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高效纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建
王海滨“２韩立荣“２冯俊涛“２张兴“２’
ｌ陕西省生物农药工程技术研究中心，杨凌７１２１００２西北农林科技大学植保资源与病虫害治理研究中心，杨凌７１２１００＋通讯作者，ｚ１１）【ｉｎｇｌ９５２＠１２６．ｃｏｍ
摘要本研究旨在筛选高效纤维素降解菌，组建复合菌系，用于堆肥接种剂的开发。通过纤维素刚果
红选择性培养基，从腐殖土、堆肥样品中分离高效纤维素降解常温菌和耐高温菌。经过羧甲基纤维素酶
活（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ
ｃｅｌｌｕｌａｓｅ，ＣＭＣａｓｅ）、滤纸条崩解能力、对稻杆及苦参（Ｊｓｏｐ危ｏｍ触∥∞ｃｅ琊Ａｉｔ．）残渣在液态
和固态发酵条件下的降解能力测定逐级淘汰，筛选高效菌株组建复合菌系。研究结果表明，通过拮抗作
用、单一菌株在复合菌系中作用测定，最终构建了由３株细菌（弗留明拜叶林克氏菌（眈ｉ如ｒｉｎｃ七施
∥ｕｍｉ加瑚括）、微杆菌（肘记ｒ０６ｎｃ把一“ｍｓｐ．）和芽胞杆菌∞ｎｃ垅凇ｓｐ．）），ｌ株链霉菌（Ｊｓｆ阳ｌｐ￡ｏｍ弦∞ｓｐ．）和１株毛壳
菌（佩ｏｅｆｏｍｉＭｍｓｐ．）组成的木质纤维素降解高效复合菌系。供试菌株在液态发酵条件下对稻杆和苦参残
渣的降解效果明显强于固态发酵，稻杆比苦参残渣更容易被大多数微生物降解，供试真菌在稻杆和苦参
残渣的降解中普遍表现出较高的降解效果。筛选得到弗留明拜叶林克氏菌ｘＭ一３可以在４８ｈ内将滤纸条完全崩解，复合菌系在固态发酵２０ｄ后对苦参残渣和稻秆的降解率分别达到３１．４％和６３．１％。本研究
对堆肥接种剂的开发具有参考和借鉴意义。
关键词筛选，纤维素降解菌，滤纸崩解，复合菌系，苦参残渣
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ＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎＭｉｃｒｏｂｅｓ
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ＭａｎａｇｅｍｅｎｔＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＮｏｎｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉ吼Ｙａｎｇｌｉｎｇ７ｌ２ｌ００，Ｃｈｉｎａ
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基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）项目（Ｎｏ．２０ｌｌＡＡｌＯＡ２０２一１）收稿日期：２０１４．１２—０２接受日期：２０１５一０１—０４
４２２
…
农业生物技术学报
ＪｏｕｎｌａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｍｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
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ｓｔｒａｉｎｓ，Ｒａｄｉｘ
１．ｅｓｊｄｌ】ｅｓ
中国的植物提取物产业如中药提取、植物源农药提取及食品加工等每年产生大量有机固体废弃物，仅
中药提取一项每年产残渣就达１５０万ｔ左右（Ｗａｎｇ
ｅｔ
ａ１．，２０１０）。此类废弃物一般采取焚烧、填埋等手段处理，既污染了环境又造成大量资源的浪费。堆肥是一
种处理大量有机固体废弃物的有效手段。植物提取
残渣中往往木质纤维素含量较高，而此类物质在堆肥过程中降解缓慢，腐熟周期长，成为制约其堆肥化处理的一大瓶颈。通过在堆肥过程中接种高效木质纤维素降解菌可以有效促进木质纤维素的降解，缩短堆肥发酵周期，加速堆肥腐熟，提高堆肥品质（王伟东等，２００８；刘佳等，２０１１）。因而，筛选具有木质纤维素酶活力的高效菌株，构建高效堆肥接种剂，成为堆肥化处理植物提取所产生大量有机固态残渣的有效手段（Ｚｅｎｇｅｔａ１．，２０１０）。
单一菌株作为堆肥接种剂作用有限，构建由不同特性的多菌株组成的复合菌系用于促进木质纤维素的降解或堆肥发酵，受到越来越多的重视（牛俊玲等，２００７）。复合菌系构建往往通过直接筛选或对已有高效菌株组合来实现。大多数研究采用直接筛选法，通过连续多代驯化培养得到复合菌系（Ｇｕｏ
ｅｔａ１．，２００８；２０１０；Ｈａｒｕｔａｅｔ
ａ１．，２００２；崔宗均
等，２００２），而利用不同高效菌株组合来构建复合菌系的研究较少。通过直接筛选法构建复合菌系，往往存在复合菌系中菌株组成种类多，鉴定困难，群落结构容易受到营养及环境条件影响等（崔诗法等，２００９）。通过对已有高效菌株进行组合，各菌株的特性明确，单一菌株活性高，质量和稳定性容易控制。本研究从腐殖土、堆肥样品中分离筛选高效木质纤维素降解菌株，然后通过合理优化组合构建高效复合菌系，为同类研究和堆肥接种剂的开发提供参考。
１材料与方法
１．１实验材料１．１．１样品来源
从渭南、杨凌、天水等地采集的腐殖土、堆肥样品用于常温菌的分离筛选。从牛粪和秸秆堆肥的高温期采样用于耐高温菌的分离筛选。
苦参残渣为豆科苦参属植物苦参（ｓｏｐ＾ｏｒ０．肛一秽船ｃｅ瑚Ａ∽根部经乙醇提取后的剩余物，本研究所
用苦参残渣来自山西德威生化有限公司。
１．１．２培养基
纤维素刚果红培养基：ＣＭＣ—Ｎａ２
ｇ／Ｌ，呷。）２Ｓ０４
２ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ０．５ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ。１ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０—７Ｈ：Ｏ０．５
ｇ／Ｌ，刚果红０．４ｇ／Ｌ，琼脂１２ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０。
滤纸条崩解培养基：（ＮＨ一）ｚＳＯ。１．０ｇ／Ｌ，Ｍｇ－
ＳＯ。‘７Ｈ：Ｏ０．５ｇ／Ｌ，ＫＨ：ＰＯ。１．Ｏ
ｇ／Ｌ，酵母膏０．１
ｇ／Ｌ，
滤纸条（１ｃｍ×６
ｃｍ）３条／三角瓶，ｐＨ
７．０。
羧甲基纤维素钠培养基：ＣＭＣ—Ｎａ
１０
ｇ／Ｌ，蛋
白胨２
ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ０．５，ＫｚＨＰｏ。１
ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０。。７Ｈ：Ｏ
０．５
ｇ／Ｌ，酵母膏０．５ｇ／Ｌ，琼脂１２∥Ｌ，ｐＨ
７．０。
稻杆及苦参残渣降解培养基：营养液Ａ包括蛋白胨２ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ。‘７ＨｚＯ
Ｏ．５ｇ／Ｌ，ＫＨｚＰＯ。１．０ｇ／Ｌ，
ＮａＣｌ０．５
ｇ／Ｌ，酵母膏０．５ｇ／Ｌ，ＣａＣｌｚ０．２
ｇ／Ｌ，ｐＨ
７．０；
营养液Ｂ成分同营养液Ａ，浓度为营养液Ａ的５倍。１．２实验方法
１．２．１常温菌的筛选和纯化
将采集的样品用无菌水逐级１０倍稀释至１０～、１０‘５和１０巧倍后，分别取０．１ｍＬ涂布于纤维素刚果红选择性培养基上，每个浓度涂５个平板，２８℃下培养，定期观察，挑取菌落周围出现清晰透明圈的菌株，通过划线法分离纯化。分别用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ），牛肉膏蛋白胨及高氏一号培养基培养真菌，细菌和放线菌，并用斜面低温保藏法保存（下同）。
１．２．２耐高温菌的筛选和纯化
取样品５ｇ加入１００ｍＬ蒸馏水，于６５℃水浴
７２
ｈ，然后稀释至ｌＯ～、１０。３和１０４倍后，分别吸取０．１ｍＬ涂布于纤维素刚果红选择性培养基上，４５℃培养，定期观察，挑取菌落周围出现清晰透明圈的菌株，通过划线法分离，纯化。
１．２．３
羧甲基纤维素酶（ＣＭＣａｓｅ）活性测定
将纯化后的菌株分别涂布于不同的营养琼脂
培养基平板（细菌用牛肉膏蛋白胨培养基、放线菌用高氏一号培养基、真菌用ＰＤＡ培养基），待菌落长出后，用打孔器打６ｍｍ的菌饼接种于纤维素刚果红平板，２８℃培养３ｄ后（耐高温菌４５℃培养），测量透明圈直径大小。１．２．４滤纸条崩解实验
滤纸条崩解实验可以反映不同菌株所分泌的各种纤维酶的综合酶活力水平。用无菌水将所获得的具有高ＣＭＣａｓｅ活性的菌株斜面培养物分别制成菌悬液，分别接种２ｍＬ于装有１００ｍＬ滤纸条崩解培养基的２５０ｍＬ三角瓶中，摇床培养（２８℃，
１３０
ｒ／ｍｉｎ），定期观察滤纸条崩解情况。耐高温菌
在４５℃，１３０ｒ／ｍｉｎ条件下培养（下同）。
１．２．５液态发酵降解稻杆及苦参残渣
将稻杆和苦参残渣粉碎，过６０目筛，５０℃烘至恒重。在每个三角瓶中加入１００ｍＬ营养液Ａ，然后分别加入２ｇ稻杆或苦参残渣，１２ｌ℃灭菌２０
ｍｉｎ，
各接种２ｍＬ菌悬液，２８℃，１３０ｒ／ｍｉｎ培养，耐高温菌在４５℃下培养。１０ｄ后，将培养物５０００×ｇ离心
１０
ｍｉｎ，弃上清，用盐酸和硝酸的混合液冲洗消除
菌体，５０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，用蒸馏水洗，５０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，１０５℃烘至恒重，计算失重率。对照不接种菌悬液（下同）。
１．２．６固态发酵降解稻杆及苦参残渣
在每个三角瓶中加入１５ｍＬ营养液Ｂ，再分别加入１０ｇ稻杆或苦参残渣，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，各接种２ｍＬ菌悬液，２８℃静置培养，每隔３ｄ用手摇匀一次。１０ｄ后培养物各加入１００ｍＬ蒸馏水，５
０００№
离心１０ｍｉｎ，弃上清，用盐酸和硝酸混合液冲洗消除菌体，５０００獬离心１０ｍｉｎ，用蒸馏水洗，５０００橹离心１０ｍｉｎ，１０５℃烘至恒重，计算失重率。
１．２．７拮抗实验
分别取各菌悬液０．５ｍＬ，用涂布器均匀涂于直径为１５０ｍｍ的羧甲基纤维素钠培养基上。将灭菌滤纸片（１ｃｍ×１ｃｍ）在各菌悬液中完全浸湿，然后
将滤纸片均匀分布，平铺于涂布了单一菌悬液的羧甲基纤维素钠培养基平板上。２８℃培养３ｄ后分别检查各菌株（滤纸片）和涂布于羧甲基纤维素钠培养基上单一菌株之间的拮抗活性。
１．２．８复合菌系中不同菌株组合粗酶液制备及滤纸酶活性（Ｆｐａｓｅ）测定
设置ｘＭ一３等单一菌实验组、６株菌组合即Ｔｏｔｏｌ实验组、除去１株菌之后任意５株菌的组合（例如除去ｘＭ一３的组合为Ｔ０１一ｘＭ一３实验组）等。将各菌株组合的菌悬液按照体积比１：１混合，分别接种２ｍＬ于苦参残渣降解培养基中ｆ成分同１．２．６），２８℃下静置培养，每隔３ｄ用手摇匀，保证物料均匀及氧气充足。每个处理设置３个重复。培养１０ｄ后，每个三角瓶中加入５０ｍＬ无菌水，室温下１２０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２
ｈ，８
０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，上
清作为粗酶液采用ＤＮＳ法（李合生，２０００）用于滤纸酶活测定，酶活力单位（ｕ），即每分钟产生１斗ｍｏｌ葡萄糖的酶量为１
Ｕ。
１．２．９复合菌系中不同菌株组合对苦参残渣降解能力测定
发酵方式同１．２．８，待发酵至第２０ｄ时，在各个三角瓶中加入１００ｍＬ无菌水，室温１２０ｒ／ｍｉｎ摇床ｈ，５
０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，弃上清，加入盐酸和
水洗，５０００獬离心１０ｍｉｎ，１０５℃烘至恒重，计算失重率。对照采用相同处理但不接种菌悬液。每个处理设置３个重复。１．２．１０菌株鉴定
细菌、放线菌采用形态、生理生化及１６Ｓ
ｒＲＮＡ
内转录间隔区（ｉｎｅｍａｌ仃ａｎｓｃ抽ｅｄｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）区序
列比对进行鉴定。细菌和放线菌总ＤＮＡ采用细菌
京），真菌总ＤＮＡ采用真菌基因组提取试剂盒提取
菌总ＤＮＡ为模板，
１４９２Ｒ：５’ＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣ３’。
ｒＲＮＡ序列。ＰＣＲ反应体Ｂｕ行．ｅｒ
５¨Ｌ，ＭｇＣｌ：３
ｕＬ，ｄＮＴＰ４“Ｌ，
ｐＬ，
ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／斗Ｌ）０．５此，加ｄｄＨ：Ｏ至５０
培养２
硝酸的混合液冲洗消除菌体，离心，弃上清，用蒸馏
序列比对进行鉴定；真菌采用形态及核糖体ＤＮＡ
基因组提取试剂盒提取（ＣＷ０５５２，康为世纪，北
（Ｄ３３９０—０１，０ｍｅｇａ，广州）。以提取的细菌和放线８Ｆ：５’ＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ３’：作引物扩增菌株的１６Ｓ系：１０×ＰＣＲ
模板１“Ｌ，引物８Ｆ和１４９２Ｒ（１０¨ｍｏｌ／Ｌ）各１
ｒ死ｑ
４２４篙譬主盏ａ。…酬。科
ｕＬ。ＰＣＲ反应条件：９５ｃＣ变性５
ｍｉｎ，９４
ｃＣ变性１菌（５株放线菌，１６株细菌，２株真菌）和２１６株常温菌。常温菌中５４株培养７２ｈ的透明圈直径超过
１０
ｍｉｎ，５４℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ。以提取的真菌总ＤＮＡ为模板，通用引物：
ＩＴＳｌ５．８ＳＦ：５’ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣ３’：ＩＴＳ４５．８ＳＲ：５’ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ３’。
ｍｍ，进行后续实验。
２．２滤纸条崩解实验
对筛选得到的５４株常温菌和２３株耐高温茵进一步测定了其各自的滤纸条崩解能力。测定结果表明，绝大多数菌株对滤纸条均有一定的崩解能力。２５ｄ内有２６株菌可以将滤纸条完全崩解（表１），其中包含１７株细菌、５株放线菌和４株真菌。常温细菌ｘＭ．３降解能力最强，可以在４８ｈ之内将滤纸条完全崩解（图２）。耐高温菌中，Ｇ一１３可以在
５
扩增菌株的ＩＴＳ序列。ＰＣＲ反应体系：１０×ＰＣＲ
Ｂｕ虢ｒ５斗Ｌ，ＭｇＣｌｚ
酶（５
３
ｐＬ，ｄＮＴＰ４肛Ｌ，模板１ｐＬ，引
物ＩＴＳｌ和ＩＴＳ４（１０斗ｍｏｌ／Ｌ）各ｌｐＬ，ｒ死ｇＤＮＡ聚合
Ｕ／¨Ｌ）０．２５皿，加ｄｄＨｚ０至５０肛Ｌ。ＰＣＲ反应
条件：９４ｃＣ预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，５３℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸５０ｓ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。用凝胶提取回收试剂盒纯化回收ＰＣＲ产物，送上海英骏生物技术公司测序。将所测１６Ｓ
ｒＲＮＡ
ｄ内将滤纸条完全崩解。
和ＩＴＳ区序列与ＧｅｎＢａｎｋ中己知的相关的序列进行多重比对，用ＣｌｕｓｔａｌＸ和Ｍｅｇａ４．Ｏ软件包进行序
２．３供试菌株对稻杆和苦参残渣降解实验
对２．２中２６株菌进一步测定了其对稻杆及苦参残渣的降解能力。
２．３．１
列比对和系统发育分析，并用Ｎｅｉ曲ｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ算
法构建系统发育树。１．３数据处理
采用ＳＰＳＳ１８．Ｏ软件对数据进行单因素方差分析及显著性检验。
液态发酵条件下，供试菌株对稻杆及苦参
残渣的降解效果
各菌株对稻秆和苦参残渣均表现出一定的降
解作用（图３Ａ）。其中，木霉菌（嘶ｃ危Ｄ如ｒｍｏｓｐ．）ＬＡ一
９对稻秆和苦参残渣的降解率最高（Ｐ＜Ｏ．０５），分别为３２．８％和１９．６％。细菌ＸＭ．３对稻秆和苦参残渣的降解率分别为２４．８％和１３．６％。放线菌ＬＳ．１２和
２结果与分析
２．１纤维素刚果红培养基筛选菌株
分离纯化得到２３９株菌可以在纤维素刚果红培养基上形成清晰透明圈（图１），包含２３株耐高温
ＴＳ．７对稻秆的降解率分别为２１．７％和２０．７％，对苦参残渣的降解率分别为８．１％和１２．３％。绝大多数菌株在液态发酵条件下对稻秆的降解作用显著大
图２菌株的滤纸条崩解效果
Ｆｎｔｅｒｐａｐｅｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｏｆｓｔｒａｉｎｓ
ＦｉｇｕＩ．ｅ２
ＸＭ．３培养第２天（Ａ）和ｘＭ一８培养第３天（Ｃ），左边为对照；Ｔｓ．３（Ｂ）和ＮＦ．２培养第９天（Ｄ），右边为对照。与对照相比，滤纸条完全崩解
ｘＭ一３２ｄｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ（Ａ）ａｎｄｘＭ．８３ｄｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ（Ｃ），ｒｅｓｐｅｃ—
ｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｌｅＲｗａｓｃｏｎ仃ｏｌ；ＴＳ一３（Ｂ）ａｎｄＮＦ一２（Ｄ）９ｄｃｕｌｔｉｖａｔ．ｅｄｆｏｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｒｉｇｈｔｗａｓｃｏｎ仃０１．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎ－ｏｌ，ｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｓｔｒｉｐｅｓｗｅｒｅｄｅｇｒａｄｅｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ
ｃｏｎ—
于其对苦参残渣的降解（Ｐ＜０．０５１。
２．３．２
ＸＭ一３、ＸＭ一８、ＷＳ一３、ＷＳ一４和ＴＳ一３在对两者的降解中也表现出了较高的活力。和液态发酵下相似，绝大多数菌株在固态发酵条件下对稻秆的降解作用
固态发酵条件下，供试菌株对稻秆及苦参残
渣的降解效果
固态发酵条件下对稻秆降解作用最强的菌株
为放线菌ＬＳ一１２（图３Ｂ），降解率达到了１９．Ｏ％（Ｐ＜０．０５）。其次，放线菌ＴＳ一７和真菌ＬＡ一９对稻秆的降解率分别为１７．９％和１８．３％。在供试菌株中，对苦参残渣降解作用最强的为真菌ＬＡ一９，降解率为１０．３％（Ｐ＜０．０５）。放线菌中的ＬＳ一１２和ＴＳ一７对稻秆及苦参残渣均表现出较强的降解作用，细菌中的
表１
２６株菌的滤纸条崩解实验
要高于其对苦参残渣的降解。
２．４复合菌系构建
根据ＣＭＣａｓｅ酶活力，滤纸条崩解能力及各菌株对稻杆和苦参残渣的降解效果，结合在堆肥过程中常温菌、耐高温菌及细菌、放线菌和真菌之间的协同作用，最终选取ｘＭ一３等１２株菌作为构建复合菌系的初选菌株。其中包含了细菌、放线菌和真
Ｔａｂｌｅｌ
Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆ６ｌｔｅｒｐａｐｅｒｓｔｒｉｐｅｓｄｅｇｒａｄａｔｊｏｎｂｙ２６ｓｔｒａｉｎｓ
＋：滤纸软化；＋＋：１／４降解；＋＋＋：１／２降解；＋＋＋＋：３／４降解；＋＋＋＋＋：完全降解；１～３：耐高温菌：４～２６：常温菌：下同
＋：Ｆｉｔｅｒｐ印ｅｒｓｏＲｅｎｅｄ；十＋：１／４ｄｅｇｒａｄｅｄ；＋＋＋：ｌ／２ｄｅｇｒａｄｅｄ；＋＋＋＋：３／４ｄｅｇｒａｄｅｄ；＋＋＋＋＋：Ａ１１ｄｅｇｒａｄｅｄ；ｌ～３：Ｈｉｇｈｔｅｍｐｅｍｔｕｒｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｉｃｍｏ唱ａｎｉｓｍｓ；４～２６：Ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃｍｉｃｒｏｏ唱ａｎｉｓｍｓ；Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
４２６淼臻当盖慧。。眦。ｈ山纠
菌，同时也包含了常温菌和耐高温菌。这１２株菌著的滤纸条崩解能力（表１）；ＴＳ一３、ＷＳ．３和ＷＳ．４三之间的拮抗作用结果见表２。从表２可以看出，菌者除具有较高的滤纸条崩解能力及对稻杆和苦参株ＸＭ．３和ＸＭ．８存在拮抗作用，同时Ｇ一２、Ｇ一３和残渣的降解能力外（表ｌ，图３和４），还具有较强的ＬＳ一１２均对ＸＭ一８产生拮抗作用。菌株ＷＳ．３与Ｇ一琼胶酶活力（结果未列出）；Ｇ一２、Ｇ一３和Ｇ—１３均可以２、Ｇ．３、Ｇ．１３及ＬＡ．９存在拮抗作用。３株耐高温菌耐受６５℃的高温，Ｇ一１３表现出相对较高的降解能中只有Ｇ—１３与其他菌株存在较少的拮抗作用。菌力（表ｌ，图３）；放线菌ＴＳ一７和ＬＳ一１２表现出较高残株ＴＳ一７和其他菌株具有较好的相容性。真菌中的渣降解活力和一定的表面活性（图３）。综上所述，ＬＡ．９与多株菌（ＷＳ一３，Ｇ一２，Ｇ一３和Ｇ一１３）存在拮抗选取ＸＭ一３、ＴＳ．３、Ｇ一１３、ＬＳ．１２、ＴＳ一７和ＳＬＴ＿１２这６作用。在１２株初选菌株中：ＸＭ一３和ＸＭ．８具有显
株菌组建复合菌系。
习稻杆
Ｒｉｃｅｓｔｒａｗ
ｊ苫参残渣Ｒａｄｉｘ
ｒｅｓｉｄｕｅｓ
ａ旱
∞１
蔷．董ｚ
蓁量２
２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７ｌ８１９２０２ｌ２２２３２４２５２６
菌株Ｓｔｒａｉｎｓ
Ａ
图３
２６株菌对稻杆及苦参残渣在液态（Ａ）和固态（Ｂ）发酵条件下的降解效果
Ｆ蟾ｕｒｅ３
Ｄｅｇｒａｄａｔｉ伽ｒａｔｅ
ｏｆｒｉｃｅｓｔｒａｗａｎｄ
ｍｄｉｘ
ｒｅｓｉｄｕｅｓｂｙ２６
ｓｔｒａｉ璐ｕｎｄｅｒＵｑｕｉｄ（Ａ）ａｎｄｓｏＩｉｄ（Ｂ）ｓｔａｔｅ
ｆｅ珊ｅｎｔａｔｉｏｎ
根据邓肯多重范围检验，不同字母表示处理间存在显著差异（Ｐ＜Ｏ．０５），菌株编号及相关信息见表ｌ，下同
ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＤｕｎｃａｎ’ｓｍｕｔｉｐｌｅｍｎｇｅｔｅｓｔ，ｄｉｆｒｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）ａｍｏｎｇ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，ＳｔｒａｉｎＮｏ
ａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ
ｓｅｅ
Ｔ曲ｌｅ
１．ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
表２１２株木质纤维素降解茵之间的拮抗活性
ＴａｂＩｅ２
Ｔｈｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｍｏｎｇ１２ｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈｌｉｇｎｏｃｅｌＩｕＩｏｓｅ
ｄｅｇｍｄｉｎｇａｂｉＩｉｔｙ
菌株
ＸＭ一３ＸＭ－８ＴＳ．３
ＷＳ．４ｗＳ一３
Ｇ一２Ｇ一３
Ｇ．１３
ＬＳ．１２
ＴＳ．７
ＬＡ一９
ＳＬｌ二１２
Ｓｔｒａｉｎｓ
＋＋十
什
抖
抖
抖
什＋
抖
＋
抖
一
一＋
一
抖
抖抖
＋
抖＋
抖抖
抖抖
什ｏ名，４抖
抖
抖
＋什抖
忖
ｏ
一
一一
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一＋＋
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抖
一
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＋
一¨
什
＋＋
＋
抖
＋
Ⅲ煳；垒啪∞叭峪；查№邮３他７母ｕ
～：具有拮抗作用；＋：菌株间无明显拮抗作用但不能交叉生长；＋＋：菌株间无拮抗作用，可以交叉生长
～：ＡｎｔａｇｏｎｉｓｍｂｅＭｅｅｎＭｏ
ｓｔｒａｉｎｓ；＋：Ｎｏｓｉｇｌｌｍｃａｎｔａｎｔａｇｏｎｉｓｍｂｅｔ、ｖｅｅｎ
Ｍｏ
ｓ仃ａｉｎｓ，ｂｕｔ
ｎｏ
ｃｍｓｓｇｒｏ、＾，ｔｈ；＋＋：Ｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ａｎ—
ｔａｇｏｎｉｓｍ
ｂｅ帆ｅｅｎＭｏ
ｓｔｒａｉｎｓ，ａｎｄ
ｃｍｓｓ伊。叭ｈ
２．５单一菌株在复合菌系中的作用测定
为了用最少的菌株构建对木质纤维素降解能力尽可能强的复合菌系，通过测定不同菌株组合的滤纸酶活力和对苦参残渣的降解，进一步测定了复合菌系中单一菌株在复合菌系中发挥作用的大小。
２．５．１
系滤纸酶活力的影响较小。
２．５．２不同菌株组合对苦参残渣的降解
由图４Ｂ可知，不同菌株处理对苦参残渣的降解效果存在较大差异。不同菌株组合对苦参残渣
的降解效果均未显著低于任何单一菌株（Ｐ＞Ｏ．０５），
说明单一菌株所分泌酶的种类和数量有限，不及复合菌系，苦参残渣的降解需要多种酶的协同作用。
不同菌株组合的滤纸酶活力
由图４Ａ可以看出，除Ｔｏｔ—ＬＳ．１２外，各复合菌
系的滤纸酶活力均显著高于单一菌株（Ｐ＜０．０５），说
明通过构建复合菌系的方法可以显著提高菌系的滤纸酶活力水平。在单一菌株中，３株细菌（ｘＭ一３，ＴＳ一３和Ｇ一１３）的滤纸酶活力要显著低于放线菌（ＬＳ一１２）和真菌（ＳＬＴ－１２）（Ｐ＜０．０５），其中以真菌ＳＬＴ－１２的酶活力最高。复合菌系中Ｔｏｔ—ＴＳ一７的酶活力最高，表明放线菌ＴＳ一７在菌株群体的生长增殖过程中，可能与其他菌株存在营养或空间的竞争，从而对其他菌株产生了一定的抑制作用，导致复合菌系整体酶活力的降低。而Ｔ０ｔ—ＬＳ—１２和Ｔｏｔ—ＳＬＴ－１２与Ｔｏｔａｌ相比，酶活力显著降低（Ｐ＜０．０５），说明放线菌ＬＳ．１２和真菌ｓＬＴ－１２在复合菌系中发挥很重要的作用，能提高整个菌系的酶活力。Ｔｏｔ—ｘＭ一３、Ｔｏｔ—ＴＳ一３和Ｔ０ｔ—Ｇ一１３三者与Ｔｏｔｏｌ之间的酶活力差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明３株细菌的存在与否对复合菌
单一菌株处理中，真菌ＳＬＴ．１２对苦参残渣的降解
率显著高于其他菌株（Ｐ＜０．０５），而细菌ＴＳ一３对苦参残渣的降解率最低（Ｐ＜０．０５），说明在对天然木质纤维素材料的降解过程中真菌往往发挥重要作用。与Ｔｏｔｏｌ相比，Ｔｏｔ—ＬＳ．１２、Ｔｏｔ—ＳＬ卫１２、Ｔｏｔ—ＸＭ一３和Ｔｏｔ—ＴＳ．３的降解率均显著降低（尸＜０．０５），说明复合菌系中ＬＳ—１２、ＳＬＴ－１２、ｘＭ一３和ＴＳ一３在对苦参残渣的降解中均发挥了重要作用，特别是ＬＳ一１２和ＳＬＴ－１２。Ｔｏｔ—Ｇ．１３与Ｔｏｔｏｌ对苦参残渣的降解率差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明耐高温细菌Ｇ一１３在复合菌系中发挥的作用较小，可能与其在常温下与其他菌株相比，竞争力不足相关；同时也说明该菌株对复合菌系中其他菌株作用的发挥没有负面影响，在堆肥的高温阶段，该菌株将发挥作用。与Ｔｏｔｏｌ相比，Ｔ０ｔ—ＴＳ一７对苦参残渣的降解率显著升高（Ｐ＜０．０５１，达到３１．４％，这说明放线菌ＴＳ．７对复合菌系
ｆ
一宣３
￥蜒避螺煺
１２３４５６７８９１０ｌｌ１２１３
Ｂ
组别Ｇｒｏｕｐｓ
图４不同菌株处理发酵液的滤纸酶活力（Ａ）和对苦参残渣的降解（Ｂ）
ＦｉｇＩｌｒｅ４
Ｆｐ鹪ｅａｃｔｉｖｉｔｉ鼯（Ａ）ａｎｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ
ｏｆｍｄｉｘｒ鹪ｉｄｕ髂（Ｂ）ｏｆｔｈｅｄｉ仃ｅｒｅｎｔｓｔｒａｉ璐ｔｒｅａｔｅｄｃｕｌｔ町ｅ
ｍｅｄｉ岫
１：ｘＭ．３：２：ＴＳ．３；３：Ｇ．１３；４：Ｔｓ．７；５：ＬＳ一１２；６：ｓＬＴ．１２；７：除ｘＭ一３之外的其他５株菌（Ｔｏｔ．ｘＭ．３）；８：除ＴＳ一３之外的其他５株菌（Ｔｏｔ．ＴＳ．３）；９：除Ｇ．１３之外的其他５株菌（Ｔｏｔ—Ｇ一１３）；１０：除ＴＳ．７之外的其他５株菌（Ｔｏｔ—ＴＳ－７）；１１：除ＬＳ－１２之外的其他５株菌（Ｔｏｔ．ＬＳ一１２）；１２：除Ｓｕ二１２之外的其他５株菌（Ｔｏｔ．Ｓｕ二１２）；１３：１～６株菌的组合（Ｔｏｔ０１）；下同
ｌ：ＸＭ．３：２：ＴＳ．３：３：Ｇ．１３；４：ＴＳ一７；５：ＬＳ．１２；６：Ｓ【ｊｒ－１２；７：Ｔｈｅｏｍｅｒ５ｓｔａｉｎｓｗｉｍｏｕｔｘＭ－３（Ｔｂｔ－ＸＭ一３）；８：Ｔｈｅｏｔｈｅｒ５ｓｔａｉｎｓ
ｗｉｔｈｏｕｔＴＳ．３ｆＴｏｔ—ＴＳ．３）；９：Ｔｈｅｏｔｈｅｒ５ｓｔａｉｎｓｗｉｔｈｏｕｔＧ－１３（Ｔｏｔ－Ｇ一１３）；１０：Ｔｈｅｏｔｈｅｒ５ｓｔａｉｎｓｗｉｔｈｏｕｔｏｔｈｅｒ５ｓｔａｉｎｓｗｉｍｏｕｔＬＳ．１２（Ｔｏｔ—ＬＳ．１２）；１２：Ｔｈｅｏｔｈｅｒ５ｓｔａｉｎｓｗｉｔｈｏｕｔ
ＴＳ一７（Ｔｏｔ—ＴＳ一７）；１１：Ｔ１１ｅ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆ
１～６
ＳＬ，Ｔ－１２（Ｔｏｔ—ＳＬＴ二１２）；１３：Ｓｔｒａｉｎ
（Ｔｂｔ０１）；Ｔｈｅ
ｓ锄ｅ
ｂｅｌｏｗ
４２８盏兰警譬淼。。龇。㈦咧
中其他菌株产生了一定的抑制作用，限制了其他菌
（日Ｐ咖一聊七沉∥Ⅱｍｉ舶ｍ厶，ＫＰ３９８５６２），Ｔｓ－３为微杆菌属（心ｃｒ０６０ｃ把ｒｉＭｍｓｐ．，Ⅺ１３９４３５），Ｇ一１３为芽胞杆菌
对苦参残渣的有效降解。
综上表明，复合菌系中去掉放线菌ＴＳ一７就可以有效提高整个复合菌系的滤纸酶活力和对苦参残渣的降解能力。本研究最终确定将ｘＭ一３、ＴＳ一３、Ｇ一１３、ＬＳ—１２和ＳＬＴ－１２作为构建复合菌系的最终菌株。
将上述５株菌按照体积比１：ｌ混合接种于固体稻秆降解培养基，发酵２０ｄ后测得稻秆的失重率为
６３．１％。
属∞ｏｃ谢凇ｓｐ．，Ⅺ１３９４３４），ＬＳ—１２为链霉菌属（Ｓ￡即一
￡ｏ哗ｅｓ
ｓｐ．，ＩＵｌ３９４３１）（图５），ＳＬＴ－１２为毛壳菌属
（吼。ｅ￡ｏｍｉｕｍｓｐ．，ＫＭ０９８０５３）（图６）。
３讨论
木质纤维素降解菌的筛选中，应根据筛选目的
和筛选所处阶段灵活采用多重评价标准。不同微生物特性不同，表现出来的酶活力与其对底物的降
２．６菌株鉴定结果
根据形态学，生理生化及１６ＳｒＲＮＡ或ＩＴＳ区序列比对结果表明，ｘＭ一３为弗留明拜叶林克氏菌
解能力间的相关性存在差异，微生物对真实底物的降解往往最能反映其实际应用潜力。本研究中，供试菌株在液态酵条件下对稻秆的降解效果普遍高
图５
ｘＭ－３、ＴＳ．３、Ｇ．１３和ＬＳ．１２的１６ＳｒＲＮＡ基因序列系统发育树
Ｐｈｙｌｏｇｅ耻ｔｉｃｔｒ∞０ｆＸＭ－３，ＴＳ－３，Ｇ－１３ａｎｄ
ＬＳ－１２１６Ｓ
ＦｉｇＩｌｒｅ５
ｒＩ斟Ａｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃ鹤
于对苦参残渣的降解（Ｐ＜０．０５），这与苦参残渣中木质素含量高且含有某些抑菌化学成分相关（杨雪云
理优化组合来构建复合菌系可以达到高效降解木质纤维素的目的。研究表明，单一的细菌、真菌和放线菌尽管活性较高，但在加速堆肥化进程中的效果却不如复合微生物菌群的共同作用，自然界中木质素纤维素的降解是真菌、细菌及相应微生物群落
等，２００８），同时也说明微生物对不同底物的降解能力和适应性存在差异。研究显示，细菌和真菌降解
木质纤维素的机理不同，真菌主要靠分泌多种胞外酶对木质纤维素进行降解；而大多数细菌对木质纤维素的降解是通过细胞表面酶进行的，需要附着在木质纤维素表面上才能将其降解（李振红，陆贻通，２００３）。本研究中，在复合菌系中分别除去细菌ＸＭ．３、ＴＳ一３和Ｇ一１３前后的滤纸酶活力相比差异不显著（Ｐ＞０．０５），这可能与大多细菌本身胞外酶活力低相关（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ
ｅｔ
共同作用的结果（蒋荣清等，２０１０）。崔宗均等
（２００２）利用酸碱互补的原则驯化得到高效复合菌系ＭＣｌ，该复合菌系在７２ｈ对滤纸的降解率为９４．０％。邱向阳等（２００３）在秸秆堆肥中以纤维素为唯一碳源筛选得到一批具有较高纤维素降解能力的微生物，通过正交实验得到４组复合菌剂可以在
３
ａ１．，２００２；赵彩云等，２００９）。
ｄ内快速启动滤纸条降解。王伟东等（２００５）利用
发酵液的酶活只能反映胞外酶活力大小，而非微生物对木质纤维素的降解能力。滤纸聚合度和结晶度中等，接近天然纤维素，滤纸酶活反映了纤维素酶的总糖化能力（傅力等，２０００），因而在纤维素降解菌的筛选中被广泛采用，同时也便于不同研究之间效果的比较。然而，微生物对天然木质纤维素材料的降解会更直接反映其降解能力及实际应用潜力。本研究中供试的４株真菌（ＬＡ一４，ＬＡ．９，Ｌｘ一１和ＳＬＴ－１２，图３）在液态发酵条件下对稻秆和苦参残渣均表现出较高的降解效果（Ｐ＜０．０５），而细菌和放线菌中仅有少数菌株对两者的降解效果相对较高，这说明真菌在木质纤维素的降解中通常发挥重要作用。此外，本研究采用ＣＭＣａｓｅ酶活、滤纸条
限制性培养技术经过多代驯化及优化得到高效复合菌系ＷＳＣ．６，该复合菌系在７２ｈ内对滤纸的降解率为９７．０％，对稻杆的降解率为２８．２％。崔诗法等（２００９）从枯枝落叶中分离到一组纤维素分解复合菌系Ｓｔ一１３，该复合菌系由平板可分离细菌和难培养细菌组成，该复合菌系５ｄ可使滤纸完全崩溃；本研究构建的复合菌系中菌株ｘＭ一３，可以在
４８
ｈ内将滤纸条完全崩解，效果强于上述己报道菌
株及菌株组合：经鉴定，菌株ｘＭ一３经鉴定为弗留
明拜叶林克氏菌，为一种固氮菌，这也是首次报道该菌具有较强的纤维素酶活和滤纸条崩解能力，后续可以开展该菌在降解纤维素过程中的固氮作用研究。刘甲锋等（２０１０）采用限制性培养技术与温度梯度诱导相结合的方法从土壤中筛选、构建出一组在中温条件下对水稻秸秆具有腐解功能的复合菌系ＲＳＳ一４，该复合菌系腐解１６ｄ对稻秆、纤维素及半纤维素的降解率分别达到了４５．０％、５５．５％和４４．１％。Ｙａｎｇ等（２００４）构建了一组由里氏木霉
崩解、对苦参和稻秆在液体和固态发酵下的降解等多重标准评价各菌株的活力，同时通过在复合菌系
中剔除某株菌来研究该菌株在复合菌系中的作用及其对其他菌株的影响，为木质纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建提供了一条有效途径。
将不同特性的高效木质纤维素降解菌通过合
（ｎｉｃ＾ｏ如ｒ，礼口ｒｅｅｓ反）、黑曲霉（Ａ５卵卿ＺＺ榔ｎ橱ｅｒ）和酒
图６真菌ＳＬＴ．１２的ＩＴＳ区基因序列系统发育树
ＦｉｇＩｌｒｅ６
Ｐｈｙｌｏｇｅ眦ｔｉｃ
ｔｒ∞ｏｆ劬ｇｉＳＬＴ－１２ｂ嬲ｅｄ
ｏｎ
ＩＴＳｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎ∞ｓ
４３０惫鉴警譬盖煞。眦。酬。科
精酵母（＆ｃｃ＾口ｒＤｍ”ｅｓｃｅＭ厶ｉ口∞）组成的复合菌系，该复合菌系的最高滤纸酶活力为５．６４Ｕ／ｇ，对稻壳
的降解率为２８．０５％。林捷等（２００６）用６株相互间无拮抗作用的纤维素分解菌进行混合发酵，大幅度提高了纤维素酶活力及对还原糖的耐受力。本研究中，通过构建复合菌系混合发酵培养，显著提高了其滤纸酶活力和对苦参残渣及稻秆的降解效果（Ｐ＜０．０５）。最终得到的复合菌系对苦参残渣和稻秆固态发酵２０ｄ的降解率分别达到３１．４％和６３．１％。苦参提取残渣和中药提取残渣一样，代表了一大类工业生产有机固体废弃物，此类废弃物木质纤维素含量高，堆肥化处理困难，关于此类物质处理的报道极少，本研究通过将不同菌株组合构建复合菌系显著提高了微生物对此类物质的降解，为堆肥化处理此类物质、开发堆肥接种剂提供了一条有效途径。同时，本研究所构建的复合菌系只有５株菌组成，生产工序简单，质量容易控制，在实际生产应用中操作性强。
４结论
本研究通过纤维素刚果红选择性培养基初筛得到大量纤维素降解菌，然后经过滤纸条崩解实验，对苦参残渣和稻杆在液态和固态发酵条件下的降解实验，层层筛选，最后通过拮抗和组合实验，最终构建了由弗留明拜叶林克氏菌、微杆菌属、芽胞杆菌属、链霉菌属和毛壳菌属５株菌组成的复合菌系。该复合菌系单一菌株活性高，对稻杆和苦参残渣具有较强的降解能力，且效果不比通过直接筛选法得到的复合菌系效果差；同时该复合菌系菌株组成简单、各菌株特性明确、在实际应用中质量容易
控制、实用性强，为堆肥接种剂的开发提供了一条
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（责任编辑
马丽萍）
高效纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建
作者：
作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
王海滨， 韩立荣， 冯俊涛， 张兴， WANG Hai-Bin， HAN Li-Rong， FENG Jun-Tao， ZHANG Xing陕西省生物农药工程技术研究中心,杨凌712100;西北农林科技大学植保资源与病虫害治理研究中心,杨凌712100
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology2015,23(4)
引用本文格式：王海滨.韩立荣.冯俊涛.张兴.WANG Hai-Bin.HAN Li-Rong.FENG Jun-Tao.ZHANG Xing 高效纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建[期刊论文]-农业生物技术学报 2015(4)
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高效纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建
王海滨“２韩立荣“２冯俊涛“２张兴“２’
ｌ陕西省生物农药工程技术研究中心，杨凌７１２１００２西北农林科技大学植保资源与病虫害治理研究中心，杨凌７１２１００＋通讯作者，ｚ１１）【ｉｎｇｌ９５２＠１２６．ｃｏｍ
摘要本研究旨在筛选高效纤维素降解菌，组建复合菌系，用于堆肥接种剂的开发。通过纤维素刚果
红选择性培养基，从腐殖土、堆肥样品中分离高效纤维素降解常温菌和耐高温菌。经过羧甲基纤维素酶
活（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ
ｃｅｌｌｕｌａｓｅ，ＣＭＣａｓｅ）、滤纸条崩解能力、对稻杆及苦参（Ｊｓｏｐ危ｏｍ触∥∞ｃｅ琊Ａｉｔ．）残渣在液态
和固态发酵条件下的降解能力测定逐级淘汰，筛选高效菌株组建复合菌系。研究结果表明，通过拮抗作
用、单一菌株在复合菌系中作用测定，最终构建了由３株细菌（弗留明拜叶林克氏菌（眈ｉ如ｒｉｎｃ七施
∥ｕｍｉ加瑚括）、微杆菌（肘记ｒ０６ｎｃ把一“ｍｓｐ．）和芽胞杆菌∞ｎｃ垅凇ｓｐ．）），ｌ株链霉菌（Ｊｓｆ阳ｌｐ￡ｏｍ弦∞ｓｐ．）和１株毛壳
菌（佩ｏｅｆｏｍｉＭｍｓｐ．）组成的木质纤维素降解高效复合菌系。供试菌株在液态发酵条件下对稻杆和苦参残
渣的降解效果明显强于固态发酵，稻杆比苦参残渣更容易被大多数微生物降解，供试真菌在稻杆和苦参
残渣的降解中普遍表现出较高的降解效果。筛选得到弗留明拜叶林克氏菌ｘＭ一３可以在４８ｈ内将滤纸条完全崩解，复合菌系在固态发酵２０ｄ后对苦参残渣和稻秆的降解率分别达到３１．４％和６３．１％。本研究
对堆肥接种剂的开发具有参考和借鉴意义。
关键词筛选，纤维素降解菌，滤纸崩解，复合菌系，苦参残渣
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｏｆＨｉｇｈｌｙ
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１Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ１＇ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｅｎｔｅｒＳｈａａｎｘｉＰｍｖｉｎｃｅ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ７１２ｌＯＯ，Ｃｈｉｎａ；２ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰ１ａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＲｅｓｏｕｒｃｅｓ
ＭａｎａｇｅｍｅｎｔＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＮｏｎｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉ吼Ｙａｎｇｌｉｎｇ７ｌ２ｌ００，Ｃｈｉｎａ
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４２２
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农业生物技术学报
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Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｄｅｇｍｄａｔｉｏｎｍｉｃｒｏｂｅｓ，Ｆｉｌｔｅｒｐ印ｅｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ
ｓｔｒａｉｎｓ，Ｒａｄｉｘ
１．ｅｓｊｄｌ】ｅｓ
中国的植物提取物产业如中药提取、植物源农药提取及食品加工等每年产生大量有机固体废弃物，仅
中药提取一项每年产残渣就达１５０万ｔ左右（Ｗａｎｇ
ｅｔ
ａ１．，２０１０）。此类废弃物一般采取焚烧、填埋等手段处理，既污染了环境又造成大量资源的浪费。堆肥是一
种处理大量有机固体废弃物的有效手段。植物提取
残渣中往往木质纤维素含量较高，而此类物质在堆肥过程中降解缓慢，腐熟周期长，成为制约其堆肥化处理的一大瓶颈。通过在堆肥过程中接种高效木质纤维素降解菌可以有效促进木质纤维素的降解，缩短堆肥发酵周期，加速堆肥腐熟，提高堆肥品质（王伟东等，２００８；刘佳等，２０１１）。因而，筛选具有木质纤维素酶活力的高效菌株，构建高效堆肥接种剂，成为堆肥化处理植物提取所产生大量有机固态残渣的有效手段（Ｚｅｎｇｅｔａ１．，２０１０）。
单一菌株作为堆肥接种剂作用有限，构建由不同特性的多菌株组成的复合菌系用于促进木质纤维素的降解或堆肥发酵，受到越来越多的重视（牛俊玲等，２００７）。复合菌系构建往往通过直接筛选或对已有高效菌株组合来实现。大多数研究采用直接筛选法，通过连续多代驯化培养得到复合菌系（Ｇｕｏ
ｅｔａ１．，２００８；２０１０；Ｈａｒｕｔａｅｔ
ａ１．，２００２；崔宗均
等，２００２），而利用不同高效菌株组合来构建复合菌系的研究较少。通过直接筛选法构建复合菌系，往往存在复合菌系中菌株组成种类多，鉴定困难，群落结构容易受到营养及环境条件影响等（崔诗法等，２００９）。通过对已有高效菌株进行组合，各菌株的特性明确，单一菌株活性高，质量和稳定性容易控制。本研究从腐殖土、堆肥样品中分离筛选高效木质纤维素降解菌株，然后通过合理优化组合构建高效复合菌系，为同类研究和堆肥接种剂的开发提供参考。
１材料与方法
１．１实验材料１．１．１样品来源
从渭南、杨凌、天水等地采集的腐殖土、堆肥样品用于常温菌的分离筛选。从牛粪和秸秆堆肥的高温期采样用于耐高温菌的分离筛选。
苦参残渣为豆科苦参属植物苦参（ｓｏｐ＾ｏｒ０．肛一秽船ｃｅ瑚Ａ∽根部经乙醇提取后的剩余物，本研究所
用苦参残渣来自山西德威生化有限公司。
１．１．２培养基
纤维素刚果红培养基：ＣＭＣ—Ｎａ２
ｇ／Ｌ，呷。）２Ｓ０４
２ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ０．５ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ。１ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０—７Ｈ：Ｏ０．５
ｇ／Ｌ，刚果红０．４ｇ／Ｌ，琼脂１２ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０。
滤纸条崩解培养基：（ＮＨ一）ｚＳＯ。１．０ｇ／Ｌ，Ｍｇ－
ＳＯ。‘７Ｈ：Ｏ０．５ｇ／Ｌ，ＫＨ：ＰＯ。１．Ｏ
ｇ／Ｌ，酵母膏０．１
ｇ／Ｌ，
滤纸条（１ｃｍ×６
ｃｍ）３条／三角瓶，ｐＨ
７．０。
羧甲基纤维素钠培养基：ＣＭＣ—Ｎａ
１０
ｇ／Ｌ，蛋
白胨２
ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ０．５，ＫｚＨＰｏ。１
ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０。。７Ｈ：Ｏ
０．５
ｇ／Ｌ，酵母膏０．５ｇ／Ｌ，琼脂１２∥Ｌ，ｐＨ
７．０。
稻杆及苦参残渣降解培养基：营养液Ａ包括蛋白胨２ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ。‘７ＨｚＯ
Ｏ．５ｇ／Ｌ，ＫＨｚＰＯ。１．０ｇ／Ｌ，
ＮａＣｌ０．５
ｇ／Ｌ，酵母膏０．５ｇ／Ｌ，ＣａＣｌｚ０．２
ｇ／Ｌ，ｐＨ
７．０；
营养液Ｂ成分同营养液Ａ，浓度为营养液Ａ的５倍。１．２实验方法
１．２．１常温菌的筛选和纯化
将采集的样品用无菌水逐级１０倍稀释至１０～、１０‘５和１０巧倍后，分别取０．１ｍＬ涂布于纤维素刚果红选择性培养基上，每个浓度涂５个平板，２８℃下培养，定期观察，挑取菌落周围出现清晰透明圈的菌株，通过划线法分离纯化。分别用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ），牛肉膏蛋白胨及高氏一号培养基培养真菌，细菌和放线菌，并用斜面低温保藏法保存（下同）。
１．２．２耐高温菌的筛选和纯化
取样品５ｇ加入１００ｍＬ蒸馏水，于６５℃水浴
７２
ｈ，然后稀释至ｌＯ～、１０。３和１０４倍后，分别吸取０．１ｍＬ涂布于纤维素刚果红选择性培养基上，４５℃培养，定期观察，挑取菌落周围出现清晰透明圈的菌株，通过划线法分离，纯化。
１．２．３
羧甲基纤维素酶（ＣＭＣａｓｅ）活性测定
将纯化后的菌株分别涂布于不同的营养琼脂
培养基平板（细菌用牛肉膏蛋白胨培养基、放线菌用高氏一号培养基、真菌用ＰＤＡ培养基），待菌落长出后，用打孔器打６ｍｍ的菌饼接种于纤维素刚果红平板，２８℃培养３ｄ后（耐高温菌４５℃培养），测量透明圈直径大小。１．２．４滤纸条崩解实验
滤纸条崩解实验可以反映不同菌株所分泌的各种纤维酶的综合酶活力水平。用无菌水将所获得的具有高ＣＭＣａｓｅ活性的菌株斜面培养物分别制成菌悬液，分别接种２ｍＬ于装有１００ｍＬ滤纸条崩解培养基的２５０ｍＬ三角瓶中，摇床培养（２８℃，
１３０
ｒ／ｍｉｎ），定期观察滤纸条崩解情况。耐高温菌
在４５℃，１３０ｒ／ｍｉｎ条件下培养（下同）。
１．２．５液态发酵降解稻杆及苦参残渣
将稻杆和苦参残渣粉碎，过６０目筛，５０℃烘至恒重。在每个三角瓶中加入１００ｍＬ营养液Ａ，然后分别加入２ｇ稻杆或苦参残渣，１２ｌ℃灭菌２０
ｍｉｎ，
各接种２ｍＬ菌悬液，２８℃，１３０ｒ／ｍｉｎ培养，耐高温菌在４５℃下培养。１０ｄ后，将培养物５０００×ｇ离心
１０
ｍｉｎ，弃上清，用盐酸和硝酸的混合液冲洗消除
菌体，５０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，用蒸馏水洗，５０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，１０５℃烘至恒重，计算失重率。对照不接种菌悬液（下同）。
１．２．６固态发酵降解稻杆及苦参残渣
在每个三角瓶中加入１５ｍＬ营养液Ｂ，再分别加入１０ｇ稻杆或苦参残渣，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，各接种２ｍＬ菌悬液，２８℃静置培养，每隔３ｄ用手摇匀一次。１０ｄ后培养物各加入１００ｍＬ蒸馏水，５
０００№
离心１０ｍｉｎ，弃上清，用盐酸和硝酸混合液冲洗消除菌体，５０００獬离心１０ｍｉｎ，用蒸馏水洗，５０００橹离心１０ｍｉｎ，１０５℃烘至恒重，计算失重率。
１．２．７拮抗实验
分别取各菌悬液０．５ｍＬ，用涂布器均匀涂于直径为１５０ｍｍ的羧甲基纤维素钠培养基上。将灭菌滤纸片（１ｃｍ×１ｃｍ）在各菌悬液中完全浸湿，然后
将滤纸片均匀分布，平铺于涂布了单一菌悬液的羧甲基纤维素钠培养基平板上。２８℃培养３ｄ后分别检查各菌株（滤纸片）和涂布于羧甲基纤维素钠培养基上单一菌株之间的拮抗活性。
１．２．８复合菌系中不同菌株组合粗酶液制备及滤纸酶活性（Ｆｐａｓｅ）测定
设置ｘＭ一３等单一菌实验组、６株菌组合即Ｔｏｔｏｌ实验组、除去１株菌之后任意５株菌的组合（例如除去ｘＭ一３的组合为Ｔ０１一ｘＭ一３实验组）等。将各菌株组合的菌悬液按照体积比１：１混合，分别接种２ｍＬ于苦参残渣降解培养基中ｆ成分同１．２．６），２８℃下静置培养，每隔３ｄ用手摇匀，保证物料均匀及氧气充足。每个处理设置３个重复。培养１０ｄ后，每个三角瓶中加入５０ｍＬ无菌水，室温下１２０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２
ｈ，８
０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，上
清作为粗酶液采用ＤＮＳ法（李合生，２０００）用于滤纸酶活测定，酶活力单位（ｕ），即每分钟产生１斗ｍｏｌ葡萄糖的酶量为１
Ｕ。
１．２．９复合菌系中不同菌株组合对苦参残渣降解能力测定
发酵方式同１．２．８，待发酵至第２０ｄ时，在各个三角瓶中加入１００ｍＬ无菌水，室温１２０ｒ／ｍｉｎ摇床ｈ，５
０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，弃上清，加入盐酸和
水洗，５０００獬离心１０ｍｉｎ，１０５℃烘至恒重，计算失重率。对照采用相同处理但不接种菌悬液。每个处理设置３个重复。１．２．１０菌株鉴定
细菌、放线菌采用形态、生理生化及１６Ｓ
ｒＲＮＡ
内转录间隔区（ｉｎｅｍａｌ仃ａｎｓｃ抽ｅｄｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）区序
列比对进行鉴定。细菌和放线菌总ＤＮＡ采用细菌
京），真菌总ＤＮＡ采用真菌基因组提取试剂盒提取
菌总ＤＮＡ为模板，
１４９２Ｒ：５’ＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣ３’。
ｒＲＮＡ序列。ＰＣＲ反应体Ｂｕ行．ｅｒ
５¨Ｌ，ＭｇＣｌ：３
ｕＬ，ｄＮＴＰ４“Ｌ，
ｐＬ，
ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／斗Ｌ）０．５此，加ｄｄＨ：Ｏ至５０
培养２
硝酸的混合液冲洗消除菌体，离心，弃上清，用蒸馏
序列比对进行鉴定；真菌采用形态及核糖体ＤＮＡ
基因组提取试剂盒提取（ＣＷ０５５２，康为世纪，北
（Ｄ３３９０—０１，０ｍｅｇａ，广州）。以提取的细菌和放线８Ｆ：５’ＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ３’：作引物扩增菌株的１６Ｓ系：１０×ＰＣＲ
模板１“Ｌ，引物８Ｆ和１４９２Ｒ（１０¨ｍｏｌ／Ｌ）各１
ｒ死ｑ
４２４篙譬主盏ａ。…酬。科
ｕＬ。ＰＣＲ反应条件：９５ｃＣ变性５
ｍｉｎ，９４
ｃＣ变性１菌（５株放线菌，１６株细菌，２株真菌）和２１６株常温菌。常温菌中５４株培养７２ｈ的透明圈直径超过
１０
ｍｉｎ，５４℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ。以提取的真菌总ＤＮＡ为模板，通用引物：
ＩＴＳｌ５．８ＳＦ：５’ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣ３’：ＩＴＳ４５．８ＳＲ：５’ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ３’。
ｍｍ，进行后续实验。
２．２滤纸条崩解实验
对筛选得到的５４株常温菌和２３株耐高温茵进一步测定了其各自的滤纸条崩解能力。测定结果表明，绝大多数菌株对滤纸条均有一定的崩解能力。２５ｄ内有２６株菌可以将滤纸条完全崩解（表１），其中包含１７株细菌、５株放线菌和４株真菌。常温细菌ｘＭ．３降解能力最强，可以在４８ｈ之内将滤纸条完全崩解（图２）。耐高温菌中，Ｇ一１３可以在
５
扩增菌株的ＩＴＳ序列。ＰＣＲ反应体系：１０×ＰＣＲ
Ｂｕ虢ｒ５斗Ｌ，ＭｇＣｌｚ
酶（５
３
ｐＬ，ｄＮＴＰ４肛Ｌ，模板１ｐＬ，引
物ＩＴＳｌ和ＩＴＳ４（１０斗ｍｏｌ／Ｌ）各ｌｐＬ，ｒ死ｇＤＮＡ聚合
Ｕ／¨Ｌ）０．２５皿，加ｄｄＨｚ０至５０肛Ｌ。ＰＣＲ反应
条件：９４ｃＣ预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，５３℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸５０ｓ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。用凝胶提取回收试剂盒纯化回收ＰＣＲ产物，送上海英骏生物技术公司测序。将所测１６Ｓ
ｒＲＮＡ
ｄ内将滤纸条完全崩解。
和ＩＴＳ区序列与ＧｅｎＢａｎｋ中己知的相关的序列进行多重比对，用ＣｌｕｓｔａｌＸ和Ｍｅｇａ４．Ｏ软件包进行序
２．３供试菌株对稻杆和苦参残渣降解实验
对２．２中２６株菌进一步测定了其对稻杆及苦参残渣的降解能力。
２．３．１
列比对和系统发育分析，并用Ｎｅｉ曲ｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ算
法构建系统发育树。１．３数据处理
采用ＳＰＳＳ１８．Ｏ软件对数据进行单因素方差分析及显著性检验。
液态发酵条件下，供试菌株对稻杆及苦参
残渣的降解效果
各菌株对稻秆和苦参残渣均表现出一定的降
解作用（图３Ａ）。其中，木霉菌（嘶ｃ危Ｄ如ｒｍｏｓｐ．）ＬＡ一
９对稻秆和苦参残渣的降解率最高（Ｐ＜Ｏ．０５），分别为３２．８％和１９．６％。细菌ＸＭ．３对稻秆和苦参残渣的降解率分别为２４．８％和１３．６％。放线菌ＬＳ．１２和
２结果与分析
２．１纤维素刚果红培养基筛选菌株
分离纯化得到２３９株菌可以在纤维素刚果红培养基上形成清晰透明圈（图１），包含２３株耐高温
ＴＳ．７对稻秆的降解率分别为２１．７％和２０．７％，对苦参残渣的降解率分别为８．１％和１２．３％。绝大多数菌株在液态发酵条件下对稻秆的降解作用显著大
图２菌株的滤纸条崩解效果
Ｆｎｔｅｒｐａｐｅｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｏｆｓｔｒａｉｎｓ
ＦｉｇｕＩ．ｅ２
ＸＭ．３培养第２天（Ａ）和ｘＭ一８培养第３天（Ｃ），左边为对照；Ｔｓ．３（Ｂ）和ＮＦ．２培养第９天（Ｄ），右边为对照。与对照相比，滤纸条完全崩解
ｘＭ一３２ｄｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ（Ａ）ａｎｄｘＭ．８３ｄｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ（Ｃ），ｒｅｓｐｅｃ—
ｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｌｅＲｗａｓｃｏｎ仃ｏｌ；ＴＳ一３（Ｂ）ａｎｄＮＦ一２（Ｄ）９ｄｃｕｌｔｉｖａｔ．ｅｄｆｏｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｒｉｇｈｔｗａｓｃｏｎ仃０１．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎ－ｏｌ，ｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｓｔｒｉｐｅｓｗｅｒｅｄｅｇｒａｄｅｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ
ｃｏｎ—
于其对苦参残渣的降解（Ｐ＜０．０５１。
２．３．２
ＸＭ一３、ＸＭ一８、ＷＳ一３、ＷＳ一４和ＴＳ一３在对两者的降解中也表现出了较高的活力。和液态发酵下相似，绝大多数菌株在固态发酵条件下对稻秆的降解作用
固态发酵条件下，供试菌株对稻秆及苦参残
渣的降解效果
固态发酵条件下对稻秆降解作用最强的菌株
为放线菌ＬＳ一１２（图３Ｂ），降解率达到了１９．Ｏ％（Ｐ＜０．０５）。其次，放线菌ＴＳ一７和真菌ＬＡ一９对稻秆的降解率分别为１７．９％和１８．３％。在供试菌株中，对苦参残渣降解作用最强的为真菌ＬＡ一９，降解率为１０．３％（Ｐ＜０．０５）。放线菌中的ＬＳ一１２和ＴＳ一７对稻秆及苦参残渣均表现出较强的降解作用，细菌中的
表１
２６株菌的滤纸条崩解实验
要高于其对苦参残渣的降解。
２．４复合菌系构建
根据ＣＭＣａｓｅ酶活力，滤纸条崩解能力及各菌株对稻杆和苦参残渣的降解效果，结合在堆肥过程中常温菌、耐高温菌及细菌、放线菌和真菌之间的协同作用，最终选取ｘＭ一３等１２株菌作为构建复合菌系的初选菌株。其中包含了细菌、放线菌和真
Ｔａｂｌｅｌ
Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆ６ｌｔｅｒｐａｐｅｒｓｔｒｉｐｅｓｄｅｇｒａｄａｔｊｏｎｂｙ２６ｓｔｒａｉｎｓ
＋：滤纸软化；＋＋：１／４降解；＋＋＋：１／２降解；＋＋＋＋：３／４降解；＋＋＋＋＋：完全降解；１～３：耐高温菌：４～２６：常温菌：下同
＋：Ｆｉｔｅｒｐ印ｅｒｓｏＲｅｎｅｄ；十＋：１／４ｄｅｇｒａｄｅｄ；＋＋＋：ｌ／２ｄｅｇｒａｄｅｄ；＋＋＋＋：３／４ｄｅｇｒａｄｅｄ；＋＋＋＋＋：Ａ１１ｄｅｇｒａｄｅｄ；ｌ～３：Ｈｉｇｈｔｅｍｐｅｍｔｕｒｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｉｃｍｏ唱ａｎｉｓｍｓ；４～２６：Ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃｍｉｃｒｏｏ唱ａｎｉｓｍｓ；Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
４２６淼臻当盖慧。。眦。ｈ山纠
菌，同时也包含了常温菌和耐高温菌。这１２株菌著的滤纸条崩解能力（表１）；ＴＳ一３、ＷＳ．３和ＷＳ．４三之间的拮抗作用结果见表２。从表２可以看出，菌者除具有较高的滤纸条崩解能力及对稻杆和苦参株ＸＭ．３和ＸＭ．８存在拮抗作用，同时Ｇ一２、Ｇ一３和残渣的降解能力外（表ｌ，图３和４），还具有较强的ＬＳ一１２均对ＸＭ一８产生拮抗作用。菌株ＷＳ．３与Ｇ一琼胶酶活力（结果未列出）；Ｇ一２、Ｇ一３和Ｇ—１３均可以２、Ｇ．３、Ｇ．１３及ＬＡ．９存在拮抗作用。３株耐高温菌耐受６５℃的高温，Ｇ一１３表现出相对较高的降解能中只有Ｇ—１３与其他菌株存在较少的拮抗作用。菌力（表ｌ，图３）；放线菌ＴＳ一７和ＬＳ一１２表现出较高残株ＴＳ一７和其他菌株具有较好的相容性。真菌中的渣降解活力和一定的表面活性（图３）。综上所述，ＬＡ．９与多株菌（ＷＳ一３，Ｇ一２，Ｇ一３和Ｇ一１３）存在拮抗选取ＸＭ一３、ＴＳ．３、Ｇ一１３、ＬＳ．１２、ＴＳ一７和ＳＬＴ＿１２这６作用。在１２株初选菌株中：ＸＭ一３和ＸＭ．８具有显
株菌组建复合菌系。
习稻杆
Ｒｉｃｅｓｔｒａｗ
ｊ苫参残渣Ｒａｄｉｘ
ｒｅｓｉｄｕｅｓ
ａ旱
∞１
蔷．董ｚ
蓁量２
２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７ｌ８１９２０２ｌ２２２３２４２５２６
菌株Ｓｔｒａｉｎｓ
Ａ
图３
２６株菌对稻杆及苦参残渣在液态（Ａ）和固态（Ｂ）发酵条件下的降解效果
Ｆ蟾ｕｒｅ３
Ｄｅｇｒａｄａｔｉ伽ｒａｔｅ
ｏｆｒｉｃｅｓｔｒａｗａｎｄ
ｍｄｉｘ
ｒｅｓｉｄｕｅｓｂｙ２６
ｓｔｒａｉ璐ｕｎｄｅｒＵｑｕｉｄ（Ａ）ａｎｄｓｏＩｉｄ（Ｂ）ｓｔａｔｅ
ｆｅ珊ｅｎｔａｔｉｏｎ
根据邓肯多重范围检验，不同字母表示处理间存在显著差异（Ｐ＜Ｏ．０５），菌株编号及相关信息见表ｌ，下同
ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＤｕｎｃａｎ’ｓｍｕｔｉｐｌｅｍｎｇｅｔｅｓｔ，ｄｉｆｒｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）ａｍｏｎｇ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，ＳｔｒａｉｎＮｏ
ａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ
ｓｅｅ
Ｔ曲ｌｅ
１．ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
表２１２株木质纤维素降解茵之间的拮抗活性
ＴａｂＩｅ２
Ｔｈｅａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｍｏｎｇ１２ｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈｌｉｇｎｏｃｅｌＩｕＩｏｓｅ
ｄｅｇｍｄｉｎｇａｂｉＩｉｔｙ
菌株
ＸＭ一３ＸＭ－８ＴＳ．３
ＷＳ．４ｗＳ一３
Ｇ一２Ｇ一３
Ｇ．１３
ＬＳ．１２
ＴＳ．７
ＬＡ一９
ＳＬｌ二１２
Ｓｔｒａｉｎｓ
＋＋十
什
抖
抖
抖
什＋
抖
＋
抖
一
一＋
一
抖
抖抖
＋
抖＋
抖抖
抖抖
什ｏ名，４抖
抖
抖
＋什抖
忖
ｏ
一
一一
＋什
一＋＋
＋＋
抖一一
＋
＋
抖
一
Ｈ＋
＋
一¨
什
＋＋
＋
抖
＋
Ⅲ煳；垒啪∞叭峪；查№邮３他７母ｕ
～：具有拮抗作用；＋：菌株间无明显拮抗作用但不能交叉生长；＋＋：菌株间无拮抗作用，可以交叉生长
～：ＡｎｔａｇｏｎｉｓｍｂｅＭｅｅｎＭｏ
ｓｔｒａｉｎｓ；＋：Ｎｏｓｉｇｌｌｍｃａｎｔａｎｔａｇｏｎｉｓｍｂｅｔ、ｖｅｅｎ
Ｍｏ
ｓ仃ａｉｎｓ，ｂｕｔ
ｎｏ
ｃｍｓｓｇｒｏ、＾，ｔｈ；＋＋：Ｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ａｎ—
ｔａｇｏｎｉｓｍ
ｂｅ帆ｅｅｎＭｏ
ｓｔｒａｉｎｓ，ａｎｄ
ｃｍｓｓ伊。叭ｈ
２．５单一菌株在复合菌系中的作用测定
为了用最少的菌株构建对木质纤维素降解能力尽可能强的复合菌系，通过测定不同菌株组合的滤纸酶活力和对苦参残渣的降解，进一步测定了复合菌系中单一菌株在复合菌系中发挥作用的大小。
２．５．１
系滤纸酶活力的影响较小。
２．５．２不同菌株组合对苦参残渣的降解
由图４Ｂ可知，不同菌株处理对苦参残渣的降解效果存在较大差异。不同菌株组合对苦参残渣
的降解效果均未显著低于任何单一菌株（Ｐ＞Ｏ．０５），
说明单一菌株所分泌酶的种类和数量有限，不及复合菌系，苦参残渣的降解需要多种酶的协同作用。
不同菌株组合的滤纸酶活力
由图４Ａ可以看出，除Ｔｏｔ—ＬＳ．１２外，各复合菌
系的滤纸酶活力均显著高于单一菌株（Ｐ＜０．０５），说
明通过构建复合菌系的方法可以显著提高菌系的滤纸酶活力水平。在单一菌株中，３株细菌（ｘＭ一３，ＴＳ一３和Ｇ一１３）的滤纸酶活力要显著低于放线菌（ＬＳ一１２）和真菌（ＳＬＴ－１２）（Ｐ＜０．０５），其中以真菌ＳＬＴ－１２的酶活力最高。复合菌系中Ｔｏｔ—ＴＳ一７的酶活力最高，表明放线菌ＴＳ一７在菌株群体的生长增殖过程中，可能与其他菌株存在营养或空间的竞争，从而对其他菌株产生了一定的抑制作用，导致复合菌系整体酶活力的降低。而Ｔ０ｔ—ＬＳ—１２和Ｔｏｔ—ＳＬＴ－１２与Ｔｏｔａｌ相比，酶活力显著降低（Ｐ＜０．０５），说明放线菌ＬＳ．１２和真菌ｓＬＴ－１２在复合菌系中发挥很重要的作用，能提高整个菌系的酶活力。Ｔｏｔ—ｘＭ一３、Ｔｏｔ—ＴＳ一３和Ｔ０ｔ—Ｇ一１３三者与Ｔｏｔｏｌ之间的酶活力差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明３株细菌的存在与否对复合菌
单一菌株处理中，真菌ＳＬＴ．１２对苦参残渣的降解
率显著高于其他菌株（Ｐ＜０．０５），而细菌ＴＳ一３对苦参残渣的降解率最低（Ｐ＜０．０５），说明在对天然木质纤维素材料的降解过程中真菌往往发挥重要作用。与Ｔｏｔｏｌ相比，Ｔｏｔ—ＬＳ．１２、Ｔｏｔ—ＳＬ卫１２、Ｔｏｔ—ＸＭ一３和Ｔｏｔ—ＴＳ．３的降解率均显著降低（尸＜０．０５），说明复合菌系中ＬＳ—１２、ＳＬＴ－１２、ｘＭ一３和ＴＳ一３在对苦参残渣的降解中均发挥了重要作用，特别是ＬＳ一１２和ＳＬＴ－１２。Ｔｏｔ—Ｇ．１３与Ｔｏｔｏｌ对苦参残渣的降解率差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明耐高温细菌Ｇ一１３在复合菌系中发挥的作用较小，可能与其在常温下与其他菌株相比，竞争力不足相关；同时也说明该菌株对复合菌系中其他菌株作用的发挥没有负面影响，在堆肥的高温阶段，该菌株将发挥作用。与Ｔｏｔｏｌ相比，Ｔ０ｔ—ＴＳ一７对苦参残渣的降解率显著升高（Ｐ＜０．０５１，达到３１．４％，这说明放线菌ＴＳ．７对复合菌系
ｆ
一宣３
￥蜒避螺煺
１２３４５６７８９１０ｌｌ１２１３
Ｂ
组别Ｇｒｏｕｐｓ
图４不同菌株处理发酵液的滤纸酶活力（Ａ）和对苦参残渣的降解（Ｂ）
ＦｉｇＩｌｒｅ４
Ｆｐ鹪ｅａｃｔｉｖｉｔｉ鼯（Ａ）ａｎｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ
ｏｆｍｄｉｘｒ鹪ｉｄｕ髂（Ｂ）ｏｆｔｈｅｄｉ仃ｅｒｅｎｔｓｔｒａｉ璐ｔｒｅａｔｅｄｃｕｌｔ町ｅ
ｍｅｄｉ岫
１：ｘＭ．３：２：ＴＳ．３；３：Ｇ．１３；４：Ｔｓ．７；５：ＬＳ一１２；６：ｓＬＴ．１２；７：除ｘＭ一３之外的其他５株菌（Ｔｏｔ．ｘＭ．３）；８：除ＴＳ一３之外的其他５株菌（Ｔｏｔ．ＴＳ．３）；９：除Ｇ．１３之外的其他５株菌（Ｔｏｔ—Ｇ一１３）；１０：除ＴＳ．７之外的其他５株菌（Ｔｏｔ—ＴＳ－７）；１１：除ＬＳ－１２之外的其他５株菌（Ｔｏｔ．ＬＳ一１２）；１２：除Ｓｕ二１２之外的其他５株菌（Ｔｏｔ．Ｓｕ二１２）；１３：１～６株菌的组合（Ｔｏｔ０１）；下同
ｌ：ＸＭ．３：２：ＴＳ．３：３：Ｇ．１３；４：ＴＳ一７；５：ＬＳ．１２；６：Ｓ【ｊｒ－１２；７：Ｔｈｅｏｍｅｒ５ｓｔａｉｎｓｗｉｍｏｕｔｘＭ－３（Ｔｂｔ－ＸＭ一３）；８：Ｔｈｅｏｔｈｅｒ５ｓｔａｉｎｓ
ｗｉｔｈｏｕｔＴＳ．３ｆＴｏｔ—ＴＳ．３）；９：Ｔｈｅｏｔｈｅｒ５ｓｔａｉｎｓｗｉｔｈｏｕｔＧ－１３（Ｔｏｔ－Ｇ一１３）；１０：Ｔｈｅｏｔｈｅｒ５ｓｔａｉｎｓｗｉｔｈｏｕｔｏｔｈｅｒ５ｓｔａｉｎｓｗｉｍｏｕｔＬＳ．１２（Ｔｏｔ—ＬＳ．１２）；１２：Ｔｈｅｏｔｈｅｒ５ｓｔａｉｎｓｗｉｔｈｏｕｔ
ＴＳ一７（Ｔｏｔ—ＴＳ一７）；１１：Ｔ１１ｅ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆ
１～６
ＳＬ，Ｔ－１２（Ｔｏｔ—ＳＬＴ二１２）；１３：Ｓｔｒａｉｎ
（Ｔｂｔ０１）；Ｔｈｅ
ｓ锄ｅ
ｂｅｌｏｗ
４２８盏兰警譬淼。。龇。㈦咧
中其他菌株产生了一定的抑制作用，限制了其他菌
（日Ｐ咖一聊七沉∥Ⅱｍｉ舶ｍ厶，ＫＰ３９８５６２），Ｔｓ－３为微杆菌属（心ｃｒ０６０ｃ把ｒｉＭｍｓｐ．，Ⅺ１３９４３５），Ｇ一１３为芽胞杆菌
对苦参残渣的有效降解。
综上表明，复合菌系中去掉放线菌ＴＳ一７就可以有效提高整个复合菌系的滤纸酶活力和对苦参残渣的降解能力。本研究最终确定将ｘＭ一３、ＴＳ一３、Ｇ一１３、ＬＳ—１２和ＳＬＴ－１２作为构建复合菌系的最终菌株。
将上述５株菌按照体积比１：ｌ混合接种于固体稻秆降解培养基，发酵２０ｄ后测得稻秆的失重率为
６３．１％。
属∞ｏｃ谢凇ｓｐ．，Ⅺ１３９４３４），ＬＳ—１２为链霉菌属（Ｓ￡即一
￡ｏ哗ｅｓ
ｓｐ．，ＩＵｌ３９４３１）（图５），ＳＬＴ－１２为毛壳菌属
（吼。ｅ￡ｏｍｉｕｍｓｐ．，ＫＭ０９８０５３）（图６）。
３讨论
木质纤维素降解菌的筛选中，应根据筛选目的
和筛选所处阶段灵活采用多重评价标准。不同微生物特性不同，表现出来的酶活力与其对底物的降
２．６菌株鉴定结果
根据形态学，生理生化及１６ＳｒＲＮＡ或ＩＴＳ区序列比对结果表明，ｘＭ一３为弗留明拜叶林克氏菌
解能力间的相关性存在差异，微生物对真实底物的降解往往最能反映其实际应用潜力。本研究中，供试菌株在液态酵条件下对稻秆的降解效果普遍高
图５
ｘＭ－３、ＴＳ．３、Ｇ．１３和ＬＳ．１２的１６ＳｒＲＮＡ基因序列系统发育树
Ｐｈｙｌｏｇｅ耻ｔｉｃｔｒ∞０ｆＸＭ－３，ＴＳ－３，Ｇ－１３ａｎｄ
ＬＳ－１２１６Ｓ
ＦｉｇＩｌｒｅ５
ｒＩ斟Ａｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃ鹤
于对苦参残渣的降解（Ｐ＜０．０５），这与苦参残渣中木质素含量高且含有某些抑菌化学成分相关（杨雪云
理优化组合来构建复合菌系可以达到高效降解木质纤维素的目的。研究表明，单一的细菌、真菌和放线菌尽管活性较高，但在加速堆肥化进程中的效果却不如复合微生物菌群的共同作用，自然界中木质素纤维素的降解是真菌、细菌及相应微生物群落
等，２００８），同时也说明微生物对不同底物的降解能力和适应性存在差异。研究显示，细菌和真菌降解
木质纤维素的机理不同，真菌主要靠分泌多种胞外酶对木质纤维素进行降解；而大多数细菌对木质纤维素的降解是通过细胞表面酶进行的，需要附着在木质纤维素表面上才能将其降解（李振红，陆贻通，２００３）。本研究中，在复合菌系中分别除去细菌ＸＭ．３、ＴＳ一３和Ｇ一１３前后的滤纸酶活力相比差异不显著（Ｐ＞０．０５），这可能与大多细菌本身胞外酶活力低相关（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ
ｅｔ
共同作用的结果（蒋荣清等，２０１０）。崔宗均等
（２００２）利用酸碱互补的原则驯化得到高效复合菌系ＭＣｌ，该复合菌系在７２ｈ对滤纸的降解率为９４．０％。邱向阳等（２００３）在秸秆堆肥中以纤维素为唯一碳源筛选得到一批具有较高纤维素降解能力的微生物，通过正交实验得到４组复合菌剂可以在
３
ａ１．，２００２；赵彩云等，２００９）。
ｄ内快速启动滤纸条降解。王伟东等（２００５）利用
发酵液的酶活只能反映胞外酶活力大小，而非微生物对木质纤维素的降解能力。滤纸聚合度和结晶度中等，接近天然纤维素，滤纸酶活反映了纤维素酶的总糖化能力（傅力等，２０００），因而在纤维素降解菌的筛选中被广泛采用，同时也便于不同研究之间效果的比较。然而，微生物对天然木质纤维素材料的降解会更直接反映其降解能力及实际应用潜力。本研究中供试的４株真菌（ＬＡ一４，ＬＡ．９，Ｌｘ一１和ＳＬＴ－１２，图３）在液态发酵条件下对稻秆和苦参残渣均表现出较高的降解效果（Ｐ＜０．０５），而细菌和放线菌中仅有少数菌株对两者的降解效果相对较高，这说明真菌在木质纤维素的降解中通常发挥重要作用。此外，本研究采用ＣＭＣａｓｅ酶活、滤纸条
限制性培养技术经过多代驯化及优化得到高效复合菌系ＷＳＣ．６，该复合菌系在７２ｈ内对滤纸的降解率为９７．０％，对稻杆的降解率为２８．２％。崔诗法等（２００９）从枯枝落叶中分离到一组纤维素分解复合菌系Ｓｔ一１３，该复合菌系由平板可分离细菌和难培养细菌组成，该复合菌系５ｄ可使滤纸完全崩溃；本研究构建的复合菌系中菌株ｘＭ一３，可以在
４８
ｈ内将滤纸条完全崩解，效果强于上述己报道菌
株及菌株组合：经鉴定，菌株ｘＭ一３经鉴定为弗留
明拜叶林克氏菌，为一种固氮菌，这也是首次报道该菌具有较强的纤维素酶活和滤纸条崩解能力，后续可以开展该菌在降解纤维素过程中的固氮作用研究。刘甲锋等（２０１０）采用限制性培养技术与温度梯度诱导相结合的方法从土壤中筛选、构建出一组在中温条件下对水稻秸秆具有腐解功能的复合菌系ＲＳＳ一４，该复合菌系腐解１６ｄ对稻秆、纤维素及半纤维素的降解率分别达到了４５．０％、５５．５％和４４．１％。Ｙａｎｇ等（２００４）构建了一组由里氏木霉
崩解、对苦参和稻秆在液体和固态发酵下的降解等多重标准评价各菌株的活力，同时通过在复合菌系
中剔除某株菌来研究该菌株在复合菌系中的作用及其对其他菌株的影响，为木质纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建提供了一条有效途径。
将不同特性的高效木质纤维素降解菌通过合
（ｎｉｃ＾ｏ如ｒ，礼口ｒｅｅｓ反）、黑曲霉（Ａ５卵卿ＺＺ榔ｎ橱ｅｒ）和酒
图６真菌ＳＬＴ．１２的ＩＴＳ区基因序列系统发育树
ＦｉｇＩｌｒｅ６
Ｐｈｙｌｏｇｅ眦ｔｉｃ
ｔｒ∞ｏｆ劬ｇｉＳＬＴ－１２ｂ嬲ｅｄ
ｏｎ
ＩＴＳｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎ∞ｓ
４３０惫鉴警譬盖煞。眦。酬。科
精酵母（＆ｃｃ＾口ｒＤｍ”ｅｓｃｅＭ厶ｉ口∞）组成的复合菌系，该复合菌系的最高滤纸酶活力为５．６４Ｕ／ｇ，对稻壳
的降解率为２８．０５％。林捷等（２００６）用６株相互间无拮抗作用的纤维素分解菌进行混合发酵，大幅度提高了纤维素酶活力及对还原糖的耐受力。本研究中，通过构建复合菌系混合发酵培养，显著提高了其滤纸酶活力和对苦参残渣及稻秆的降解效果（Ｐ＜０．０５）。最终得到的复合菌系对苦参残渣和稻秆固态发酵２０ｄ的降解率分别达到３１．４％和６３．１％。苦参提取残渣和中药提取残渣一样，代表了一大类工业生产有机固体废弃物，此类废弃物木质纤维素含量高，堆肥化处理困难，关于此类物质处理的报道极少，本研究通过将不同菌株组合构建复合菌系显著提高了微生物对此类物质的降解，为堆肥化处理此类物质、开发堆肥接种剂提供了一条有效途径。同时，本研究所构建的复合菌系只有５株菌组成，生产工序简单，质量容易控制，在实际生产应用中操作性强。
４结论
本研究通过纤维素刚果红选择性培养基初筛得到大量纤维素降解菌，然后经过滤纸条崩解实验，对苦参残渣和稻杆在液态和固态发酵条件下的降解实验，层层筛选，最后通过拮抗和组合实验，最终构建了由弗留明拜叶林克氏菌、微杆菌属、芽胞杆菌属、链霉菌属和毛壳菌属５株菌组成的复合菌系。该复合菌系单一菌株活性高，对稻杆和苦参残渣具有较强的降解能力，且效果不比通过直接筛选法得到的复合菌系效果差；同时该复合菌系菌株组成简单、各菌株特性明确、在实际应用中质量容易
控制、实用性强，为堆肥接种剂的开发提供了一条
新的途径。
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（责任编辑
马丽萍）
高效纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建
作者：
作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
王海滨， 韩立荣， 冯俊涛， 张兴， WANG Hai-Bin， HAN Li-Rong， FENG Jun-Tao， ZHANG Xing陕西省生物农药工程技术研究中心,杨凌712100;西北农林科技大学植保资源与病虫害治理研究中心,杨凌712100
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology2015,23(4)
引用本文格式：王海滨.韩立荣.冯俊涛.张兴.WANG Hai-Bin.HAN Li-Rong.FENG Jun-Tao.ZHANG Xing 高效纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建[期刊论文]-农业生物技术学报 2015(4)