作者：汪杨 白雪源 魏日胞 陈香美
【关键词】 糖; 端粒; 细胞周期; 氧化应激; 衰老
衰老是在正常情况下随着年龄的增加引起各个器官功能障碍并最终引起机体死亡的不可避免的过程。一般来说，与易衰老的物种相比，较长寿的物种或个体其能量代谢率较低〔1〕。能量代谢主要包括糖、脂肪、蛋白质三大物质的代谢，而人体所需能量的70%是由糖的分解代谢提供。糖尿病最主要的临床表现就是餐后或(和) 空腹血糖的升高，而高血糖是引起代谢综合征(ms)的病理生理基础，老年糖尿病及其并发症等均与高血糖有关。但有关高血糖是否会促进衰老的研究较少〔2〕。衰老过程可发生在生物界的整体、种群、个体、细胞以及分子水平等不同的层次。根据目前已有的研究发现，高糖可以从多个水平促进衰老。
1 高糖能引起端粒的异常
端粒是位于染色体3′ 末端的一段富含g 的dna 重复序列，对染色体末端起着保护作用，能决定细胞的寿命，体外培养的细胞其端粒的长度随着细胞逐代相传而缩短，每复制一代即有50～200 bp 的dna 丢失，端粒丢失到一定程度即失去对染色体的保护作用，细胞随之发生衰老和死亡。而大部分永生化细胞系、肿瘤细胞、胚胎细胞和生殖细胞的端粒长度不随细胞分裂次数的增加而缩短，究其原因是由于端粒酶的存在，端粒酶维持着端粒的长度，使细胞寿命延长，并具有无限分裂的能力。端粒酶是由端粒酶rna 和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，通过识别并结合富含g 的端粒末端，以自身为模板，逆转录合成端粒。hayflick 〔3〕证实在体外培养的人二倍体成纤维细胞随所传代数的增加，细胞的增殖能力逐渐丧失，hayflick 将这种人正常体细胞在体外分裂潜能受限的现象称为细胞复制性衰老. 高糖能通过引起端粒的缩短使细胞发生过早的复制性衰老，正常的体细胞有有限的复制能力，当染色体端粒的长度缩短到一定程度时，细胞启动了阻止其继续分裂的信号，有丝分裂被不可逆的阻断在细胞周期的某个时期，这时细胞就会发生生长阻滞，凋亡也增加，高糖能使这个时期提前到来，从而导致不可逆的过早复制性衰老。
目前的一些研究已发现〔4〕，人的皮肤成纤维细胞在正常的糖浓度(即5.5 mmol/l)下增殖; 加入16.5 mmol/l的d 葡萄糖使培养液的糖浓度达到高糖(22 mmol/l)水平时，人成纤维细胞分裂44.42±1.5代可发生早老现象， 而在正常的糖浓度条件下需经过57.9±3.83代(p<0.000 1)才会发生衰老。而同浓度l 葡萄糖则没有这种作用，这表明高糖的促衰老作用不是由高渗透压引起的。实验证明，端粒酶的高表达能防止高糖对细胞复制能力及细胞凋亡的影响，通过恢复端粒酶活性能增加培养基中细胞的复制能力〔5〕，且能防止进行性端粒长度的减少，保护端粒的完整性。因此，目前认为端粒的缩短可作为细胞由分裂递减阶段到复制性衰老阶段的一个“指针”〔6〕。sibbitt 〔7〕等研究了高糖对正常人的成纤维细胞增长的影响，结果表明糖浓度的升高与达到复制性衰老的群体倍增数的下降是相联系的。 目前有观点认为，细胞衰老的发生是由于关键的同源染色体中独特的端粒的缩短引起，而不是因为端粒平均长度的缩短。单一的端粒缩短就能导致过早衰老〔8〕，高糖诱导的衰老可能与一个或多个端粒加速的缩短有关，而不影响整体或平均的trf(端粒限制性片段) 的长度, 高糖诱导的过早衰老的端粒限制性酶切片段(trf的长度6.1～9.0 kb)一般比正常糖浓度下的衰老的长度(trf的长度4.5～6 kb) 要长〔8〕。而另一种观点则认为，高糖诱导的衰老是与端粒的平均长度紧密相关。近期端粒长度和细胞周期之间关系的研究更支持后一观点。新近研究表明，在细胞复制阻滞期，端粒长度的范围可能是变化的〔9〕，在生理或病理条件下，糖浓度的变化对端粒的平均长度发挥调节作用。
2 高糖通过细胞周期影响衰老
细胞周期是细胞生命活动的基本过程，若细胞周期调控异常，细胞将进入病理状态。在细胞周期中，g1期是起始与限速阶段。研究表明，加入高浓度糖以后，人腹膜间皮细胞(hpmc)的g1期比例明显升高，而加甘露醇的高渗组，其g1期细胞的比例与对照组无显著差异，提
示高糖可以使hpmc 停滞于细胞周期的g1期，而此作用与高渗关系不大，同时还发现，高糖可使p21 蛋白表达增加, 此作用同样与高渗关系不大, 提示高糖并非通过高渗而是通过影响细胞周期调控蛋白, 从而影响细胞周期的改变〔10〕。
高糖可以加速内皮祖细胞(epcs)的衰老，糖尿病病人的骨髓源性的epcs 在数量和功能上都受到损伤。糖浓度的增加可以导致几种细胞信号转导级联反应的异常，包括蛋白激酶c 的变化，活性氧簇的产生和产物的积聚。糖能激活多种信号通路包括epcs 的p38mapk 通路, 增加epcs 的p38mapk 的磷酸化(mapks属于丝/苏氨酸蛋白家族) ，诱导epcs 数目降低〔12，13〕，推测高糖可能通过p38mapk 途径损害内皮细胞的功能，但高糖诱导的epcs 衰老的始动因素还有待进一步明确。p38mapk 信号通路与血管发生相关，p38mapk 的抑制剂能拮抗高血糖引起的抗血管生成作用，促使人单核细胞分化成epcs ，而高糖却能增加p38mapk 的活性。p38mapk 抑制剂(sb203580)能增加epcs 的数量、减少糖诱导的epcs 衰老，同样，糖能诱导细胞的sa β gal 阳性细胞数的增加，sb203580 治疗 后β 半乳糖苷酶(sa β gal) 阳性细胞数明显下降。而erk1/2抑制剂(pd98059)则对糖诱导的epc 衰老没有作用〔12〕。 3 高糖诱导产生的大量活性氧促进细胞的衰老
氧化应激衰老理论(sohal,1996)认为:氧化应激(氧化和还原之间的平衡失调) 是造成动物逐渐衰老的根本原因，体内氧化损伤的进程取决于氧化应激的程度和抗氧化防御体系的水平。已经证实高糖(30 mmol/l)能促使大网膜源性的人腹膜间质细胞(hpmc)的衰老，其衰老与活性氧(ros)的增加以及谷胱甘肽(gsh)减少有关。ishibashi 等〔14〕和lee 等〔15〕发现高糖培养条件下的hpmc 中ros 的产生增加。有趣的是，随着不断传代，高糖作用下ros 产生增加，并在细胞复制终末期达到最大值，而相同浓度的甘露醇并没有这种反应，表明高糖促进ros 产生的机制是通过影响细胞的代谢活性而不是影响细胞的渗透压来发挥作用的。 高糖可以引起ros 的增加，经过糖处理的hpmc 的gsh 的浓度则呈进行性下降的趋势。这些清楚表明高糖能引起氧化应激，氧化应激的强度随着hpmc 的复制年龄增加而增加〔16〕。
线粒体是ros 的主要来源〔17〕，因此糖介导的氧化应激引起细胞衰老较大可能与线粒体的功能异常有关〔18〕。氧化应激会增加dna 的损伤水平，从而激发衰老反应。高糖能明显加剧这些作用，同时增加衰老相关的sa β gal 和8 羟基脱氧鸟苷(8 oh dg) 的表达。8 oh dg 是活性氧自由基如羟自由基、单线态氧等攻击dna 分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性化合物，是dna 氧化损伤中最常用的生物标志。研究发现高糖条件下hpmc 停止增殖的时间提前，衰老标记sa β gal 表达增加， 8 oh dg 的产生增加，造成dna 损伤〔19〕。
但氧化应激是否会加速体内hpmc 的衰老有待进一步明确。最近有证据表明老年人的hpmc 表达“促炎症反应表型”的基因，而抗氧化剂能部分减低炎症反应〔29〕。
4 端粒、细胞周期与活性氧三者之间的相互作用
近年的研究发现，高糖所导致的 hpmc 肥大、衰老及再生修复障碍等一系列病理变化中，ros 可能发挥了重要作用。高糖培养的hpmc 可产生较多的过氧化氢，过氧化氢作为ros 的重要一员，已被证实可导致人多种细胞肥大、衰老以及细胞周期停滞，并影响p21、p27的表达〔10〕。内源和外源性的ros 均能引起dna 广泛的损伤，包括端粒dna 的损伤。von zglinicki 等〔30〕研究表明，dna 损伤在端粒缩短中起着重要作用。人成纤维细胞在正常条件下，可以传44 ～ 45 代，每次分裂使端粒缩短90 bp ，而当细胞在40%的高压氧下培养时却只能传几代，每次分裂使端粒缩短的速率由原来的90增至500 bp，同时细胞从形态、脂褐质的沉积、线粒体失水、dna 的含量和端粒长度等都表现出衰老的特征，而高压氧和正常衰老都可导致细胞内ros 生成的增加，所以说，在高压氧和细胞衰老过程中端粒dna 损伤的积累正是ros 生成增加所致〔31〕。
然而，细胞衰老的机制是否适用于机体的衰老目前尚存在争议〔32〕，如果能证实高血糖
症可引起机体衰老，这将具有重要的临床意义。
作者：汪杨 白雪源 魏日胞 陈香美
【关键词】 糖; 端粒; 细胞周期; 氧化应激; 衰老
衰老是在正常情况下随着年龄的增加引起各个器官功能障碍并最终引起机体死亡的不可避免的过程。一般来说，与易衰老的物种相比，较长寿的物种或个体其能量代谢率较低〔1〕。能量代谢主要包括糖、脂肪、蛋白质三大物质的代谢，而人体所需能量的70%是由糖的分解代谢提供。糖尿病最主要的临床表现就是餐后或(和) 空腹血糖的升高，而高血糖是引起代谢综合征(ms)的病理生理基础，老年糖尿病及其并发症等均与高血糖有关。但有关高血糖是否会促进衰老的研究较少〔2〕。衰老过程可发生在生物界的整体、种群、个体、细胞以及分子水平等不同的层次。根据目前已有的研究发现，高糖可以从多个水平促进衰老。
1 高糖能引起端粒的异常
端粒是位于染色体3′ 末端的一段富含g 的dna 重复序列，对染色体末端起着保护作用，能决定细胞的寿命，体外培养的细胞其端粒的长度随着细胞逐代相传而缩短，每复制一代即有50～200 bp 的dna 丢失，端粒丢失到一定程度即失去对染色体的保护作用，细胞随之发生衰老和死亡。而大部分永生化细胞系、肿瘤细胞、胚胎细胞和生殖细胞的端粒长度不随细胞分裂次数的增加而缩短，究其原因是由于端粒酶的存在，端粒酶维持着端粒的长度，使细胞寿命延长，并具有无限分裂的能力。端粒酶是由端粒酶rna 和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，通过识别并结合富含g 的端粒末端，以自身为模板，逆转录合成端粒。hayflick 〔3〕证实在体外培养的人二倍体成纤维细胞随所传代数的增加，细胞的增殖能力逐渐丧失，hayflick 将这种人正常体细胞在体外分裂潜能受限的现象称为细胞复制性衰老. 高糖能通过引起端粒的缩短使细胞发生过早的复制性衰老，正常的体细胞有有限的复制能力，当染色体端粒的长度缩短到一定程度时，细胞启动了阻止其继续分裂的信号，有丝分裂被不可逆的阻断在细胞周期的某个时期，这时细胞就会发生生长阻滞，凋亡也增加，高糖能使这个时期提前到来，从而导致不可逆的过早复制性衰老。
目前的一些研究已发现〔4〕，人的皮肤成纤维细胞在正常的糖浓度(即5.5 mmol/l)下增殖; 加入16.5 mmol/l的d 葡萄糖使培养液的糖浓度达到高糖(22 mmol/l)水平时，人成纤维细胞分裂44.42±1.5代可发生早老现象， 而在正常的糖浓度条件下需经过57.9±3.83代(p<0.000 1)才会发生衰老。而同浓度l 葡萄糖则没有这种作用，这表明高糖的促衰老作用不是由高渗透压引起的。实验证明，端粒酶的高表达能防止高糖对细胞复制能力及细胞凋亡的影响，通过恢复端粒酶活性能增加培养基中细胞的复制能力〔5〕，且能防止进行性端粒长度的减少，保护端粒的完整性。因此，目前认为端粒的缩短可作为细胞由分裂递减阶段到复制性衰老阶段的一个“指针”〔6〕。sibbitt 〔7〕等研究了高糖对正常人的成纤维细胞增长的影响，结果表明糖浓度的升高与达到复制性衰老的群体倍增数的下降是相联系的。 目前有观点认为，细胞衰老的发生是由于关键的同源染色体中独特的端粒的缩短引起，而不是因为端粒平均长度的缩短。单一的端粒缩短就能导致过早衰老〔8〕，高糖诱导的衰老可能与一个或多个端粒加速的缩短有关，而不影响整体或平均的trf(端粒限制性片段) 的长度, 高糖诱导的过早衰老的端粒限制性酶切片段(trf的长度6.1～9.0 kb)一般比正常糖浓度下的衰老的长度(trf的长度4.5～6 kb) 要长〔8〕。而另一种观点则认为，高糖诱导的衰老是与端粒的平均长度紧密相关。近期端粒长度和细胞周期之间关系的研究更支持后一观点。新近研究表明，在细胞复制阻滞期，端粒长度的范围可能是变化的〔9〕，在生理或病理条件下，糖浓度的变化对端粒的平均长度发挥调节作用。
2 高糖通过细胞周期影响衰老
细胞周期是细胞生命活动的基本过程，若细胞周期调控异常，细胞将进入病理状态。在细胞周期中，g1期是起始与限速阶段。研究表明，加入高浓度糖以后，人腹膜间皮细胞(hpmc)的g1期比例明显升高，而加甘露醇的高渗组，其g1期细胞的比例与对照组无显著差异，提
示高糖可以使hpmc 停滞于细胞周期的g1期，而此作用与高渗关系不大，同时还发现，高糖可使p21 蛋白表达增加, 此作用同样与高渗关系不大, 提示高糖并非通过高渗而是通过影响细胞周期调控蛋白, 从而影响细胞周期的改变〔10〕。
高糖可以加速内皮祖细胞(epcs)的衰老，糖尿病病人的骨髓源性的epcs 在数量和功能上都受到损伤。糖浓度的增加可以导致几种细胞信号转导级联反应的异常，包括蛋白激酶c 的变化，活性氧簇的产生和产物的积聚。糖能激活多种信号通路包括epcs 的p38mapk 通路, 增加epcs 的p38mapk 的磷酸化(mapks属于丝/苏氨酸蛋白家族) ，诱导epcs 数目降低〔12，13〕，推测高糖可能通过p38mapk 途径损害内皮细胞的功能，但高糖诱导的epcs 衰老的始动因素还有待进一步明确。p38mapk 信号通路与血管发生相关，p38mapk 的抑制剂能拮抗高血糖引起的抗血管生成作用，促使人单核细胞分化成epcs ，而高糖却能增加p38mapk 的活性。p38mapk 抑制剂(sb203580)能增加epcs 的数量、减少糖诱导的epcs 衰老，同样，糖能诱导细胞的sa β gal 阳性细胞数的增加，sb203580 治疗 后β 半乳糖苷酶(sa β gal) 阳性细胞数明显下降。而erk1/2抑制剂(pd98059)则对糖诱导的epc 衰老没有作用〔12〕。 3 高糖诱导产生的大量活性氧促进细胞的衰老
氧化应激衰老理论(sohal,1996)认为:氧化应激(氧化和还原之间的平衡失调) 是造成动物逐渐衰老的根本原因，体内氧化损伤的进程取决于氧化应激的程度和抗氧化防御体系的水平。已经证实高糖(30 mmol/l)能促使大网膜源性的人腹膜间质细胞(hpmc)的衰老，其衰老与活性氧(ros)的增加以及谷胱甘肽(gsh)减少有关。ishibashi 等〔14〕和lee 等〔15〕发现高糖培养条件下的hpmc 中ros 的产生增加。有趣的是，随着不断传代，高糖作用下ros 产生增加，并在细胞复制终末期达到最大值，而相同浓度的甘露醇并没有这种反应，表明高糖促进ros 产生的机制是通过影响细胞的代谢活性而不是影响细胞的渗透压来发挥作用的。 高糖可以引起ros 的增加，经过糖处理的hpmc 的gsh 的浓度则呈进行性下降的趋势。这些清楚表明高糖能引起氧化应激，氧化应激的强度随着hpmc 的复制年龄增加而增加〔16〕。
线粒体是ros 的主要来源〔17〕，因此糖介导的氧化应激引起细胞衰老较大可能与线粒体的功能异常有关〔18〕。氧化应激会增加dna 的损伤水平，从而激发衰老反应。高糖能明显加剧这些作用，同时增加衰老相关的sa β gal 和8 羟基脱氧鸟苷(8 oh dg) 的表达。8 oh dg 是活性氧自由基如羟自由基、单线态氧等攻击dna 分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性化合物，是dna 氧化损伤中最常用的生物标志。研究发现高糖条件下hpmc 停止增殖的时间提前，衰老标记sa β gal 表达增加， 8 oh dg 的产生增加，造成dna 损伤〔19〕。
但氧化应激是否会加速体内hpmc 的衰老有待进一步明确。最近有证据表明老年人的hpmc 表达“促炎症反应表型”的基因，而抗氧化剂能部分减低炎症反应〔29〕。
4 端粒、细胞周期与活性氧三者之间的相互作用
近年的研究发现，高糖所导致的 hpmc 肥大、衰老及再生修复障碍等一系列病理变化中，ros 可能发挥了重要作用。高糖培养的hpmc 可产生较多的过氧化氢，过氧化氢作为ros 的重要一员，已被证实可导致人多种细胞肥大、衰老以及细胞周期停滞，并影响p21、p27的表达〔10〕。内源和外源性的ros 均能引起dna 广泛的损伤，包括端粒dna 的损伤。von zglinicki 等〔30〕研究表明，dna 损伤在端粒缩短中起着重要作用。人成纤维细胞在正常条件下，可以传44 ～ 45 代，每次分裂使端粒缩短90 bp ，而当细胞在40%的高压氧下培养时却只能传几代，每次分裂使端粒缩短的速率由原来的90增至500 bp，同时细胞从形态、脂褐质的沉积、线粒体失水、dna 的含量和端粒长度等都表现出衰老的特征，而高压氧和正常衰老都可导致细胞内ros 生成的增加，所以说，在高压氧和细胞衰老过程中端粒dna 损伤的积累正是ros 生成增加所致〔31〕。
然而，细胞衰老的机制是否适用于机体的衰老目前尚存在争议〔32〕，如果能证实高血糖
症可引起机体衰老，这将具有重要的临床意义。