的一种抗体分子。基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。此技术的基本原理是,首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA,逆转录成cDNA,再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因,按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中,并在适当的细胞中表达并折叠成有功能的抗体
分子,筛选出高表达的细胞株,再用亲和层析等手段纯化抗体片段。基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分,保留原有抗体的亲和力和特异性。借助于基因工程技术,既可以对完整抗体,又可以对抗体片段进行改造。 2抗体类型
基因工程抗体按分子结构可以分为嵌合抗体、重构抗体、单链抗体及单域抗体等。其中以嵌合抗体研究的较多，技术也较为成熟。而单链抗体、单区抗体等小分子抗体，具有结构简单、分子小、免疫源性低的优点，但其临床应用前景十分广阔。抗体基因组文库技术的出现，从根本上改变了单抗的制备流程，操作简便、成本低、产量大，被称为抗体发展史上的一次革命。下面我们分类加以介绍。
2.1完整抗体
此类抗体结构与天然抗体相似，具有完整的轻链和重链，只是将抗体中部分鼠源性成分人源化，从而降低其免疫源性。
2.1.1嵌合抗体在基因水平上连接鼠抗体可变和人抗体稳定区，插入表达质粒在转染细胞表达所产生的抗体，称之为嵌合抗体。由于嵌合抗体中含有75%～80%人源性成分，只有20%鼠源性成分，故可以大大减少注入人体后产生的免疫反应。目前国外已制备出多种可用于肿瘤导向治疗的嵌合抗体，部分已进入Ⅱ期临床阶段。
2.1.2重构抗体 重构抗体是在嵌合抗体的基础上发展起来的。因为CDR的结构是不依赖FR的，假如将人抗体可变区的CDR改换成小鼠单抗的CDR，使其变为具有小鼠单抗特异性的人源抗体，这就是所谓的重构抗体。重构抗体的设想是用互补性决定区（CDR）移植的方法将鼠源单抗重新构建为人源单抗。但由于人-鼠嵌合抗体的可变区仍保留着小鼠抗体成分，因而不能完全克服其在人体内的免疫原性，从而使其应用受到了限制。
2.2亚单位抗体
亚单位子抗体是利用重组DNA技术，通过细菌表达决定抗体特异性的结构域所得到的，因其大小只有完整IgG分子的l/6～l/2，故也称之为小分子抗体。根据小分子抗体结构的特点，又可分为以下4种类型。
2.2.1单链抗体 单链抗体（Single chain antibody，scFv）是指在重链V区cDNA5’端与轻链V区cDNA5’端之间用一寡聚核甘酸连接，在大肠杆菌中表达成一单链多肽，并在细菌体内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体，大小仅为完整IgG的l/6。单链抗体的独特组成是其多肽接头，多肽接头可设计为具有特殊功能的位点，如金属螯合、连接毒素或药物等，以用于影像和临床治疗。
2.2.2双链抗体 通过缩短单链抗体间的接头，可以使V H V L之间形成配对，这就是双链抗体这种抗体比单链抗体在抗原识别和结合方面性能更好，在免疫诊断和免疫治疗方面前景广阔。
2.2.3 F（ab’） 将重链的V区和C Hl的cDNA与完整的轻链cDNA连接在一起，在细菌的启动子控制下在大肠杆菌中表达为Fab，其具有抗体的活性，而大小为完整IgG的l/3。另外，因为其不含有Fc段、分子量小、抗原性低，故在肿瘤治疗上有其优越性。
2.2.4单域抗体 Ward等1989年发现单独的V H区也具有与抗原结合的能力，且保持了完整抗体的特异性，称其单域抗体。单域抗体大小只有完整IgG分子的1/12，更比较容易穿入细胞，到达完整抗体不能接近的部位。
2.3多价抗体
传统的抗体只能结合单一特异性的抗原分子，而多价抗体的多个抗原结合位点具有不同的特异性，能够结合不同的抗原分子。研究较为深入的多价抗体是双特异性抗体，现在已有至少9种双特异性抗体进行了临床试验，在一些病例中已取得效果。
2.4抗体基因组文库
抗体库是近些年出现的一门新技术，1989年Ward等首次报道了全套抗体组合库的构建，其制备的步骤为:抗体基因的获得，抗体库的构建，对库进行筛选，并在适当载体上表达。在20世纪90年代，噬菌体表面展示技术的出现推动了抗体基因组文库的发展，将抗体基因与单链噬菌体的外表蛋白融合并表达于噬菌体的表面，以固相化的抗原吸附相应的噬菌体抗体，经多次”吸附-洗脱-扩增”即可获得所需抗体。抗体库技术省去了细胞融
合步骤，避免因杂交瘤不稳定而需反复克隆的繁琐程序，省时省力;扩大了筛选容量，杂交瘤技术一般筛选能力在上千个克隆以内，而抗体库可筛选10 6个克隆;可在原核系统中表达，生长迅速，成本低;因直接克隆到抗体基因，便于进一步构建各种基因工程抗体;从根本上改变了单抗的制备流程，在生物技术研究及开发中，成为众所瞩目的热点之一，日前我国已建成迄今为止世界上第1个针对SARS的基因工程抗体库。
3.基因工程抗体的临床应用
基因工程抗体构建形式灵活多样，不仅能通过减少抗体中的鼠源成分降低免疫原性，而且可以将抗体的部分片段与其它功能性分子连接，使抗体除了与抗原结合外，还能发挥其他效应分子的生物学作用。基因工程抗体在医学领域的许多方面都极具应用潜力，尤其在诊断和治疗肿瘤性疾病及抗感染方面优势明显。
3.1在肿瘤性疾病诊疗方面的应用 以标记抗体注入人体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合的放射浓集称放射免疫显像，显像效果受抗体亲和力、特异性、半衰期和组织穿透力等因素影响。同时，用鼠源单抗会引起人抗鼠抗体反应，改变抗体药物代谢动力学而导致显像失败，并产生副作用。用基因工程抗体可解决上述问题，而且基因工程抗体中如单链抗体、F（ab’）等，分子量小、能很快清除、组织穿透力强，显像本底低，更加适合放射免疫显像。恶性肿瘤的导向治疗是通过重组技术将抗肿瘤相关抗原的抗体，与毒性蛋白如绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒素等，或是细胞因子如白介素、肿
瘤坏死因子、等融合形成的重组毒素或免疫毒素可将细胞杀伤效应引导到肿瘤部位，对肿瘤细胞进行直接杀伤或调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞。
3.2基因工程抗体的抗感染作用 预防和治疗感染性疾病常用的药是疫苗和抗生素，但对于如SARS、AIDS等难以获得相应疫苗或疫苗效果不理想的病毒感染，目前仍缺乏有效的治疗方法。在这一方面，基因工程抗体应用前景十分广阔。如在治疗AIDS方面，利用抗体工程技术已成功地制备出HIV病毒整合菌的单链抗体ScAb2-19，对HIV病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用，并可望成为AIDS基因治疗的有效手段。
3.3基因工程抗体在器官移植中的应用 移植排斥反应是器官移植的主要障碍之一。随着病人长期存活率的提高，他们将面临真菌感染、病毒感染和肿瘤等危险。基因工程抗体在这一领域也崭露头角，其中抗CD3及抗IL-2基因工程抗体的研究较为多见。目前，Murmonab CD3和Anti-IL-2R已被FDA批准用于预防器官移植排斥反应并取得了较好的疗效。基因工程抗体不仅在上述疾病中有着重要的应用，而且在自身免疫性疾病、中毒性疾病、变态反应性疾病等的治疗方面也显示出独特的优势。
4.基因工程抗体的应用前景
全人源抗体的研究在近30年中得到了极大的发展,目前全球已有500余种诊断和治疗用的单克隆抗体投放市场,100多种用于临床研究。全人源抗体在医学领域的许多方面都极具应用潜力,如病毒感染、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、中风等疾病治疗,尤其在诊断和治疗肿瘤疾病及抗感
染方面优势明显。但是全人源抗体的研究仍有许多问题等待解决,如抗体亲和力的成熟、全人源杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性、抗体的大规模生产等。随着制备技术的完善和成熟,全人源抗体必将成为当今以及未来生命科学及生物技术的研究热点和产业化增长点。