※专题论述食品科学
2009, Vol. 30, No. 21443
多糖含量测定的研究进展
徐晓飞1,2，陈 健2,*
(1.南方李锦记有限公司，广东 广州 510620；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)摘 要：本文综述了多糖含量测定方法，主要包括化学法、气相色谱法、液相色谱法、阴离子交换色谱-脉冲安培检测、体积排除色谱、薄层色谱法、毛细管电泳法、红外光谱法等，这些方法可为多糖含量测定提供一定的参考，并为多糖的更深入研究提供部分理论基础。关键词：多糖；含量；测定；方法
Research Progress in Methods for Quantitative Determination of Polysaccharides
XU Xiao-fei1,2，CHEN Jian2,*
(1.Nanfang Lee Kum Kee Co. Ltd., Guangzhou 510620, China；2.College of Light Industry and Food Sciences,
South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)
Abstract ：With the purpose of offering useful guidance for the selection of an optimal method for quantitative determinationof polysaccharides in various samples, this paper reviews methods for quantitative determination of polysaccharides, mainlyincluding chemical assay, gas liquid chromatographic (GC) method, high pressure liquid chromatographic (HPLC) method, anionion exchange chromatographic (AEC) method, size exclusion chromatographic (SEC) method, thin layer chromatographic (TLC)method, capillary electrophoresis (EC) method, infrared spectroscopic (IR) method and so on.Key words：polysaccharides；content；determination；methods
中图分类号：TS201.23 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)21-0443-06
多糖(polysaccharides，PS)是由10个以上的单糖聚合而成的生物高分子。多糖包含均多糖(homosaccharide)和杂多糖(heterosaccharide)，前者是由同一种单糖组成，后者则是由两种以上不同的单糖组成。多糖除含有单糖外，还含有糖醛酸、氨基糖、糖醇、脱氧糖等基团。多糖按来源可分为动物多糖、植物多糖、微生物多糖和藻类多糖；按酸碱性可分为酸性多糖、中性多糖及碱性多糖；按溶解性可分水溶性多糖、水不溶性多糖、酸性多糖和碱性多糖等[1]。
多糖不仅是生物体必不可少的成分，而且还具有多种生理机能，如真菌多糖具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老等多种生物学活性，已被开发成多种药物和功能性食品添加剂[2]。在多糖工业生产过程中，常需对多糖的含量进行测量和监控，由于多糖的种类繁多，多糖含量和存在形式也多变，因此，选择适当的多糖分析方法十分重要。本文就多糖
收稿日期：2008-11-10
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD27B04)
含量分析的一些方法进行综述。１
多糖的提取
多糖提取方法有热水浸提法、酸提、碱提、有机
溶剂提取、酶法提取等，常以微波和超声波辅助强化。水溶性多糖可采用水提法，水不溶性多糖一般用碱或酸法提取，常用试剂有草酸铵、碳酸钠、氢氧化钠、三氟乙酸、稀盐酸等。影响多糖得率的因素主要是提取时间、浸提比、提取次数、温度、pH值、溶剂和搅拌等[3]。２
多糖的降解
为对多糖总量进行测定，常将多糖还原为单糖或寡糖。多糖的定性和定量组成可通过酸催化水解多糖成单糖或寡糖后再进行分析。甲醇分解、乙酰分解作用、甲醛分解作用、酶水解等方法也可用于多糖降解[4]。其
作者简介：徐晓飞(1979－)，男，工程师，硕士，主要从事食品生物技术方面的研究。E-mail：[email protected]*通讯作者：陈健(1967－)，男，副教授，博士，主要从事食品化学、天然产物化学、生物分离技术等方面的研究。：
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食品科学※专题论述
中，酸水解最为常见，最常用的酸是盐酸、硫酸和三氟乙酸。如利用色谱方法进行检测，由于酸和盐往往干扰色谱分离，常需利用中和、沉淀、透析等形式消除干扰[5]。３3.1
多糖含量测定
硫酸-咔唑法主要用于糖醛酸的测定，多糖经水解氧化生成糖醛酸，在强酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，各中性单糖在0.04～0.32mg/ml，糖醛酸在0.01～0.08mg/ml范围内，其浓度与咔唑法检测吸收值呈线性，可定量测定。糖的存在，可使糖醛酸含量偏高，采用改进的含量测定方法，可在一定程度上消除糖的干扰[11]。
此外，滴定法(包括斐林氏滴定法、间接碘量滴定法、氧化还原滴定法等)也常用于糖类分析[12]。化学法测定多糖含量获得的往往是总的多糖含量，无具体单糖组成细节，但由于操作简单，成本低，仍有广泛应用。3.23.2.1
色谱法
气相色谱法(GC)
化学法
苯酚-硫酸法是测定多糖最常用的一种方法。多糖在浓硫酸作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，并通过比色法确定含量，该方法具有操作简单、快速、重复性好，显色后稳定性较好等优点，但对有色样品结果易偏高[6]。
多糖可用与其组成结构相近的多糖作标准曲线。但更多的情况下是以相应的单糖作标准，此时，需以0.9的转化系数校正。对于均多糖, 可直接以其组成糖作标准曲线。而对于由不同糖残基构成的杂多糖，则需根据k'=Σki'awi计算校正系数k'，式中，awi为组成糖i 的重量百分含量，ki'为其相对于葡萄糖的校正系数[7]。苏颖等利用全波长酶标仪代替分光光度计测定虫草多糖含量，由于采用了96 孔板代替分光光度计比色杯，分析时间大大减少，并且误差也有所减少[8]。
蒽酮-硫酸法是多糖类在浓硫酸作用下水解、脱水，再与蒽酮结合成有色化合物，于最大吸收波长处测吸光度。蒽酮-硫酸法稳定性较差，宜新鲜配制并注意避光。此外，色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰[6]。
3,5-二硝基水杨酸(DNS)法是在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖加热后被还原生成氨基化合物，呈橘红色，比色测定糖含量。该法可测定还原糖和总糖含量，并通过多糖=总糖－还原糖，可获得多糖含量[9]
。该方法为半微量定糖法，简便、快速，适用于大量样品的测定。改良的DNS方法可使己糖和戊糖的混合糖样的分析结果更准确[10]。
表１ 化学法测定多糖含量
Table 1 Chemical assays for quantitative determination of
polysaccharides
样品槲寄生多糖茶叶多糖虫草多糖B型古巴流感疫苗总糖
6mol/L盐酸水解，中和，
当归多糖
测总糖；乙醇除杂，热水浸提，测还原糖
玉米秸秆总糖
加盐酸，沸水浴加热，中和，定容，过滤
DNS
定量限0.2mg/ml[10]
DNS
定量限0.2mg/ml
[9]
样品制备热水浸提，过滤，离心，醇沉
80%乙醇脱色，75℃热水浸提，过滤，离心，醇沉，干燥
脱酯，沸水浸提，离心，浓缩，醇沉
测定方法苯酚硫酸法苯酚硫酸法改良苯酚-硫酸法
备注定量限4μg检测限10μg
参考文献[13][14]
气相色谱法可定性、定量分析多糖的组分和含量，一般是将多糖酸水解或甲醇醇解[16]，用衍生物法以增加其挥发性。
在GC分析中，糖有两类衍生物[16]，一类是三甲基硅醚衍生物，是通过糖在吡啶或二甲基亚砜等非水溶剂中与六甲基二硅烷，三甲基氯硅烷，双三甲基硅烷基乙酰胺，三氟甲磺酸三甲基硅酯等反应形成，这类衍生物容易制取并具有较强挥发性。
另一类糖衍生物是醋酸衍生物，包括三氟醋酸盐多羟基醇衍生物，三氟醋酸多羟基醇衍生物，醋酸乙醛肟衍生物，醋酸腈衍生物等。
气相色谱分析法常用的色谱柱有填充柱和毛细管色谱柱，近年来，随着多程序升温技术的完善，石英毛细管柱应用更为普遍，在糖分析中主要采用AT-1701、DB-1701、HP-1701、OV-1701、OV-17、OV- 225、 SE-30、SE-33、SE-52、DB-1等[17]。
被分离产物的检测常采用灵敏度高、选择性好的检测器，最常用的氢火焰离子化检测器(hydrogen flameionization detector，FID)，具有最高的选择性和灵敏度。此外也用到火焰光度检测器(flame photometricdetector，FPD)、电子捕获检测器(electron capturedetector，ECD)、质谱检测器(MS)等[18]。3.2.2
液相色谱法(HPLC)
糖的高效液相色谱分析方法已成为常规分析方法。可对单糖和寡糖进行常量和微量分析。高效液相色谱分析糖类化合物色谱柱一般采用氨基键合固定相，可用于分离一般的单糖、寡糖等。常用的氨基键合色谱柱有碳水化合物柱、Amino-sil-X-1、Lichroeorb-NH2、Hypersil NH2、Polygosil 60-5NH2、YMG-NH2、Amide-80、ZORBAX氨基柱等。乙腈和水通常可作为流动相，糖的保留时间随水的比例减少而减少[16]。C18和C8硅烷色谱柱也常用于糖分析。此外，阳离子交换柱也可用
定量限0.01mg/ml[8]
[15]
硫酸-蒽酮法检测限10μg/ml
※专题论述食品科学
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于糖分析，一般是以聚苯乙烯型阳交换色谱树脂制作，有H+型、Ca2+、Ag+、Pb2+等离子型。一般以水作流动相，在较高温度(75～85℃)下，分离效果较好[18]。
HPLC常用的检测器有示差折光检测器(differentialrefractometers，RI)、蒸发光检测器(evaporative lightscattering detector，ELSD)、紫外检测器(ultravioletdetector，UV)、荧光检测器(fluorescence detector，FLD)、电化学检测器(electrochemical detector，ED)等。RI检测器具有样品毋需衍生化、操作简单、稳定性高等优点，但存在灵敏度偏低、不适合梯度洗脱、受流速和温度影响大等缺点；ELSD是一种质量检测器，其灵敏度比RI检测器高；UV检测器主要用于在190～210nm有紫外吸收的非衍生醛糖、酮糖、二糖和脱氧糖等，二级管阵列检测器(photodiode array detector，PDA)是紫外-可见光检测器中的一种，二者灵敏度远高于RI和ELSD检测器；FLD是利用物质的荧光吸收而实现检测，灵敏度更高[19]。
由于糖类不具有紫外吸收和荧光吸收，需对其进行衍生化处理。检测极限可达到pmol～ amol级，可比RI检测器灵敏度提高1000倍。常用的糖类紫外衍生化试剂有2,4-二硝基苯、对甲氧基苯胺、2-氨基吡啶、6-氨基喹啉、苯甲酸、对氨基苯甲酸乙酷、3-甲基-1-苯基-2吡唑琳酮、苯甲酰氯等。另外糖醇可以对硝基苯甲酰氯(p-nitrobenzoyl chloride)衍生后可在260nm检测，肌醇在以异氰酸苯酯(phenyl isocyanate)衍生后在240nm处可检测[16]。
作为荧光检测的衍生化试剂主要有2-氨基吡啶、芴甲基羟基肼、邻氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺、2,3-二氨基萘、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、乙酰乙酰苯胺、3-(4-羧基苯甲酰基)-2-喹啉羧基醛、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸、1-氨基芘-3,6,8-三磺酸、7-氨基-萘磺酸、四甲基若丹明等[16,20]。3.2.3
高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测
糖是一种多羟基醛或多羟基酮化合物，具有弱酸
本核，具较好的流动性和较小反向压力。常见商业色谱柱有CatrboPac PA1(单糖、双糖和低聚糖)、C a t r bo P a c PA10(单糖、双糖)、CatrboPac PA20(单糖，双糖的快速分析)，另有分析低聚糖的CatrboPac PA100、CatrboPac PA200等。3.2.4SEC)
体积排除色谱方法，通常是一种对分子量大于2000的物质按其分子尺寸大小进行分离的技术，又分为有机相的凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)和水相的凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography，GFC)。有时也统称凝胶渗透色谱(GPC)。SEC法主要用于多糖分离和分子量测定，常用的商业凝胶色谱柱产品主要有Tsk gel G2000 pwxl～6000pwxl、Ionpak S-801～806、Ohpak Q801～806、Seheron P40～P10000、PL-GFC300～4000、 Toyopearl 系列、Asahipak GS Gel等[17]。
用相应的多糖作标准品，也可同时实现多糖的含量测定[26-27]，现有文献报道一般是采用葡聚糖标准，如采用单糖组成和分子量都比较接近的标准品，结果会更准确。3.2.5
薄层色谱 (TLC)
薄层色谱又叫薄层层析，是根据样品组分与吸附剂的吸附力及其在展层溶剂中的分配系数的不同而使混合物分离。薄层层析对设备要求不高，分离效果好、操作简便、分离速度快(1～3h)、样品需要量较少(500ng～1μg)，纸色谱因分离时间和样品量均处劣势，逐渐淘汰[28]。
邓国栋等[29]以双波长薄层扫描技术测定了一种茶叶多糖的单糖组成。建立了单糖浓度和斑点面积的定量关系，以此对样品中各单糖作定量分析，并对阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖检测限可达1.2μg。TLC方法还可以实现糖醇[30]、寡糖等[31]分析，检测限都可达到μg级别。利用高效薄层色谱(high per-formance thin layer chromatograph，HPTLC)，进行薄层扫描，检测限可达到ng级[31]。3.3
毛细管电泳法
毛细管电泳也称为高效毛细管电泳(high performancecapillary electrophoresis，HPCE)，是一种利用带电粒子在高压直流电场中迁移速度的不同而分离的分析方法。又分为单根毛细管、单根填充管、阵列毛细管电泳、芯片式毛细管电泳、毛细管电泳联用技术等五大类。毛细管电泳具有仪器相对简单，消耗的样品很少等优点，可直接测定单糖和部分寡糖含量，并能间接测定单糖、寡糖和多糖的组成。由于单糖pKa超过11，单糖在强碱性缓冲液中带负电荷，在复合电场中能进一步分离。为使单糖在较低的pH值条件下带上电荷，常用硼砂做
体积排除色谱(size exclusion chromatography，
性，当pH12～14时，会发生解离，故能被阴离子交换树脂保留，用pH值大于12的碱性溶液淋洗，可实现糖的分离，再以脉冲安培检测器(PAD)检测，以峰保留时间定性，以峰高外标法定量。PAD在选择性，灵敏度和梯度洗脱等方面优于RI和ELSD，样品不必经过柱前和柱后衍生等复杂的处理手段，RI适合于检测含量较高的糖(参考检测范围为0.011～71g/L)，而PAD则适合检测微量至痕量的糖(检测限可达10μg/L)[19]。由于优越性明显，在近20年来HPAEC-PAD方法正成为当前糖含量和单糖组成分析的一个新趋势[21-25]。
美国戴安公司在给领域取得领先，成功开发了系列糖分析柱，均是以大尺寸二乙基-苯乙烯聚合物作为基
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食品科学
表２ 色谱法测定多糖含量
※专题论述
Table 2 Chromatogarphic methods for quantitative determination of polysaccharides
样品香烟中单糖
样品制备
乙醇浸提，蒸干；吡啶溶解，加热回流，冷却，过滤，定容
测定方法GC-FID硅醚化反应Ultra-2型色谱柱GCTMS衍生DB-5毛细管柱
GC-MS
经糖肟和醋酸酐共热后形成糖
腈乙酸酯衍生物Supelco SPB-50色谱柱HPLC-RI
流动相：纯水，柱温：65℃，流速：0.5ml/min Eurokat Pb色谱柱HPLC-RI
流动相：纯水，柱温：85℃，流速：0.5ml/minAminex HPX-87P色谱柱
HPLC-UV流动相：乙睛/水氨基苯乙酯柱前衍生
RP-HPLC-UV
流动相：醋酸钠缓冲液-乙睛-甲醇氨基苯乙酯柱前衍生Pico-Tag色谱柱
SAX-HPLC-荧光检测器
流动相：NaCl2-氰基乙酰胺柱后衍生
Sepherisorb 5-SAX色谱柱
HPLC-ESI-MS
流动相：乙睛/蚁酸/水Cyclobond I 2000色谱柱
HPAEC-PAD
流动相：NaOH/H2O梯度CarboPac PA1色谱柱
HPAEC-PAD
流动相：NaOH等梯度
激光偏振器进行旋光检测CarboPac PA1 色谱柱流动相：NaOH/NaOCH3梯度
CarboPac PA1色谱柱HPAEC-比色检测CarboPac PA1色谱柱
HPAEC-PAD
流动相：0.25mol/L NaOH/1mol/LNaOAc / H2O
等梯度CarboPac PA20色谱柱HPGPC
流动相：0.1mol/L KCl，流速：0.3ml/min；
Ultrahydrogel 250色谱柱，柱温：40℃GPC
流动相：0.1mol/L NaNO3，流速：0.3ml/min；
TSK-GEL G3000SW 柱，
柱温：35℃
TLC
薄层板：硅胶G与0.2mol/L NaH2PO4，二次展开
显色剂：苯胺-草酸溶液
TLC
薄层板：WhatmanK6 20×20cm，
二次展开
显色：碱性AgNO3浸润程序
HPTLC
衍生物：4-氨基苯甲酸试剂
扫描波长：400nm
检测限：50pmol能分离11种的糖残基11种单糖的检测限在5～25ng/ml
备注
参考文献[32]
担子菌多糖盐酸和TFA水解, 减压蒸馏，挥干[33]
游离单糖乙醇浸泡，超声，减压蒸干
[34]
微生物胞外多糖非淀粉多糖
H2SO4水解，加热，中和，过滤，柱层析
H2SO4水解
检测限：0.122mmol/L[35]
[36][37]
寡糖标准酶消化
糖蛋白TFA酸水解
检测限：50pmol；
同时分析中性和氨基糖。[38]
检测限20ng,
[39]
K4杆菌属之大肠杆菌
新的寡糖标准溶解于水
检测限50pg[40]
不同的食品样品酶水解
回收率可达94.9%～105%[21]
细菌荚膜多糖TFA酸水解
同时使用电化学和旋光检测，实现糖对映体检测
[22]
玉米糖浆在Ca型阳离子交换树脂上水解
HPAEC-PAD[23]
半乳糖醛酸寡聚体标准混合物多糖和半纤维素
高压釜水解/HCl
检测限0.1μg[24]
同时检测单糖和糖醛酸；
检测限：2.5～14.4mg/L[25]检测限：2～16mg/ml；定量限：7～32mg/ml
[26]
果汁及白酒多糖离心
中药多糖过滤、离心、柱层析
定量限：5μg/μl[27]
茶叶多糖硫酸封管水解
检测限：1.2μg[29]
糖和糖醇
检测限：1.0μg[30]
寡糖水溶解检测限：5ng[31]
※专题论述食品科学
表３ 电泳法测定多糖含量
2009, Vol. 30, No. 21447
Table 3 Electrophoresis methods for quantitative determination of polysaccharides
样品市售饮料中糖类物质枣中糖类物质植物细胞壁多糖荚膜多糖K4及衍生物K4d
样品制备0.22μm滤膜过滤，
NaOH稀释热水浸提，过滤，浓缩三氟乙酸水解K4通过酸处理(pH 3.0)去果糖
确定方法
CE-EC石英毛细管: 80cm×30μmLC-3D型微电流检测器电压：20kVCE-EC石英毛细管：65cm×25μmCH1812 电化学分析仪进样电压：2 5 kVPA-CGE衍生方法：寡糖和单糖分别
以 ANTS和2-AMAC衍生FACE衍生：2-AMAC；检测波长：
200nm；电压20kVFACE衍生方法：2-AMACMicrochip CE激光诱导荧光检测；衍生：NBD-F微芯片规格12.5×33.5mm
检测限分别为500fmol和100fmol检测限：K4：0.5～1μgK4d：0.1～0.2μg
检测限：50ng，回收率大于85%
检出质量限：0.6fmol定量限：0.8fmol
[45][46][47][48]
备注
葡萄糖、果糖、蔗糖的浓度检出限分别为1×10-6、2×10-6、5×10-6mol/L蔗糖、葡萄糖和果糖的检测限分别为
0.78、0.46 和0.71μmol/L
[44][43]参考文献
人血浆硫酸软骨素冻干，Tris-HCl再生，加蛋白酶孵化，煮沸，膜过滤
氨基糖
碳酸氢钠溶解，加四氢硼酸钠，离子交换，水、氨水洗涤，蒸干氨水液得单糖醇
电泳介质。为改善分离效率，常将一些表面活性剂，
如SDS、四氢呋喃、十六烷基乳酸酯、十六烷基三甲基溴化铵和丙酰溴等添加进缓冲液[20]。
毛细管电泳有UV或光激发荧光检测法(laser inducedfluorescence detector，LIF)、EC、MS、核磁共振检测(nuclear magnetic resonance，NMR)。紫外和荧光检测，常需要衍生化处理，衍生化方法在GC和HPLC部分已有描述，这些方法也适合于CE 分离和糖分析。毛细管电泳的检测限可达到fmol～amol(即10-12～10-10mol)数量级[41]。
芯片毛细管电泳(microchip capillary electrophoresis，CCE)是一种新的微量分析技术，其分离通道、反应容器及检测器收集在一芯片中，只有几个平方厘米的大小。样品的分离、检测等所有程序，能同时完成。与CE相比，具有通道短、散热性能好、样品用量很少(pl)、分析速度更快的特点。常用的检测方式是激光诱导荧光检测，微芯片毛细管电泳灵敏度可达10～10mol/L。
毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis，CGE)主要包括聚丙烯酰胺毛细管凝胶电泳PA-CGE和琼脂糖
[7]
-10
-12
[42]
生物传感器法利用酶的专一性反应，能实现糖的快速分析。葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等糖类的快速分析生物传感器已较成熟，检测限可达3.5×10-5mol/L[51]。
此外，糖分析还有其他一些方法，随着检测仪器不断革新升级，多糖含量检测方法趋于多样化。多糖含量检测总的发展趋势是使检测过程更简便、快速、准确、实现痕量检测、在线检测及更多反应结构信息等。
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其他方法
红外光谱定量分析多糖是通过对特征吸收谱带强度
的测量来求出组份含量。其理论依据是朗伯-比耳定律。定量分析方法可用标准曲线法、求解联立方程法等方法进行定量分析。利用傅里叶变换红外光谱估测多糖含量时[49]，一般认为糖量的特征波在970cm 和1182cm之间。Blakeney等[50]用近红外反射光谱测定了谷物中非淀粉多糖，该方法快速、便宜，作为一种快速分析具有营养功能重要多糖的方法使用具有很大的潜力。
[15]
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※专题论述食品科学
2009, Vol. 30, No. 21443
多糖含量测定的研究进展
徐晓飞1,2，陈 健2,*
(1.南方李锦记有限公司，广东 广州 510620；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)摘 要：本文综述了多糖含量测定方法，主要包括化学法、气相色谱法、液相色谱法、阴离子交换色谱-脉冲安培检测、体积排除色谱、薄层色谱法、毛细管电泳法、红外光谱法等，这些方法可为多糖含量测定提供一定的参考，并为多糖的更深入研究提供部分理论基础。关键词：多糖；含量；测定；方法
Research Progress in Methods for Quantitative Determination of Polysaccharides
XU Xiao-fei1,2，CHEN Jian2,*
(1.Nanfang Lee Kum Kee Co. Ltd., Guangzhou 510620, China；2.College of Light Industry and Food Sciences,
South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)
Abstract ：With the purpose of offering useful guidance for the selection of an optimal method for quantitative determinationof polysaccharides in various samples, this paper reviews methods for quantitative determination of polysaccharides, mainlyincluding chemical assay, gas liquid chromatographic (GC) method, high pressure liquid chromatographic (HPLC) method, anionion exchange chromatographic (AEC) method, size exclusion chromatographic (SEC) method, thin layer chromatographic (TLC)method, capillary electrophoresis (EC) method, infrared spectroscopic (IR) method and so on.Key words：polysaccharides；content；determination；methods
中图分类号：TS201.23 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)21-0443-06
多糖(polysaccharides，PS)是由10个以上的单糖聚合而成的生物高分子。多糖包含均多糖(homosaccharide)和杂多糖(heterosaccharide)，前者是由同一种单糖组成，后者则是由两种以上不同的单糖组成。多糖除含有单糖外，还含有糖醛酸、氨基糖、糖醇、脱氧糖等基团。多糖按来源可分为动物多糖、植物多糖、微生物多糖和藻类多糖；按酸碱性可分为酸性多糖、中性多糖及碱性多糖；按溶解性可分水溶性多糖、水不溶性多糖、酸性多糖和碱性多糖等[1]。
多糖不仅是生物体必不可少的成分，而且还具有多种生理机能，如真菌多糖具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老等多种生物学活性，已被开发成多种药物和功能性食品添加剂[2]。在多糖工业生产过程中，常需对多糖的含量进行测量和监控，由于多糖的种类繁多，多糖含量和存在形式也多变，因此，选择适当的多糖分析方法十分重要。本文就多糖
收稿日期：2008-11-10
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD27B04)
含量分析的一些方法进行综述。１
多糖的提取
多糖提取方法有热水浸提法、酸提、碱提、有机
溶剂提取、酶法提取等，常以微波和超声波辅助强化。水溶性多糖可采用水提法，水不溶性多糖一般用碱或酸法提取，常用试剂有草酸铵、碳酸钠、氢氧化钠、三氟乙酸、稀盐酸等。影响多糖得率的因素主要是提取时间、浸提比、提取次数、温度、pH值、溶剂和搅拌等[3]。２
多糖的降解
为对多糖总量进行测定，常将多糖还原为单糖或寡糖。多糖的定性和定量组成可通过酸催化水解多糖成单糖或寡糖后再进行分析。甲醇分解、乙酰分解作用、甲醛分解作用、酶水解等方法也可用于多糖降解[4]。其
作者简介：徐晓飞(1979－)，男，工程师，硕士，主要从事食品生物技术方面的研究。E-mail：[email protected]*通讯作者：陈健(1967－)，男，副教授，博士，主要从事食品化学、天然产物化学、生物分离技术等方面的研究。：
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食品科学※专题论述
中，酸水解最为常见，最常用的酸是盐酸、硫酸和三氟乙酸。如利用色谱方法进行检测，由于酸和盐往往干扰色谱分离，常需利用中和、沉淀、透析等形式消除干扰[5]。３3.1
多糖含量测定
硫酸-咔唑法主要用于糖醛酸的测定，多糖经水解氧化生成糖醛酸，在强酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，各中性单糖在0.04～0.32mg/ml，糖醛酸在0.01～0.08mg/ml范围内，其浓度与咔唑法检测吸收值呈线性，可定量测定。糖的存在，可使糖醛酸含量偏高，采用改进的含量测定方法，可在一定程度上消除糖的干扰[11]。
此外，滴定法(包括斐林氏滴定法、间接碘量滴定法、氧化还原滴定法等)也常用于糖类分析[12]。化学法测定多糖含量获得的往往是总的多糖含量，无具体单糖组成细节，但由于操作简单，成本低，仍有广泛应用。3.23.2.1
色谱法
气相色谱法(GC)
化学法
苯酚-硫酸法是测定多糖最常用的一种方法。多糖在浓硫酸作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，并通过比色法确定含量，该方法具有操作简单、快速、重复性好，显色后稳定性较好等优点，但对有色样品结果易偏高[6]。
多糖可用与其组成结构相近的多糖作标准曲线。但更多的情况下是以相应的单糖作标准，此时，需以0.9的转化系数校正。对于均多糖, 可直接以其组成糖作标准曲线。而对于由不同糖残基构成的杂多糖，则需根据k'=Σki'awi计算校正系数k'，式中，awi为组成糖i 的重量百分含量，ki'为其相对于葡萄糖的校正系数[7]。苏颖等利用全波长酶标仪代替分光光度计测定虫草多糖含量，由于采用了96 孔板代替分光光度计比色杯，分析时间大大减少，并且误差也有所减少[8]。
蒽酮-硫酸法是多糖类在浓硫酸作用下水解、脱水，再与蒽酮结合成有色化合物，于最大吸收波长处测吸光度。蒽酮-硫酸法稳定性较差，宜新鲜配制并注意避光。此外，色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰[6]。
3,5-二硝基水杨酸(DNS)法是在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖加热后被还原生成氨基化合物，呈橘红色，比色测定糖含量。该法可测定还原糖和总糖含量，并通过多糖=总糖－还原糖，可获得多糖含量[9]
。该方法为半微量定糖法，简便、快速，适用于大量样品的测定。改良的DNS方法可使己糖和戊糖的混合糖样的分析结果更准确[10]。
表１ 化学法测定多糖含量
Table 1 Chemical assays for quantitative determination of
polysaccharides
样品槲寄生多糖茶叶多糖虫草多糖B型古巴流感疫苗总糖
6mol/L盐酸水解，中和，
当归多糖
测总糖；乙醇除杂，热水浸提，测还原糖
玉米秸秆总糖
加盐酸，沸水浴加热，中和，定容，过滤
DNS
定量限0.2mg/ml[10]
DNS
定量限0.2mg/ml
[9]
样品制备热水浸提，过滤，离心，醇沉
80%乙醇脱色，75℃热水浸提，过滤，离心，醇沉，干燥
脱酯，沸水浸提，离心，浓缩，醇沉
测定方法苯酚硫酸法苯酚硫酸法改良苯酚-硫酸法
备注定量限4μg检测限10μg
参考文献[13][14]
气相色谱法可定性、定量分析多糖的组分和含量，一般是将多糖酸水解或甲醇醇解[16]，用衍生物法以增加其挥发性。
在GC分析中，糖有两类衍生物[16]，一类是三甲基硅醚衍生物，是通过糖在吡啶或二甲基亚砜等非水溶剂中与六甲基二硅烷，三甲基氯硅烷，双三甲基硅烷基乙酰胺，三氟甲磺酸三甲基硅酯等反应形成，这类衍生物容易制取并具有较强挥发性。
另一类糖衍生物是醋酸衍生物，包括三氟醋酸盐多羟基醇衍生物，三氟醋酸多羟基醇衍生物，醋酸乙醛肟衍生物，醋酸腈衍生物等。
气相色谱分析法常用的色谱柱有填充柱和毛细管色谱柱，近年来，随着多程序升温技术的完善，石英毛细管柱应用更为普遍，在糖分析中主要采用AT-1701、DB-1701、HP-1701、OV-1701、OV-17、OV- 225、 SE-30、SE-33、SE-52、DB-1等[17]。
被分离产物的检测常采用灵敏度高、选择性好的检测器，最常用的氢火焰离子化检测器(hydrogen flameionization detector，FID)，具有最高的选择性和灵敏度。此外也用到火焰光度检测器(flame photometricdetector，FPD)、电子捕获检测器(electron capturedetector，ECD)、质谱检测器(MS)等[18]。3.2.2
液相色谱法(HPLC)
糖的高效液相色谱分析方法已成为常规分析方法。可对单糖和寡糖进行常量和微量分析。高效液相色谱分析糖类化合物色谱柱一般采用氨基键合固定相，可用于分离一般的单糖、寡糖等。常用的氨基键合色谱柱有碳水化合物柱、Amino-sil-X-1、Lichroeorb-NH2、Hypersil NH2、Polygosil 60-5NH2、YMG-NH2、Amide-80、ZORBAX氨基柱等。乙腈和水通常可作为流动相，糖的保留时间随水的比例减少而减少[16]。C18和C8硅烷色谱柱也常用于糖分析。此外，阳离子交换柱也可用
定量限0.01mg/ml[8]
[15]
硫酸-蒽酮法检测限10μg/ml
※专题论述食品科学
2009, Vol. 30, No. 21445
于糖分析，一般是以聚苯乙烯型阳交换色谱树脂制作，有H+型、Ca2+、Ag+、Pb2+等离子型。一般以水作流动相，在较高温度(75～85℃)下，分离效果较好[18]。
HPLC常用的检测器有示差折光检测器(differentialrefractometers，RI)、蒸发光检测器(evaporative lightscattering detector，ELSD)、紫外检测器(ultravioletdetector，UV)、荧光检测器(fluorescence detector，FLD)、电化学检测器(electrochemical detector，ED)等。RI检测器具有样品毋需衍生化、操作简单、稳定性高等优点，但存在灵敏度偏低、不适合梯度洗脱、受流速和温度影响大等缺点；ELSD是一种质量检测器，其灵敏度比RI检测器高；UV检测器主要用于在190～210nm有紫外吸收的非衍生醛糖、酮糖、二糖和脱氧糖等，二级管阵列检测器(photodiode array detector，PDA)是紫外-可见光检测器中的一种，二者灵敏度远高于RI和ELSD检测器；FLD是利用物质的荧光吸收而实现检测，灵敏度更高[19]。
由于糖类不具有紫外吸收和荧光吸收，需对其进行衍生化处理。检测极限可达到pmol～ amol级，可比RI检测器灵敏度提高1000倍。常用的糖类紫外衍生化试剂有2,4-二硝基苯、对甲氧基苯胺、2-氨基吡啶、6-氨基喹啉、苯甲酸、对氨基苯甲酸乙酷、3-甲基-1-苯基-2吡唑琳酮、苯甲酰氯等。另外糖醇可以对硝基苯甲酰氯(p-nitrobenzoyl chloride)衍生后可在260nm检测，肌醇在以异氰酸苯酯(phenyl isocyanate)衍生后在240nm处可检测[16]。
作为荧光检测的衍生化试剂主要有2-氨基吡啶、芴甲基羟基肼、邻氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺、2,3-二氨基萘、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、乙酰乙酰苯胺、3-(4-羧基苯甲酰基)-2-喹啉羧基醛、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸、1-氨基芘-3,6,8-三磺酸、7-氨基-萘磺酸、四甲基若丹明等[16,20]。3.2.3
高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测
糖是一种多羟基醛或多羟基酮化合物，具有弱酸
本核，具较好的流动性和较小反向压力。常见商业色谱柱有CatrboPac PA1(单糖、双糖和低聚糖)、C a t r bo P a c PA10(单糖、双糖)、CatrboPac PA20(单糖，双糖的快速分析)，另有分析低聚糖的CatrboPac PA100、CatrboPac PA200等。3.2.4SEC)
体积排除色谱方法，通常是一种对分子量大于2000的物质按其分子尺寸大小进行分离的技术，又分为有机相的凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)和水相的凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography，GFC)。有时也统称凝胶渗透色谱(GPC)。SEC法主要用于多糖分离和分子量测定，常用的商业凝胶色谱柱产品主要有Tsk gel G2000 pwxl～6000pwxl、Ionpak S-801～806、Ohpak Q801～806、Seheron P40～P10000、PL-GFC300～4000、 Toyopearl 系列、Asahipak GS Gel等[17]。
用相应的多糖作标准品，也可同时实现多糖的含量测定[26-27]，现有文献报道一般是采用葡聚糖标准，如采用单糖组成和分子量都比较接近的标准品，结果会更准确。3.2.5
薄层色谱 (TLC)
薄层色谱又叫薄层层析，是根据样品组分与吸附剂的吸附力及其在展层溶剂中的分配系数的不同而使混合物分离。薄层层析对设备要求不高，分离效果好、操作简便、分离速度快(1～3h)、样品需要量较少(500ng～1μg)，纸色谱因分离时间和样品量均处劣势，逐渐淘汰[28]。
邓国栋等[29]以双波长薄层扫描技术测定了一种茶叶多糖的单糖组成。建立了单糖浓度和斑点面积的定量关系，以此对样品中各单糖作定量分析，并对阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖检测限可达1.2μg。TLC方法还可以实现糖醇[30]、寡糖等[31]分析，检测限都可达到μg级别。利用高效薄层色谱(high per-formance thin layer chromatograph，HPTLC)，进行薄层扫描，检测限可达到ng级[31]。3.3
毛细管电泳法
毛细管电泳也称为高效毛细管电泳(high performancecapillary electrophoresis，HPCE)，是一种利用带电粒子在高压直流电场中迁移速度的不同而分离的分析方法。又分为单根毛细管、单根填充管、阵列毛细管电泳、芯片式毛细管电泳、毛细管电泳联用技术等五大类。毛细管电泳具有仪器相对简单，消耗的样品很少等优点，可直接测定单糖和部分寡糖含量，并能间接测定单糖、寡糖和多糖的组成。由于单糖pKa超过11，单糖在强碱性缓冲液中带负电荷，在复合电场中能进一步分离。为使单糖在较低的pH值条件下带上电荷，常用硼砂做
体积排除色谱(size exclusion chromatography，
性，当pH12～14时，会发生解离，故能被阴离子交换树脂保留，用pH值大于12的碱性溶液淋洗，可实现糖的分离，再以脉冲安培检测器(PAD)检测，以峰保留时间定性，以峰高外标法定量。PAD在选择性，灵敏度和梯度洗脱等方面优于RI和ELSD，样品不必经过柱前和柱后衍生等复杂的处理手段，RI适合于检测含量较高的糖(参考检测范围为0.011～71g/L)，而PAD则适合检测微量至痕量的糖(检测限可达10μg/L)[19]。由于优越性明显，在近20年来HPAEC-PAD方法正成为当前糖含量和单糖组成分析的一个新趋势[21-25]。
美国戴安公司在给领域取得领先，成功开发了系列糖分析柱，均是以大尺寸二乙基-苯乙烯聚合物作为基
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食品科学
表２ 色谱法测定多糖含量
※专题论述
Table 2 Chromatogarphic methods for quantitative determination of polysaccharides
样品香烟中单糖
样品制备
乙醇浸提，蒸干；吡啶溶解，加热回流，冷却，过滤，定容
测定方法GC-FID硅醚化反应Ultra-2型色谱柱GCTMS衍生DB-5毛细管柱
GC-MS
经糖肟和醋酸酐共热后形成糖
腈乙酸酯衍生物Supelco SPB-50色谱柱HPLC-RI
流动相：纯水，柱温：65℃，流速：0.5ml/min Eurokat Pb色谱柱HPLC-RI
流动相：纯水，柱温：85℃，流速：0.5ml/minAminex HPX-87P色谱柱
HPLC-UV流动相：乙睛/水氨基苯乙酯柱前衍生
RP-HPLC-UV
流动相：醋酸钠缓冲液-乙睛-甲醇氨基苯乙酯柱前衍生Pico-Tag色谱柱
SAX-HPLC-荧光检测器
流动相：NaCl2-氰基乙酰胺柱后衍生
Sepherisorb 5-SAX色谱柱
HPLC-ESI-MS
流动相：乙睛/蚁酸/水Cyclobond I 2000色谱柱
HPAEC-PAD
流动相：NaOH/H2O梯度CarboPac PA1色谱柱
HPAEC-PAD
流动相：NaOH等梯度
激光偏振器进行旋光检测CarboPac PA1 色谱柱流动相：NaOH/NaOCH3梯度
CarboPac PA1色谱柱HPAEC-比色检测CarboPac PA1色谱柱
HPAEC-PAD
流动相：0.25mol/L NaOH/1mol/LNaOAc / H2O
等梯度CarboPac PA20色谱柱HPGPC
流动相：0.1mol/L KCl，流速：0.3ml/min；
Ultrahydrogel 250色谱柱，柱温：40℃GPC
流动相：0.1mol/L NaNO3，流速：0.3ml/min；
TSK-GEL G3000SW 柱，
柱温：35℃
TLC
薄层板：硅胶G与0.2mol/L NaH2PO4，二次展开
显色剂：苯胺-草酸溶液
TLC
薄层板：WhatmanK6 20×20cm，
二次展开
显色：碱性AgNO3浸润程序
HPTLC
衍生物：4-氨基苯甲酸试剂
扫描波长：400nm
检测限：50pmol能分离11种的糖残基11种单糖的检测限在5～25ng/ml
备注
参考文献[32]
担子菌多糖盐酸和TFA水解, 减压蒸馏，挥干[33]
游离单糖乙醇浸泡，超声，减压蒸干
[34]
微生物胞外多糖非淀粉多糖
H2SO4水解，加热，中和，过滤，柱层析
H2SO4水解
检测限：0.122mmol/L[35]
[36][37]
寡糖标准酶消化
糖蛋白TFA酸水解
检测限：50pmol；
同时分析中性和氨基糖。[38]
检测限20ng,
[39]
K4杆菌属之大肠杆菌
新的寡糖标准溶解于水
检测限50pg[40]
不同的食品样品酶水解
回收率可达94.9%～105%[21]
细菌荚膜多糖TFA酸水解
同时使用电化学和旋光检测，实现糖对映体检测
[22]
玉米糖浆在Ca型阳离子交换树脂上水解
HPAEC-PAD[23]
半乳糖醛酸寡聚体标准混合物多糖和半纤维素
高压釜水解/HCl
检测限0.1μg[24]
同时检测单糖和糖醛酸；
检测限：2.5～14.4mg/L[25]检测限：2～16mg/ml；定量限：7～32mg/ml
[26]
果汁及白酒多糖离心
中药多糖过滤、离心、柱层析
定量限：5μg/μl[27]
茶叶多糖硫酸封管水解
检测限：1.2μg[29]
糖和糖醇
检测限：1.0μg[30]
寡糖水溶解检测限：5ng[31]
※专题论述食品科学
表３ 电泳法测定多糖含量
2009, Vol. 30, No. 21447
Table 3 Electrophoresis methods for quantitative determination of polysaccharides
样品市售饮料中糖类物质枣中糖类物质植物细胞壁多糖荚膜多糖K4及衍生物K4d
样品制备0.22μm滤膜过滤，
NaOH稀释热水浸提，过滤，浓缩三氟乙酸水解K4通过酸处理(pH 3.0)去果糖
确定方法
CE-EC石英毛细管: 80cm×30μmLC-3D型微电流检测器电压：20kVCE-EC石英毛细管：65cm×25μmCH1812 电化学分析仪进样电压：2 5 kVPA-CGE衍生方法：寡糖和单糖分别
以 ANTS和2-AMAC衍生FACE衍生：2-AMAC；检测波长：
200nm；电压20kVFACE衍生方法：2-AMACMicrochip CE激光诱导荧光检测；衍生：NBD-F微芯片规格12.5×33.5mm
检测限分别为500fmol和100fmol检测限：K4：0.5～1μgK4d：0.1～0.2μg
检测限：50ng，回收率大于85%
检出质量限：0.6fmol定量限：0.8fmol
[45][46][47][48]
备注
葡萄糖、果糖、蔗糖的浓度检出限分别为1×10-6、2×10-6、5×10-6mol/L蔗糖、葡萄糖和果糖的检测限分别为
0.78、0.46 和0.71μmol/L
[44][43]参考文献
人血浆硫酸软骨素冻干，Tris-HCl再生，加蛋白酶孵化，煮沸，膜过滤
氨基糖
碳酸氢钠溶解，加四氢硼酸钠，离子交换，水、氨水洗涤，蒸干氨水液得单糖醇
电泳介质。为改善分离效率，常将一些表面活性剂，
如SDS、四氢呋喃、十六烷基乳酸酯、十六烷基三甲基溴化铵和丙酰溴等添加进缓冲液[20]。
毛细管电泳有UV或光激发荧光检测法(laser inducedfluorescence detector，LIF)、EC、MS、核磁共振检测(nuclear magnetic resonance，NMR)。紫外和荧光检测，常需要衍生化处理，衍生化方法在GC和HPLC部分已有描述，这些方法也适合于CE 分离和糖分析。毛细管电泳的检测限可达到fmol～amol(即10-12～10-10mol)数量级[41]。
芯片毛细管电泳(microchip capillary electrophoresis，CCE)是一种新的微量分析技术，其分离通道、反应容器及检测器收集在一芯片中，只有几个平方厘米的大小。样品的分离、检测等所有程序，能同时完成。与CE相比，具有通道短、散热性能好、样品用量很少(pl)、分析速度更快的特点。常用的检测方式是激光诱导荧光检测，微芯片毛细管电泳灵敏度可达10～10mol/L。
毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis，CGE)主要包括聚丙烯酰胺毛细管凝胶电泳PA-CGE和琼脂糖
[7]
-10
-12
[42]
生物传感器法利用酶的专一性反应，能实现糖的快速分析。葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等糖类的快速分析生物传感器已较成熟，检测限可达3.5×10-5mol/L[51]。
此外，糖分析还有其他一些方法，随着检测仪器不断革新升级，多糖含量检测方法趋于多样化。多糖含量检测总的发展趋势是使检测过程更简便、快速、准确、实现痕量检测、在线检测及更多反应结构信息等。
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毛细管凝胶电泳(Agar-CGE)；毛细管联用主要包括毛细管电泳/质谱(CE-MS)、毛细管电泳/核磁共振(CE-NMR)和毛细管电泳/激光诱导荧光，或激光辅助糖电泳(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis，FACE)。毛细管电泳在糖分析的应用情况见表3。3.4
其他方法
红外光谱定量分析多糖是通过对特征吸收谱带强度
的测量来求出组份含量。其理论依据是朗伯-比耳定律。定量分析方法可用标准曲线法、求解联立方程法等方法进行定量分析。利用傅里叶变换红外光谱估测多糖含量时[49]，一般认为糖量的特征波在970cm 和1182cm之间。Blakeney等[50]用近红外反射光谱测定了谷物中非淀粉多糖，该方法快速、便宜，作为一种快速分析具有营养功能重要多糖的方法使用具有很大的潜力。
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448 2009, Vol. 30, No. 21
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