天然产物研究与开发NatProdResDev2009,21:3792381,387
文章编号:100126880(2009)0320379204
多粘类芽孢杆菌HY9622发酵液化学成分研究
龚春燕,张道敬,魏鸿刚,李淑兰,沈国敏,李元广
1
1112113
华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;
2
上海泽元海洋生物技术有限公司,上海200237
摘 要:从多粘类芽孢杆菌(PaenibacilluspolymyxaHY9622)的发酵液中分离得到了12个化合物,其结构通过波谱分析分别鉴定为苯甲酸(1)、对羟基苯甲酸(2)、对羟基苯丙酸(3)、22苯基乳酸(4)、32苯基乳酸(5)、琥珀酸
(6)、棕榈酸甲酯(7)、大豆甙元(8)、环(甘氨酸2L2丙氨酸)二肽(9)、吲哚232乙酸(10)、L2苯丙氨酸(11)和2R,3R2丁二醇(12),其中化合物1～9均为首次从该菌中分离得到,化合物1、2、5和6对青枯劳尔氏菌的最小抑菌
浓度(MIC)分别为1、3、2和3mg/mL。
关键词:多粘类芽孢杆菌;化学成分;抑菌活性;青枯劳尔氏菌中图分类号:Q936;R284.1;S182
文献标识码:A
CompoundsfromCultureBrothofPaenibacilluspolymyxa22
GONGChun2yan,ZHANGDao2jing,WEIHong2gang,LIShu2lanSHENin,Iguang
1
111113
StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastUof2
Shanghai200237,China;ShanghaiZeyuanMarineBCo.,L.,200237,China
Abstract:TwelvecompoundswereisolatedtheothpolymyxaHY9622.Onthebasisofspectralanalysis,theywere)poxybenzoicacid(2),p2hydroxy2phenylpropionicacid(3),22),32acid5),succinicacid(6),methylpalmitate(7),daidzein(8),cyclo(Gly2L),23(10),L2phenylalanine(11)and(2R,3R)2butanediol(12).Compounds129wereisP.forthefirsttime.Compounds1,2,5and6inhibitthegrowthofRalstoniasolanacearumwithMICof1,3,2and3mg/mL.
Keywords:Paenibacilluspolymyxa;chemicalconstituents;antimicrobialactivity;Ralstoniasolanacearum
多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa),芽孢杆菌科类芽孢杆菌属,又称多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa),是一种植物根际促生细菌。关于多粘类芽孢杆菌产生的次级代谢产物,国内外学者做过许多研究,主要有多粘菌素及其它多肽类抗生素、植物
[1,2]
激素等。作者从江西南昌郊区土壤中分离得到一株生防菌株多粘类芽孢杆菌HY9622,其培养液对素有“植物癌症”之称的青枯病病原菌———青枯劳尔氏菌具有较好的拮抗作用,前文已从多粘类芽孢杆菌HY9622发酵液乙醇提取物的乙酸乙酯活性部
[3]
位分离得到生物碱、黄酮和酚酸等化学成分,本文继续对其乙酸乙酯和正丁醇活性部位进行分离纯化,从中又分离出12个化合物。利用波谱技术分别
收稿日期:2008204209 接受日期:2008205226 基金项目:上海市博士后基金项目;上海市重点学科建设项目
(B505)
鉴定为苯甲酸(1)、对羟基苯甲酸(2)、对羟基苯丙
酸(3)、22苯基乳酸(4),32苯基乳酸(5)、琥珀酸(6)、棕榈酸甲酯(7)、大豆甙元(8)、环(甘氨酸2L2丙氨酸)二肽(9)、吲哚232乙酸(10)、L2苯丙氨酸(11)和2R,3R2丁二醇(12),其中化合物1～9均为首次从该菌中分离得到。化合物1、2、5和6均对指示菌青枯劳尔氏菌具有抑制作用。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
X4双目镜熔点测定仪(温度未校正);Magna2IR550型傅立叶红外光谱仪;AA210R型数字旋光仪;GCT飞行时间质谱仪(EI,Micromass公司),电子轰
击电压70eV;BrukerAVANCE500核磁共振仪,TMS为内标;HSG2F254型薄层色谱硅胶板(烟台市化学工业研究所);200～300目柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂)。
3通讯作者Tel:[1**********]964;E2mail:[email protected]
380天然产物研究与开发 Vol121
多粘类芽孢杆菌HY9622,分离自江西南昌郊区番茄根际土壤,中国科学院微生物研究所鉴定,由本实验室保藏;青枯劳尔氏菌(RalstoniasolanacearumNb21)分离自南昌郊区番茄根际土壤,由本实验室保藏。1.2 菌株发酵种子培养基、发酵培养基配方及其培养见US
[4]
专利。1.3 提取与分离
将发酵24h多粘类芽孢杆菌HY9622发酵液30L用等体积95%乙醇室温浸泡后,8000r/min离心10min,上清液经减压浓缩得浸膏,用3L蒸馏水混悬,分别用等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对青枯病菌有抑制作用,遂分别对上述两活性部位萃取物进一步分离。
将乙酸乙酯萃取物24g经硅胶柱色谱(Φ6×L88cm,流速6mL/min),以正己烷/乙酸乙酯(99∶1～50∶50)梯度洗脱得到112个流分(400mL/流分),以TLC检测合并相同流分。其中流分25227过SephadexLH220柱层析经氯仿/甲醇1流分6和7中分离得到化合物3(8流分60～62经到化合物2(通过SephadexLH2201∶1洗脱,分别从流分6和8中得到化合物4(16mg)和5(16mg);流分13、14经SephdexLH220柱层析氯仿/甲醇1∶1洗脱得到化合物7(20mg);流分82通过SephadexLH220柱层析经甲醇洗脱得到化合物10(5mg);流分97和98经SephdexLH220柱层析氯仿/甲醇1∶1洗脱得到化合
2 结果与讨论
2.1 结构鉴定
苯甲酸(1) 无色片状结晶(甲醇),mp.76～
1
78℃。IR、HNMR和Rf数值均与标准品的一致。
对羟基苯甲酸(2) 白色针状晶体(乙醇),mp.215～216℃。EI2MS、H、CNMR数据与文献
1
13
报道相符。
对羟基苯丙酸(3) 无色针状晶体(甲醇),
+
mp.126～130℃。EI2MSm/z:166[M](2),120(12),107(100),91(10),77(20),65(11),51(9),
1
39(15)。HNMR(CDCl3,500MHz)δ:7130(2H,d,J=715Hz,H22,6),7122(2H,d,J=715Hz,H23,5),2197(2H,t,J=716Hz,H21),2169(2H,t,J=
13
716Hz,H22);CNMR(CDCl3,125MHz)δ:17611(C2),15715(C21′4),13215(12(C22,6),
2(C。以上数据116(C23153715。
2()色针状晶体(甲醇),
+
1℃。EI2MSm/z:166[M](2),12143),105(10),77(17),65(2),51(12),43
1
(100),39(3)。HNMR(CD3OD,500MHz)δ:7142(5H,m,H2),4116(1H,m,H24′,3′,5′,2′,6′3),3114(1H,dd,J=1410,411Hz,H22a),2194(1H,
13
dd,J=1410,716Hz,H22b),2130(1H,s,2OH);CNMR(CD3OD,125MHz)δ:18111(C21),4018(C2
),13010(C2),2),7319(C23),13817(C21′3′,5′),12711(C2)。以上数据与文献报12910(C22′,6′4′
[6]
[5]
物11(15mg);流分88和89经SephadexLH220柱
层析氯仿/甲醇1∶1洗脱得到化合物12(14mg)。(以上SephadexLH220层析柱(Φ2×L45cm),流速1.5mL/min,每流分收集10mL)。
正丁醇萃取物43g经硅胶柱色谱(Φ7×L120cm,流速6mL/min),以氯仿/甲醇(99∶1～50∶50)梯度洗脱得到158个流分(400mL/流分),以TLC检测合并相同流分。流分11经重结晶(甲醇)得到化合物6(2mg),流分44经重结晶(甲醇)得到化合物8(8mg),流分51和52经浓缩有沉淀析出,TLC检测合并沉淀部分,经甲醇反复洗涤得到化合物9(10mg)。1.4 抑菌活性测定
道相符。
32苯基乳酸(5) 无色针状晶体(甲醇),mp196
+
～98℃。EI2MSm/z:166[M](513),148(3314),121(615),103(1014),91(100),77(618),65
1
(9)。HNMR(CD3OD,500MHz)δ:7121(4H,m,H2
[7,8]
),7113(1H,m,H2),4112(1H,d,J=3′,5′,2′,6′4′510Hz,H22),3109(1H,d,J=815Hz,H23b),2178
13(1H,dd,J=1315,812Hz,H23a);CNMR(CD3OD,125MHz)δ:18113(C21),7512(C22),4219(C23),
),13111(C2),12915(C2),14019(C21′3′,5′2′,6′)。以上数据与文献报道相符12715(C24′
2
。
琥珀酸(6) 无色针晶(甲醇),mp1160～162
21
[9]
℃。EI2MSm/z:117[M2H],73[M2COOH]。HNMR(DMSO2d6,500MHz)δ:2141(4H,m,H22,3),
[10]12114(2H,s)。以上数据与文献报道相符。
采用琼脂扩散滤纸片法测定抑菌圈大小。
Vol121 龚春燕等:多粘类芽孢杆菌HY9622发酵液化学成分研究
381
棕榈酸甲酯(7) 无色油状(氯仿),mp130℃。+
EI2MSm/z:270[M],241[M2C2H5],239[M2OCH3]。EI2MS数据与文献数据一致。
大豆甙元(8) 无色针状结晶(甲醇),mp1315
[11]
菌,以及长柄链格孢(Alternarialongipes)、立枯丝核
菌(Rhizoctoniasolani)等真菌亦有不同程度的抑制作用,以上各化合物农用抑菌活性均为首次报道。其中化合物1和5为主要抑菌活性成分。化合物1钠盐在食品工业领域中被广泛应作化学防腐剂
[15]
℃。EI2MSm/z:254[M](100),253[M21](50),
1
137(42),118(22),108(8)。HNMR(DMSO2d6,500MHz)δ:8129(1H,s,H22),7198(1H,d,J=817Hz,
),6194(1H,H25),7138(2H,d,J=813Hz,H22′,6′dd,J=817,210Hz,H26),6188(1H,d,J=210Hz,)。以上数据H28),6182(2H,d,J=813Hz,H23′,5′
+
。
近几年来,化合物5作为一种新型抑菌剂,受到了食品行业的广泛关注,该化合物对上述农用病原菌抑菌活性强度与李兴峰等
[15]
报道相当,但弱于农用链
霉素等抗生素的抑菌活性。
参考文献
1 ZhangZP(张致平),YaoTJ(姚天爵).AntibioticsandBio2
activeSubstancefromMicroorganism(抗生素与微生物产生
与文献报道相符。
环(甘氨酸2L2丙氨酸)二肽(9) 无色粉末(甲
20
醇),[α]D2811°(c1136,H2O)。EI2MSm/z:128[M](35),85(100),57(13),44(10)。HNMR(CDCl3,500MHz)δ:8112(1H,s),7193(1H,s),3184(1H,dd,J=1315,619Hz),3173(2H,d,J=015Hz),1126(3H,d,J=710Hz);CNMR(CDCl3,125MHz)δ:16819,16613,4917,4415,1817。以上数据
13
+
1
[12]
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与文献报道相符。
吲哚232乙酸(10) 棕色晶体(mp～170℃。EI2MSm/z:(),1
(5),77(5),65(04)(DMSO2d6,500MHz:(s)19(1H,s),7151,
13
7136,7123,7699,3165;CNMR(DMSO2d6,125MHz)δ:17312,13611,12712,12319,12110,
[13]
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11814,11816,11113,10717,3110。经TLC检测与标
准品对照,Rf值相同。
L2苯丙氨酸(11) 白色粉末(甲醇),[α]22816°(c0131,H2O),mp1131～132℃。茚三酮反
20D
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应阳性,提示可能为氨基酸类物质。IR和HNMR
[13]
数据与文献报道相符。
(2R,3R)2丁二醇(12) 无色油状(氯仿),201[α]D23912°(c0103,EtOH)。HNMR(CDCl3,500MHz)δ:3151(2H,m,H22,3),2112(2H,s,OH),
13
1118(6H,d,J=517Hz,H21,4);CNMR(CDCl3,125MHz)δ:2010(C21,4),7312(C22,3)。以上数据
[14]
与文献报道相符。2.2 抑菌活性
化合物1、2、5和6对青枯劳尔氏菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1、3、2和3mg/mL。另外,化合物1、2、5、6对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、胡萝卜软腐欧文式杆菌A菌(Erwiniacarotovoravar1carotovora)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)等细
1
1622163.
(下转第387页)
Vol121 王元凤等:茶多糖金属络合物的制备及清除自由基活性研究
387
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(上接第381页)
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多粘类芽孢杆菌HY9622发酵液化学成分研究
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1112113
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上海泽元海洋生物技术有限公司,上海200237
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关键词:多粘类芽孢杆菌;化学成分;抑菌活性;青枯劳尔氏菌中图分类号:Q936;R284.1;S182
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Shanghai200237,China;ShanghaiZeyuanMarineBCo.,L.,200237,China
Abstract:TwelvecompoundswereisolatedtheothpolymyxaHY9622.Onthebasisofspectralanalysis,theywere)poxybenzoicacid(2),p2hydroxy2phenylpropionicacid(3),22),32acid5),succinicacid(6),methylpalmitate(7),daidzein(8),cyclo(Gly2L),23(10),L2phenylalanine(11)and(2R,3R)2butanediol(12).Compounds129wereisP.forthefirsttime.Compounds1,2,5and6inhibitthegrowthofRalstoniasolanacearumwithMICof1,3,2and3mg/mL.
Keywords:Paenibacilluspolymyxa;chemicalconstituents;antimicrobialactivity;Ralstoniasolanacearum
多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa),芽孢杆菌科类芽孢杆菌属,又称多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa),是一种植物根际促生细菌。关于多粘类芽孢杆菌产生的次级代谢产物,国内外学者做过许多研究,主要有多粘菌素及其它多肽类抗生素、植物
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激素等。作者从江西南昌郊区土壤中分离得到一株生防菌株多粘类芽孢杆菌HY9622,其培养液对素有“植物癌症”之称的青枯病病原菌———青枯劳尔氏菌具有较好的拮抗作用,前文已从多粘类芽孢杆菌HY9622发酵液乙醇提取物的乙酸乙酯活性部
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位分离得到生物碱、黄酮和酚酸等化学成分,本文继续对其乙酸乙酯和正丁醇活性部位进行分离纯化,从中又分离出12个化合物。利用波谱技术分别
收稿日期:2008204209 接受日期:2008205226 基金项目:上海市博士后基金项目;上海市重点学科建设项目
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鉴定为苯甲酸(1)、对羟基苯甲酸(2)、对羟基苯丙
酸(3)、22苯基乳酸(4),32苯基乳酸(5)、琥珀酸(6)、棕榈酸甲酯(7)、大豆甙元(8)、环(甘氨酸2L2丙氨酸)二肽(9)、吲哚232乙酸(10)、L2苯丙氨酸(11)和2R,3R2丁二醇(12),其中化合物1～9均为首次从该菌中分离得到。化合物1、2、5和6均对指示菌青枯劳尔氏菌具有抑制作用。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
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3通讯作者Tel:[1**********]964;E2mail:[email protected]
380天然产物研究与开发 Vol121
多粘类芽孢杆菌HY9622,分离自江西南昌郊区番茄根际土壤,中国科学院微生物研究所鉴定,由本实验室保藏;青枯劳尔氏菌(RalstoniasolanacearumNb21)分离自南昌郊区番茄根际土壤,由本实验室保藏。1.2 菌株发酵种子培养基、发酵培养基配方及其培养见US
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专利。1.3 提取与分离
将发酵24h多粘类芽孢杆菌HY9622发酵液30L用等体积95%乙醇室温浸泡后,8000r/min离心10min,上清液经减压浓缩得浸膏,用3L蒸馏水混悬,分别用等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对青枯病菌有抑制作用,遂分别对上述两活性部位萃取物进一步分离。
将乙酸乙酯萃取物24g经硅胶柱色谱(Φ6×L88cm,流速6mL/min),以正己烷/乙酸乙酯(99∶1～50∶50)梯度洗脱得到112个流分(400mL/流分),以TLC检测合并相同流分。其中流分25227过SephadexLH220柱层析经氯仿/甲醇1流分6和7中分离得到化合物3(8流分60～62经到化合物2(通过SephadexLH2201∶1洗脱,分别从流分6和8中得到化合物4(16mg)和5(16mg);流分13、14经SephdexLH220柱层析氯仿/甲醇1∶1洗脱得到化合物7(20mg);流分82通过SephadexLH220柱层析经甲醇洗脱得到化合物10(5mg);流分97和98经SephdexLH220柱层析氯仿/甲醇1∶1洗脱得到化合
2 结果与讨论
2.1 结构鉴定
苯甲酸(1) 无色片状结晶(甲醇),mp.76～
1
78℃。IR、HNMR和Rf数值均与标准品的一致。
对羟基苯甲酸(2) 白色针状晶体(乙醇),mp.215～216℃。EI2MS、H、CNMR数据与文献
1
13
报道相符。
对羟基苯丙酸(3) 无色针状晶体(甲醇),
+
mp.126～130℃。EI2MSm/z:166[M](2),120(12),107(100),91(10),77(20),65(11),51(9),
1
39(15)。HNMR(CDCl3,500MHz)δ:7130(2H,d,J=715Hz,H22,6),7122(2H,d,J=715Hz,H23,5),2197(2H,t,J=716Hz,H21),2169(2H,t,J=
13
716Hz,H22);CNMR(CDCl3,125MHz)δ:17611(C2),15715(C21′4),13215(12(C22,6),
2(C。以上数据116(C23153715。
2()色针状晶体(甲醇),
+
1℃。EI2MSm/z:166[M](2),12143),105(10),77(17),65(2),51(12),43
1
(100),39(3)。HNMR(CD3OD,500MHz)δ:7142(5H,m,H2),4116(1H,m,H24′,3′,5′,2′,6′3),3114(1H,dd,J=1410,411Hz,H22a),2194(1H,
13
dd,J=1410,716Hz,H22b),2130(1H,s,2OH);CNMR(CD3OD,125MHz)δ:18111(C21),4018(C2
),13010(C2),2),7319(C23),13817(C21′3′,5′),12711(C2)。以上数据与文献报12910(C22′,6′4′
[6]
[5]
物11(15mg);流分88和89经SephadexLH220柱
层析氯仿/甲醇1∶1洗脱得到化合物12(14mg)。(以上SephadexLH220层析柱(Φ2×L45cm),流速1.5mL/min,每流分收集10mL)。
正丁醇萃取物43g经硅胶柱色谱(Φ7×L120cm,流速6mL/min),以氯仿/甲醇(99∶1～50∶50)梯度洗脱得到158个流分(400mL/流分),以TLC检测合并相同流分。流分11经重结晶(甲醇)得到化合物6(2mg),流分44经重结晶(甲醇)得到化合物8(8mg),流分51和52经浓缩有沉淀析出,TLC检测合并沉淀部分,经甲醇反复洗涤得到化合物9(10mg)。1.4 抑菌活性测定
道相符。
32苯基乳酸(5) 无色针状晶体(甲醇),mp196
+
～98℃。EI2MSm/z:166[M](513),148(3314),121(615),103(1014),91(100),77(618),65
1
(9)。HNMR(CD3OD,500MHz)δ:7121(4H,m,H2
[7,8]
),7113(1H,m,H2),4112(1H,d,J=3′,5′,2′,6′4′510Hz,H22),3109(1H,d,J=815Hz,H23b),2178
13(1H,dd,J=1315,812Hz,H23a);CNMR(CD3OD,125MHz)δ:18113(C21),7512(C22),4219(C23),
),13111(C2),12915(C2),14019(C21′3′,5′2′,6′)。以上数据与文献报道相符12715(C24′
2
。
琥珀酸(6) 无色针晶(甲醇),mp1160～162
21
[9]
℃。EI2MSm/z:117[M2H],73[M2COOH]。HNMR(DMSO2d6,500MHz)δ:2141(4H,m,H22,3),
[10]12114(2H,s)。以上数据与文献报道相符。
采用琼脂扩散滤纸片法测定抑菌圈大小。
Vol121 龚春燕等:多粘类芽孢杆菌HY9622发酵液化学成分研究
381
棕榈酸甲酯(7) 无色油状(氯仿),mp130℃。+
EI2MSm/z:270[M],241[M2C2H5],239[M2OCH3]。EI2MS数据与文献数据一致。
大豆甙元(8) 无色针状结晶(甲醇),mp1315
[11]
菌,以及长柄链格孢(Alternarialongipes)、立枯丝核
菌(Rhizoctoniasolani)等真菌亦有不同程度的抑制作用,以上各化合物农用抑菌活性均为首次报道。其中化合物1和5为主要抑菌活性成分。化合物1钠盐在食品工业领域中被广泛应作化学防腐剂
[15]
℃。EI2MSm/z:254[M](100),253[M21](50),
1
137(42),118(22),108(8)。HNMR(DMSO2d6,500MHz)δ:8129(1H,s,H22),7198(1H,d,J=817Hz,
),6194(1H,H25),7138(2H,d,J=813Hz,H22′,6′dd,J=817,210Hz,H26),6188(1H,d,J=210Hz,)。以上数据H28),6182(2H,d,J=813Hz,H23′,5′
+
。
近几年来,化合物5作为一种新型抑菌剂,受到了食品行业的广泛关注,该化合物对上述农用病原菌抑菌活性强度与李兴峰等
[15]
报道相当,但弱于农用链
霉素等抗生素的抑菌活性。
参考文献
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与文献报道相符。
环(甘氨酸2L2丙氨酸)二肽(9) 无色粉末(甲
20
醇),[α]D2811°(c1136,H2O)。EI2MSm/z:128[M](35),85(100),57(13),44(10)。HNMR(CDCl3,500MHz)δ:8112(1H,s),7193(1H,s),3184(1H,dd,J=1315,619Hz),3173(2H,d,J=015Hz),1126(3H,d,J=710Hz);CNMR(CDCl3,125MHz)δ:16819,16613,4917,4415,1817。以上数据
13
+
1
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与文献报道相符。
吲哚232乙酸(10) 棕色晶体(mp～170℃。EI2MSm/z:(),1
(5),77(5),65(04)(DMSO2d6,500MHz:(s)19(1H,s),7151,
13
7136,7123,7699,3165;CNMR(DMSO2d6,125MHz)δ:17312,13611,12712,12319,12110,
[13]
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11814,11816,11113,10717,3110。经TLC检测与标
准品对照,Rf值相同。
L2苯丙氨酸(11) 白色粉末(甲醇),[α]22816°(c0131,H2O),mp1131～132℃。茚三酮反
20D
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[13]
数据与文献报道相符。
(2R,3R)2丁二醇(12) 无色油状(氯仿),201[α]D23912°(c0103,EtOH)。HNMR(CDCl3,500MHz)δ:3151(2H,m,H22,3),2112(2H,s,OH),
13
1118(6H,d,J=517Hz,H21,4);CNMR(CDCl3,125MHz)δ:2010(C21,4),7312(C22,3)。以上数据
[14]
与文献报道相符。2.2 抑菌活性
化合物1、2、5和6对青枯劳尔氏菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1、3、2和3mg/mL。另外,化合物1、2、5、6对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、胡萝卜软腐欧文式杆菌A菌(Erwiniacarotovoravar1carotovora)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)等细
1
1622163.
(下转第387页)
Vol121 王元凤等:茶多糖金属络合物的制备及清除自由基活性研究
387
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