（）：中国兽医科学 ２０１２，４２０２１４４１４９－
ＣｈｉｎｅｓｅＶｅｔｅｒｉｎａｒＳｃｉｅｎｃｅ ｙ
（）中图分类号：Ｓ８５２．６５９．２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７３４６９６２０１２０２０１４４０６ －－－
藏獒源犬细小病毒的分离鉴定
梁璐琪１，张 恒１，魏胜男１，李思琪１，舒 龙１，钟志军１，符华林１，
曹随忠１，胡延春１，余树民１，李成军２，陈 英２，李万清２，彭广能１＊
（四川农业大学动物医学院动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安 ６１．２５０１４；
）名山县农业局，四川名山 ６２．２５１００
在藏獒中的流行情况，将临床上经胶体金试纸检测为阳性的藏獒直肠ＣＰＶ） 摘要：为弄清犬细小病毒（
，、棉拭子８份处理后接种猫肾传代细胞（分离到６株病毒，对其进行了血凝试验（半数组织培Ｆ８１细胞）ＨＡ）
的测定，理化性质鉴定，提取分离株Ｄ扩增其一特养物感染剂量（ＴＣＩＤＮＡ并通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）５０）异性片段和Ｖ并与Ｇ接毒后第６～１Ｐ２全序列，ｅｎＢａｎｋ上登录的ＣＰＶ毒株进行比对。结果表明，３天在Ｆ８１
，细胞上出现了明显的细胞病变（表现为细胞融合、变圆或拉长；所得分离株能使猪红细胞发生凝集反ＣＰＥ）
７１１
、、／／应，血凝效价为２能抗酸（热（从细胞培养物中分别扩Ｈ３）６０℃）２００ｍＬＬ乙醚、４８０ｍＬＬ氯仿；～２；ｐ
增出与特异性片段８２５ｂＰ２全基因１７５５ｂＰ２序列与ＧｅｎＢａｎｋ ｐ一致以及与Ｖｐ一致的条带。将扩增的Ｖ上登录的ＨＱ结果显８８３２６７．１、ＦＪ２２２８２３．１、ＦＪ００５２１４．１等１０个国内外ＣＰＶ分离株的ＶＰ２序列进行比对；）示，与北京地区一分离株（的同源性最高，为９但均ＨＱ８８３２６７．１９．０％～９９．６％。所得分离株为不同毒株，为ＣＰＶ２ａ型。－
关键词：犬细小病毒；藏獒；分离；鉴定
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＰＶｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍＴｉｂｅｔａｎｍａｓｔｉｆｆ
１１１１１１１
，，，ＬＩＡＮＧＬｕｉＺＨＡＮＧ ＨｅｎＷＥＩＳｈｅｎｎａｎＬＩＳｉｉＳＨＵＬｏｎＺＨＯＮＧＺｈｉｕｎＦＵ Ｈｕａｌｉｎ －ｑ ， － －ｑ ， －－ｇ，ｇｇ，ｊ
１１１２
，，，ＣＡＯＳｕｉｚｈｏｎＨＵ ＹａｎｃｈｕｎＹＵＳｈｕｉｎＬＩＣｈｅｎｕｎ －－ －ｍ －ｇ，ｇｊ
２２１
ＣＨＥＮ ＹｉｎＬＩＷａｎｉｎＰＥＮＧＧｕａｎｎｅｎ －ｑ －ｇ，ｇ，ｇｇ
（／１．ＫｅＬａｂｏｒａｔｏｒｏＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅａｎｄ Ｈｕｍａｎ ＨｅａｌｔｈｏＳｉｃｈｕａｎ ＰｒｏｖｉｎｃｅＣｏｌｌｅｅｏＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ， ｙ ｙｆ ｆ ｇｆ ｙ
Ｓｉｃｈｕａｎ ＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔＹａ’ａｎ６２５０１４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｍｉｎｓｈａｎ ＣｏｕｎｔＢｕｒｅａｕｏ ｇｙ，ｇｙ ｆ
Ａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍｉｎｓｈａｎ６２５１００，Ｃｈｉｎａ）ｇｇ
：（，ｂｓｔｒａｃｔＴｏｓｔｕｄｔｈｅｅｉｄｅｍｉｏｌｏｏｆｃａｎｉｎｅＣＰＶ）ｉｎＴｉｂｅｔａｎｍａｓｔｉｆｆｅｉｈｔｆｅｃａｌｓａｍｌｅｓａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ａ ｙｐｇｙｇｐｐ
ｃｏｌｌｅｃｔｅｄｂｃｏｔｔｏｎｓｗａｂｆｒｏｍ ＴｉｂｅｔａｎｍａｓｔｉｆｆｗｈｏｓｅＣＰＶｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｏｓｉｔｉｖｅａｃｃｏｒｄｉｎｔｏｔｈｅｗｅｒｅ ｙｐｇ ｉｍｍｕｎｅＣｏｌｌｏｉｄａｌＧｏｌｄｋｉｔ．ＳｉｘｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｂｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｉｎＦ８１ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉ －ｙ ｆｉｅｄｂＨＡ，ＴＣＩＤａｓｓａ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｉｃａｌｃｔｏａｔｈｏｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔｈｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｙｙｙｐｙｐｇｐｙ５０， （ＣＰＥ）ｗａｓｓｏｔｔｅｄｉｎＦ８１ｃｅｌｌｓｆｒｏｍ６ｔｏ１３ｄａｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅａｂｌｅｔｏａｌｕｔｉｎａｔｅｏｒ －ｐｙｇｇｐ
７１１
，（），（ｃｉｎｅｅｒｔｈｒｏｃｔｅｓａｎｄｔｈｅＨＡｔｉｔｅｒｗｅｒｅｆｒｏｍ２ｔｏ２．Ｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｌｌａｎｔｉａｃｉｄａｎｔｉｈｅａｔ６０Ｈ３ －－ｙｙｐ／／（℃）ａｎｄｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏ２００ｍＬＬａｅｔｈｅｒａｎｄ４８０ｍＬＬｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ．ＴｈｅＶＰ２ｇｅｎｅ１７５５ｂａｎｄａ８２５ｂ ｐ）ｐ
’Ｖ’（，ｆｒａｍｅｎｔｏｎｉｔｗｅｒｅａｍｌｉｆｉｅｄｂＰＣＲ．ＣｏｍａｒｅｄｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓＰ２ｗｉｔｈ１０ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｔｒａｉｎｓＨＱ８８３２６７．１ ｇｐｙｐ ＦＪ２２２８２３．１，ＦＪ００５２１４．１，ｅｔａｌ）ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ，ｔｈｅｍｏｓｔｓｉｍｉｌａｒｏｎｅｗａｓＨＱ８８３２６７．１ｗｉｔｈｉｄｅｎｔｉｔｏｆ ｙ ９９．６％．ＡｌｌｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｔｏｂｅＣＰＶ２ａ．９９．０％ｔｏｒｏｖｅｄ －ｐ
：；；ＫｅｗｏｒｄｓＣＰＶ；Ｔｉｂｅｔａｎｍａｓｔｉｆｆｉｓｏｌａｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｙ
；修回日期：收稿日期：２０１１０８２９２０１１１１２３－－－－
）；；基金项目：四川省教育厅重点项目（教育部“长江学者和创新团队发展规划”创新团队项目（四川农０９ＺＡ０８２ＩＲＴ０８４８）
）业大学双支计划项目（００２７０７０６
，：：作者简介：梁璐琪（男，四川雅安人，硕士生。＊通讯作者，ｎ．ｓｉｃａｕ１９８４Ｔｅｌ１３９８１６０６７１２，Ｅ－ｍａｉｌ６３．ｃｏｍ－）＠１ｐｇ
第２期 藏獒源犬细小病毒的分离鉴定 梁璐琪等：
１４５
已有３０００多年的育成 藏獒生活在青藏高原，
主要分布于我国西部地区的西藏、青海和四川历史，
等省区，不仅是我国特有的珍贵犬种，而且也是我国人民引以为骄傲和自豪的保种动物。但是近年来，犬细小病毒病对藏獒，特别是幼獒的感染和危害越来越严重，其发病率和死亡率比一般的犬种更高，多数藏獒虽经免疫但仍有部分仍得不到有效保护，甚至有一些病犬久治不愈最终死亡。这使许多藏獒养殖户经济上蒙受了巨大的损失，成为当前危害藏獒养殖业最严重的传染病。目前国内外对犬细小病毒（分离鉴定的报道很多，但藏獒源ＣＣＰＶ）ＰＶ的分离
］１７－
。为了进一步了解和掌握Ｃ鉴定却鲜有报道［ＰＶ在藏獒中的流行变异情况，笔者收集了来源于四川雅安、成都、乐山等地的经ＣＰＶ胶体金试纸检测为并用Ｆ阳性的藏獒病犬的直肠棉拭子，８１细胞进行了藏獒源ＣＰＶ毒株的分离鉴定。
，预期扩增的目的片ＴＴＣＴＡＧＧＴＧＣＴＡＧＴＴＧＡ３′－
段大小分别为８２５ｂ７５５ｂｎ －ｐ和１ｐ。引物由上海Ｉｖｉｔｒｏｅｎ公司合成。ｇ
１．４ 病毒的分离
／细胞培养１００ｍＬＬ样品混悬液）∶Ｖ（ 按Ｖ（
液）同步接毒Ｆ加入含＝１∶３０～１∶６０，８１细胞，
／／置于３１５０ｍＬＬＦＢＳ的ＤＭＥＭ后，７℃、５０ｍＬＬ ，换液，再加１／ＣＯ５０ｍＬＬＦＢＳ的 ２中２～４ｈ继续培养２配制分别ＤＭＥＭ，４ｈ。每日观察细胞，／／根据细胞含１５０ｍＬＬ和５０ｍＬＬＦＢＳ的ＤＭＥＭ， 生长情况及时改变ＦＢＳ的浓度。待出现大面积
并用Ｐ置于－２ＣＰＥ时收毒，ＥＧ６０００浓缩，０℃中－备用。１．５ ＰＣＲ鉴定
１．５．１ ＤＮＡ提取 将１．４中浓缩后的病毒液２００
按照病毒ＤＬ加入１．５ｍＬＥＰ管中，ＮＡ提取试剂 μ
盒说明书提取病毒Ｄ进行下一步Ｐ或ＮＡ，ＣＲ扩增，避免反复冻融。者置于－２０℃保存，
１．５．２ ＶＰ２特异性片段的ＰＣＲ扩增 采用２５μＬ
体系进行扩增：模板ＤＮＡ１．０μＬ，ＥｘＴａ５ ｑ（
２＋／）ＵＬ）０．１２５μＬ，１０×ＥｘＴａＭｌｕｓ ｇＰｑ缓冲液（μ
／各２．上游２．５μＬ，ｄＮＴＰ混合物（５ｍｍｏｌＬ）２μＬ，
）引物（下游引物（加入灭菌水使Ｐ１１μＬ，Ｐ２）１μＬ，
１ 材料与方法
１．１ 主要试剂
８１细胞购于中国科学院上 分离病毒所用的Ｆ
海细胞库；ＴａＤＮＡ聚合酶为大连宝生物工程有限ｑ 公司产品，病毒Ｄ琼脂糖凝胶ＮＡ提取试剂盒、ＤＮＡ回收试剂盒、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ均为天根生化科技、公司产品，小牛血清（ＦＢＳ）Ｌ－谷氨酰胺、ＤＭＥＭ培养液均为ＧＩＢＣＯ公司产品。１．２ 病料采集与处理
韩国ＰＶ胶体金试纸（ 选择临床上经Ｃ
检测为阳性的藏獒，将灭菌棉签伸入ＢＩＯＩＮＤＩＳＴ）擦拭直肠壁，沾取肠黏膜上皮，将棉发病藏獒肛门，
签头置于１．加入无血清的ＤＭＥＭ至１５ｍＬＥＰ管， 每次化冻后在振荡器上振荡１ｍＬ。反复冻融３次，
ｉｎ后再进行下一次冻融。冻融后将液体转入～２ｍ
用无血清ＤＭＥＭ反复冲洗、振荡１５ｍＬ离心管中，棉签头３～４次，并将冲洗后的液体也转入离心管／中，最后加无血清ＤＭ制成１ＥＭ至１０ｍＬ，００ｍＬＬ／。取上清样品混悬液。８０００ｒｍｉｎ离心１０～１５ｍｉｎ 液，经０置于－．２２μｍ微孔滤膜过滤后，２０℃备用。１．３ 引物的设计与合成
ｅｎＢａｎｋ上公布的ＣＰＶ的ＶＰ２核酸序 根据Ｇ
）列，分别设计扩增Ｖ和ＶＰ２片段（Ｐ１、Ｐ２Ｐ２全基因（特异性引物各１对，上游引物ＰＰ３、Ｐ４）１∶５′－，下游引物ＡＡＣＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣ３′－；上游Ｐ２：５′ＴＡＧＣＴＴＣＡＧＴＡＡＴＡ３′－ＴＡＡＴＡＧ－
引物Ｐ３：５′ＣＡＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡ－Ｃ－下游引物ＰＡＣＣＡＧＡＣ－３′，４：５′－ＡＡＴＡＴＡＡＴＴ－
反应体系达到２５μＬ。ＰＣＲ程序：９６℃预变性１８０
；；，，９４℃变性３０ｓ５２℃退火３５ｓ７２℃延伸４０ｓ３０ｓ
。Ｐ／个循环；最后延伸１于１０ｍｉｎＣＲ结束后，０ｇＬ琼脂糖凝胶中电泳，观察并记录结果。
１．５．３ ＶＰ２全基因的ＰＣＲ扩增 采用５０μＬ体系
／模板Ｄ进行扩增：ＮＡ２．５μＬ，ＥｘＴａ５ＵＬ） ｑ（μ
２＋
）０．２５μＬ，１０×ＥｘＴａＭｌｕｓ５．０μＬ， ｇＰｑ缓冲液（
／各２．上游引物（ｄＮＴＰ混合物（５ｍｍｏｌＬ）４μＬ，Ｐ３）
）下游引物（加入灭菌水使反应体系达２μＬ，Ｐ４２μＬ，
；到５０μＬ。ＰＣＲ程序：９６℃预变性１８０ｓ９５℃变性
，，，最３０ｓ５０℃退火３０ｓ７２℃延伸１４０ｓ３５个循环；。Ｐ／后延伸１在８ｇ０ｍｉｎＣＲ完成后，Ｌ琼脂糖凝胶
观察并将目的条带切下，用普通琼脂糖上进行电泳，
凝胶Ｄ送ＮＡ回收试剂盒对目的产物进行回收后，上海Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ公司测序。ｇ
１．６ 血凝试验（ＨＡ）
牛、山羊、小鼠、犬、猫、兔等血 无菌采集健康猪、
液，以阿氏液为抗凝剂。用ＰＢＳ洗涤红细胞３～５／次，制成红细胞泥，最后加入含１ｇＬ牛血清白蛋白／制成１的ＰＢＳ，０ｍＬＬ红细胞悬液。按文献［８９］－的方法测定各分离毒株对上述动物红细胞的ＨＡ
效价。
１４６
中国兽医科学第４２卷
１．７ ＴＣＩＤ５０效价的测定
］进行，将各分离株第５代细胞培养１０ 按文献［
－１
。每孔加入处于对数物做１０倍稀释（１００－６）～１
４℃过夜。然后再按１．７的方法计算出各分离株的
ＴＣＩＤ５０效价。
再加入各个稀释度的病增长期的Ｆ８１细胞１００μＬ，毒液１最后两孔作为空白对照。００μＬ，３７℃吸附２
换液继续培养。此后每日观察Ｃ至第５ＰＥ，～３ｈ，
天判读结果。以Ｒｅｅｄｕｅｎｃｈ法计算ＴＣＩＤ－Ｍ５０
效价。
１．８ 病毒的理化性质检测
方法将各分离株病毒进行如下处１１］ 按文献［
理：６０℃水浴作用３０ｍｉｎ；４℃，Ｈ３环境中作用２ｐ／／ｈ；４８０ｍＬＬ氯仿４℃作用１０ｍｉｎ；２００ｍＬＬ乙醚
２ 结果
２．１ 病毒的分离
有６份 采集的８份藏獒直肠棉拭子经过处理，
在接种Ｆ８１细胞后６～１３ｄ出现了较为明显的即表现为细胞融合、变圆或者细胞变细变长，ＣＰＥ，
，呈现“拉网”病变（见图１）同批次空白对照细胞正、常。各分离株依次被命名为ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１ＣＰＶ－
、、、ＹＡ－ＺＡ２ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５ＣＰＶ－ＣＤ－。ＺＡ１、ＣＰＶ－ＬＳＺ１
－Ｙ
图１ ＣＰＶ分离株在Ｆ８１细胞上的变化
Ｆｉ．１ ＴｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｃｈａｎｅｓｉｎＦ８１ｃｅｌｌｓｒｅｓｕｌｔｅｄｆｒｏｍｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＣＰＶ ｇｇ
正常的Ｆ分离株在ＦＡ：８１细胞对照；Ｂ：８１细胞上产生的ＣＰＥ；Ａ：ＮｏｒｍａｌＦ８１ｃｅｌｌｓｃｏｎｔｒｏｌＢ：ＴｉｃａｌＣＰＥｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｉｎＦ８１ｃｅｌｌ ｙｐ
２．２ ＰＣＲ鉴定
２．２．１ ＶＰ２特异性片段的扩增 用引物Ｐ１、Ｐ２进
／行Ｐ结果产物在１ＣＲ扩增，０ｇＬ琼脂糖凝胶中电泳见后出现了与预期值８２５ｂｐ大小相符的特异性条带（
）。表明各分离株的细胞培养物中存在Ｃ图２ＰＶ
。
２．２．２ ＶＰ２全基因的扩增 用引物Ｐ３、Ｐ４进行
／结果，产物在８ｇＰＣＲ扩增；Ｌ琼脂糖凝胶中电泳后出现了与预期值１７５５ｂ ｐ大小相符的特异性条带（），见图３说明扩增出了ＶＰ２全基因序列。将分离株所测得的序列与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的ＣＰＶ２－
（、ＧＵ５６９９４３．１，Ｃｈｉｎａ）ＣＰＶ２ａ（ＧＵ５６９９４７．１，－；；、ＣｈｉｎａＨＱ８８３２６７．１，ＢｅｉｉｎＦＪ００５２５９．１，Ｉｔａｌｊｇｙ）
；ＣＰＶ２ｂ（ＧＵ５６９９４４．１，ＧｕａｎｚｈｏｕＦＪ２２２８２３．１，－ｇ；、ＩｔａｌＡＹ７４２９５１．１，ＵＳ）ＣＰＶ２ｃ（ＦＪ２２２８２１．１，－ｙ
；；）的ＩｔａｌＦＪ００５２１４．１，ＳａｉｎＧＱ８６５５１９．１，Ｇｒｅｅｃｅｙｐ结果显示，各分离株间的同源ＶＰ２序列进行比对，性为９分离株与北京分离的参考株８．７％～９９．４％；为９ＨＱ８８３２６７．１的同源性最高，９．０％～９９．６％（；见表１）各分离株ＶＰ２氨基酸残基在Ｌ８７Ｍ、Ｉ１０１Ｔ、Ａ３００Ｇ、Ｄ３０５Ｙ的变异情况与ＣＰＶ２ａ的变－
。异一致。表明６个分离株均为ＣＰＶ２ａ－
图２ ６株分离病毒的ＰＣＲ结果Ｆｉ．２ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｂＰＣＲ ｇｙ
；；阳性对照Ｐ阴性对照Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ１：ｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２： ；；；Ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ３：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１４：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２５：ＣＰＶ－ＹＡ－ ｇ；；ＺＡ４；６：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５７：ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１８：ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１－－
第２期 藏獒源犬细小病毒的分离鉴定 梁璐琪等：
１４７
９
；Ｃ红细胞的血凝效价为２ＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５株对猪红１０
；Ｃ细胞的血凝效价为２ＰＶ－ＬＳＺＡ１株对猪红细－７
。Ｃ、胞的血凝效价为２ＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１－４
；、株对猫红细胞的血凝效价为２ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２
图３ ６株分离病毒ＶＰ２基因全序列的扩增结果Ｆｉ．３ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶＰ２ｇｅｎｅｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｂＰＣＲ ｇｙ
；；阳性对照Ｐ阴性对照Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ１：ｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２： ；；；Ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ３：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１４：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２５：ＣＰＶ－ＹＡ－ ｇ；；ＺＡ４；６：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５７：ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１８：ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１－－
、ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５株对猫红细胞的血凝
３；效价为２ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１株对猫红细胞的血凝效价－
１
。这表明分离株对猪红细胞有很好的凝集，为２对
但对其他动物的红细猫红细胞有一定的凝集能力，
］８９－
。胞基本不凝集，这与国内外相关报道一致［
２．３ 分离株的血凝试验
／牛、山羊、小０ｍＬＬ猪、 用６株分离株分别与１
鼠、犬、猫、兔红细胞进行凝集反应。结果显示，、ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１株对猪红细胞的血凝－
１１
；Ｃ、Ｃ效价为２ＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２ＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４株对猪
２．４ 分离株ＴＣＩＤ５０的测定及其理化特性鉴定
酸、氯仿、乙醚处理 测定了各分离株经过高温、
前后的Ｔ结果见表２。通过比较发现处ＣＩＤ５０效价，理前后Ｔ无明显ＣＩＤ５０效价相差都小于１个数量级，、变化。说明这６株分离病毒能耐受热（酸６０℃）（）、氯仿和乙醚。Ｈ３ｐ
表１ 藏獒源细小病毒分离株ＶＰ２全基因与参考株的同源性比较Ｔａｂｌｅ１ ＴｈｅＶＰ２ｇｅｎｅｈｏｍｏｌｏｉｅｓｏｆｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｇ
Ｓｔｒａｉｎ１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６
１
２
３
４
５
６
７
８
９
１０
１１
１２
１３
１４
１５
％
１６
９９．２９．０９．４８．７９．３８．５９．０９．６９．０９．０８．８９．０９．０８．８８．９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
０．８ １．０ ０．６ １．３ ０．７ １．６ １．０ ０．４ １．０ １．０ １．２ １．０ １．０ １．２ １．１
１．０ ０．８ ０．９ １．０ １．０ ０．４ ０．４ ０．５ ０．７ ０．６ ０．５ ０．５ ０．６ ０．５
０．５ ０．６ １．１ １．７ １．１ ０．６ １．２ １．２ １．４ １．１ １．２ １．４ １．３
１．０ ０．９ １．６ １．０ ０．５ １．０ １．０ １．２ １．０ １．０ １．２ １．１
１．１ １．７ １．０ １．０ １．１ １．３ １．３ １．２ １．１ １．３ １．２
１．７ １．０ ０．９ １．２ １．３ １．４ １．１ １．２ １．４ １．３
０．７ １．１ ０．７ ０．９ ０．９ ０．９ ０．７ ０．９ ０．８
０．６ ０．３ ０．４ ０．５ ０．５ ０．３ ０．５ ０．３
０．６ ０．６ ０．８ ０．６ ０．６ ０．８ ０．７
０．５ ０．４ ０．４ ０．２ ０．４ ０．３
０．５ ０．５ ０．３ ０．５ ０．４
０．５ ０．３ ０．５ ０．３
０．３ ０．５ ０．３
０．２ ０．１
０．１
９９．０９．２９．１９．０９．０９．６９．６９．５９．３９．４９．５９．５９．４９．５ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．５９．４８．９８．３８．９９．４８．８８．８８．６８．９８．８８．６８．７ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．０９．１８．５９．０９．５９．０９．０８．８９．０９．０８．８８．９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９８．９８．３９．０９．０８．９８．７８．７８．８８．９８．７８．８ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９８．３９．０９．１８．８８．７８．６８．９８．８８．６８．７ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．３８．９９．３９．１９．１９．１９．３９．１９．２ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．４９．７９．６９．５９．５９．７９．５９．７ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．４９．４９．２９．４９．４９．２９．３ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．５９．６９．６９．８９．６９．７ ９ ９ ９ ９ ９
９９．５９．５９．７９．５９．６ ９ ９ ９ ９
９９．５９．７９．５９．７ ９ ９ ９
９９．７９．５９．７ ９ ９
９９．８９．９ ９
９９．９
、、右上部分为不同毒株Ｖ左下部分为不同毒株的差异度；分别为藏獒源细小病毒分离株（Ｐ２序列的相似度，１～６：ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１－－、、、；分别为国内外分离到的细小病毒毒株，ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５）７～１６：ＧｅｎＢａｎｋ登录号分别为ＧＵ５６９９４３．１、ＧＵ５６９９４７．１、ＨＱ８８３２６７．１、ＦＪ００５２５９．１、ＧＵ５６９９４４．１、ＦＪ２２２８２３．１、ＡＹ７４２９５１．１、ＦＪ２２２８２１．１、ＦＪ００５２１４．１、ＧＱ８６５５１９．１；ＴｈｅｒｉｈｔｕｅｒｏｆＴａｂｌｅ１ｉｓｔｈｅｅｒｃｅｎｔｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓｏｆＶＰ２ｇｅｎｅａｍｏｎｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅｌｅｆｔｌｏｗｅｒｉｓｔｈｅｄｉｖｅｒｅｎｃｅｓ１－６：ＣＰＶｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍ Ｔｉ － － －ｇｐｐｐｇｇ （，，，，，）；ｂｅｔａｎｍａｓｔｉｆｆＣＰＶ－ＣＤＺＡ１ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５７－１６：ＣＰＶｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｈｏｍｅａｎｄ －－ ，：ａｂｒｏａｄｔｈｅＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＧＵ５６９９４３．１，ＧＵ５６９９４７．１，ＨＱ８８３２６７．１，ＦＪ００５２５９．１，ＧＵ５６９９４４．１，ＦＪ２２２８２３．１，ＡＹ７４２９５１．１，ＦＪ２２２８２１．１， ＦＪ００５２１４．１，ＧＱ８６５５１９．１，ｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌｐｙ
表２ 各分离株经热、酸和有机溶剂处理前后的ＴＣＩＤ５０效价
，，Ｔａｂｌｅ２ ＴＣＩＤｆｉｓｏｌａｔｅｓｔｒｅａｔｉｎｗｉｔｈｈｅａｔａｃｉｄｏｒａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｏｒｎｏｎｅ ５０ｏｇｇ
处理方式Ｍｅｔｈｏｄｓ
不处理Ｎｏｔｔｒｅａｔｅｄ ６０℃Ｈ３ ｐ
氯仿Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ 乙醚Ａｅｔｈｅｒ
ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５ １．３×１０
５
１．０×１０
５
０．５×１０
５
０．５×１０
５
０．６×１０
ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５ １．０×１０
５
０．８×１０
５
０．３×１０
５
０．２×１０
５
０．４×１０
ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５ １．６×１０
５
１．４×１０
５
０．８×１０
５
０．９×１０
５
０．９×１０
ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５ １．３×１０
５
０．９×１０
５
０．６×１０
５
０．５×１０
５
０．５×１０
ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１－
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５ ２．０×１０
５
１．８×１０
５
１．３×１０
５
１．４×１０
５
１．２×１０
ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１－
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５０．８×１０
５
０．４×１０
５
０．１×１０
５
０．１×１０
５
０．２×１０
１４８
中国兽医科学第４２卷
３ 讨论
ＰＶ的分离鉴定之前未见有相关报道。 藏獒源Ｃ
本试验从８份患病藏獒的直肠棉拭子中成功分离到分析比对其Ｖ藏獒源６株ＣＰＶ，Ｐ２全基因序列，
应为ＣＰＶ各分离株间的同源性为９８．７％～９９．４％，不同病毒。根据分离株ＶＰ２全基因的比对结果和
ＶＰ２上氨基酸残基的变异情况，６株分离株均为
［２］１３－
。１至今已有ＣＰＶ２ａ９７８年首次发现ＣＰＶ１－
、、ＣＰＶ２、ＣＰＶ２ａＣＰＶ２ｂＣＰＶ２ｃ等亚型，国内－－－－［４］１５－
。病毒由ＣＣＰＶ仍以ＣＰＶ２ａ流行为主１ＰＶ２－－
要作用，但结果易受红细胞种类、Ｈ和温度等因素ｐ的影响。由于ＣＰＶ对不同动物红细胞的敏感性不
８］
，、同［而且Ｃ猫细小病毒（水貂肠炎病毒ＰＶ、ＦＰＶ）
（都能凝集猪红细胞，所以，笔者选取了猪、ＭＥＶ）牛、山羊、小鼠、犬、猫、兔等７种动物的红细胞进行同时严格把ｐ试验温度控制鉴定，Ｈ值控制在７．２，在４℃或在冰浴中进行，在如此较为严格的试验条件下得到的结果与Ｃ进一步佐ＰＶ的特性完全相符，证了所分离病毒的可靠性。
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进化为ＣＰＶ２ａ是由于ＶＰ２上４个氨基酸残基位－
点（发生了变异，本Ｌ８７Ｍ、Ｉ１０１Ｔ、Ａ３００Ｇ、Ｄ３０５Ｙ）次分离的６个毒株在上述４个位点的变异情况与说明ＣＣＰＶ２ａ的相同，ＰＶ在藏獒中的流行情况与－
国内的流行情况一致。这为藏獒源ＣＰＶ分子流行病学调查和预防控制奠定了重要的前期工作基础。ＰＶ的病料多数来源于死亡动物剖 以往分离Ｃ
解后采集的内脏实质器官或小肠内容物，这显然不适用于患病期间藏獒的采样。直接采集粪便虽然也
１４］
，可以分离到病毒［但是粪便排出后容易受到环境
的污染以及动物排便的时间不受采样人员的控制以致不能及时得到粪便样品。在本研究中，为了调查和取样的方便，笔者尝试了用直肠棉拭子法采样，既减少污染，又能及时采到样能保证样品的新鲜度、
品、节约采样时间。本研究初期，笔者也多次试图直接用胶体金试纸检测ＣＰＶ后剩下的粪便液体用于病毒的分离，但都没有成功，这可能是由于胶体金试使病纸管中稀释液的某些成分破坏了病毒的结构，毒丧失了侵袭细胞的能力。当然直肠棉拭子法采集的直肠内容物的量通常不恒定，再加上粪便中毒素和组织分解代谢产物可能会对培养细胞产生一定的如何处理直肠内容物，尽量减少对病毒影响。因此，
的破坏，以及接种Ｆ８１细胞的时机和接种的量或比例成为能否成功分离病毒的关键。通过摸索，初步认为首先用无血清的ＤＭＥＭ及时处理直肠棉拭
／子，并将其配制成１一般按Ｖ００ｍＬＬ样品悬液，（／细胞培养液）１００ｍＬＬ样品混悬液）∶Ｖ（＝１∶３０
并用含Ｆ０在细胞传代时同步接入，ＢＳ１５０～１∶６ ／／ｍＬＬ和５０ｍＬＬ的ＤＭＥＭ及时调整细胞培养液
中Ｆ让细胞在接毒后第４～５天生长至ＢＳ浓度，再过１～２ｄ出现较为明显的Ｃ８０％左右，ＰＥ。这些经验可能为用粪便或直肠棉拭子法分离病毒提供有益的借鉴和参考。
ＰＶ的分离鉴定过程中发挥着重 血凝试验在Ｃ
ＢｕｌｌｅｔｉｎｏｔｈｅＡｃａｄｅｍｏＭｉｌｉｔａｒＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００６， ｆｙｆ ｙ
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１４９
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（责任编辑 胡弘博）
（）：中国兽医科学 ２０１２，４２０２１４４１４９－
ＣｈｉｎｅｓｅＶｅｔｅｒｉｎａｒＳｃｉｅｎｃｅ ｙ
（）中图分类号：Ｓ８５２．６５９．２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７３４６９６２０１２０２０１４４０６ －－－
藏獒源犬细小病毒的分离鉴定
梁璐琪１，张 恒１，魏胜男１，李思琪１，舒 龙１，钟志军１，符华林１，
曹随忠１，胡延春１，余树民１，李成军２，陈 英２，李万清２，彭广能１＊
（四川农业大学动物医学院动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安 ６１．２５０１４；
）名山县农业局，四川名山 ６２．２５１００
在藏獒中的流行情况，将临床上经胶体金试纸检测为阳性的藏獒直肠ＣＰＶ） 摘要：为弄清犬细小病毒（
，、棉拭子８份处理后接种猫肾传代细胞（分离到６株病毒，对其进行了血凝试验（半数组织培Ｆ８１细胞）ＨＡ）
的测定，理化性质鉴定，提取分离株Ｄ扩增其一特养物感染剂量（ＴＣＩＤＮＡ并通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）５０）异性片段和Ｖ并与Ｇ接毒后第６～１Ｐ２全序列，ｅｎＢａｎｋ上登录的ＣＰＶ毒株进行比对。结果表明，３天在Ｆ８１
，细胞上出现了明显的细胞病变（表现为细胞融合、变圆或拉长；所得分离株能使猪红细胞发生凝集反ＣＰＥ）
７１１
、、／／应，血凝效价为２能抗酸（热（从细胞培养物中分别扩Ｈ３）６０℃）２００ｍＬＬ乙醚、４８０ｍＬＬ氯仿；～２；ｐ
增出与特异性片段８２５ｂＰ２全基因１７５５ｂＰ２序列与ＧｅｎＢａｎｋ ｐ一致以及与Ｖｐ一致的条带。将扩增的Ｖ上登录的ＨＱ结果显８８３２６７．１、ＦＪ２２２８２３．１、ＦＪ００５２１４．１等１０个国内外ＣＰＶ分离株的ＶＰ２序列进行比对；）示，与北京地区一分离株（的同源性最高，为９但均ＨＱ８８３２６７．１９．０％～９９．６％。所得分离株为不同毒株，为ＣＰＶ２ａ型。－
关键词：犬细小病毒；藏獒；分离；鉴定
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＰＶｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍＴｉｂｅｔａｎｍａｓｔｉｆｆ
１１１１１１１
，，，ＬＩＡＮＧＬｕｉＺＨＡＮＧ ＨｅｎＷＥＩＳｈｅｎｎａｎＬＩＳｉｉＳＨＵＬｏｎＺＨＯＮＧＺｈｉｕｎＦＵ Ｈｕａｌｉｎ －ｑ ， － －ｑ ， －－ｇ，ｇｇ，ｊ
１１１２
，，，ＣＡＯＳｕｉｚｈｏｎＨＵ ＹａｎｃｈｕｎＹＵＳｈｕｉｎＬＩＣｈｅｎｕｎ －－ －ｍ －ｇ，ｇｊ
２２１
ＣＨＥＮ ＹｉｎＬＩＷａｎｉｎＰＥＮＧＧｕａｎｎｅｎ －ｑ －ｇ，ｇ，ｇｇ
（／１．ＫｅＬａｂｏｒａｔｏｒｏＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅａｎｄ Ｈｕｍａｎ ＨｅａｌｔｈｏＳｉｃｈｕａｎ ＰｒｏｖｉｎｃｅＣｏｌｌｅｅｏＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ， ｙ ｙｆ ｆ ｇｆ ｙ
Ｓｉｃｈｕａｎ ＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔＹａ’ａｎ６２５０１４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｍｉｎｓｈａｎ ＣｏｕｎｔＢｕｒｅａｕｏ ｇｙ，ｇｙ ｆ
Ａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍｉｎｓｈａｎ６２５１００，Ｃｈｉｎａ）ｇｇ
：（，ｂｓｔｒａｃｔＴｏｓｔｕｄｔｈｅｅｉｄｅｍｉｏｌｏｏｆｃａｎｉｎｅＣＰＶ）ｉｎＴｉｂｅｔａｎｍａｓｔｉｆｆｅｉｈｔｆｅｃａｌｓａｍｌｅｓａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ａ ｙｐｇｙｇｐｐ
ｃｏｌｌｅｃｔｅｄｂｃｏｔｔｏｎｓｗａｂｆｒｏｍ ＴｉｂｅｔａｎｍａｓｔｉｆｆｗｈｏｓｅＣＰＶｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｏｓｉｔｉｖｅａｃｃｏｒｄｉｎｔｏｔｈｅｗｅｒｅ ｙｐｇ ｉｍｍｕｎｅＣｏｌｌｏｉｄａｌＧｏｌｄｋｉｔ．ＳｉｘｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｂｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｉｎＦ８１ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉ －ｙ ｆｉｅｄｂＨＡ，ＴＣＩＤａｓｓａ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｉｃａｌｃｔｏａｔｈｏｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔｈｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｙｙｙｐｙｐｇｐｙ５０， （ＣＰＥ）ｗａｓｓｏｔｔｅｄｉｎＦ８１ｃｅｌｌｓｆｒｏｍ６ｔｏ１３ｄａｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅａｂｌｅｔｏａｌｕｔｉｎａｔｅｏｒ －ｐｙｇｇｐ
７１１
，（），（ｃｉｎｅｅｒｔｈｒｏｃｔｅｓａｎｄｔｈｅＨＡｔｉｔｅｒｗｅｒｅｆｒｏｍ２ｔｏ２．Ｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｌｌａｎｔｉａｃｉｄａｎｔｉｈｅａｔ６０Ｈ３ －－ｙｙｐ／／（℃）ａｎｄｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏ２００ｍＬＬａｅｔｈｅｒａｎｄ４８０ｍＬＬｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ．ＴｈｅＶＰ２ｇｅｎｅ１７５５ｂａｎｄａ８２５ｂ ｐ）ｐ
’Ｖ’（，ｆｒａｍｅｎｔｏｎｉｔｗｅｒｅａｍｌｉｆｉｅｄｂＰＣＲ．ＣｏｍａｒｅｄｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｓＰ２ｗｉｔｈ１０ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｔｒａｉｎｓＨＱ８８３２６７．１ ｇｐｙｐ ＦＪ２２２８２３．１，ＦＪ００５２１４．１，ｅｔａｌ）ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ，ｔｈｅｍｏｓｔｓｉｍｉｌａｒｏｎｅｗａｓＨＱ８８３２６７．１ｗｉｔｈｉｄｅｎｔｉｔｏｆ ｙ ９９．６％．ＡｌｌｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｔｏｂｅＣＰＶ２ａ．９９．０％ｔｏｒｏｖｅｄ －ｐ
：；；ＫｅｗｏｒｄｓＣＰＶ；Ｔｉｂｅｔａｎｍａｓｔｉｆｆｉｓｏｌａｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｙ
；修回日期：收稿日期：２０１１０８２９２０１１１１２３－－－－
）；；基金项目：四川省教育厅重点项目（教育部“长江学者和创新团队发展规划”创新团队项目（四川农０９ＺＡ０８２ＩＲＴ０８４８）
）业大学双支计划项目（００２７０７０６
，：：作者简介：梁璐琪（男，四川雅安人，硕士生。＊通讯作者，ｎ．ｓｉｃａｕ１９８４Ｔｅｌ１３９８１６０６７１２，Ｅ－ｍａｉｌ６３．ｃｏｍ－）＠１ｐｇ
第２期 藏獒源犬细小病毒的分离鉴定 梁璐琪等：
１４５
已有３０００多年的育成 藏獒生活在青藏高原，
主要分布于我国西部地区的西藏、青海和四川历史，
等省区，不仅是我国特有的珍贵犬种，而且也是我国人民引以为骄傲和自豪的保种动物。但是近年来，犬细小病毒病对藏獒，特别是幼獒的感染和危害越来越严重，其发病率和死亡率比一般的犬种更高，多数藏獒虽经免疫但仍有部分仍得不到有效保护，甚至有一些病犬久治不愈最终死亡。这使许多藏獒养殖户经济上蒙受了巨大的损失，成为当前危害藏獒养殖业最严重的传染病。目前国内外对犬细小病毒（分离鉴定的报道很多，但藏獒源ＣＣＰＶ）ＰＶ的分离
］１７－
。为了进一步了解和掌握Ｃ鉴定却鲜有报道［ＰＶ在藏獒中的流行变异情况，笔者收集了来源于四川雅安、成都、乐山等地的经ＣＰＶ胶体金试纸检测为并用Ｆ阳性的藏獒病犬的直肠棉拭子，８１细胞进行了藏獒源ＣＰＶ毒株的分离鉴定。
，预期扩增的目的片ＴＴＣＴＡＧＧＴＧＣＴＡＧＴＴＧＡ３′－
段大小分别为８２５ｂ７５５ｂｎ －ｐ和１ｐ。引物由上海Ｉｖｉｔｒｏｅｎ公司合成。ｇ
１．４ 病毒的分离
／细胞培养１００ｍＬＬ样品混悬液）∶Ｖ（ 按Ｖ（
液）同步接毒Ｆ加入含＝１∶３０～１∶６０，８１细胞，
／／置于３１５０ｍＬＬＦＢＳ的ＤＭＥＭ后，７℃、５０ｍＬＬ ，换液，再加１／ＣＯ５０ｍＬＬＦＢＳ的 ２中２～４ｈ继续培养２配制分别ＤＭＥＭ，４ｈ。每日观察细胞，／／根据细胞含１５０ｍＬＬ和５０ｍＬＬＦＢＳ的ＤＭＥＭ， 生长情况及时改变ＦＢＳ的浓度。待出现大面积
并用Ｐ置于－２ＣＰＥ时收毒，ＥＧ６０００浓缩，０℃中－备用。１．５ ＰＣＲ鉴定
１．５．１ ＤＮＡ提取 将１．４中浓缩后的病毒液２００
按照病毒ＤＬ加入１．５ｍＬＥＰ管中，ＮＡ提取试剂 μ
盒说明书提取病毒Ｄ进行下一步Ｐ或ＮＡ，ＣＲ扩增，避免反复冻融。者置于－２０℃保存，
１．５．２ ＶＰ２特异性片段的ＰＣＲ扩增 采用２５μＬ
体系进行扩增：模板ＤＮＡ１．０μＬ，ＥｘＴａ５ ｑ（
２＋／）ＵＬ）０．１２５μＬ，１０×ＥｘＴａＭｌｕｓ ｇＰｑ缓冲液（μ
／各２．上游２．５μＬ，ｄＮＴＰ混合物（５ｍｍｏｌＬ）２μＬ，
）引物（下游引物（加入灭菌水使Ｐ１１μＬ，Ｐ２）１μＬ，
１ 材料与方法
１．１ 主要试剂
８１细胞购于中国科学院上 分离病毒所用的Ｆ
海细胞库；ＴａＤＮＡ聚合酶为大连宝生物工程有限ｑ 公司产品，病毒Ｄ琼脂糖凝胶ＮＡ提取试剂盒、ＤＮＡ回收试剂盒、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ均为天根生化科技、公司产品，小牛血清（ＦＢＳ）Ｌ－谷氨酰胺、ＤＭＥＭ培养液均为ＧＩＢＣＯ公司产品。１．２ 病料采集与处理
韩国ＰＶ胶体金试纸（ 选择临床上经Ｃ
检测为阳性的藏獒，将灭菌棉签伸入ＢＩＯＩＮＤＩＳＴ）擦拭直肠壁，沾取肠黏膜上皮，将棉发病藏獒肛门，
签头置于１．加入无血清的ＤＭＥＭ至１５ｍＬＥＰ管， 每次化冻后在振荡器上振荡１ｍＬ。反复冻融３次，
ｉｎ后再进行下一次冻融。冻融后将液体转入～２ｍ
用无血清ＤＭＥＭ反复冲洗、振荡１５ｍＬ离心管中，棉签头３～４次，并将冲洗后的液体也转入离心管／中，最后加无血清ＤＭ制成１ＥＭ至１０ｍＬ，００ｍＬＬ／。取上清样品混悬液。８０００ｒｍｉｎ离心１０～１５ｍｉｎ 液，经０置于－．２２μｍ微孔滤膜过滤后，２０℃备用。１．３ 引物的设计与合成
ｅｎＢａｎｋ上公布的ＣＰＶ的ＶＰ２核酸序 根据Ｇ
）列，分别设计扩增Ｖ和ＶＰ２片段（Ｐ１、Ｐ２Ｐ２全基因（特异性引物各１对，上游引物ＰＰ３、Ｐ４）１∶５′－，下游引物ＡＡＣＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣ３′－；上游Ｐ２：５′ＴＡＧＣＴＴＣＡＧＴＡＡＴＡ３′－ＴＡＡＴＡＧ－
引物Ｐ３：５′ＣＡＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡ－Ｃ－下游引物ＰＡＣＣＡＧＡＣ－３′，４：５′－ＡＡＴＡＴＡＡＴＴ－
反应体系达到２５μＬ。ＰＣＲ程序：９６℃预变性１８０
；；，，９４℃变性３０ｓ５２℃退火３５ｓ７２℃延伸４０ｓ３０ｓ
。Ｐ／个循环；最后延伸１于１０ｍｉｎＣＲ结束后，０ｇＬ琼脂糖凝胶中电泳，观察并记录结果。
１．５．３ ＶＰ２全基因的ＰＣＲ扩增 采用５０μＬ体系
／模板Ｄ进行扩增：ＮＡ２．５μＬ，ＥｘＴａ５ＵＬ） ｑ（μ
２＋
）０．２５μＬ，１０×ＥｘＴａＭｌｕｓ５．０μＬ， ｇＰｑ缓冲液（
／各２．上游引物（ｄＮＴＰ混合物（５ｍｍｏｌＬ）４μＬ，Ｐ３）
）下游引物（加入灭菌水使反应体系达２μＬ，Ｐ４２μＬ，
；到５０μＬ。ＰＣＲ程序：９６℃预变性１８０ｓ９５℃变性
，，，最３０ｓ５０℃退火３０ｓ７２℃延伸１４０ｓ３５个循环；。Ｐ／后延伸１在８ｇ０ｍｉｎＣＲ完成后，Ｌ琼脂糖凝胶
观察并将目的条带切下，用普通琼脂糖上进行电泳，
凝胶Ｄ送ＮＡ回收试剂盒对目的产物进行回收后，上海Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ公司测序。ｇ
１．６ 血凝试验（ＨＡ）
牛、山羊、小鼠、犬、猫、兔等血 无菌采集健康猪、
液，以阿氏液为抗凝剂。用ＰＢＳ洗涤红细胞３～５／次，制成红细胞泥，最后加入含１ｇＬ牛血清白蛋白／制成１的ＰＢＳ，０ｍＬＬ红细胞悬液。按文献［８９］－的方法测定各分离毒株对上述动物红细胞的ＨＡ
效价。
１４６
中国兽医科学第４２卷
１．７ ＴＣＩＤ５０效价的测定
］进行，将各分离株第５代细胞培养１０ 按文献［
－１
。每孔加入处于对数物做１０倍稀释（１００－６）～１
４℃过夜。然后再按１．７的方法计算出各分离株的
ＴＣＩＤ５０效价。
再加入各个稀释度的病增长期的Ｆ８１细胞１００μＬ，毒液１最后两孔作为空白对照。００μＬ，３７℃吸附２
换液继续培养。此后每日观察Ｃ至第５ＰＥ，～３ｈ，
天判读结果。以Ｒｅｅｄｕｅｎｃｈ法计算ＴＣＩＤ－Ｍ５０
效价。
１．８ 病毒的理化性质检测
方法将各分离株病毒进行如下处１１］ 按文献［
理：６０℃水浴作用３０ｍｉｎ；４℃，Ｈ３环境中作用２ｐ／／ｈ；４８０ｍＬＬ氯仿４℃作用１０ｍｉｎ；２００ｍＬＬ乙醚
２ 结果
２．１ 病毒的分离
有６份 采集的８份藏獒直肠棉拭子经过处理，
在接种Ｆ８１细胞后６～１３ｄ出现了较为明显的即表现为细胞融合、变圆或者细胞变细变长，ＣＰＥ，
，呈现“拉网”病变（见图１）同批次空白对照细胞正、常。各分离株依次被命名为ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１ＣＰＶ－
、、、ＹＡ－ＺＡ２ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５ＣＰＶ－ＣＤ－。ＺＡ１、ＣＰＶ－ＬＳＺ１
－Ｙ
图１ ＣＰＶ分离株在Ｆ８１细胞上的变化
Ｆｉ．１ ＴｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｃｈａｎｅｓｉｎＦ８１ｃｅｌｌｓｒｅｓｕｌｔｅｄｆｒｏｍｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＣＰＶ ｇｇ
正常的Ｆ分离株在ＦＡ：８１细胞对照；Ｂ：８１细胞上产生的ＣＰＥ；Ａ：ＮｏｒｍａｌＦ８１ｃｅｌｌｓｃｏｎｔｒｏｌＢ：ＴｉｃａｌＣＰＥｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｉｎＦ８１ｃｅｌｌ ｙｐ
２．２ ＰＣＲ鉴定
２．２．１ ＶＰ２特异性片段的扩增 用引物Ｐ１、Ｐ２进
／行Ｐ结果产物在１ＣＲ扩增，０ｇＬ琼脂糖凝胶中电泳见后出现了与预期值８２５ｂｐ大小相符的特异性条带（
）。表明各分离株的细胞培养物中存在Ｃ图２ＰＶ
。
２．２．２ ＶＰ２全基因的扩增 用引物Ｐ３、Ｐ４进行
／结果，产物在８ｇＰＣＲ扩增；Ｌ琼脂糖凝胶中电泳后出现了与预期值１７５５ｂ ｐ大小相符的特异性条带（），见图３说明扩增出了ＶＰ２全基因序列。将分离株所测得的序列与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的ＣＰＶ２－
（、ＧＵ５６９９４３．１，Ｃｈｉｎａ）ＣＰＶ２ａ（ＧＵ５６９９４７．１，－；；、ＣｈｉｎａＨＱ８８３２６７．１，ＢｅｉｉｎＦＪ００５２５９．１，Ｉｔａｌｊｇｙ）
；ＣＰＶ２ｂ（ＧＵ５６９９４４．１，ＧｕａｎｚｈｏｕＦＪ２２２８２３．１，－ｇ；、ＩｔａｌＡＹ７４２９５１．１，ＵＳ）ＣＰＶ２ｃ（ＦＪ２２２８２１．１，－ｙ
；；）的ＩｔａｌＦＪ００５２１４．１，ＳａｉｎＧＱ８６５５１９．１，Ｇｒｅｅｃｅｙｐ结果显示，各分离株间的同源ＶＰ２序列进行比对，性为９分离株与北京分离的参考株８．７％～９９．４％；为９ＨＱ８８３２６７．１的同源性最高，９．０％～９９．６％（；见表１）各分离株ＶＰ２氨基酸残基在Ｌ８７Ｍ、Ｉ１０１Ｔ、Ａ３００Ｇ、Ｄ３０５Ｙ的变异情况与ＣＰＶ２ａ的变－
。异一致。表明６个分离株均为ＣＰＶ２ａ－
图２ ６株分离病毒的ＰＣＲ结果Ｆｉ．２ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｂＰＣＲ ｇｙ
；；阳性对照Ｐ阴性对照Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ１：ｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２： ；；；Ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ３：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１４：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２５：ＣＰＶ－ＹＡ－ ｇ；；ＺＡ４；６：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５７：ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１８：ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１－－
第２期 藏獒源犬细小病毒的分离鉴定 梁璐琪等：
１４７
９
；Ｃ红细胞的血凝效价为２ＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５株对猪红１０
；Ｃ细胞的血凝效价为２ＰＶ－ＬＳＺＡ１株对猪红细－７
。Ｃ、胞的血凝效价为２ＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１－４
；、株对猫红细胞的血凝效价为２ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２
图３ ６株分离病毒ＶＰ２基因全序列的扩增结果Ｆｉ．３ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶＰ２ｇｅｎｅｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｂＰＣＲ ｇｙ
；；阳性对照Ｐ阴性对照Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ１：ｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２： ；；；Ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ３：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１４：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２５：ＣＰＶ－ＹＡ－ ｇ；；ＺＡ４；６：ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５７：ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１８：ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１－－
、ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５株对猫红细胞的血凝
３；效价为２ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１株对猫红细胞的血凝效价－
１
。这表明分离株对猪红细胞有很好的凝集，为２对
但对其他动物的红细猫红细胞有一定的凝集能力，
］８９－
。胞基本不凝集，这与国内外相关报道一致［
２．３ 分离株的血凝试验
／牛、山羊、小０ｍＬＬ猪、 用６株分离株分别与１
鼠、犬、猫、兔红细胞进行凝集反应。结果显示，、ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１株对猪红细胞的血凝－
１１
；Ｃ、Ｃ效价为２ＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２ＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４株对猪
２．４ 分离株ＴＣＩＤ５０的测定及其理化特性鉴定
酸、氯仿、乙醚处理 测定了各分离株经过高温、
前后的Ｔ结果见表２。通过比较发现处ＣＩＤ５０效价，理前后Ｔ无明显ＣＩＤ５０效价相差都小于１个数量级，、变化。说明这６株分离病毒能耐受热（酸６０℃）（）、氯仿和乙醚。Ｈ３ｐ
表１ 藏獒源细小病毒分离株ＶＰ２全基因与参考株的同源性比较Ｔａｂｌｅ１ ＴｈｅＶＰ２ｇｅｎｅｈｏｍｏｌｏｉｅｓｏｆｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｇ
Ｓｔｒａｉｎ１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６
１
２
３
４
５
６
７
８
９
１０
１１
１２
１３
１４
１５
％
１６
９９．２９．０９．４８．７９．３８．５９．０９．６９．０９．０８．８９．０９．０８．８８．９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
０．８ １．０ ０．６ １．３ ０．７ １．６ １．０ ０．４ １．０ １．０ １．２ １．０ １．０ １．２ １．１
１．０ ０．８ ０．９ １．０ １．０ ０．４ ０．４ ０．５ ０．７ ０．６ ０．５ ０．５ ０．６ ０．５
０．５ ０．６ １．１ １．７ １．１ ０．６ １．２ １．２ １．４ １．１ １．２ １．４ １．３
１．０ ０．９ １．６ １．０ ０．５ １．０ １．０ １．２ １．０ １．０ １．２ １．１
１．１ １．７ １．０ １．０ １．１ １．３ １．３ １．２ １．１ １．３ １．２
１．７ １．０ ０．９ １．２ １．３ １．４ １．１ １．２ １．４ １．３
０．７ １．１ ０．７ ０．９ ０．９ ０．９ ０．７ ０．９ ０．８
０．６ ０．３ ０．４ ０．５ ０．５ ０．３ ０．５ ０．３
０．６ ０．６ ０．８ ０．６ ０．６ ０．８ ０．７
０．５ ０．４ ０．４ ０．２ ０．４ ０．３
０．５ ０．５ ０．３ ０．５ ０．４
０．５ ０．３ ０．５ ０．３
０．３ ０．５ ０．３
０．２ ０．１
０．１
９９．０９．２９．１９．０９．０９．６９．６９．５９．３９．４９．５９．５９．４９．５ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．５９．４８．９８．３８．９９．４８．８８．８８．６８．９８．８８．６８．７ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．０９．１８．５９．０９．５９．０９．０８．８９．０９．０８．８８．９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９８．９８．３９．０９．０８．９８．７８．７８．８８．９８．７８．８ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９８．３９．０９．１８．８８．７８．６８．９８．８８．６８．７ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．３８．９９．３９．１９．１９．１９．３９．１９．２ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．４９．７９．６９．５９．５９．７９．５９．７ ９ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．４９．４９．２９．４９．４９．２９．３ ９ ９ ９ ９ ９ ９
９９．５９．６９．６９．８９．６９．７ ９ ９ ９ ９ ９
９９．５９．５９．７９．５９．６ ９ ９ ９ ９
９９．５９．７９．５９．７ ９ ９ ９
９９．７９．５９．７ ９ ９
９９．８９．９ ９
９９．９
、、右上部分为不同毒株Ｖ左下部分为不同毒株的差异度；分别为藏獒源细小病毒分离株（Ｐ２序列的相似度，１～６：ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１－－、、、；分别为国内外分离到的细小病毒毒株，ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５）７～１６：ＧｅｎＢａｎｋ登录号分别为ＧＵ５６９９４３．１、ＧＵ５６９９４７．１、ＨＱ８８３２６７．１、ＦＪ００５２５９．１、ＧＵ５６９９４４．１、ＦＪ２２２８２３．１、ＡＹ７４２９５１．１、ＦＪ２２２８２１．１、ＦＪ００５２１４．１、ＧＱ８６５５１９．１；ＴｈｅｒｉｈｔｕｅｒｏｆＴａｂｌｅ１ｉｓｔｈｅｅｒｃｅｎｔｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓｏｆＶＰ２ｇｅｎｅａｍｏｎｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅｌｅｆｔｌｏｗｅｒｉｓｔｈｅｄｉｖｅｒｅｎｃｅｓ１－６：ＣＰＶｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍ Ｔｉ － － －ｇｐｐｐｇｇ （，，，，，）；ｂｅｔａｎｍａｓｔｉｆｆＣＰＶ－ＣＤＺＡ１ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５７－１６：ＣＰＶｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｈｏｍｅａｎｄ －－ ，：ａｂｒｏａｄｔｈｅＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＧＵ５６９９４３．１，ＧＵ５６９９４７．１，ＨＱ８８３２６７．１，ＦＪ００５２５９．１，ＧＵ５６９９４４．１，ＦＪ２２２８２３．１，ＡＹ７４２９５１．１，ＦＪ２２２８２１．１， ＦＪ００５２１４．１，ＧＱ８６５５１９．１，ｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌｐｙ
表２ 各分离株经热、酸和有机溶剂处理前后的ＴＣＩＤ５０效价
，，Ｔａｂｌｅ２ ＴＣＩＤｆｉｓｏｌａｔｅｓｔｒｅａｔｉｎｗｉｔｈｈｅａｔａｃｉｄｏｒａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｏｒｎｏｎｅ ５０ｏｇｇ
处理方式Ｍｅｔｈｏｄｓ
不处理Ｎｏｔｔｒｅａｔｅｄ ６０℃Ｈ３ ｐ
氯仿Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ 乙醚Ａｅｔｈｅｒ
ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ１
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５ １．３×１０
５
１．０×１０
５
０．５×１０
５
０．５×１０
５
０．６×１０
ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ２
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５ １．０×１０
５
０．８×１０
５
０．３×１０
５
０．２×１０
５
０．４×１０
ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ４
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５ １．６×１０
５
１．４×１０
５
０．８×１０
５
０．９×１０
５
０．９×１０
ＣＰＶ－ＹＡ－ＺＡ５
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５ １．３×１０
５
０．９×１０
５
０．６×１０
５
０．５×１０
５
０．５×１０
ＣＰＶ－ＣＤＺＡ１－
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５ ２．０×１０
５
１．８×１０
５
１．３×１０
５
１．４×１０
５
１．２×１０
ＣＰＶ－ＬＳＺＡ１－
（／）ＴＣＩＤｍＬ５０
５０．８×１０
５
０．４×１０
５
０．１×１０
５
０．１×１０
５
０．２×１０
１４８
中国兽医科学第４２卷
３ 讨论
ＰＶ的分离鉴定之前未见有相关报道。 藏獒源Ｃ
本试验从８份患病藏獒的直肠棉拭子中成功分离到分析比对其Ｖ藏獒源６株ＣＰＶ，Ｐ２全基因序列，
应为ＣＰＶ各分离株间的同源性为９８．７％～９９．４％，不同病毒。根据分离株ＶＰ２全基因的比对结果和
ＶＰ２上氨基酸残基的变异情况，６株分离株均为
［２］１３－
。１至今已有ＣＰＶ２ａ９７８年首次发现ＣＰＶ１－
、、ＣＰＶ２、ＣＰＶ２ａＣＰＶ２ｂＣＰＶ２ｃ等亚型，国内－－－－［４］１５－
。病毒由ＣＣＰＶ仍以ＣＰＶ２ａ流行为主１ＰＶ２－－
要作用，但结果易受红细胞种类、Ｈ和温度等因素ｐ的影响。由于ＣＰＶ对不同动物红细胞的敏感性不
８］
，、同［而且Ｃ猫细小病毒（水貂肠炎病毒ＰＶ、ＦＰＶ）
（都能凝集猪红细胞，所以，笔者选取了猪、ＭＥＶ）牛、山羊、小鼠、犬、猫、兔等７种动物的红细胞进行同时严格把ｐ试验温度控制鉴定，Ｈ值控制在７．２，在４℃或在冰浴中进行，在如此较为严格的试验条件下得到的结果与Ｃ进一步佐ＰＶ的特性完全相符，证了所分离病毒的可靠性。
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，，，ＬＩＵ ＤａｆｅｉＷＡＮＧ ＭｕｉｎＳＩＷｅｉｅｔａｌ．Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎｏｆａ－－ ｐｇｃａｎｉｎｅａｒｖｏｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎＣＰＶ－ＹＮｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ Ｈｅｉｌｏｎｉａｎ ｐｇｊｇ［］ｒｏｖｉｎｃｅＪ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄｉ －ｐｆ ｙ （）：（）ｃｉｎｅ，２０１０，３２１１８７５８７８．ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ－
［］刘宏伟，刘大伟，等．犬细小病毒抗原变异株的分离与鉴６ 杨敬，
］（）：军事医学科学院院刊，定［Ｊ．２００６，３０６５２６５２８．－
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进化为ＣＰＶ２ａ是由于ＶＰ２上４个氨基酸残基位－
点（发生了变异，本Ｌ８７Ｍ、Ｉ１０１Ｔ、Ａ３００Ｇ、Ｄ３０５Ｙ）次分离的６个毒株在上述４个位点的变异情况与说明ＣＣＰＶ２ａ的相同，ＰＶ在藏獒中的流行情况与－
国内的流行情况一致。这为藏獒源ＣＰＶ分子流行病学调查和预防控制奠定了重要的前期工作基础。ＰＶ的病料多数来源于死亡动物剖 以往分离Ｃ
解后采集的内脏实质器官或小肠内容物，这显然不适用于患病期间藏獒的采样。直接采集粪便虽然也
１４］
，可以分离到病毒［但是粪便排出后容易受到环境
的污染以及动物排便的时间不受采样人员的控制以致不能及时得到粪便样品。在本研究中，为了调查和取样的方便，笔者尝试了用直肠棉拭子法采样，既减少污染，又能及时采到样能保证样品的新鲜度、
品、节约采样时间。本研究初期，笔者也多次试图直接用胶体金试纸检测ＣＰＶ后剩下的粪便液体用于病毒的分离，但都没有成功，这可能是由于胶体金试使病纸管中稀释液的某些成分破坏了病毒的结构，毒丧失了侵袭细胞的能力。当然直肠棉拭子法采集的直肠内容物的量通常不恒定，再加上粪便中毒素和组织分解代谢产物可能会对培养细胞产生一定的如何处理直肠内容物，尽量减少对病毒影响。因此，
的破坏，以及接种Ｆ８１细胞的时机和接种的量或比例成为能否成功分离病毒的关键。通过摸索，初步认为首先用无血清的ＤＭＥＭ及时处理直肠棉拭
／子，并将其配制成１一般按Ｖ００ｍＬＬ样品悬液，（／细胞培养液）１００ｍＬＬ样品混悬液）∶Ｖ（＝１∶３０
并用含Ｆ０在细胞传代时同步接入，ＢＳ１５０～１∶６ ／／ｍＬＬ和５０ｍＬＬ的ＤＭＥＭ及时调整细胞培养液
中Ｆ让细胞在接毒后第４～５天生长至ＢＳ浓度，再过１～２ｄ出现较为明显的Ｃ８０％左右，ＰＥ。这些经验可能为用粪便或直肠棉拭子法分离病毒提供有益的借鉴和参考。
ＰＶ的分离鉴定过程中发挥着重 血凝试验在Ｃ
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（责任编辑 胡弘博）