生物工程学报 C hin J Biotech 2008, October 25; 24(10): 1818-1823 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 [email protected] 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved
通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定
陈兴启*, 孙达权*, 刘凤军, 贾淑玲, 张涌
西北农林科技大学动物医学院生物工程研究所, 杨凌 712100
摘 要: 为了构建适合大多数基因座位点打靶的通用型基因打靶载体及打靶成功后去除正选择标记基因, 以克隆载体pGEM-3Z 为骨架, 插入了一个正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neo ) 、两个相同的负选择标记基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk1和HSV-tk2, 并在neo 的两侧各添加了一个方向相同的LoxP(locus of crossing-over (x) in P1)序列及两个不同的多克隆位点序列, 从而构建了载体pA2T 。插入的两个不同的多克隆位点序列中, neo 和HSV-tk1之间的多克隆位点序列有8个稀少的酶切位点、neo 和HSV-tk2之间的多克隆位点序列有5个稀少的酶切位点, neo 、HSV-tk1和HSV-tk2有各自独立的转录单元。脂质体法转染山羊成纤维细胞, 用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GAC)进行正负筛选, 验证了正负选择标记基因的生物活性, 证明通用型基因打靶载体pA2T 构建成功。载体pA2T 转化组成性表达Cre 重组酶(Cyclization recombination protein)的大肠杆菌BM25.8, 检测到LoxP 序列的生物活性, 结果表明pA2T 中的正选基因可以被Cre 重组酶去除。因此, 本研究所构建的通用型基因打靶载体pA2T, 根据不同的基因座设计同源臂后, 插入到MCS 中可直接用于不同基因座位点的打靶, 并能够在打靶成功后用Cre 重组酶去除基因组中插入的neo 基因, 为用基因打靶的方法制作转基因动物提供了便利。
关键词: 转基因动物, 通用型基因打靶载体, LoxP序列, Cre重组酶
Construction of Universal Vector for Gene Targeting and Analysis of Its Function
Xingqi Chen*, Daquan Sun*, Fengjun Liu, Shuling Jia, and Yong Zhang
Institute of Biotechnology, College of Animal Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, China
Abstract : To make a universal gene targeting vector fitting for most gene and delete positive selection gene after targeting
successfully, a vector named pA2T was constructed by inserting one neomycin gene (neo ) for positive selection and two same herpes simplex virus thymidine kinase gene HSV-tk1 and HSV-tk2 for negative selection into the vector of pGEM-3Z, and two locus of crossing-over (x) in P1 (LoxP) and two different multiple cloning sites (MCS) were inserted into two flanks of neo separately. There were eight rare cloning sites between neo and HSV-tk1 and five rare cloning sites between neo and HSV-tk2, and neo , HSV-tk1 and HSV-tk2 could be translated respectively in the pA2T. Transfection of the pA2T into goat fetus fibroblast cells with LipofectamineTM 2000 conferred resistance to geneticin (G418) and resistance to ganciclovir (GAC) in the cells, which suggested the positive and negative selectable markers could express in the cells and thus the vector pA2T could be used as a universal gene targeting vector. Transformation of the pA2T into the BM25.8 expressing Cre recombinase conferred neo was deleted in the pA2T, which suggested the LoxP was active. Thus, this vector can be inserted by most gene sequences as homologous sequences and positive selection gene
Received : February 26, 2008; Accepted : April 16, 2008
Supported by: the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2004AA213072). Corresponding author: Yong Zhang. Tel: +86-29-87080085; E-mail: [email protected] 国家高技术研究发展计划项目(“863计划”) (No. 2004AA213072)资助。 * They are the co-first authors.
陈兴启等: 通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定
1819
can be deleted after targeting successfully, which is very convenience for the production of transgenic animals using gene targeting method.
Keywords : transgenic animals, universal gene targeting vector, LoxP sequence, Cre recombinase
转基因动物在基因功能研究、人类疾病模型建立、乳腺生物反应器的研制及家畜的转基因育种等研究领域中都有重要的意义[1−6]。克隆羊多莉的诞生[7], 使以体细胞为遗传操作单元的转基因细胞制作结合体细胞核移植技术生产转基因动物成为可能, 其中供核转基因细胞的制作中转基因载体的构建是其关键步骤之一。目前应用于转基因细胞制作的载体主要有病毒载体、普通质粒载体及基因打靶载体。其中病毒载体因其高效的感染性受到许多学者的青睐, 但病毒载体存在插入位点的不可预测性和承载外源基因长度有限的问题; 普通质粒载体虽然有较大的承载量, 但存在整合效率低和多拷贝插入的缺陷; 而基因打靶载体可对细胞进行单拷贝基因定位修饰, 并且能够稳定的遗传。迄今为止用基因打靶的方法已经生产出了转基因牛、羊、鼠[2, 6−8]。基因打靶技术的关键步骤之一是基因打靶载体的构建, Mansoor等[9]提出的正负筛选基因打靶策略能很好的筛选打靶成功的细胞克隆, 正选标记基因用于筛选阳性克隆, 负选标记基因通过排除假阳性进一步富积阳性克隆。对于不同的基因打靶位点, 分别构建打靶载体涉及骨架载体的选择、正负选基因的连接及鉴定、多克隆的设计、同源臂的插入等烦琐的过程。虽然出现了带有正负选基因及多克隆位点序列的通用型基因打靶载体[10], 但是酶切位点太少限制了这些载体的应用范围。
现行用基因打靶方法生产的转基因动物基因组中, 都整合有正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neo ) [2, 6−8, 11], neo 的存在会影响中靶细胞及转基因动物个体的生长和正常生理状况, 同时增加了后期研究工作的影响因素。LoxP(Locus of crossing- over(x) in P1)序列由2个13 bp的反向重复序列和1个8 bp的间隔区域构成。Cre 重组酶(Cyclization recombination protein)是一种位点特异性重组酶, 它能使2个同向LoxP 之间的序列删除或重排[12], 是由Sternberg 等[13] 于1981年从P1噬菌体中发现, 属于λ Int酶超基因家族。由于Cre 重组酶的表达可以进行精确的时空调控, 所以, Cre/LoxP系统在基因打
靶研究工作中有越来越多的应用[14, 15]。
本研究以克隆载体pEGM-3Z 为骨架, 在其多克隆位点中插入了1个正选择标记neo 、2个负选择标记HSV-tk1 和HSV-tk2, 并在neo 的两侧各添加了一个方向相同的LoxP 序列, 从而构建了载体pA2T, 载体中包含有2个含有稀少酶切位点的多克隆位点, 并对此载体中的正负选择标记基因及Loxp 序列的生物活性进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌株
pGEM-Teasy 载体和pGEM-3Z 载体购自Promega 公司, pMCIneoployA 载体购自Stratagene 公司, pORF-HSVtk载体购自Invivogen 公司, 大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BM25.8由本室保存。 1.1.2 工具酶和试剂
各种内切酶购自MBI 公司, 质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自Promega 公司, T4 DNA连接酶、Klenow Fragment和CIAP 购自TaKaRa 公司, G418购自Invitrogen 公司, GAC购自Invivogen 公司, DMEM 和DMEM/F12购自Invitrogen 公司, Lipofectamine TM2000购自Invitrogen 公司。 1.1.3 合成和测序
引物合成与测序在Invitrogen 公司, 多克隆位点序列在上海捷瑞公司合成。 1.1.4 山羊成纤维细胞
由本室冻存。
1.2 载体的构建
1.2.1 pGT 和pTK 的构建
Not I、Swa I双酶切载体pORFHSV-tk, 胶回收包括启动子及polyA 序列的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk ), Klenow Fragment补平后克隆入Sma I 单酶切的载体pGEM-3Z, 分别用Bam H I、Sal I 、Pst I 、Nhe I/Nco I 酶切载体, 鉴定阳性克隆pGT 。设计引物Ptk1(5′-3′): GGCCGCAATAAAAATCTTTATTT及Ptk2(5′-3′): AAATGGATCTACCACATTTGTAGAG
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1820 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech October 25, 2008 Vol.24 No.10
G, 以pORFHSV-tk 为模板扩增包括启动子及polyA 序列的HSV-tk , 凝胶回收PCR 产物并克隆入载体pGEM-Teasy 中, 分别Pst I 、Not I用酶切载体, 鉴定阳性克隆pTK 。 1.2.2 pGN 的构建
合成一段含Xba I、Sgs I、Bpu1120 I、Bsp1407 I 、Nhe I、Eco R I、Not I、Xho I 、Bam H I、Sal I 、Bsu15 II、Bst1107 I、Pf123 II、Spe I、Pst I、Sac II、Xba I酶切位点的多克隆位点序列, 其中Xho I和Sal I 两侧各有一段方向相同的LoxP(5′-ATAACTTCGTATAGCATA CATTATACGAAGTTAT-3′), 合成的序列位于载体pGH 上。Xho I 、Sal I双酶切载体pMCIneoployA 凝胶回收包括启动子及ployA 序列的neo , 克隆入已用相应酶切的pGH 中, Xho I、Sal I双酶切鉴定阳性克隆pGN 。 1.2.3 pA2T的构建
Spe I 、Sac II 分别双酶切载体pTK 和pGN, 分别凝胶回收pTK 中的包括启动子及ployA 序列的HSV-tk 和pGN 中的长片段, 连接2个回收片段, Spe I、Sac II 双酶切鉴定阳性克隆载体pAT 。Xba I分别单酶切载体pGT 和载体pAT, 凝胶回收酶切载体pGT 并用CIAP 去除5′端磷酸基团, 凝胶回收酶切载体pAT 中长片段, T4 DNA连接酶连接2个回收片段, 分别用Sac II、Sfi I 、Kpn I、Bam H I酶切鉴定阳性克隆pA2T, 测序验证。
分别加入相应浓度药物, 1周内观察筛选结果。
1.4 pA2T 转化大肠杆菌BM25.8
将载体pA2T 转化组成性表达Cre 酶的大肠杆菌BM25.8, 提取BM25.8中质粒命名为pA2T2, Bam H I分别酶切pA2T 和pA2T2凝胶电泳, 电泳检测, 比较两载体的酶切结果。用引物Pneo1(5′-3′): CCAGGTCCACTTCGCATATTAAGGT 及Pneo2(5′-3′): CGGATCCCCTCAGAAGAACTCGTCA, 分别以pA2T2和pA2T 为模板进行PCR 扩增, 电泳检测。
2 结果与分析
2.1 通用型基因打靶载体酶切鉴定及分析 2.1.1 载体pGT 和载体pTK 酶切鉴定及分析
HSV-tk 编码的蛋白产物以丙氧鸟苷(GAC)为底物, 将其代谢成对细胞有毒性的物质, 使细胞死亡, 而细胞中胸苷激酶基因编码的蛋白不能代谢GAC, 根据这一原理基因打靶载体选用单纯疱疹病毒胸苷激酶基因做为负选择标记基因, 插入到同源序列的一侧用于排除随机插入的细胞克隆[9]。当打靶载体随机整合到细胞的基因组上时, HSV-tk 也被整合到细胞的基因组上, 细胞就不能在含有GAC 的药物培养基中存活; 当打靶载体通过同源重组整合到细胞基因组中, HSV-tk 被去除, 细胞得以在含有正负药物筛选的培养基中存活。本试验分别用酶切和PCR 的方法构建了含有一个HSV-tk 的载体pGT 和载体pTK, 便于后续工作中加入到打靶载体中。根据HSV-tk 基因上的酶切位点和pGEM-3Z 本身上的酶切位点酶切鉴定载体pGT(图1) 和载体pTK(图2), 根据片段长度确定pGT 和pTK 连接成功。
1.3 细胞转染和相关检测
1.3.1 遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GAC)筛选浓度
测定
第4代山羊成纤维细胞分别加入浓度梯度的G418和GAC 筛选1周, 统计G418的最大致死浓度和GAC 的最小致死浓度。 1.3.2 质粒转染
将pA2T 按照LipofectamineTM2000使用说明书转染山羊第4代成纤维细胞。 1.3.3 质粒的抗药性检测
把转染的细胞分为A 、B 、C 、D 、E 、F 六组, 按照测定的G418的最大致死浓度和GAC 的最小致死浓度进行药物筛选, A组为正常生长对照组, B组为转染载体后培养液中加入G418筛选组, C组为转染载体后G418和GAC 筛选组, D组为转染载体后GAC 筛选组, E组为转染载体后正常培养组, F组是不转染载体加入负选药物组。转染载体24 h后各组
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图1 质粒pGT 的酶切鉴定
Fig. 1 Identification of pGT plasmid
M: molecular weight marker ; 1~4: the plasmid was digested with
Bam H I, Sal I, Pst I, Nhe I/Nco I, respectively; 6: PCR fragment of tk
陈兴启等: 通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定
1821
因, 连接后构建成载体pA2T, 酶切鉴定载体pA2T (图3), 确定连接正确, 经测序进一步得到证实。构建的载体pA2T(图4) 含有一个正选择标记基因neo 和2个相同的负选择标记基因HSV-tk1和HSV-tk2, neo 、HSV-tk1及neo 和HSV-tk2之间各有一段MCS, 分别含有8个和5个稀少的酶切位点, 可用于同源臂序列的插入, neo 、HSV-tk1和HSV-tk2有各自独立的转录单元。
图2 质粒pTK 的酶切鉴定
Fig. 2 Identification of pTK pladmid by enzyme digestion
M: molecular weight marker; 1, 2: the plasmid was digested with
Pst I, Not I respectively
2.1.2 pGN 酶切鉴定及分析
基因打靶过程也是同源重组的过程, 同源臂序列插入到打靶载体中是打靶载体构建的关键, 因此打靶载体中要有合适的酶切位点适合于同源臂序列的插入, 通用型打靶载体中应有足够多的酶切位点适合为同源臂的插入。pGH 上合成的多克隆位点序列中含有多个酶切位点, 便于不同序列作为同源臂插入。neo 编码的产物新霉素磷酸转移酶能分解遗传霉素(G418), 将G418代谢成对细胞无毒性的物质, 使细胞在G418筛选培养基下存活, 而正常细胞无neo 基因不能在含有G418的培养基中生存, 根据这一原理基因打靶载体构建时neo 基因作为正选择标记基因, 通过G418筛选检测以判定打靶载体是否整合到细胞的基因组中[10]。打靶载体中正选择标记基因neo 位于2个同源臂之间, 因此neo 基因两侧应各有一段MCS 便于同源臂的插入。本研究用酶切的方法将neo 基因克隆入载体pGH 中构建成载体pGN, 根据酶切鉴定结果确定pGN 连接正确, 载体pGN 中neo 基因的两侧各有一段MCS, 便于后续工作中同源臂的插入。另外, 本研究在合成序列时包含有2个同向的LoxP 序列, pGH加入neo 后, 2个同向的LoxP 序列刚好位于neo 的两侧, 便于在基因打靶成功后用Cre/LoxP系统去除neo 。 2.1.3 载体pA2T 酶切鉴定及分析
基因打靶载体的正负筛选策略可以最大程度的获得中靶细胞, 研究表明打靶载体中2个负选择标本试验酶记基因HSV-tk 比一个更能排除假阳性[10]。切载体pGT 、pTK 及pGN, 分别获得正负选标记基
图4 质粒的pA2T 图谱
Fig. 4 Map of universal gene targeting vector pA2T
[9]
图3 质粒pA2T 的酶切鉴定
Fig. 3 Identification of pA2T plasmid by enzyme digestion
M: molecular weight marker; 1~4: the plasmid was digested with
Sac II, Sfi I, Kpn I, and Bam
H I respectively
2.2 转染山羊成纤维细胞及正负选基因活性检测 2.2.1 G418最大致死浓度和GAC 最小致死浓度的
确定
虽然只有细胞中存在neo 时, 细胞才能分解G418使其免受毒害, 但在较低浓度下细胞也能生长, 为排除细胞本身的适应性造成的假阳性, 有必要测定G418的最大致死浓度, 以确定基因打靶过程中G418的筛选浓度。哺乳动物细胞中虽然不存在
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1822 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech October 25, 2008 Vol.24 No.10
HSV-tk , 但是GAC 在较高浓度条件下能改变细胞膜的通透性, 从而导致细胞死亡, 因此很有必要测定GAC 的最小致死浓度以确定基因打靶过程中GAC 的筛选浓度。本试验筛选1 w后, 确定山羊成纤维细胞G418的最大致死浓度是400 μg/mL, GAC的最小致死浓度是4 μmol/mL。 2.2.2 药物筛选及基因活性分析
山羊成纤维细胞转染pA2T 24 h后, 各组分别进行筛选, 1周内观察筛选结果(图5), B组细胞转染pA2T 后在G418筛选下, 第3天发现有部分细胞存活, G418浓度减半(200 μg/mL)后继续培养又长满, 说明pA2T 中neo 在表达, D组细胞转染pA2T 后在GAC 筛选下有部分死亡, 说明pA2T 中HSV-tk 可能在表达, C组细胞转染pA2T 后在G418和GAC 双重药物筛选下全部死亡, 进一步证明pA2T 中的neo 和HSV-tk 都在表达, A组、E 组、F 组生长正常, 说明B 组、C 组、D 组的实验结果不是假阳性现象, 根据正负筛选的原理及实验结果证明pA2T 中的正负选择标记基因都能表达, pA2T可以用作通用型基因打靶载体。
因neo 两侧各有1个LoxP 序列, Bam H I分别酶切pA2T2与pA2T 的电泳图谱确定pA2T2比pA2T 短1200 bp(图6), PCR比较进一步确定pA2T2没有neo (图6) 。以上结果证明pA2T 在转化组成性表达Cre 重组酶的BM25.8后, neo 被删除, 说明Loxp 序列存在生物活性, 这表明在用pA2T 进行基因打靶成功后, 可以用Cre/LoxP系统去除正选标记基因neo 。
图6 Loxp 序列的生物活性鉴定
Fig. 6 Identification of the activity of Loxp sequences
1: pA2T was digested with Bam H I; 2: pA2T2 was digested with
Bam H I; 3, 5: neo fragment was amplified from pA2T; 4: no fragment was amplified from pA2T2; M: molecular weight marker
3 讨论
对于不同的基因打靶位点打靶时, 如果分别构建打靶载体涉及骨架载体的选择、正负选基因的连接及鉴定、多克隆的设计、同源臂的插入等烦琐的过程, 因此在正负筛选策略基础上构建的通用型基因打靶载体为基因打靶研究工作提供了方便。在利用通用型基因打靶载体进行基因打靶研究工作中, 需要有合适的酶切位点满足同源臂插入, 选择的酶
图5 载体pA2T 转染山羊成细胞后不同处理组的细胞生
长情况
Fig. 5 Growth of goat fetus fibroblast cells after transfection of plasmid pA2T in different groups
A: negative group without transfection; B: selecton with G418 after transfection; C: selection with G418+GAC after transfection; D: selection with GAC after transfection; E: without selection after
transfection; F: selection with GAC without transfection
切位点同源臂中不能存在, 因此通用型基因打靶载体中应有足够多的, 并且在基因组中出现频率较低的酶切位点作为其多克隆位点, 满足不同基因座位点作为同源臂插入。本研究构建的通用型基因打靶载体pA2T 中, neo 和HSV-tk1之间有8个酶切位点, neo 和HSV-tk2之间有5个酶切位点, 并且这些酶切位点在基因组中出现的频率较低, 可以满足大多数基因座位点构建同源臂插入。虽然正负筛选的策略可以最大可能性的聚集中靶细胞, 但打靶成功的细胞基因组中整合有正选择标记基因neo , 这势必影响后续的研究工作, 目前在基因打靶的研究工作中
2.3 LoxP 序列生物活性分析
Cre 重组酶能介导2个LoxP 位点之间的序列发生特异性重组, 使2个LoxP 位点之间的序列重排或本研究所构建的载体pA2T 中, 正选标记基删除[11]。
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陈兴启等: 通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定
1823
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都存在正选择标记基因neo 的干扰[2, 6−8, 11], 因此本研究在neo 的两侧各添加了一个同向的LoxP 序列, 并且证实这两个LoxP 序列存在生物活性, 能在打靶成功后用Cre/LoxP系统排除neo 干扰。
所以, 本研究所构建的通用型基因打靶载体pA2T, 几乎所有的基因设计同源臂后, 插入到 MCS 可直接用于基因打靶的研究, 并能够在打靶成功后用Cre 重组酶去除基因组中插入neo 基因。
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关键词: 转基因动物, 通用型基因打靶载体, LoxP序列, Cre重组酶
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Abstract : To make a universal gene targeting vector fitting for most gene and delete positive selection gene after targeting
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Received : February 26, 2008; Accepted : April 16, 2008
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陈兴启等: 通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定
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can be deleted after targeting successfully, which is very convenience for the production of transgenic animals using gene targeting method.
Keywords : transgenic animals, universal gene targeting vector, LoxP sequence, Cre recombinase
转基因动物在基因功能研究、人类疾病模型建立、乳腺生物反应器的研制及家畜的转基因育种等研究领域中都有重要的意义[1−6]。克隆羊多莉的诞生[7], 使以体细胞为遗传操作单元的转基因细胞制作结合体细胞核移植技术生产转基因动物成为可能, 其中供核转基因细胞的制作中转基因载体的构建是其关键步骤之一。目前应用于转基因细胞制作的载体主要有病毒载体、普通质粒载体及基因打靶载体。其中病毒载体因其高效的感染性受到许多学者的青睐, 但病毒载体存在插入位点的不可预测性和承载外源基因长度有限的问题; 普通质粒载体虽然有较大的承载量, 但存在整合效率低和多拷贝插入的缺陷; 而基因打靶载体可对细胞进行单拷贝基因定位修饰, 并且能够稳定的遗传。迄今为止用基因打靶的方法已经生产出了转基因牛、羊、鼠[2, 6−8]。基因打靶技术的关键步骤之一是基因打靶载体的构建, Mansoor等[9]提出的正负筛选基因打靶策略能很好的筛选打靶成功的细胞克隆, 正选标记基因用于筛选阳性克隆, 负选标记基因通过排除假阳性进一步富积阳性克隆。对于不同的基因打靶位点, 分别构建打靶载体涉及骨架载体的选择、正负选基因的连接及鉴定、多克隆的设计、同源臂的插入等烦琐的过程。虽然出现了带有正负选基因及多克隆位点序列的通用型基因打靶载体[10], 但是酶切位点太少限制了这些载体的应用范围。
现行用基因打靶方法生产的转基因动物基因组中, 都整合有正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neo ) [2, 6−8, 11], neo 的存在会影响中靶细胞及转基因动物个体的生长和正常生理状况, 同时增加了后期研究工作的影响因素。LoxP(Locus of crossing- over(x) in P1)序列由2个13 bp的反向重复序列和1个8 bp的间隔区域构成。Cre 重组酶(Cyclization recombination protein)是一种位点特异性重组酶, 它能使2个同向LoxP 之间的序列删除或重排[12], 是由Sternberg 等[13] 于1981年从P1噬菌体中发现, 属于λ Int酶超基因家族。由于Cre 重组酶的表达可以进行精确的时空调控, 所以, Cre/LoxP系统在基因打
靶研究工作中有越来越多的应用[14, 15]。
本研究以克隆载体pEGM-3Z 为骨架, 在其多克隆位点中插入了1个正选择标记neo 、2个负选择标记HSV-tk1 和HSV-tk2, 并在neo 的两侧各添加了一个方向相同的LoxP 序列, 从而构建了载体pA2T, 载体中包含有2个含有稀少酶切位点的多克隆位点, 并对此载体中的正负选择标记基因及Loxp 序列的生物活性进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌株
pGEM-Teasy 载体和pGEM-3Z 载体购自Promega 公司, pMCIneoployA 载体购自Stratagene 公司, pORF-HSVtk载体购自Invivogen 公司, 大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BM25.8由本室保存。 1.1.2 工具酶和试剂
各种内切酶购自MBI 公司, 质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自Promega 公司, T4 DNA连接酶、Klenow Fragment和CIAP 购自TaKaRa 公司, G418购自Invitrogen 公司, GAC购自Invivogen 公司, DMEM 和DMEM/F12购自Invitrogen 公司, Lipofectamine TM2000购自Invitrogen 公司。 1.1.3 合成和测序
引物合成与测序在Invitrogen 公司, 多克隆位点序列在上海捷瑞公司合成。 1.1.4 山羊成纤维细胞
由本室冻存。
1.2 载体的构建
1.2.1 pGT 和pTK 的构建
Not I、Swa I双酶切载体pORFHSV-tk, 胶回收包括启动子及polyA 序列的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk ), Klenow Fragment补平后克隆入Sma I 单酶切的载体pGEM-3Z, 分别用Bam H I、Sal I 、Pst I 、Nhe I/Nco I 酶切载体, 鉴定阳性克隆pGT 。设计引物Ptk1(5′-3′): GGCCGCAATAAAAATCTTTATTT及Ptk2(5′-3′): AAATGGATCTACCACATTTGTAGAG
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G, 以pORFHSV-tk 为模板扩增包括启动子及polyA 序列的HSV-tk , 凝胶回收PCR 产物并克隆入载体pGEM-Teasy 中, 分别Pst I 、Not I用酶切载体, 鉴定阳性克隆pTK 。 1.2.2 pGN 的构建
合成一段含Xba I、Sgs I、Bpu1120 I、Bsp1407 I 、Nhe I、Eco R I、Not I、Xho I 、Bam H I、Sal I 、Bsu15 II、Bst1107 I、Pf123 II、Spe I、Pst I、Sac II、Xba I酶切位点的多克隆位点序列, 其中Xho I和Sal I 两侧各有一段方向相同的LoxP(5′-ATAACTTCGTATAGCATA CATTATACGAAGTTAT-3′), 合成的序列位于载体pGH 上。Xho I 、Sal I双酶切载体pMCIneoployA 凝胶回收包括启动子及ployA 序列的neo , 克隆入已用相应酶切的pGH 中, Xho I、Sal I双酶切鉴定阳性克隆pGN 。 1.2.3 pA2T的构建
Spe I 、Sac II 分别双酶切载体pTK 和pGN, 分别凝胶回收pTK 中的包括启动子及ployA 序列的HSV-tk 和pGN 中的长片段, 连接2个回收片段, Spe I、Sac II 双酶切鉴定阳性克隆载体pAT 。Xba I分别单酶切载体pGT 和载体pAT, 凝胶回收酶切载体pGT 并用CIAP 去除5′端磷酸基团, 凝胶回收酶切载体pAT 中长片段, T4 DNA连接酶连接2个回收片段, 分别用Sac II、Sfi I 、Kpn I、Bam H I酶切鉴定阳性克隆pA2T, 测序验证。
分别加入相应浓度药物, 1周内观察筛选结果。
1.4 pA2T 转化大肠杆菌BM25.8
将载体pA2T 转化组成性表达Cre 酶的大肠杆菌BM25.8, 提取BM25.8中质粒命名为pA2T2, Bam H I分别酶切pA2T 和pA2T2凝胶电泳, 电泳检测, 比较两载体的酶切结果。用引物Pneo1(5′-3′): CCAGGTCCACTTCGCATATTAAGGT 及Pneo2(5′-3′): CGGATCCCCTCAGAAGAACTCGTCA, 分别以pA2T2和pA2T 为模板进行PCR 扩增, 电泳检测。
2 结果与分析
2.1 通用型基因打靶载体酶切鉴定及分析 2.1.1 载体pGT 和载体pTK 酶切鉴定及分析
HSV-tk 编码的蛋白产物以丙氧鸟苷(GAC)为底物, 将其代谢成对细胞有毒性的物质, 使细胞死亡, 而细胞中胸苷激酶基因编码的蛋白不能代谢GAC, 根据这一原理基因打靶载体选用单纯疱疹病毒胸苷激酶基因做为负选择标记基因, 插入到同源序列的一侧用于排除随机插入的细胞克隆[9]。当打靶载体随机整合到细胞的基因组上时, HSV-tk 也被整合到细胞的基因组上, 细胞就不能在含有GAC 的药物培养基中存活; 当打靶载体通过同源重组整合到细胞基因组中, HSV-tk 被去除, 细胞得以在含有正负药物筛选的培养基中存活。本试验分别用酶切和PCR 的方法构建了含有一个HSV-tk 的载体pGT 和载体pTK, 便于后续工作中加入到打靶载体中。根据HSV-tk 基因上的酶切位点和pGEM-3Z 本身上的酶切位点酶切鉴定载体pGT(图1) 和载体pTK(图2), 根据片段长度确定pGT 和pTK 连接成功。
1.3 细胞转染和相关检测
1.3.1 遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GAC)筛选浓度
测定
第4代山羊成纤维细胞分别加入浓度梯度的G418和GAC 筛选1周, 统计G418的最大致死浓度和GAC 的最小致死浓度。 1.3.2 质粒转染
将pA2T 按照LipofectamineTM2000使用说明书转染山羊第4代成纤维细胞。 1.3.3 质粒的抗药性检测
把转染的细胞分为A 、B 、C 、D 、E 、F 六组, 按照测定的G418的最大致死浓度和GAC 的最小致死浓度进行药物筛选, A组为正常生长对照组, B组为转染载体后培养液中加入G418筛选组, C组为转染载体后G418和GAC 筛选组, D组为转染载体后GAC 筛选组, E组为转染载体后正常培养组, F组是不转染载体加入负选药物组。转染载体24 h后各组
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图1 质粒pGT 的酶切鉴定
Fig. 1 Identification of pGT plasmid
M: molecular weight marker ; 1~4: the plasmid was digested with
Bam H I, Sal I, Pst I, Nhe I/Nco I, respectively; 6: PCR fragment of tk
陈兴启等: 通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定
1821
因, 连接后构建成载体pA2T, 酶切鉴定载体pA2T (图3), 确定连接正确, 经测序进一步得到证实。构建的载体pA2T(图4) 含有一个正选择标记基因neo 和2个相同的负选择标记基因HSV-tk1和HSV-tk2, neo 、HSV-tk1及neo 和HSV-tk2之间各有一段MCS, 分别含有8个和5个稀少的酶切位点, 可用于同源臂序列的插入, neo 、HSV-tk1和HSV-tk2有各自独立的转录单元。
图2 质粒pTK 的酶切鉴定
Fig. 2 Identification of pTK pladmid by enzyme digestion
M: molecular weight marker; 1, 2: the plasmid was digested with
Pst I, Not I respectively
2.1.2 pGN 酶切鉴定及分析
基因打靶过程也是同源重组的过程, 同源臂序列插入到打靶载体中是打靶载体构建的关键, 因此打靶载体中要有合适的酶切位点适合于同源臂序列的插入, 通用型打靶载体中应有足够多的酶切位点适合为同源臂的插入。pGH 上合成的多克隆位点序列中含有多个酶切位点, 便于不同序列作为同源臂插入。neo 编码的产物新霉素磷酸转移酶能分解遗传霉素(G418), 将G418代谢成对细胞无毒性的物质, 使细胞在G418筛选培养基下存活, 而正常细胞无neo 基因不能在含有G418的培养基中生存, 根据这一原理基因打靶载体构建时neo 基因作为正选择标记基因, 通过G418筛选检测以判定打靶载体是否整合到细胞的基因组中[10]。打靶载体中正选择标记基因neo 位于2个同源臂之间, 因此neo 基因两侧应各有一段MCS 便于同源臂的插入。本研究用酶切的方法将neo 基因克隆入载体pGH 中构建成载体pGN, 根据酶切鉴定结果确定pGN 连接正确, 载体pGN 中neo 基因的两侧各有一段MCS, 便于后续工作中同源臂的插入。另外, 本研究在合成序列时包含有2个同向的LoxP 序列, pGH加入neo 后, 2个同向的LoxP 序列刚好位于neo 的两侧, 便于在基因打靶成功后用Cre/LoxP系统去除neo 。 2.1.3 载体pA2T 酶切鉴定及分析
基因打靶载体的正负筛选策略可以最大程度的获得中靶细胞, 研究表明打靶载体中2个负选择标本试验酶记基因HSV-tk 比一个更能排除假阳性[10]。切载体pGT 、pTK 及pGN, 分别获得正负选标记基
图4 质粒的pA2T 图谱
Fig. 4 Map of universal gene targeting vector pA2T
[9]
图3 质粒pA2T 的酶切鉴定
Fig. 3 Identification of pA2T plasmid by enzyme digestion
M: molecular weight marker; 1~4: the plasmid was digested with
Sac II, Sfi I, Kpn I, and Bam
H I respectively
2.2 转染山羊成纤维细胞及正负选基因活性检测 2.2.1 G418最大致死浓度和GAC 最小致死浓度的
确定
虽然只有细胞中存在neo 时, 细胞才能分解G418使其免受毒害, 但在较低浓度下细胞也能生长, 为排除细胞本身的适应性造成的假阳性, 有必要测定G418的最大致死浓度, 以确定基因打靶过程中G418的筛选浓度。哺乳动物细胞中虽然不存在
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HSV-tk , 但是GAC 在较高浓度条件下能改变细胞膜的通透性, 从而导致细胞死亡, 因此很有必要测定GAC 的最小致死浓度以确定基因打靶过程中GAC 的筛选浓度。本试验筛选1 w后, 确定山羊成纤维细胞G418的最大致死浓度是400 μg/mL, GAC的最小致死浓度是4 μmol/mL。 2.2.2 药物筛选及基因活性分析
山羊成纤维细胞转染pA2T 24 h后, 各组分别进行筛选, 1周内观察筛选结果(图5), B组细胞转染pA2T 后在G418筛选下, 第3天发现有部分细胞存活, G418浓度减半(200 μg/mL)后继续培养又长满, 说明pA2T 中neo 在表达, D组细胞转染pA2T 后在GAC 筛选下有部分死亡, 说明pA2T 中HSV-tk 可能在表达, C组细胞转染pA2T 后在G418和GAC 双重药物筛选下全部死亡, 进一步证明pA2T 中的neo 和HSV-tk 都在表达, A组、E 组、F 组生长正常, 说明B 组、C 组、D 组的实验结果不是假阳性现象, 根据正负筛选的原理及实验结果证明pA2T 中的正负选择标记基因都能表达, pA2T可以用作通用型基因打靶载体。
因neo 两侧各有1个LoxP 序列, Bam H I分别酶切pA2T2与pA2T 的电泳图谱确定pA2T2比pA2T 短1200 bp(图6), PCR比较进一步确定pA2T2没有neo (图6) 。以上结果证明pA2T 在转化组成性表达Cre 重组酶的BM25.8后, neo 被删除, 说明Loxp 序列存在生物活性, 这表明在用pA2T 进行基因打靶成功后, 可以用Cre/LoxP系统去除正选标记基因neo 。
图6 Loxp 序列的生物活性鉴定
Fig. 6 Identification of the activity of Loxp sequences
1: pA2T was digested with Bam H I; 2: pA2T2 was digested with
Bam H I; 3, 5: neo fragment was amplified from pA2T; 4: no fragment was amplified from pA2T2; M: molecular weight marker
3 讨论
对于不同的基因打靶位点打靶时, 如果分别构建打靶载体涉及骨架载体的选择、正负选基因的连接及鉴定、多克隆的设计、同源臂的插入等烦琐的过程, 因此在正负筛选策略基础上构建的通用型基因打靶载体为基因打靶研究工作提供了方便。在利用通用型基因打靶载体进行基因打靶研究工作中, 需要有合适的酶切位点满足同源臂插入, 选择的酶
图5 载体pA2T 转染山羊成细胞后不同处理组的细胞生
长情况
Fig. 5 Growth of goat fetus fibroblast cells after transfection of plasmid pA2T in different groups
A: negative group without transfection; B: selecton with G418 after transfection; C: selection with G418+GAC after transfection; D: selection with GAC after transfection; E: without selection after
transfection; F: selection with GAC without transfection
切位点同源臂中不能存在, 因此通用型基因打靶载体中应有足够多的, 并且在基因组中出现频率较低的酶切位点作为其多克隆位点, 满足不同基因座位点作为同源臂插入。本研究构建的通用型基因打靶载体pA2T 中, neo 和HSV-tk1之间有8个酶切位点, neo 和HSV-tk2之间有5个酶切位点, 并且这些酶切位点在基因组中出现的频率较低, 可以满足大多数基因座位点构建同源臂插入。虽然正负筛选的策略可以最大可能性的聚集中靶细胞, 但打靶成功的细胞基因组中整合有正选择标记基因neo , 这势必影响后续的研究工作, 目前在基因打靶的研究工作中
2.3 LoxP 序列生物活性分析
Cre 重组酶能介导2个LoxP 位点之间的序列发生特异性重组, 使2个LoxP 位点之间的序列重排或本研究所构建的载体pA2T 中, 正选标记基删除[11]。
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陈兴启等: 通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定
1823
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都存在正选择标记基因neo 的干扰[2, 6−8, 11], 因此本研究在neo 的两侧各添加了一个同向的LoxP 序列, 并且证实这两个LoxP 序列存在生物活性, 能在打靶成功后用Cre/LoxP系统排除neo 干扰。
所以, 本研究所构建的通用型基因打靶载体pA2T, 几乎所有的基因设计同源臂后, 插入到 MCS 可直接用于基因打靶的研究, 并能够在打靶成功后用Cre 重组酶去除基因组中插入neo 基因。
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