六-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)為兒茶酚胺(catecholamine)神經元的專一性神經毒素，長久以來被使用做為產生巴金森氏症動物模式。然而，其如何造成動物中腦黑質神經元退化的機制，雖然經過了多年的探討，但到目前為止尚未完全清楚。近年來有些學者認為神經毒素能誘發細胞凋亡(apoptosis)，是與立即早期反應基因c-fos及/或與神經性一氧化氮(NO)關係非常密切。本研究於是選擇了能破壞多巴胺神經元，造成動物產生類巴金森氏症之藥物6-OHDA，來探討大白鼠中腦黑質細胞退化及紋狀體可塑性的可能機制。
（一） 運用立體定位及免疫組織化學和組織化學技術，研究6-OHDA
對紋狀體及黑質區多巴胺造成的傷害及其可塑性，與c-fos及NO是否相關。
（二） 進一步研究神經毒素產生毒害黑質細胞造成細胞凋亡及紋狀
體可塑性的分子機制。
（三）找尋預防神經退化及神經細胞死亡的藥物或其它可行辦法。
三﹑研究設備器材
（一）實驗器材
1.大白鼠（Sprague-Dawley）體重200至250公克(國家實驗動物中心，台北市南港)
2.電動剃毛刀、電動鑽
3.立體定位儀(David-Koff, USA)
4.手術器材︰手術刀、鑷子、探針（以濃度百分之七十酒精浸泡消毒）、棉棒、消毒紗布、外科手術釘、外科手術剪
5.微量注射器、微量吸管
6.動物旋轉儀
7.冷凍切片機（Reichert-Jung 2880, Germany）
8.蓋玻片、載玻片、滴管、玻璃管、毛筆
9.光學顯微鏡及攝影設備(Optiphot-II, Nikon, Japan)
（二）實驗藥品
1. 麻醉藥（chloral hydrate）
2. 神經毒素（6-hydroxyldopamine, 6-OHDA）
3. 生理食鹽水（normal saline）
4. 甲基安非他命
5. 4﹪福馬林固定液
6. 30﹪蔗糖溶液
7. 包埋劑（O.C.T）
8. 0.1M磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液（phosphate buffer saline.
PBS）
9. 30﹪山羊血清（normal goat serum）
10. 0.04% triton X-100
11. 酪胺酸水解酵素(tyrosine hydroxylase, TH)
12. c-fos
13. reduced nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate
(NADPH,Sigma, St. Louis, MO., USA)
14. Nitro Blue Tetrazolium(NBT, Sigma, St. Louis, MO., USA)
15. 次級抗體（biotinylated goat anti-rabbit IgG, Vector Lab., CA,
USA）
16. 明膠（gelatin）
17. 0.5﹪甲基綠（methyl green）
18. 二甲苯（Xylene）
19. 70%、95﹪、100﹪酒精
20. 封片膠（Permount, Fisher Co., PA., USA）
21. avidin-biotin-peroxidase complex ABC (Vector Lab
USA)
, CA,
四﹑研究過程及方式
（一）實驗動物
大白鼠(Sprague-Dawley)體重200至250公克，飼養於室溫之動物室中。
（二）動物手術
實驗動物於手術前停止餵食物及水2小時，先將動物秤重並計算所需麻醉藥量(400毫克/100公克)，由腹腔注入麻醉藥後，將大白鼠放入籠內約5~10分鐘;待其深度麻醉後，即可用剃刀將其頭部上方的毛剃除。將老鼠置放於立體定位儀,首先以耳棒穿入外耳道，並將上下頷分開以固定夾將頭部水平固定。以優碘消毒其頭部後，再以70％酒精清洗乾淨，以手術刀劃開頭皮,並將皮下組織及肌肉清除，以十字縫為參考點，將針尖在十字縫的位置向右移動1.2毫米，並向後移動4.5毫米，其下便為內側前腦束上方（medial forebrain bundle, MFB）之所在,即為入針的位置。以電鑽接上小鑽頭將頭骨鑽開。需以探針看是否已將頭骨鑽開;否則易鑽破硬腦膜及腦組織。將微量注射器以硬腦膜為參考點向下插至7.8毫米的MFB處，以每分鐘1微升的速度注入4微升可破壞兒茶酚胺的神經毒素6-OHDA，注射完後等5分鐘，才將注射器向上旋出，以減輕腦內壓力過大將所注入毒物壓擠出。注射後，將動物頭皮縫合，並打上耳號，擦上優碘即完成手術步驟。對照組微量注射器內的藥品改以溶解藥物含0.02％維他命C磷酸鹽緩衝液代替。
（三）測試動物注入6-OHDA後的運動行為反應
手術後的大白鼠送回動物室飼養3 天及2週後，測試手術是否成功。由老鼠的腹腔注入安非他命（5毫克/100公克），令其在動物旋轉儀中旋轉。由電腦紀錄轉圈數，判斷手術位置是否正確。
（四）犧牲動物
準備約200毫升的生理食鹽水及500毫升含4％福馬林的固定液(甲醛溶解在0.1莫耳，酸鹼度7.4磷酸鹽緩衝液)，分開置放於通風煙櫥中。由大白鼠的腹腔注入過量麻醉劑，待老鼠深度麻醉後，在通風煙櫥內將大白鼠固定在木板上，夾起胸骨箭突處的毛皮並以剪刀剪開皮膚，夾起箭突，將胸骨剪斷，以手術剪沿著箭突兩側外緣肋軟處剪開，避免傷及內胸動脈。再以大型蚊狀手術鑷，夾住箭突，向外翻後，以小手術剪，剪開心包膜，露出心臟，用平滑手術鑷夾住心臟後，再以預先備妥內裝有生理鹽水的鈍型針頭插入左心室，深入到主動脈處，以小蚊狀鑷夾住針頭後，打開灌流幫浦，並將右心耳剪開，讓血液流出。待200毫升的生理食鹽水灌流完畢，將灌流幫浦接到福馬林固定液處並灌流。
（五）切片
所使用的是冷凍切片機；鼠腦由30％的蔗糖溶液取出後，先用刀片在左大腦上方輕劃一刀做記號。將鼠腦豎立在標本座的底座上；腦的周圍淋上包埋劑（O.C.T.，製作冷凍切片標本固定及保護）並放入攝氏零下二十度的切片機中，待其腦組織凝固至適當溫度，即可將標本座置放在切片機上，調整刀座及防卷片，進行冷凍切片（-20℃），切片厚度為30微米，並以毛筆將切片收集並保存於磷酸鹽緩衝生理鹽水溶液(0.1M, pH7.4, phosphate buffer saline《PBS》）中。切及黑質及紋狀體時，將切片厚度調至16微米，並直接以載玻片黏取，存於零下四度冰箱中，預做DAPI染色的準備。
（六）免疫組織化學(Immunohistochemistry)及組織化學反應
(histochemistry)
1. 免疫組織化學反應
實驗所用的免疫組織化學技術，採用自由懸浮法(Hsu, et al., 1981)。將保存於PBS中的切片先以PBS清洗2次（各約5分鐘）；
吸去PBS後，加入30％ normal goat serum及0.04％ triton X-100的PBS中（1％-GS-PBS-T）30分鐘；吸出後加入酥胺酸水解酵素 (TH, 1:1000)或 c-fos(1:5000-7000) 的初級抗體。置於室溫中輕微振盪，培養24小時。吸去初級抗體，以0.1M PBS洗2次；吸去PBS，加入次級抗體（biotinylated goat anti-rabbit IgG）於室溫中反應45分鐘後，吸去次級抗體，並以0.1M PBS洗2次；吸去PBS，加入avidin-biotin-peroxidase complex（ABC）試劑，於室溫下作用45分鐘，以0.1M PBS清洗1次，再加入Tris緩衝液（pH7.6），後以0.05％
3.3‘-diaminobenzidine（DAB）作為過氧酵素的基質，及含0.03％的過氧化氫作呈色反應（約10分鐘），標本經反應後會略呈棕紅色，至適當呈色反應後，吸出DAB反應液，加入蒸餾水清洗1~2次，再以0.1M PBS清洗2次。
2. 組織化學反應
煙鹼醯胺腺嘌呤二核咁磷酸去雙磷酸酵素
將經TH 或 c-fos免疫組織化學反應後的腦組織切片(進行雙重染色)，或未經染色的附近一組腦組織切片進行NOS 組織化學反應。將組織切片加入預先配妥每10 毫升 0.1M 磷酸鹽緩衝液(PBS, pH 7.4) 含10 毫克 reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) 及1.0毫克nitro blue tetrazolium 混合溶液，在攝氏37度下的水浴中反應30至60 分鐘。反應結束後，以0.1 M PBS清洗2至3次。
（七）鋪片與封片
鋪片的載玻片要事先即以明膠（gelatin）處理；處理過程如下：先將載玻片（75㎜×25㎜）浸入含有清潔劑的水中一小時，再用自來水沖洗一天後，放入經過濾後的明膠中，使其沾附於載玻片後，即可放入60℃的烤箱中，待其乾燥後，取出重覆浸入明膠再經烘乾後，再取出、冷卻後儲存備用。染好色的標本撈出置於裝有PBS的塑膠
盤內，依前後、左右順序將標本鋪於載玻片上。鋪好的載玻片置於烘片機以低溫烘乾，待其乾燥後即可行脫水、透明及封片步驟。
封片前還要進行對比染色及脫水與透明手續，先將載玻片浸入蒸餾水中2~3分鐘後，將多餘的鹽份清除，放入0.5％的甲基綠（methyl green）內約30秒到1分鐘，在以蒸餾水洗去多餘染色劑；並將標本進行退染步驟，把載玻片浸入含冰醋酸的70％酒精內，得適當退染。 因最後要用不與水互溶的二甲苯（xylene）進行透明作用；將退染後標本漸進放入70％（一次）、95％（二次）、100％（二次）的酒精中，每次2~3分鐘，進行脫水作用。最後放入二甲苯中（二次）使標本透明無水；即可以手術鑷夾起載玻片 ，置放於紙巾上。以滴了封片膠的蓋玻片緩緩蓋上標本，並擠出其中的小氣泡即可晾乾。待玻片晾乾後，即可以光學顯微鏡觀察，記錄並照相。
（八）統計分析
本實驗每隻動物以30微米厚度切片，切片保存於pH=7.4、0.1M PBS的試管中。試管總共30管，切片依序放入，每隔六管分成一組，共分為五組，選取三組分別進行TH、c-fos及NOS染色。在40倍物鏡視野下選取同一隻動物（各五片，相隔200微米）位於相似區域的紋狀體及黑質，計算其範圍內所有具陽性反應的細胞數總和。本實驗觀察計算所得神經細胞數目，以Student’s t-test 比較實驗側與對照側之差異。
五﹑研究結果
神經毒素6-OHDA注入MFB一小時後，將動物犧牲進行TH和c-fos組織免疫化學反應及NOS組織化學反應。結果發現c-fos在紋狀體及皮質區（由其梨狀皮質區）明顯地增加，而TH及NOS在紋狀體及黑質區其實驗側與對照側並無明顯差異。
神經毒素6-OHDA注入MFB三天後，施以皮下注射安非他命（5毫克/100克重）無法誘發大白鼠定向旋轉行為。大白鼠立即犧牲，發現實驗側紋狀體c-fos反應增強，而實驗側與對照側黑質區皆未發現含c-fos及NOS細胞。而TH在實驗側紋狀體反應明顯減弱，在黑質區的TH反應與對照側不俱明顯差異。
神經毒素6-OHDA注入MFB二星期以上後，施以皮下注射安非他命（5毫克/100克重）旋轉紀錄發現大白鼠逆時針定向旋轉，每分鐘達六次以上。大白鼠立即犧牲，發現實驗側紋狀體c-fos反應增強，而實驗側與對照側黑質區皆未發現含c-fos及NOS細胞。實驗側的紋狀體及黑質區TH反應都明顯降低。
表：黑質、紋狀體經6-OHDA注入MFB後動物旋轉次數、 TH、
c-fos及NOS神經元數目統計表
附註：計算黑質和紋狀體區TH、c-fos免疫組織化學反應及NOS
組織化學反應神經細胞體數目(平均值＋標準誤), 在40倍物鏡視野下選取同一隻動物(各五片標本，相隔200微米)位於相似區域的神經組織，計算其範圍具陽性反應神經胞體總合，以Student’s T-test比較實驗側與對照側之差異(*為p值＜0.05)；「※※※」表示未觀察；「＋」表示紋狀體中TH神經末梢的反應濃度。
六﹑討論及應用
神經毒素6-OHDA注入MFB三天後，TH在實驗側紋狀體反應明顯減弱，施以皮下注射安非他命（5毫克/100克重）無法誘發大白鼠定向旋轉行為，這乃由於實驗側紋狀體中多巴胺第一型受器(D1receptor)對於早期多巴胺神經末梢退化超敏感化(super sensitization)所致。在黑質區的TH反應與對照側尚不俱明顯差異；二星期以上後，施以皮下注射安非他命（5毫克/100克重）旋轉紀錄發現大白鼠逆時針定向旋轉，平均每小時達560次以上，且實驗側的紋狀體及黑質區TH反應都明顯降低，以上所得結果與本研究實驗室及國內外其他學者實驗結果相吻合。黑質區中的c-fos 與NOS無論在實驗組(實驗側與對照側)及對照組，各個時期均無改便，這結果顯示c-fos與NO與由6-OHDA誘發黑質區多巴胺神經元退化，可能沒有直接關係。實驗組c-fos在紋狀體不論神經毒素6-OHDA注入後之時間長短皆增加，這其中表示有三種意義，在第一小時為立即反應基因(immediate early gene)的表現；在第三天為立即反應基因與慢速反應基因(late response gene)同時存在；二十一天以後為慢速反應基因繼續表現。至於造成實驗組對照側c-fos也有表現的原因，可能是由於在注入6-OHDA時經由擴散到對側的內側前腦束使然。神經毒素6-OHDA誘發實驗組實驗側紋狀體中c-fos持續顯著的表現，這可能與紋狀體中其它神經傳遞物增加表現有密切關係。
七﹑結論
（一） 本研究結果發現NO與c-fos似乎和6-OHDA造成黑質神經
細胞退化無直接關聯。
（二） c-fos在黑質紋狀體系統損傷後，長時期持續增強表現，很可
能擔負紋狀體可塑性重要角色。
八﹑參考文獻及其他
1. 馬國興著，〔巴金森氏症蘭嶼豬模式之建立〕，國防醫學院碩士論
文，民國八十六年六月。
2. Barzilai, A., Kennedy, T. E., Sweatt, J. D. and Kandel E. R. and E. R.
Kandel, 5-HT modulates protein synthesis and the expression of specific proteins during long-term facilitation in Aplysis sensory neurons. Neuron 2:1577-1586, 1989.
3. Hantraye, P., E. Brouillet, R. Ferrante, S. Palfi, R. Dolan, R. T.
Matthews and M. F. Beal, Inhibition of neuronal nitric oxide synthase prevents MPTP-induced parkinsonism in baboons. Nature Med., 2:1017-1021, 1996.
4. Scallet, A. C., X. Ye, and S. F. Ali, NOS and c-fos in rat and mouse
brain regions: Possible relation to ibogain-induced Purkinje cell loss. Ann. NY. Acad. Sci., 801:227-238, 1996.
5. Snyer, S. H., No NO prevents parkinsonism, Nature Med., 2:965-966,
1996.
6. Wang, Y., S. D. Wang, S. Z. Lin and J. C. Liu, Restoration of
dopamine overflow and clearance from 6-hydroxydoapmine lesioned rat striatum and fetal mesencephalic grafts. J. Pharmacol. Exp. Ther., 261:403-411, 1994.
7. Ungerstedt, U., 6-hydroxydopamine induced degeneration of central
monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol., 5:107-110, 1968.
8. Zhou, F. C. and Y. S. Chiang, Excitochemical induced trophic
bridging directs axonal growth of transplanted neurons to distal target. Cell Transplant. 4:103-112, 1995.
六-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)為兒茶酚胺(catecholamine)神經元的專一性神經毒素，長久以來被使用做為產生巴金森氏症動物模式。然而，其如何造成動物中腦黑質神經元退化的機制，雖然經過了多年的探討，但到目前為止尚未完全清楚。近年來有些學者認為神經毒素能誘發細胞凋亡(apoptosis)，是與立即早期反應基因c-fos及/或與神經性一氧化氮(NO)關係非常密切。本研究於是選擇了能破壞多巴胺神經元，造成動物產生類巴金森氏症之藥物6-OHDA，來探討大白鼠中腦黑質細胞退化及紋狀體可塑性的可能機制。
（一） 運用立體定位及免疫組織化學和組織化學技術，研究6-OHDA
對紋狀體及黑質區多巴胺造成的傷害及其可塑性，與c-fos及NO是否相關。
（二） 進一步研究神經毒素產生毒害黑質細胞造成細胞凋亡及紋狀
體可塑性的分子機制。
（三）找尋預防神經退化及神經細胞死亡的藥物或其它可行辦法。
三﹑研究設備器材
（一）實驗器材
1.大白鼠（Sprague-Dawley）體重200至250公克(國家實驗動物中心，台北市南港)
2.電動剃毛刀、電動鑽
3.立體定位儀(David-Koff, USA)
4.手術器材︰手術刀、鑷子、探針（以濃度百分之七十酒精浸泡消毒）、棉棒、消毒紗布、外科手術釘、外科手術剪
5.微量注射器、微量吸管
6.動物旋轉儀
7.冷凍切片機（Reichert-Jung 2880, Germany）
8.蓋玻片、載玻片、滴管、玻璃管、毛筆
9.光學顯微鏡及攝影設備(Optiphot-II, Nikon, Japan)
（二）實驗藥品
1. 麻醉藥（chloral hydrate）
2. 神經毒素（6-hydroxyldopamine, 6-OHDA）
3. 生理食鹽水（normal saline）
4. 甲基安非他命
5. 4﹪福馬林固定液
6. 30﹪蔗糖溶液
7. 包埋劑（O.C.T）
8. 0.1M磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液（phosphate buffer saline.
PBS）
9. 30﹪山羊血清（normal goat serum）
10. 0.04% triton X-100
11. 酪胺酸水解酵素(tyrosine hydroxylase, TH)
12. c-fos
13. reduced nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate
(NADPH,Sigma, St. Louis, MO., USA)
14. Nitro Blue Tetrazolium(NBT, Sigma, St. Louis, MO., USA)
15. 次級抗體（biotinylated goat anti-rabbit IgG, Vector Lab., CA,
USA）
16. 明膠（gelatin）
17. 0.5﹪甲基綠（methyl green）
18. 二甲苯（Xylene）
19. 70%、95﹪、100﹪酒精
20. 封片膠（Permount, Fisher Co., PA., USA）
21. avidin-biotin-peroxidase complex ABC (Vector Lab
USA)
, CA,
四﹑研究過程及方式
（一）實驗動物
大白鼠(Sprague-Dawley)體重200至250公克，飼養於室溫之動物室中。
（二）動物手術
實驗動物於手術前停止餵食物及水2小時，先將動物秤重並計算所需麻醉藥量(400毫克/100公克)，由腹腔注入麻醉藥後，將大白鼠放入籠內約5~10分鐘;待其深度麻醉後，即可用剃刀將其頭部上方的毛剃除。將老鼠置放於立體定位儀,首先以耳棒穿入外耳道，並將上下頷分開以固定夾將頭部水平固定。以優碘消毒其頭部後，再以70％酒精清洗乾淨，以手術刀劃開頭皮,並將皮下組織及肌肉清除，以十字縫為參考點，將針尖在十字縫的位置向右移動1.2毫米，並向後移動4.5毫米，其下便為內側前腦束上方（medial forebrain bundle, MFB）之所在,即為入針的位置。以電鑽接上小鑽頭將頭骨鑽開。需以探針看是否已將頭骨鑽開;否則易鑽破硬腦膜及腦組織。將微量注射器以硬腦膜為參考點向下插至7.8毫米的MFB處，以每分鐘1微升的速度注入4微升可破壞兒茶酚胺的神經毒素6-OHDA，注射完後等5分鐘，才將注射器向上旋出，以減輕腦內壓力過大將所注入毒物壓擠出。注射後，將動物頭皮縫合，並打上耳號，擦上優碘即完成手術步驟。對照組微量注射器內的藥品改以溶解藥物含0.02％維他命C磷酸鹽緩衝液代替。
（三）測試動物注入6-OHDA後的運動行為反應
手術後的大白鼠送回動物室飼養3 天及2週後，測試手術是否成功。由老鼠的腹腔注入安非他命（5毫克/100公克），令其在動物旋轉儀中旋轉。由電腦紀錄轉圈數，判斷手術位置是否正確。
（四）犧牲動物
準備約200毫升的生理食鹽水及500毫升含4％福馬林的固定液(甲醛溶解在0.1莫耳，酸鹼度7.4磷酸鹽緩衝液)，分開置放於通風煙櫥中。由大白鼠的腹腔注入過量麻醉劑，待老鼠深度麻醉後，在通風煙櫥內將大白鼠固定在木板上，夾起胸骨箭突處的毛皮並以剪刀剪開皮膚，夾起箭突，將胸骨剪斷，以手術剪沿著箭突兩側外緣肋軟處剪開，避免傷及內胸動脈。再以大型蚊狀手術鑷，夾住箭突，向外翻後，以小手術剪，剪開心包膜，露出心臟，用平滑手術鑷夾住心臟後，再以預先備妥內裝有生理鹽水的鈍型針頭插入左心室，深入到主動脈處，以小蚊狀鑷夾住針頭後，打開灌流幫浦，並將右心耳剪開，讓血液流出。待200毫升的生理食鹽水灌流完畢，將灌流幫浦接到福馬林固定液處並灌流。
（五）切片
所使用的是冷凍切片機；鼠腦由30％的蔗糖溶液取出後，先用刀片在左大腦上方輕劃一刀做記號。將鼠腦豎立在標本座的底座上；腦的周圍淋上包埋劑（O.C.T.，製作冷凍切片標本固定及保護）並放入攝氏零下二十度的切片機中，待其腦組織凝固至適當溫度，即可將標本座置放在切片機上，調整刀座及防卷片，進行冷凍切片（-20℃），切片厚度為30微米，並以毛筆將切片收集並保存於磷酸鹽緩衝生理鹽水溶液(0.1M, pH7.4, phosphate buffer saline《PBS》）中。切及黑質及紋狀體時，將切片厚度調至16微米，並直接以載玻片黏取，存於零下四度冰箱中，預做DAPI染色的準備。
（六）免疫組織化學(Immunohistochemistry)及組織化學反應
(histochemistry)
1. 免疫組織化學反應
實驗所用的免疫組織化學技術，採用自由懸浮法(Hsu, et al., 1981)。將保存於PBS中的切片先以PBS清洗2次（各約5分鐘）；
吸去PBS後，加入30％ normal goat serum及0.04％ triton X-100的PBS中（1％-GS-PBS-T）30分鐘；吸出後加入酥胺酸水解酵素 (TH, 1:1000)或 c-fos(1:5000-7000) 的初級抗體。置於室溫中輕微振盪，培養24小時。吸去初級抗體，以0.1M PBS洗2次；吸去PBS，加入次級抗體（biotinylated goat anti-rabbit IgG）於室溫中反應45分鐘後，吸去次級抗體，並以0.1M PBS洗2次；吸去PBS，加入avidin-biotin-peroxidase complex（ABC）試劑，於室溫下作用45分鐘，以0.1M PBS清洗1次，再加入Tris緩衝液（pH7.6），後以0.05％
3.3‘-diaminobenzidine（DAB）作為過氧酵素的基質，及含0.03％的過氧化氫作呈色反應（約10分鐘），標本經反應後會略呈棕紅色，至適當呈色反應後，吸出DAB反應液，加入蒸餾水清洗1~2次，再以0.1M PBS清洗2次。
2. 組織化學反應
煙鹼醯胺腺嘌呤二核咁磷酸去雙磷酸酵素
將經TH 或 c-fos免疫組織化學反應後的腦組織切片(進行雙重染色)，或未經染色的附近一組腦組織切片進行NOS 組織化學反應。將組織切片加入預先配妥每10 毫升 0.1M 磷酸鹽緩衝液(PBS, pH 7.4) 含10 毫克 reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) 及1.0毫克nitro blue tetrazolium 混合溶液，在攝氏37度下的水浴中反應30至60 分鐘。反應結束後，以0.1 M PBS清洗2至3次。
（七）鋪片與封片
鋪片的載玻片要事先即以明膠（gelatin）處理；處理過程如下：先將載玻片（75㎜×25㎜）浸入含有清潔劑的水中一小時，再用自來水沖洗一天後，放入經過濾後的明膠中，使其沾附於載玻片後，即可放入60℃的烤箱中，待其乾燥後，取出重覆浸入明膠再經烘乾後，再取出、冷卻後儲存備用。染好色的標本撈出置於裝有PBS的塑膠
盤內，依前後、左右順序將標本鋪於載玻片上。鋪好的載玻片置於烘片機以低溫烘乾，待其乾燥後即可行脫水、透明及封片步驟。
封片前還要進行對比染色及脫水與透明手續，先將載玻片浸入蒸餾水中2~3分鐘後，將多餘的鹽份清除，放入0.5％的甲基綠（methyl green）內約30秒到1分鐘，在以蒸餾水洗去多餘染色劑；並將標本進行退染步驟，把載玻片浸入含冰醋酸的70％酒精內，得適當退染。 因最後要用不與水互溶的二甲苯（xylene）進行透明作用；將退染後標本漸進放入70％（一次）、95％（二次）、100％（二次）的酒精中，每次2~3分鐘，進行脫水作用。最後放入二甲苯中（二次）使標本透明無水；即可以手術鑷夾起載玻片 ，置放於紙巾上。以滴了封片膠的蓋玻片緩緩蓋上標本，並擠出其中的小氣泡即可晾乾。待玻片晾乾後，即可以光學顯微鏡觀察，記錄並照相。
（八）統計分析
本實驗每隻動物以30微米厚度切片，切片保存於pH=7.4、0.1M PBS的試管中。試管總共30管，切片依序放入，每隔六管分成一組，共分為五組，選取三組分別進行TH、c-fos及NOS染色。在40倍物鏡視野下選取同一隻動物（各五片，相隔200微米）位於相似區域的紋狀體及黑質，計算其範圍內所有具陽性反應的細胞數總和。本實驗觀察計算所得神經細胞數目，以Student’s t-test 比較實驗側與對照側之差異。
五﹑研究結果
神經毒素6-OHDA注入MFB一小時後，將動物犧牲進行TH和c-fos組織免疫化學反應及NOS組織化學反應。結果發現c-fos在紋狀體及皮質區（由其梨狀皮質區）明顯地增加，而TH及NOS在紋狀體及黑質區其實驗側與對照側並無明顯差異。
神經毒素6-OHDA注入MFB三天後，施以皮下注射安非他命（5毫克/100克重）無法誘發大白鼠定向旋轉行為。大白鼠立即犧牲，發現實驗側紋狀體c-fos反應增強，而實驗側與對照側黑質區皆未發現含c-fos及NOS細胞。而TH在實驗側紋狀體反應明顯減弱，在黑質區的TH反應與對照側不俱明顯差異。
神經毒素6-OHDA注入MFB二星期以上後，施以皮下注射安非他命（5毫克/100克重）旋轉紀錄發現大白鼠逆時針定向旋轉，每分鐘達六次以上。大白鼠立即犧牲，發現實驗側紋狀體c-fos反應增強，而實驗側與對照側黑質區皆未發現含c-fos及NOS細胞。實驗側的紋狀體及黑質區TH反應都明顯降低。
表：黑質、紋狀體經6-OHDA注入MFB後動物旋轉次數、 TH、
c-fos及NOS神經元數目統計表
附註：計算黑質和紋狀體區TH、c-fos免疫組織化學反應及NOS
組織化學反應神經細胞體數目(平均值＋標準誤), 在40倍物鏡視野下選取同一隻動物(各五片標本，相隔200微米)位於相似區域的神經組織，計算其範圍具陽性反應神經胞體總合，以Student’s T-test比較實驗側與對照側之差異(*為p值＜0.05)；「※※※」表示未觀察；「＋」表示紋狀體中TH神經末梢的反應濃度。
六﹑討論及應用
神經毒素6-OHDA注入MFB三天後，TH在實驗側紋狀體反應明顯減弱，施以皮下注射安非他命（5毫克/100克重）無法誘發大白鼠定向旋轉行為，這乃由於實驗側紋狀體中多巴胺第一型受器(D1receptor)對於早期多巴胺神經末梢退化超敏感化(super sensitization)所致。在黑質區的TH反應與對照側尚不俱明顯差異；二星期以上後，施以皮下注射安非他命（5毫克/100克重）旋轉紀錄發現大白鼠逆時針定向旋轉，平均每小時達560次以上，且實驗側的紋狀體及黑質區TH反應都明顯降低，以上所得結果與本研究實驗室及國內外其他學者實驗結果相吻合。黑質區中的c-fos 與NOS無論在實驗組(實驗側與對照側)及對照組，各個時期均無改便，這結果顯示c-fos與NO與由6-OHDA誘發黑質區多巴胺神經元退化，可能沒有直接關係。實驗組c-fos在紋狀體不論神經毒素6-OHDA注入後之時間長短皆增加，這其中表示有三種意義，在第一小時為立即反應基因(immediate early gene)的表現；在第三天為立即反應基因與慢速反應基因(late response gene)同時存在；二十一天以後為慢速反應基因繼續表現。至於造成實驗組對照側c-fos也有表現的原因，可能是由於在注入6-OHDA時經由擴散到對側的內側前腦束使然。神經毒素6-OHDA誘發實驗組實驗側紋狀體中c-fos持續顯著的表現，這可能與紋狀體中其它神經傳遞物增加表現有密切關係。
七﹑結論
（一） 本研究結果發現NO與c-fos似乎和6-OHDA造成黑質神經
細胞退化無直接關聯。
（二） c-fos在黑質紋狀體系統損傷後，長時期持續增強表現，很可
能擔負紋狀體可塑性重要角色。
八﹑參考文獻及其他
1. 馬國興著，〔巴金森氏症蘭嶼豬模式之建立〕，國防醫學院碩士論
文，民國八十六年六月。
2. Barzilai, A., Kennedy, T. E., Sweatt, J. D. and Kandel E. R. and E. R.
Kandel, 5-HT modulates protein synthesis and the expression of specific proteins during long-term facilitation in Aplysis sensory neurons. Neuron 2:1577-1586, 1989.
3. Hantraye, P., E. Brouillet, R. Ferrante, S. Palfi, R. Dolan, R. T.
Matthews and M. F. Beal, Inhibition of neuronal nitric oxide synthase prevents MPTP-induced parkinsonism in baboons. Nature Med., 2:1017-1021, 1996.
4. Scallet, A. C., X. Ye, and S. F. Ali, NOS and c-fos in rat and mouse
brain regions: Possible relation to ibogain-induced Purkinje cell loss. Ann. NY. Acad. Sci., 801:227-238, 1996.
5. Snyer, S. H., No NO prevents parkinsonism, Nature Med., 2:965-966,
1996.
6. Wang, Y., S. D. Wang, S. Z. Lin and J. C. Liu, Restoration of
dopamine overflow and clearance from 6-hydroxydoapmine lesioned rat striatum and fetal mesencephalic grafts. J. Pharmacol. Exp. Ther., 261:403-411, 1994.
7. Ungerstedt, U., 6-hydroxydopamine induced degeneration of central
monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol., 5:107-110, 1968.
8. Zhou, F. C. and Y. S. Chiang, Excitochemical induced trophic
bridging directs axonal growth of transplanted neurons to distal target. Cell Transplant. 4:103-112, 1995.