酶工程就是酶学理论与化学工程相结合，并在一定的反应装置中利用酶的催化特性，将原料转化为产物，是酶制剂大批量生产和应用的技术。
主要内容：酶的生产、提取与分离纯化、酶分子修饰、酶分子定向进化、酶固定化、酶非水相催化、酶反应器以及应用等。
蛋白质分子量= aa数目*110
蛋白质功能的多样性
1． 酶
2．结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）
3．贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）
4．物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）
5．细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）
6．激素功能（胰岛素）
7．（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白）
8．接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）
9．调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）
胶原蛋白中的Lys 侧链氧化时能形成很强的分子间(内) 交联。
Arg 的胍基碱性很强，与NaOH 相当。
His 是一个弱碱，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。
非极性aa 一般形成蛋白质的疏水核心，带电荷的aa 和极性aa 位于表面。
酶的活性中心：His 、Ser 、Cys
氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力
氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用
基于分配系数（极性）差异的分离方法
——分配层析
★肽键的结构特点：
（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体。
（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。
（3）肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个C α几乎处在同一平面内（酰氨平面）。
（4）肽键亚氨基在pH0---14内不解离。
（5）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro 的肽键可能出现顺、反两种构型．
★双缩脲反应
凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。
双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。
★噬菌体表面展示技术与随机多肽库的应用：
靶功能筛选多肽药物
研究大分子之间的相互作用
★丹磺酰氯（DNS-cl ，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。
N Gly —Ala —Ser —Leu —Phe C →→
DNS —Gly —Ala —Ser —Leu —Phe C
水解 DNS —Gly 、 Ala 、 Ser 、 Leu 、 Phe
DNS-AA 在紫外光激发后发黄色荧光。
问题1：求出二肽Lys —Lys 及三肽Lys —Lys —Lys 的pI 值。（10.2以上）
问题2：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI 值是大于6.0？小于6.0? 还是等于6.0？ （小于6.0）
蛋白质工程与基因工程的区别
基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质。
蛋白质工程则根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要的优点的蛋白质。
天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，好比是在实验室里加快了的进化过程，期望能更快、更有效地为人类的需要服务。
多维核磁共振技术（NMR ）
蛋白质测序的一般步骤 P168
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。
（3） 断裂链内二硫键。
（4） 分析多肽链的N 末端和C 末端。
（5） 测定多肽链的氨基酸组成。
（6） 多肽链部分裂解成肽段。
（7） 测定各个肽段的氨基酸顺序
（8） 确定肽段在多肽链中的顺序。
（9） 确定多肽链中二硫键的位置。
端基分析
①N 端分析
★DNS-Cl 法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
★DNFB 法：Sanger 试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-
氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）
抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
★ PITC 法：Edman 法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
②C 端分析
★肼解法
无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h 。
苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C 端游离氨基酸留在上清中。
Gln 、Asn 、Cys 、Arg 不能用此法。
★羧肽酶法（Pro 不能测）
羧肽酶A ：除Pro 、Arg 、Lys 外的所有C 端a.a
羧肽酶B ：只水解Arg 、Lys
N H2N „ „ „ „ „V al —Ser —Gly C
3、 肽段的分离纯化
①电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE —Cellulose 、DEAE —Sephadex ）
根据肽段的电荷特性分离
③反相ＨＰＬＣ法
根据肽段的极性分离
④凝胶过滤
要求： ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带
ＨＰＬＣ单峰
Ｎ端单一（常用ＤＮＳ－c l法）
肽段拼接成肽链
16肽，Ｎ端H Ｃ端Ｓ
Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT
Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO
重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS
★牛胰RNase 变性一复性实验：
124个a.a 残基
4个链内二硫键。
分子量：12600
(8M尿素+β硫基乙醇) 变性、失活→透析后构象恢复，
活性恢复95%以上; 而二硫键正确复性的概率是1/105。
说明1、蛋白质变性后还可以复性。2、蛋白质的高级结构由一级结构决定。
同源蛋白质：
在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。
同源蛋白质的特点：
①同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列同源性）
②有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。
除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。
③多肽链长度相同或相近
胰岛素
●有24个氨基酸残基位置始终不变：A ．B 链上6个Cys 不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。
●其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用。
●猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。
★多肽的固相合成
支持介质：聚苯乙烯树脂
合成方向：C 端 → N 端。
合成程序：挂接→去保护→中和→缩合→断裂与去保护
蛋白质一级结构的突变—分子病
胰岛素原的激活
※ 前胰岛素原，含信号肽。
※ 胰岛素原，内质网腔，信号肽被信号肽酶切除。
※ 活性胰岛素，高尔基体，切除C 肽。
天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转
肽链的二面角
★只有α碳原子连接的两个键（C α—N 和C α-C ）是单键，能自由旋转。
★环绕C α—N 键旋转的角度为Φ
环绕C α—C 键旋转的角度称Ψ
★当Φ(Ψ) 旋转键两侧的主链呈顺式时，规定Φ(Ψ) =0°
★从C α沿键轴方向看，顺时针旋转的Φ (Ψ) 角为正值，反之为负值。
α螺旋的一般特征：
★多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，
★相邻的螺圈之间形成链内氢键
★构成螺旋的每个C α都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋用3.613表示，
3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基
13表示氢键封闭的环包括13个原子。
右手螺旋比左手螺旋稳定。
β-折叠
平行式：所有参与β-折叠的肽链的N 端在同一方向。
反平行式：肽链的极性一顺一倒，N 端间隔相同
反平β-折叠比平行的更稳定
β转角的特征：
①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。
②主链骨架以180°返回折叠。
③第一个a.a 残基的C=O与第四个a.a 残基的N-H 生成氢键
④C1α与C4α之间距离小于0.7nm
⑤多数由亲水氨基酸残基组成。
回形拓扑结构（希腊钥匙）
结构域 domain ，motif(模块)
在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立的、近似球形的三维实体。
结构域是球状蛋白的折叠单位
较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。
结构域一般有１００－２００氨基酸残基。
结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。
结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。
结构域间的裂缝，常是酶的活性部位，也是反应物的出入口
★EF 手：钙结合蛋白中，含有Helix-Loop-Helix 结构
★锌指：DNA 结合蛋白中，2个His 、2个Cys 结合一个Zn
★亮氨酸拉链：DNA 结合蛋白中，由亮氨酸倒链形成的拉链式结构.
维持三级结构的作用力：
（1）氢键
（2）范德华力（分子间及基团间作用力）：
定向效应： 极性基团间
诱导效应： 极性与非极性基团间
分散效应： 非极性基团间
（3）疏水相互作用
（4）离子键（盐键）
（5）共价健，主要的是二硫键，
二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。
☆有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成，这种等同的结构成分称
为原体。如血红蛋白α2β2就是由两个原体αβ组成。
有时也把原体称为单体。
四级结构缔合的驱动力
疏水作用
极性基团之间的氢键和离子键
二硫桥
亚基之间的缔合方式
1、同多聚与杂多聚
（homomultimeric and heteromultimeric)
2、同种缔合与异种缔合（isologus and heterologus)
同种缔合：亚基间相互作用的表面是相同的，形成的结构是对称的
异种缔合：亚基间相互作用的表面是不同的，形成线形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒外壳。
★ 别构蛋白：
除了有活性部位（结合底物）外，还有别构部位（结合调节物）。有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。
★ 别构效应：
别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位产生的影响。 ★同促效应（同位效应）：
一种配体的结合对于其它部位结合同种配体的能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。
同位效应一般是指活性部位之间的效应。
同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成是对同位效应的一种修饰
★异促效应（异位效应）：
就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活性部位的影响。
★ 正协同效性：
一种配基的结合促进后续配基的结合，S 型配体结合曲线。
★负协同效性：
一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。
★正效应物：促进活性部位与配基结合的别构效应物。
★负效应物：抑制活性部位与配基结合的别构效应物。
血红蛋白的结构：
▲接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。 ▲α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似。
协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地输送氧气。
nH=1,无协同性 nH ＞1, 正协同性 nH ＜1, 负协同性
★协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率
抗原与抗体
★抗原是指进入异体机体后，导致致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。
★抗原性包括免疫原性和抗原特异性。
★免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。
★抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。
★抗原决定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团称抗原决定簇。
★抗原决定簇的作用：
①被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。
②与相应抗体的Fab 结合。
★抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B 淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，称免疫球蛋白。
★抗体具有两个特点：
①高度特异性
②多样性
几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有10,000种抗体存在。
抗原抗体反应
★抗体是2价的，抗原是多价的。
★抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体饱和，可溶。
抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原—抗体复合物，不可溶。
抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。
★抗原抗体反应的条件：
①抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。
②二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结合
（离子键、氢键 等）。
★基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法：
酶联免疫吸附测定（ELISA ）
Western 印迹(Western blot)
酵母双杂交
蛋白质的酸碱性质和等电点
★ 等电点
★ 等离子点：
中性盐（Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO42+）影响滴定曲线形状和等电点。
盐离子浓度为零时的等电点称等离子点
★等电点测定
溶解度法
聚焦电泳法
测分子量的方法：
★化学组成法测定最低分子量
★SDS-PAGE 法
★凝胶过滤法
★渗透压法
★扩散系数法
★沉降系数法和沉降平衡法
根据分子组成测定最小分子量
如肌红蛋白含0.335%的铁
Fe 分子量 55.8
最小M ＝ Fe(%) = 0.335 =16700
(实为16900) 牛血清白蛋白含Trp 0.58%
最低M=35200，实际为69000，含2个Trp
葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量
交联葡聚糖（Sephadex ）;
聚丙烯酰胺凝胶
（Bio-Gel P ，）
琼脂糖凝胶(Sepharose，Bio-Gel A）
SDS —PAGE
（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）
★制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
蛋白质分离纯化的一般原则
纯化的实质：
增加制品的纯度或比活性
一般程序：
前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存
细分级（fine fractionation)
①透析除盐
②sephadex G-25凝胶过滤除盐
★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC ） ★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳
★密度梯度离心
浓缩与保存
保存方法：
①晶体保存：
结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度 的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。
结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH 、接入晶种。 ②冻干粉保存：
③溶液保存：
加入抗冻剂（50%甘油）后 -20℃ - 70℃保存。
分离纯化蛋白质（酶）的主要方法
★根据蛋白质的溶解度分离
★根据电荷差异分离
★根据分子大小分离
★根据配体特异性分离（亲和层析）
★选择性吸附分离（物理吸附）
★根据疏水性的差异
（一）根据溶解度差异的分离：选择性沉淀法
盐析法
PEG 沉淀法
有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法
重金属盐选择性沉淀法（pH 》pI ，蛋白质带负电荷）
生物碱和酸选择性沉淀法（pH 《pI ，蛋白质带正电荷）
热处理沉淀法（铜锌SOD ，65℃、15分钟、稳定）
等电点沉淀
在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。
在pI 时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀。
蛋白质的盐溶与盐析
盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶解度↑，称盐溶。
盐析：高盐浓度时，蛋白质溶解度↓，称盐析。
盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl 、MgCl2、NH4Cl 、KCl 等的饱和溶液
(二）根据 分子大小和形状的差异
①透析和超滤法：除去小分子物质
②密度梯度离心法 蔗糖密度梯度离心
③凝胶过滤法
透析-----半透膜阻留pr 分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。
蛋白质的超过滤------施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子
蔗糖密度梯度saccharose-----沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析
（三） 根据电荷性质的差异:
1、电泳和等电聚焦法：
普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳
从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳
从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。
从支持物分： 自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等）
2、离子交换层析法
离子交换纤维素：
离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应
离子交换交联琼脂糖：
（四）根据选择性吸附的差异：
吸附层析法
极性：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键）
非极性：活性炭（范德华力、疏水作用）
最广泛最有效：羟基磷灰石（hydroxyapatite) ，即结晶磷酸钙[Ca10（PO4）6（OH ）2]，可分离蛋白质、核酸，与DNA 的亲和力最高
（五）根据疏水性的差异：
疏水层析和反相HPLC
1、疏水层析
层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sepharose)
辛基琼脂糖(octa - sepharose)
洗脱： 低盐高pH
非离子型去污剂（triton x-100)
脂肪醇（丁醇、乙二醇）
2、反相HPLC
固定相：丁基硅烷、辛基硅烷、C18硅烷
（六） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析
配基：
酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。
免疫亲和层析
凝集素亲和层析
金属螯和层析
染料配体层析
亲和层析 p91-99
（固相）载体：纤维素、葡聚糖凝胶、交联琼脂糖凝胶（sepharose ）、聚丙烯酰胺凝胶等。 要求：具备与配体偶联反应的大量功能基团；
必须是亲水性的，具有一定机械强度、结构疏松，利于酶与配基自由接触；惰性，没有或者很少非专一性吸附；化学性质稳定，良好的流体力学性。
配体和臂：
配基的选择：配基-酶的解离常数10-8 - 10-4 mol；必须具有供偶联反应的活泼基团，且其与载体或臂结合后，不影响酶的亲和力；配基偶联量1-20 μmol/mL。
臂的选择：长短适中；
纯度鉴定（均一性）
基本手段：电泳分析：单条带。
N 端测定：n 亚基蛋白有 1 —n 个N 端aa 。 选用手段：沉降分析、溶解度分析
结晶分析（能结晶的一般比较纯）
酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。
催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能较低的途径进行。
催化剂的效应只反映在动力学上（反应速度），不影响反应的热力学（化学平衡）。 ★转换数（TN) 或催化常数（Kcat) 表示酶的最大催化效率
Kcat 是一定条件下（[S]》Km ）每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（数值上Kcat =K3）
酶催化反应的特点
（1）、 催化效率高 （2）、专一性高 （3）、 反应条件温和 （4）、 活性可调节
（5）、 酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子
★ ribozyme 核酶（具有催化功能的RNA ）
酶的化学组成
单纯酶类(simple enzyme)：仅由蛋白质组成
脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等
结合酶类（conjugated enzyme):酶蛋白和辅因子
全酶（holoenzyme)=脱辅基酶（apoenzyme)+辅因子(cofactor)
如：(超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）
★ 酶的辅助因子主要有金属离子和有机化合物
辅酶(coenzyme)：与酶蛋白结合较松，可透析除去。
辅基(prosthetic group)：与酶蛋白结合较紧。
★酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和反应的性质。
NAD+构成专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶的辅基。
★大多数寡聚酶是胞内酶，而单体酶一般是胞外酶。
胞内酶：合成后仍留在细胞内发挥作用；
胞外酶：合成后分泌到细胞外发挥作用。
多酶复合体
★由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。
多酶融合体（多功能酶）
★一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。
酶的国际系统命名
★★基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。 ★酶国际系统命名法举例
谷丙转氨酶的系统名称：丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶
★★ 国际系统分类法及编号（EC 编号）
（1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示。
（2）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3„„。
（3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3表示。
每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。
第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。
乙醇脱氢酶EC1.1.1.1 ，
乳酸脱氢酶EC1.1.1.27 ，
苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37
第一个数字表示大类： 氧化还原
第二个数字表示反应基团：醇基
第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+
第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸
★酶的国际系统分类
★氧、转、水、裂、异、合
1、氧化还原酶类（乳酸脱氢酶）
催化氧化还原反应： A ·2H+B=A+B·2H
2、 转移酶类（ 谷丙转氨酶（GPT ））
AB+C=A+BC
3、 水解酶类（亮氨酸氨基肽水解酶 Ieu 氨肽酶）
催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。
4、 裂合酶类（裂解酶）{二磷酸酮糖裂合酶 ：醛缩酶}
催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应
5、 异构酶（6-磷酸Glc 异构酶）
催化同分异构体相互转化
6、 合成酶（连接酶）
催化一切必须与A TP 分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。
UTP ：氨连接酶（CTP 合成酶）
L-酪氨酸：tRNA 连接酶（酪氨酰tRNA 合成酶）
T4DNA 连接酶
▴国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异
★在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明
抗体酶：一类具有催化活性的免疫球蛋白，其可变区被赋予了酶的属性。又称催化抗体。 模拟酶：利用有机化学方法设计并合成的一些较天然酶更简单的非蛋白质分子，以其为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。
分子印迹酶：制备对某一化合物具有选择性的聚合过程
酶的专一性
1、结构专一性
绝对专一性：键及键两侧的基团（脲酶）
相对专一性：基团或键专一性 （α-葡萄糖苷）
2、立体专一性
旋光异构专一性（D-、L-）
几何异构专一性 (延胡索酸酶)
潜手性专一性
酶活力测定 p63
酶活力与酶促反应速度
酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应初速度。
酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。
单位：浓度/单位时间
研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准(底物消耗≤5%）。（产物≤ 15％）
酶的活力单位（U ）
国际单位（IU 单位）：
最适反应条件下，每分钟催化1umol 底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU ），1 IU = 1umol /min
国际单位（Katal, Kat单位）：
在最适反应条件下，每秒钟催化1mol 底物转化为产物所需的酶量，称Kat 单位
1 Kat=6 X 107 IU
最适条件：最适温度（25℃或37℃）, 最适pH 、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。 底物浓度（1）通常很大，使酶饱和
（2）底物消耗≤5%
凝胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ug λDNA 完全水解的酶量为1个酶单位。 淀粉酶两种定义：
A ：1 g可溶性淀粉，在1h 内液化所需的酶量。
B ：l ml 2%可溶性淀粉，在1h 内液化所需的酶量。
1g 酶制剂溶于1000ml H2O，取0.5ml 与2%的starch 20ml反应，pH6.0，10分钟完全液化，求酶活力。
A ：20×2%×1/0.5×1000×60/10=4800u/克酶制剂
B ： 20/0.5×1000×60/10=240000u/克酶制剂
酶的比活力 Specific activity
每毫克酶蛋白所具有的酶活力。
单位：
酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。 米氏方程：
Ks 为底物解离常数（底物常数）
所谓“稳态”：ES 的形成速度与分解速度相等、ES 的浓度保持不变的反应状态
★ 都是K3惹的祸
Km 的物理意义
当反应速度v=1/2 Vmax时， Km = [S]，
Km 的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。
单位：mol ·L-1或mmol ·L-1
Km 是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。 Km 最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为：
Km 愈小（达到Vmax 一半所需的底物浓度愈小）表示V 对△[S] 越灵敏。
Km 、Ks 与底物亲和力
★Km 是ES 分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES 解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。
★Ks （K2／K1）是底物常数，只反映ES 解离趋势（底物亲和力），1/Ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。
★只有当K1 、 K2》K3时，Km ≈Ks ，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。 ★底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与产物形成趋势K3／K1有关 问题：
（1） Km 越小，底物亲和力越大（X ）
（2） Ks 越小，底物亲和力越大（√）
（3） 天然底物就是亲和力最大的底物（X ）
（4） 天然底物就是Km 值最小的底物（√）
（5）底物亲和力越大酶促反应速度越大（X ）
（6）对于不同的酶或同一种酶的不同底物，Km 越小反应速度越大（？X ）
在一定的酶浓度下，Vmax 是一个常数，它只与底物的种类及反应条件有关。 Vmax=K3 [E]
K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat ）， 表明酶的最大催化效率
转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。 乳酸脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒
Km 和Vmax 的求解方法1、 Lineweaver-Burk 双倒数作图法
（一）多底物酶促反应有 三种动力学机制
★sequential reactions（序列机制):
▲ Ordered reaction (有序序列机制)
▲Random reactions (随机序列机制)
★ Ping pong reactions （乒乓机制)
有序反应机制 底物与酶的结合，产物的释放都有先后次序 ★在缺少A 时，B 不能与E 结合
★ A 与其产物Q 相互竞争地结合E
★ 反应的总方向决定于A 、Q 的浓度和反应的平衡常
随机反应机理
★ 限速步骤是AEB → QEP
★ A 与Q 相互竞争E 上的底物结合部位A ，B 与P 相互竞争E 上的底物结合部位B ★ 反应的总方向决定于A 、B 、Q 、P 的浓度和反应的平衡常数
乒乓反应机制
★A 与Q 竞争自由酶形式E ，B 与P 竞争修饰酶形式F ★整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式
★谷氨酸与丙氨酸竞争性结合E-磷酸吡哆醛，α-酮戊二酸与丙酮酸竞争性结合F -磷酸吡哆胺
双底物反应的动力学方程
KmA ：[B]达到饱和浓度时A 的米氏常数
KmA ’ ：A 的表观米氏常数
Vmax ：[A][B]都达到饱和浓度时的最大反应速度
★虽然大部分酶的pH —酶活曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。
★不同的离子激活不同的酶。
★不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与K+、Mg2+与Ca2+之间常常拮抗，但Mg2+与Zn2+常可替代。
★ 激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mM
抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或丧失但并不引起酶蛋白变性 变性剂没有选择性
抑制剂有不同程度的选择性
抑制程度的两种表示方法1、相对活力★相对活力分数 ★相对活力百分数
2、抑制率 ★抑制分数 ★抑制百分数
竞争性抑制 抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI 复合物，阻止底物与酶结合。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。 非竞争性抑制不能通过增加底物浓度来消除非竞争性抑制作用 某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+
反竞争性抑制 可使E 对S 的亲和力增大
竞争性抑制：★抑制程度决定于[I]、[S]、Km 和Ki Ki 为EI 的解离常数 ★Vmax 不变 ★Km 变大，而且随[I]浓度的增大而增大
非竞争性抑制 ★抑制程度决定于[I]和Ki ，与底物的Km 和[S]无关 ★Km 不变，Vmax 降至Vmax/（1+[I]/Ki）
抑制程度与[I]成正比 在一定[I] 下， Ki 越大，抑制作用越小
反竞争性抑制 ★抑制程度决定于Km 、Ki 、[S]、[I] ★Km 及Vmax 都变小 抑制程度既与[I]成正比，又与[S]成正比
在一定的[S]、[I]下，Ki 越大，抑制程度越小；Km 越大，抑制程度越小。
★含卤素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、卤乙酰苯等）常用于鉴定酶中巯基。 Ks 型不可逆抑制剂（底物型） Kcat 型不可逆抑制剂（催化型）
可逆抑制剂 ★竞争性抑制剂
★磺胺类药物及其作用机理 p19
对氨基苯磺酰胺或其衍生物是对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制细菌的二氢叶酸合成酶活性
★抗癌药 : 氨基叶酸、阿拉伯糖胞苷、5-氟尿嘧啶等。
★抑制剂与药物开发
Kcat 型不可逆抑制剂的专一性程度很强，前景广阔
底物类似物型的竞争性抑制剂最易开发
过度态底物类似物型药物最具价值(高效\特异)
酶的活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基，包括底物结合部位、催化部位
频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser 、His 、Cys 、Tyr 、Asp 、Glu 、Lys 。
相对专一性
★键专一性（对底物结构要求最低）
★基团专一性Group Specificity
不仅对键有要求，还对键一端的基团有要求，但对另一端基团要求不严格。如：α—D —Glc 苷酶，水解蔗糖和麦芽糖。
绝对专一性
只能作用于一个底物，或只催化一个反应。
麦芽糖酶只作用于麦芽糖，脲酶只催化尿素水解
酶作用专一性的解释
锁钥模型 锁钥模型较好地解释了立体异构专一性。但不能解释可逆反应。
诱导契合模型 酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合，进行反应。
高效性(降低活化能) 的机理
邻近与定向效应
邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。
定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应
酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。
邻近与定向效应对反应速度的影响：
①使底物浓度在活性中心附近很高
②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用
③酶使分子间反应转变成分子内反应
④邻近效应和定向效应对底物起固定作用
应变效应（张力学说）
酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能
①酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。
②底物形变，利于形成ES 复合物。
③底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能。
酸碱催化
酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用。
影响酸碱催化反应速度的两个因素
⑴酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。
⑵咪唑基给出质子或结合质子的速度最快，半寿期小于10-10秒
共价催化
酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物。
活性中心金属离子的催化作用
（1）通过结合底物为反应定向
（2）通过自身价数的改变参加氧化还原反应
（3）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷
活性中心的微环境
⑴ 疏水环境
介电常数低，加强极性基团间的作用。
⑵电荷环境
在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子
丝氨酸蛋白酶家族的底物专一性
★丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser-His-Asp 催化三联体（电荷中继网）。
电荷中继网： Ser195—His57—Asp102氢键体系。通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。
但它们活性中心的底物结合部位不同，底物专一性也不同。
★丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋内的微环境（疏水性、电荷性质）决定了丝氨酸蛋白酶的底物专一性
胰凝乳蛋白酶 ：裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键
胰蛋白酶：裂解碱性氨基酸残基羧基侧的肽键
弹性蛋白酶：裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键
★ 胰凝乳蛋白酶反应的详细机制
第一阶段： 酰化 第二阶段： 脱酰
★ 多酶体系具有自我调节能力
（1）第一步反应往往是限速步骤，控制着全部反应序列的总速度。
（2）反馈抑制与底物激活
催化第一步反应的酶，大多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制；有的则是反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反馈抑制；有的被底物激活。
别构调节 --非共价结合
天冬氨酸转氨甲酰酶—正协同效应的别构酶（ATCase ）
3-磷酸甘油醛脱氢酶—负协同效应的别构酶 半位反应性 — 极端的负协同效应
别构酶的结构特点和性质
（1） 已知的别构酶都是寡聚酶，通过次级键结合。
（2）具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。
（3）多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同位效应，底物就是调节物；有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。
（4）不遵循米式方程，动力学曲线是S 型（正协同效应）或表观双曲线（负协同效应）。
正协同效应的别构酶是S 型曲线 负协同效应的别构酶是表观双曲线
别构酶的鉴定
① 双倒数作图不是直线
② 饱和比值（saturation ratio, Rs)
③ 脱敏作用：理化处理后，仍保持活性，但失去调节性质。
脱敏后的别构酶表现为米氏酶的动力学曲线
齐变模型(MWC模式 ) ：p33 (6要点)
1、别构酶是寡聚酶，由多个相同亚基组成，亚基对称排布。
2、每个亚基对特定配体都有一个结合部位，且相同。
3、R 态对底物和别构激活剂亲和力较大，T 态对别构抑制剂亲和力较大。
4、同步转变。
5、当酶分子由一种构像状态转变成另一构像状态时，分子对称性保持不变。
6、R 和T 处于动态平衡中。
如：天冬氨酸转氨甲酰酶
该模型可以解析别构激活、别构抑制和正协同效应，不能解析负协同效应。
序变模型（KNF 模式）：p34 (5要点)
1、别构酶是相同亚基构成的寡聚体
2、亚基有T 态和R 态。
3、T 态和R 态可以共存于一个寡聚体中。
4、当底物或效应物与酶分子一个亚基结合时，可以引起此亚基的构像变化。这种变化可以作用于相邻的亚基，使其发生同样的构像变化。顺次第三、第四，直至酶分子中所有亚基都发生同样的构像变化。
5、一个亚基与底物或效应物结合后，可以使相邻亚基对后继底物分子的亲和力提高或降低。
KNF 和MWC 的区别：
1、无底物或效应物时，酶分子中亚基只存在一种构象状态（T 态）
2、可以同时存在T 态亚基和R 态亚基杂交形成的酶-底物复合物中间体。
3、底物之间可以正协同，也可以是负协同。
可逆的共价调节（共价调节酶） 不可逆的共价调节（酶原的激活）
专一性调控蛋白（调控因子）对酶活性的调节控制
同工酶可以实现对分支代谢的综合调控
结构酶：组成性表达，正常细胞中含量较稳定，受外界因素影响很小。
诱导酶：诱导性表达，在正常细胞中含量极少或没有，当细胞中加入特定诱导物后，诱导产生的酶，含量在诱导物存在下显著增高，诱导物往往是该酶的底物或底物类似物。 大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶
酶的阻遏 色氨酸操纵子模型
阻遏：表达降低，基因表达的调控方式之一。
细胞内某些代谢途径的终产物或某些中间产物的过量积累，阻止代谢途径中某些酶的合成
酶与非生物催化剂相比的几点共性：
①催化效率高，用量少（细胞中含量低）。
②加快反应速度但不改变化学反应平衡点。
③降低反应活化能。
④反应前后自身结构不变。
产酶细胞（菌株）应具备的条件
1．酶的产量高；
2. 容易培养和管理；
3. 产酶稳定性好；
4. 利于酶的分离纯化；
5. 安全可靠。
安全、经济、易操作
菌种分离 划线 稀释 单孢
培养基成份
一）碳源: 淀粉、石油产品（12～16C ）
二）氮源：有机与无机态氮
三）无机盐：P 、S 、K 、Mg 、Ca 、Na 盐等
四）微量元素：Fe 、Mn 、Zn 、Cu 、Co 、Mo 等
五）生长因子：AA 、维生素、等
六）产酶促进剂：诱导物、表面活性剂
发酵条件对产酶的影响
一）温度：吸热、放热
二）pH ：生理酸（碱）性盐
三）通风：O2
四）搅拌：切应力
五）泡沫：不利于CO2排出，减少溶氧量
六）湿度：固体培养基
酶的发酵生产类型
（一）固体培养发酵（传统方法）
（二）液体深层发酵：
①适用性强，可用于各种细胞的悬浮培养和发酵；
②易于人为控制；
③机械化程度高，酶产品质量较好，酶产率及产品回收率较高。
碳源：
1．选择原则：
①营养：
②对酶生物合成的调节作用：
③原料的供求和价格。
氮源
选择原则：
①根据不同的细胞要求选择
②注意C/N比
溶氧速率不宜过高
提高酶产量的其它措施
1．添加诱导物: 诱导酶
2．控制阻遏物浓度：产物阻遏
3．添加表面活性剂：Triton X-100
4．添加产酶促进剂：植酸钙镁
细胞生长曲线：四期
调整、对数、平衡、衰退
酶生物合成的模式
1．同步合成型：同步、平衡期终止
2．延续合成型：同步、平衡期后continue
3．中期合成型：滞后、平衡期终止
4．滞后合成型：细胞生长进入平衡期后
依据：酶的生产与细胞生长的关系
延续合成型是酶的工业生产中最理想的合成模式。
产酶动力学 四类 （同步、中期、滞后、延续）
微生物细胞发酵产酶
一．菌种的分离纯化：
二．富集培养：
三．菌种纯化：
四．菌种变异：
1．物理或化学方法诱变：
2．基因工程方法：
五．酶的生产
菌种变异：
1．物理或化学方法诱变：
2．基因工程方法
培养基制作、发酵方法、发酵条件是所发酵微生物菌株最适的
酶制剂的工业制备法
一．发酵液的预处理
二．发酵液的分离、过滤：
三．酶液的脱色
四．发酵液的浓缩与初步提纯
五．精制
六．浓缩与干燥
酶虽然具有高效、专一、反应条件温和、活性可调节等特点，但大多数酶存在以下不足。
1、稳定性较差：除α-淀粉酶、Taq 酶和胃蛋白酶可以耐受较低pH ，大多数酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。
2、只能一致性使用：酶一般都是在溶液中与底物、产物共存，„
3、产物分离纯化较困难：
固定化酶(immobilized enzyme)的定义
通过理化手段将酶束缚在水不溶的载体上，或限制在一定空间范围内，但仍具有酶活性。
固定化酶的优缺点（一）优点
1）酶与底物、产物易分开，简化了提纯工艺
2）可反复使用，利于连续化、管道化
3）反应过程可控，利于自动化
4）提高了稳定性
5）效率高、产率高、质量高、成本低
（二）缺点
1）损失酶活力
2）较适应水溶性底物和小分子底物
3）不适于多酶反应
4）对胞内酶需先分离，后固定化
固定化酶的方法 4种：
吸附、共价结合、交联、包埋
（一）吸附法1．物理吸附
通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。
1）有机载体：纤维素、淀粉 等
2）无机载体: 氧化铝、皂土、硅胶 等
2．离子交换吸附
酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合。
1）阴离子交换剂：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶
2）阳离子交换剂：CM-纤维素、
（二）包埋法 适于小分子底物。凝胶包埋法
微囊化 将酶包埋于具有半透性膜的微囊中。
1) 界面沉淀：一些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，将酶包埋。P110, 如：人造细胞
2) 界面聚合：疏水性和亲水性单体在界面聚合形成半透膜，酶包埋于半透膜微囊中。
3) 液体干燥：p111
4) 红血球包埋：p111 p216 图10-1
5) 脂质体包埋：酶包埋于双层脂质体形成的极细球粒中
(三）共价结合法
酶蛋白侧链基团和载体表面的功能基团之间形成共价键而固定。
优：酶与载体结合牢固，酶不易脱落；
缺：反应条件较激烈，酶易失活，制作繁琐。
偶联最普遍的基团：氨基、羧基和苯环。
二步：选择载体、偶联反应
叠氮反应
带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，先在酸性条件下用甲醇处理使其酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO2作用下转变成叠氮衍生物；衍生物低温下与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应，中性羟胺水解即得固定化酶。
交联法常与吸附法、包埋法结合使用。
原生质体固定化常采用凝胶包埋法
固定化酶的性质一、酶活力：
大多数固定化酶活性下降。结构变化、空间位阻、可能的变性。
二. 稳定性
1. 热稳定性、抵抗力、操作稳定性、储藏稳定性等增加
2. 最适温度提高
3. 最适pH 值：*
a. 载体性质对最适pH 的影响（负－碱））
b. 产物性质对最适pH 的影响：
依据酶蛋白和载体的电荷而定
固定化对酶反应系统的影响
构象改变和屏蔽效应 微环境的影响 分配效应与扩散效应
1载体与底物带有相同电荷时，Km 增大；带相反电荷Km 降低。
2载体带正电荷时，酶活性-pH 曲线向酸性偏移；阴离子载体时，曲线向碱性方向偏移。 3 采用疏水载体时，如底物为极性物质，或电荷物质， Km 降低。
酶分子的化学修饰
在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（特别是具有生物相容性的物质），进行共价连接，而改变酶的结构和性质。
酶化学修饰的目的*
1．研究酶的结构与功能
2．增强酶天然构象的稳定性与耐热性。
3．保护酶的活性部位与抗抑制剂。
4．维持酶结构功能的完整性与抗蛋白水解酶。
5．消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
酶分子的修饰方法
3种: 酶的表面修饰、内部修饰、与辅因子相关的修饰
酶的表面修饰 一）化学固定化“阴碱阳酸”；改变Km 值，“同增异减”
二）酶的小分子修饰作用 三）酶的大分子修饰 二类：共价与非共价修饰
PEG 、右旋糖苷 四）酶的分子内交联、增加酶分子表面交联键的数目。
五）分子间交联 六）脂质体包裹 七）反向胶团微囊化（有机相中）
酶分子的内部修饰 一）非催化活性基团的修饰 二）酶蛋白主链修饰 酶法。
三）催化活性基团的修饰（化学突变法）四）肽链伸展后的修饰
修饰反应的条件
尽可能在酶稳定条件下进行，
尽量不破坏酶活性功能必需基团，使修饰率、酶活力回收率高。
酶蛋白肽链的大分子修饰 要求修饰剂具有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。
2类人工酶：半合成酶、全合成酶
用有机化学和生物学的方法合成具有专一催化功能的酶的模拟物。
全合成酶不是蛋白质
用分子印迹技术制备的人工酶。
四氢叶酸THFA Tetrahydrofolate
黄素辅酶FMN 、FAD
生物素Biotin CO2传递体
焦磷酸硫胺素(TPP) 催化縮合、脱羧和还原反应
抗体酶：具有催化功能的抗体分子。
本质上是免疫球蛋白。
半抗原：
本身不能诱导免疫应答的小分子物质，共价结合到具有免疫性的蛋白质后，注射动物能诱导出对该小分子物质的抗体产生。
半抗原是过渡态类似物；
催化抗体与过渡态类似物具有互补结构。
半抗原与催化抗体的关系
1) 半抗原多含有芳香结构；
2) 半抗原与抗体的结合常数Ki ＜10-6 mol/L；
3) 诱导羧酸酯、酰胺水解的催化抗体，考虑四面体高能结构；
4) 考虑催化反应环境与反应机制。
抗体酶的制备方法 拷贝法、引入法、诱导法
单克隆细胞合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
水活度：一定压力下，反应体系中的水蒸汽压和纯水蒸汽压之比。
酶分子印迹：利用酶与配体的相互作用，可以制备具有结合特定配体能力的新酶。 生物酶工程：酶学和DNA 重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的生物工程。 主要研究内容： 克隆酶、突变酶、新酶。
突变酶
定义：酶的选择性遗传修饰以及对酶基因进行定点突变而得到的新酶。
基因定点诱变：通过取代、插入或缺失克隆基因或DNA 序列中的任何一个特定的碱基，实现在体外特异性改变某个碱基。
主要方法：盒式诱变、寡核苷酸引物诱变、PCR 诱变
PCR 诱变 2种: 重组PCR 定点诱变和大引物诱变。
生物反应器：用于完成生物化学反应的核心装置。
生物传感器概述
由感受器和换能器两部分组成
药用酶的新剂型 3个难题：抗原性、体内半衰期、体内定位
载酶人造细胞 人工制造的包含药用酶的细胞。 载酶红细胞、载酶脂质体、载酶微囊。 酶标免疫测定。1、间接ELISA 2、双抗体夹心型ELISA
酶在动物饲料中的应用：消化酶 非淀粉多糖降解酶 植酸酶
药物蛋白质工程 －－－3个实例
一、胰岛素的蛋白质工程
二、天花粉的蛋白质工程
三、抗体的人源化
胰岛素insulin 是治疗胰岛素依赖型糖尿病的特效药物 抗体的人源化 把鼠抗体改造，让改造的结果既不是人抗体也不是鼠抗体，人体可以接受它，不引起过敏反应，同时还有抗体的活性，为人治病。这种抗体就是人源化(humanied)的抗体。
决定抗原特异性的主要是位于V 区上的称为互补决定区(CDRs)的那一部分。
把光能转化成为化学能(质子梯度) 。这一过程是通过一个称为光循环的构象转变来实现的。
原则上，任何有功能的蛋白质都可以作为蛋白质工程的改造对象，但实际上选择目标时往往要考虑以下4个方面: 1）改性对象有没有测定出空间结构。2）结构和生物功能的联系是否明确。3）所选对象的重要性。4）是否易于进行分子设计和最后的基因工程生产。
正在进行设计与改性的与人类健康有关的蛋白质还很多。
核糖核酶、蛇毒、蝎毒的毒蛋白、天麻抗真菌蛋白、水蛭素等，目前国内都有人在研究。
3类结构预测的方法
同源预测 从头预测 结构类识别
血管内皮抑制素（Endostatin ）
糖尿病 diabetes melitus/glycuresis
胰岛素 insulin/insulinum
脲酶来自于植物刀豆
肌红蛋白 myoglobin
血红蛋白 hemoglobin Fe+2价
血红素 heme Fe 为2价
酶工程就是酶学理论与化学工程相结合，并在一定的反应装置中利用酶的催化特性，将原料转化为产物，是酶制剂大批量生产和应用的技术。
主要内容：酶的生产、提取与分离纯化、酶分子修饰、酶分子定向进化、酶固定化、酶非水相催化、酶反应器以及应用等。
蛋白质分子量= aa数目*110
蛋白质功能的多样性
1． 酶
2．结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）
3．贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）
4．物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）
5．细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）
6．激素功能（胰岛素）
7．（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白）
8．接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）
9．调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）
胶原蛋白中的Lys 侧链氧化时能形成很强的分子间(内) 交联。
Arg 的胍基碱性很强，与NaOH 相当。
His 是一个弱碱，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。
非极性aa 一般形成蛋白质的疏水核心，带电荷的aa 和极性aa 位于表面。
酶的活性中心：His 、Ser 、Cys
氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力
氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用
基于分配系数（极性）差异的分离方法
——分配层析
★肽键的结构特点：
（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体。
（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。
（3）肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个C α几乎处在同一平面内（酰氨平面）。
（4）肽键亚氨基在pH0---14内不解离。
（5）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro 的肽键可能出现顺、反两种构型．
★双缩脲反应
凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。
双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。
★噬菌体表面展示技术与随机多肽库的应用：
靶功能筛选多肽药物
研究大分子之间的相互作用
★丹磺酰氯（DNS-cl ，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。
N Gly —Ala —Ser —Leu —Phe C →→
DNS —Gly —Ala —Ser —Leu —Phe C
水解 DNS —Gly 、 Ala 、 Ser 、 Leu 、 Phe
DNS-AA 在紫外光激发后发黄色荧光。
问题1：求出二肽Lys —Lys 及三肽Lys —Lys —Lys 的pI 值。（10.2以上）
问题2：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI 值是大于6.0？小于6.0? 还是等于6.0？ （小于6.0）
蛋白质工程与基因工程的区别
基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质。
蛋白质工程则根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要的优点的蛋白质。
天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，好比是在实验室里加快了的进化过程，期望能更快、更有效地为人类的需要服务。
多维核磁共振技术（NMR ）
蛋白质测序的一般步骤 P168
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。
（3） 断裂链内二硫键。
（4） 分析多肽链的N 末端和C 末端。
（5） 测定多肽链的氨基酸组成。
（6） 多肽链部分裂解成肽段。
（7） 测定各个肽段的氨基酸顺序
（8） 确定肽段在多肽链中的顺序。
（9） 确定多肽链中二硫键的位置。
端基分析
①N 端分析
★DNS-Cl 法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
★DNFB 法：Sanger 试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-
氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）
抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
★ PITC 法：Edman 法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
②C 端分析
★肼解法
无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h 。
苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C 端游离氨基酸留在上清中。
Gln 、Asn 、Cys 、Arg 不能用此法。
★羧肽酶法（Pro 不能测）
羧肽酶A ：除Pro 、Arg 、Lys 外的所有C 端a.a
羧肽酶B ：只水解Arg 、Lys
N H2N „ „ „ „ „V al —Ser —Gly C
3、 肽段的分离纯化
①电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE —Cellulose 、DEAE —Sephadex ）
根据肽段的电荷特性分离
③反相ＨＰＬＣ法
根据肽段的极性分离
④凝胶过滤
要求： ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带
ＨＰＬＣ单峰
Ｎ端单一（常用ＤＮＳ－c l法）
肽段拼接成肽链
16肽，Ｎ端H Ｃ端Ｓ
Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT
Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO
重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS
★牛胰RNase 变性一复性实验：
124个a.a 残基
4个链内二硫键。
分子量：12600
(8M尿素+β硫基乙醇) 变性、失活→透析后构象恢复，
活性恢复95%以上; 而二硫键正确复性的概率是1/105。
说明1、蛋白质变性后还可以复性。2、蛋白质的高级结构由一级结构决定。
同源蛋白质：
在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。
同源蛋白质的特点：
①同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列同源性）
②有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。
除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。
③多肽链长度相同或相近
胰岛素
●有24个氨基酸残基位置始终不变：A ．B 链上6个Cys 不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。
●其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用。
●猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。
★多肽的固相合成
支持介质：聚苯乙烯树脂
合成方向：C 端 → N 端。
合成程序：挂接→去保护→中和→缩合→断裂与去保护
蛋白质一级结构的突变—分子病
胰岛素原的激活
※ 前胰岛素原，含信号肽。
※ 胰岛素原，内质网腔，信号肽被信号肽酶切除。
※ 活性胰岛素，高尔基体，切除C 肽。
天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转
肽链的二面角
★只有α碳原子连接的两个键（C α—N 和C α-C ）是单键，能自由旋转。
★环绕C α—N 键旋转的角度为Φ
环绕C α—C 键旋转的角度称Ψ
★当Φ(Ψ) 旋转键两侧的主链呈顺式时，规定Φ(Ψ) =0°
★从C α沿键轴方向看，顺时针旋转的Φ (Ψ) 角为正值，反之为负值。
α螺旋的一般特征：
★多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，
★相邻的螺圈之间形成链内氢键
★构成螺旋的每个C α都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋用3.613表示，
3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基
13表示氢键封闭的环包括13个原子。
右手螺旋比左手螺旋稳定。
β-折叠
平行式：所有参与β-折叠的肽链的N 端在同一方向。
反平行式：肽链的极性一顺一倒，N 端间隔相同
反平β-折叠比平行的更稳定
β转角的特征：
①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。
②主链骨架以180°返回折叠。
③第一个a.a 残基的C=O与第四个a.a 残基的N-H 生成氢键
④C1α与C4α之间距离小于0.7nm
⑤多数由亲水氨基酸残基组成。
回形拓扑结构（希腊钥匙）
结构域 domain ，motif(模块)
在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立的、近似球形的三维实体。
结构域是球状蛋白的折叠单位
较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。
结构域一般有１００－２００氨基酸残基。
结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。
结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。
结构域间的裂缝，常是酶的活性部位，也是反应物的出入口
★EF 手：钙结合蛋白中，含有Helix-Loop-Helix 结构
★锌指：DNA 结合蛋白中，2个His 、2个Cys 结合一个Zn
★亮氨酸拉链：DNA 结合蛋白中，由亮氨酸倒链形成的拉链式结构.
维持三级结构的作用力：
（1）氢键
（2）范德华力（分子间及基团间作用力）：
定向效应： 极性基团间
诱导效应： 极性与非极性基团间
分散效应： 非极性基团间
（3）疏水相互作用
（4）离子键（盐键）
（5）共价健，主要的是二硫键，
二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。
☆有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成，这种等同的结构成分称
为原体。如血红蛋白α2β2就是由两个原体αβ组成。
有时也把原体称为单体。
四级结构缔合的驱动力
疏水作用
极性基团之间的氢键和离子键
二硫桥
亚基之间的缔合方式
1、同多聚与杂多聚
（homomultimeric and heteromultimeric)
2、同种缔合与异种缔合（isologus and heterologus)
同种缔合：亚基间相互作用的表面是相同的，形成的结构是对称的
异种缔合：亚基间相互作用的表面是不同的，形成线形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒外壳。
★ 别构蛋白：
除了有活性部位（结合底物）外，还有别构部位（结合调节物）。有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。
★ 别构效应：
别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位产生的影响。 ★同促效应（同位效应）：
一种配体的结合对于其它部位结合同种配体的能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。
同位效应一般是指活性部位之间的效应。
同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成是对同位效应的一种修饰
★异促效应（异位效应）：
就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活性部位的影响。
★ 正协同效性：
一种配基的结合促进后续配基的结合，S 型配体结合曲线。
★负协同效性：
一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。
★正效应物：促进活性部位与配基结合的别构效应物。
★负效应物：抑制活性部位与配基结合的别构效应物。
血红蛋白的结构：
▲接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。 ▲α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似。
协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地输送氧气。
nH=1,无协同性 nH ＞1, 正协同性 nH ＜1, 负协同性
★协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率
抗原与抗体
★抗原是指进入异体机体后，导致致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。
★抗原性包括免疫原性和抗原特异性。
★免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。
★抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。
★抗原决定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团称抗原决定簇。
★抗原决定簇的作用：
①被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。
②与相应抗体的Fab 结合。
★抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B 淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，称免疫球蛋白。
★抗体具有两个特点：
①高度特异性
②多样性
几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有10,000种抗体存在。
抗原抗体反应
★抗体是2价的，抗原是多价的。
★抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体饱和，可溶。
抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原—抗体复合物，不可溶。
抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。
★抗原抗体反应的条件：
①抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。
②二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结合
（离子键、氢键 等）。
★基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法：
酶联免疫吸附测定（ELISA ）
Western 印迹(Western blot)
酵母双杂交
蛋白质的酸碱性质和等电点
★ 等电点
★ 等离子点：
中性盐（Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO42+）影响滴定曲线形状和等电点。
盐离子浓度为零时的等电点称等离子点
★等电点测定
溶解度法
聚焦电泳法
测分子量的方法：
★化学组成法测定最低分子量
★SDS-PAGE 法
★凝胶过滤法
★渗透压法
★扩散系数法
★沉降系数法和沉降平衡法
根据分子组成测定最小分子量
如肌红蛋白含0.335%的铁
Fe 分子量 55.8
最小M ＝ Fe(%) = 0.335 =16700
(实为16900) 牛血清白蛋白含Trp 0.58%
最低M=35200，实际为69000，含2个Trp
葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量
交联葡聚糖（Sephadex ）;
聚丙烯酰胺凝胶
（Bio-Gel P ，）
琼脂糖凝胶(Sepharose，Bio-Gel A）
SDS —PAGE
（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）
★制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
蛋白质分离纯化的一般原则
纯化的实质：
增加制品的纯度或比活性
一般程序：
前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存
细分级（fine fractionation)
①透析除盐
②sephadex G-25凝胶过滤除盐
★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC ） ★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳
★密度梯度离心
浓缩与保存
保存方法：
①晶体保存：
结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度 的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。
结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH 、接入晶种。 ②冻干粉保存：
③溶液保存：
加入抗冻剂（50%甘油）后 -20℃ - 70℃保存。
分离纯化蛋白质（酶）的主要方法
★根据蛋白质的溶解度分离
★根据电荷差异分离
★根据分子大小分离
★根据配体特异性分离（亲和层析）
★选择性吸附分离（物理吸附）
★根据疏水性的差异
（一）根据溶解度差异的分离：选择性沉淀法
盐析法
PEG 沉淀法
有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法
重金属盐选择性沉淀法（pH 》pI ，蛋白质带负电荷）
生物碱和酸选择性沉淀法（pH 《pI ，蛋白质带正电荷）
热处理沉淀法（铜锌SOD ，65℃、15分钟、稳定）
等电点沉淀
在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。
在pI 时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀。
蛋白质的盐溶与盐析
盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶解度↑，称盐溶。
盐析：高盐浓度时，蛋白质溶解度↓，称盐析。
盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl 、MgCl2、NH4Cl 、KCl 等的饱和溶液
(二）根据 分子大小和形状的差异
①透析和超滤法：除去小分子物质
②密度梯度离心法 蔗糖密度梯度离心
③凝胶过滤法
透析-----半透膜阻留pr 分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。
蛋白质的超过滤------施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子
蔗糖密度梯度saccharose-----沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析
（三） 根据电荷性质的差异:
1、电泳和等电聚焦法：
普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳
从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳
从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。
从支持物分： 自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等）
2、离子交换层析法
离子交换纤维素：
离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应
离子交换交联琼脂糖：
（四）根据选择性吸附的差异：
吸附层析法
极性：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键）
非极性：活性炭（范德华力、疏水作用）
最广泛最有效：羟基磷灰石（hydroxyapatite) ，即结晶磷酸钙[Ca10（PO4）6（OH ）2]，可分离蛋白质、核酸，与DNA 的亲和力最高
（五）根据疏水性的差异：
疏水层析和反相HPLC
1、疏水层析
层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sepharose)
辛基琼脂糖(octa - sepharose)
洗脱： 低盐高pH
非离子型去污剂（triton x-100)
脂肪醇（丁醇、乙二醇）
2、反相HPLC
固定相：丁基硅烷、辛基硅烷、C18硅烷
（六） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析
配基：
酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。
免疫亲和层析
凝集素亲和层析
金属螯和层析
染料配体层析
亲和层析 p91-99
（固相）载体：纤维素、葡聚糖凝胶、交联琼脂糖凝胶（sepharose ）、聚丙烯酰胺凝胶等。 要求：具备与配体偶联反应的大量功能基团；
必须是亲水性的，具有一定机械强度、结构疏松，利于酶与配基自由接触；惰性，没有或者很少非专一性吸附；化学性质稳定，良好的流体力学性。
配体和臂：
配基的选择：配基-酶的解离常数10-8 - 10-4 mol；必须具有供偶联反应的活泼基团，且其与载体或臂结合后，不影响酶的亲和力；配基偶联量1-20 μmol/mL。
臂的选择：长短适中；
纯度鉴定（均一性）
基本手段：电泳分析：单条带。
N 端测定：n 亚基蛋白有 1 —n 个N 端aa 。 选用手段：沉降分析、溶解度分析
结晶分析（能结晶的一般比较纯）
酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。
催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能较低的途径进行。
催化剂的效应只反映在动力学上（反应速度），不影响反应的热力学（化学平衡）。 ★转换数（TN) 或催化常数（Kcat) 表示酶的最大催化效率
Kcat 是一定条件下（[S]》Km ）每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（数值上Kcat =K3）
酶催化反应的特点
（1）、 催化效率高 （2）、专一性高 （3）、 反应条件温和 （4）、 活性可调节
（5）、 酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子
★ ribozyme 核酶（具有催化功能的RNA ）
酶的化学组成
单纯酶类(simple enzyme)：仅由蛋白质组成
脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等
结合酶类（conjugated enzyme):酶蛋白和辅因子
全酶（holoenzyme)=脱辅基酶（apoenzyme)+辅因子(cofactor)
如：(超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）
★ 酶的辅助因子主要有金属离子和有机化合物
辅酶(coenzyme)：与酶蛋白结合较松，可透析除去。
辅基(prosthetic group)：与酶蛋白结合较紧。
★酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和反应的性质。
NAD+构成专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶的辅基。
★大多数寡聚酶是胞内酶，而单体酶一般是胞外酶。
胞内酶：合成后仍留在细胞内发挥作用；
胞外酶：合成后分泌到细胞外发挥作用。
多酶复合体
★由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。
多酶融合体（多功能酶）
★一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。
酶的国际系统命名
★★基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。 ★酶国际系统命名法举例
谷丙转氨酶的系统名称：丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶
★★ 国际系统分类法及编号（EC 编号）
（1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示。
（2）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3„„。
（3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3表示。
每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。
第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。
乙醇脱氢酶EC1.1.1.1 ，
乳酸脱氢酶EC1.1.1.27 ，
苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37
第一个数字表示大类： 氧化还原
第二个数字表示反应基团：醇基
第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+
第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸
★酶的国际系统分类
★氧、转、水、裂、异、合
1、氧化还原酶类（乳酸脱氢酶）
催化氧化还原反应： A ·2H+B=A+B·2H
2、 转移酶类（ 谷丙转氨酶（GPT ））
AB+C=A+BC
3、 水解酶类（亮氨酸氨基肽水解酶 Ieu 氨肽酶）
催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。
4、 裂合酶类（裂解酶）{二磷酸酮糖裂合酶 ：醛缩酶}
催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应
5、 异构酶（6-磷酸Glc 异构酶）
催化同分异构体相互转化
6、 合成酶（连接酶）
催化一切必须与A TP 分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。
UTP ：氨连接酶（CTP 合成酶）
L-酪氨酸：tRNA 连接酶（酪氨酰tRNA 合成酶）
T4DNA 连接酶
▴国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异
★在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明
抗体酶：一类具有催化活性的免疫球蛋白，其可变区被赋予了酶的属性。又称催化抗体。 模拟酶：利用有机化学方法设计并合成的一些较天然酶更简单的非蛋白质分子，以其为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。
分子印迹酶：制备对某一化合物具有选择性的聚合过程
酶的专一性
1、结构专一性
绝对专一性：键及键两侧的基团（脲酶）
相对专一性：基团或键专一性 （α-葡萄糖苷）
2、立体专一性
旋光异构专一性（D-、L-）
几何异构专一性 (延胡索酸酶)
潜手性专一性
酶活力测定 p63
酶活力与酶促反应速度
酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应初速度。
酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。
单位：浓度/单位时间
研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准(底物消耗≤5%）。（产物≤ 15％）
酶的活力单位（U ）
国际单位（IU 单位）：
最适反应条件下，每分钟催化1umol 底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU ），1 IU = 1umol /min
国际单位（Katal, Kat单位）：
在最适反应条件下，每秒钟催化1mol 底物转化为产物所需的酶量，称Kat 单位
1 Kat=6 X 107 IU
最适条件：最适温度（25℃或37℃）, 最适pH 、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。 底物浓度（1）通常很大，使酶饱和
（2）底物消耗≤5%
凝胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ug λDNA 完全水解的酶量为1个酶单位。 淀粉酶两种定义：
A ：1 g可溶性淀粉，在1h 内液化所需的酶量。
B ：l ml 2%可溶性淀粉，在1h 内液化所需的酶量。
1g 酶制剂溶于1000ml H2O，取0.5ml 与2%的starch 20ml反应，pH6.0，10分钟完全液化，求酶活力。
A ：20×2%×1/0.5×1000×60/10=4800u/克酶制剂
B ： 20/0.5×1000×60/10=240000u/克酶制剂
酶的比活力 Specific activity
每毫克酶蛋白所具有的酶活力。
单位：
酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。 米氏方程：
Ks 为底物解离常数（底物常数）
所谓“稳态”：ES 的形成速度与分解速度相等、ES 的浓度保持不变的反应状态
★ 都是K3惹的祸
Km 的物理意义
当反应速度v=1/2 Vmax时， Km = [S]，
Km 的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。
单位：mol ·L-1或mmol ·L-1
Km 是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。 Km 最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为：
Km 愈小（达到Vmax 一半所需的底物浓度愈小）表示V 对△[S] 越灵敏。
Km 、Ks 与底物亲和力
★Km 是ES 分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES 解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。
★Ks （K2／K1）是底物常数，只反映ES 解离趋势（底物亲和力），1/Ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。
★只有当K1 、 K2》K3时，Km ≈Ks ，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。 ★底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与产物形成趋势K3／K1有关 问题：
（1） Km 越小，底物亲和力越大（X ）
（2） Ks 越小，底物亲和力越大（√）
（3） 天然底物就是亲和力最大的底物（X ）
（4） 天然底物就是Km 值最小的底物（√）
（5）底物亲和力越大酶促反应速度越大（X ）
（6）对于不同的酶或同一种酶的不同底物，Km 越小反应速度越大（？X ）
在一定的酶浓度下，Vmax 是一个常数，它只与底物的种类及反应条件有关。 Vmax=K3 [E]
K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat ）， 表明酶的最大催化效率
转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。 乳酸脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒
Km 和Vmax 的求解方法1、 Lineweaver-Burk 双倒数作图法
（一）多底物酶促反应有 三种动力学机制
★sequential reactions（序列机制):
▲ Ordered reaction (有序序列机制)
▲Random reactions (随机序列机制)
★ Ping pong reactions （乒乓机制)
有序反应机制 底物与酶的结合，产物的释放都有先后次序 ★在缺少A 时，B 不能与E 结合
★ A 与其产物Q 相互竞争地结合E
★ 反应的总方向决定于A 、Q 的浓度和反应的平衡常
随机反应机理
★ 限速步骤是AEB → QEP
★ A 与Q 相互竞争E 上的底物结合部位A ，B 与P 相互竞争E 上的底物结合部位B ★ 反应的总方向决定于A 、B 、Q 、P 的浓度和反应的平衡常数
乒乓反应机制
★A 与Q 竞争自由酶形式E ，B 与P 竞争修饰酶形式F ★整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式
★谷氨酸与丙氨酸竞争性结合E-磷酸吡哆醛，α-酮戊二酸与丙酮酸竞争性结合F -磷酸吡哆胺
双底物反应的动力学方程
KmA ：[B]达到饱和浓度时A 的米氏常数
KmA ’ ：A 的表观米氏常数
Vmax ：[A][B]都达到饱和浓度时的最大反应速度
★虽然大部分酶的pH —酶活曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。
★不同的离子激活不同的酶。
★不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与K+、Mg2+与Ca2+之间常常拮抗，但Mg2+与Zn2+常可替代。
★ 激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mM
抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或丧失但并不引起酶蛋白变性 变性剂没有选择性
抑制剂有不同程度的选择性
抑制程度的两种表示方法1、相对活力★相对活力分数 ★相对活力百分数
2、抑制率 ★抑制分数 ★抑制百分数
竞争性抑制 抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI 复合物，阻止底物与酶结合。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。 非竞争性抑制不能通过增加底物浓度来消除非竞争性抑制作用 某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+
反竞争性抑制 可使E 对S 的亲和力增大
竞争性抑制：★抑制程度决定于[I]、[S]、Km 和Ki Ki 为EI 的解离常数 ★Vmax 不变 ★Km 变大，而且随[I]浓度的增大而增大
非竞争性抑制 ★抑制程度决定于[I]和Ki ，与底物的Km 和[S]无关 ★Km 不变，Vmax 降至Vmax/（1+[I]/Ki）
抑制程度与[I]成正比 在一定[I] 下， Ki 越大，抑制作用越小
反竞争性抑制 ★抑制程度决定于Km 、Ki 、[S]、[I] ★Km 及Vmax 都变小 抑制程度既与[I]成正比，又与[S]成正比
在一定的[S]、[I]下，Ki 越大，抑制程度越小；Km 越大，抑制程度越小。
★含卤素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、卤乙酰苯等）常用于鉴定酶中巯基。 Ks 型不可逆抑制剂（底物型） Kcat 型不可逆抑制剂（催化型）
可逆抑制剂 ★竞争性抑制剂
★磺胺类药物及其作用机理 p19
对氨基苯磺酰胺或其衍生物是对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制细菌的二氢叶酸合成酶活性
★抗癌药 : 氨基叶酸、阿拉伯糖胞苷、5-氟尿嘧啶等。
★抑制剂与药物开发
Kcat 型不可逆抑制剂的专一性程度很强，前景广阔
底物类似物型的竞争性抑制剂最易开发
过度态底物类似物型药物最具价值(高效\特异)
酶的活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基，包括底物结合部位、催化部位
频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser 、His 、Cys 、Tyr 、Asp 、Glu 、Lys 。
相对专一性
★键专一性（对底物结构要求最低）
★基团专一性Group Specificity
不仅对键有要求，还对键一端的基团有要求，但对另一端基团要求不严格。如：α—D —Glc 苷酶，水解蔗糖和麦芽糖。
绝对专一性
只能作用于一个底物，或只催化一个反应。
麦芽糖酶只作用于麦芽糖，脲酶只催化尿素水解
酶作用专一性的解释
锁钥模型 锁钥模型较好地解释了立体异构专一性。但不能解释可逆反应。
诱导契合模型 酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合，进行反应。
高效性(降低活化能) 的机理
邻近与定向效应
邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。
定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应
酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。
邻近与定向效应对反应速度的影响：
①使底物浓度在活性中心附近很高
②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用
③酶使分子间反应转变成分子内反应
④邻近效应和定向效应对底物起固定作用
应变效应（张力学说）
酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能
①酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。
②底物形变，利于形成ES 复合物。
③底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能。
酸碱催化
酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用。
影响酸碱催化反应速度的两个因素
⑴酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。
⑵咪唑基给出质子或结合质子的速度最快，半寿期小于10-10秒
共价催化
酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物。
活性中心金属离子的催化作用
（1）通过结合底物为反应定向
（2）通过自身价数的改变参加氧化还原反应
（3）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷
活性中心的微环境
⑴ 疏水环境
介电常数低，加强极性基团间的作用。
⑵电荷环境
在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子
丝氨酸蛋白酶家族的底物专一性
★丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser-His-Asp 催化三联体（电荷中继网）。
电荷中继网： Ser195—His57—Asp102氢键体系。通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。
但它们活性中心的底物结合部位不同，底物专一性也不同。
★丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋内的微环境（疏水性、电荷性质）决定了丝氨酸蛋白酶的底物专一性
胰凝乳蛋白酶 ：裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键
胰蛋白酶：裂解碱性氨基酸残基羧基侧的肽键
弹性蛋白酶：裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键
★ 胰凝乳蛋白酶反应的详细机制
第一阶段： 酰化 第二阶段： 脱酰
★ 多酶体系具有自我调节能力
（1）第一步反应往往是限速步骤，控制着全部反应序列的总速度。
（2）反馈抑制与底物激活
催化第一步反应的酶，大多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制；有的则是反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反馈抑制；有的被底物激活。
别构调节 --非共价结合
天冬氨酸转氨甲酰酶—正协同效应的别构酶（ATCase ）
3-磷酸甘油醛脱氢酶—负协同效应的别构酶 半位反应性 — 极端的负协同效应
别构酶的结构特点和性质
（1） 已知的别构酶都是寡聚酶，通过次级键结合。
（2）具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。
（3）多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同位效应，底物就是调节物；有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。
（4）不遵循米式方程，动力学曲线是S 型（正协同效应）或表观双曲线（负协同效应）。
正协同效应的别构酶是S 型曲线 负协同效应的别构酶是表观双曲线
别构酶的鉴定
① 双倒数作图不是直线
② 饱和比值（saturation ratio, Rs)
③ 脱敏作用：理化处理后，仍保持活性，但失去调节性质。
脱敏后的别构酶表现为米氏酶的动力学曲线
齐变模型(MWC模式 ) ：p33 (6要点)
1、别构酶是寡聚酶，由多个相同亚基组成，亚基对称排布。
2、每个亚基对特定配体都有一个结合部位，且相同。
3、R 态对底物和别构激活剂亲和力较大，T 态对别构抑制剂亲和力较大。
4、同步转变。
5、当酶分子由一种构像状态转变成另一构像状态时，分子对称性保持不变。
6、R 和T 处于动态平衡中。
如：天冬氨酸转氨甲酰酶
该模型可以解析别构激活、别构抑制和正协同效应，不能解析负协同效应。
序变模型（KNF 模式）：p34 (5要点)
1、别构酶是相同亚基构成的寡聚体
2、亚基有T 态和R 态。
3、T 态和R 态可以共存于一个寡聚体中。
4、当底物或效应物与酶分子一个亚基结合时，可以引起此亚基的构像变化。这种变化可以作用于相邻的亚基，使其发生同样的构像变化。顺次第三、第四，直至酶分子中所有亚基都发生同样的构像变化。
5、一个亚基与底物或效应物结合后，可以使相邻亚基对后继底物分子的亲和力提高或降低。
KNF 和MWC 的区别：
1、无底物或效应物时，酶分子中亚基只存在一种构象状态（T 态）
2、可以同时存在T 态亚基和R 态亚基杂交形成的酶-底物复合物中间体。
3、底物之间可以正协同，也可以是负协同。
可逆的共价调节（共价调节酶） 不可逆的共价调节（酶原的激活）
专一性调控蛋白（调控因子）对酶活性的调节控制
同工酶可以实现对分支代谢的综合调控
结构酶：组成性表达，正常细胞中含量较稳定，受外界因素影响很小。
诱导酶：诱导性表达，在正常细胞中含量极少或没有，当细胞中加入特定诱导物后，诱导产生的酶，含量在诱导物存在下显著增高，诱导物往往是该酶的底物或底物类似物。 大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶
酶的阻遏 色氨酸操纵子模型
阻遏：表达降低，基因表达的调控方式之一。
细胞内某些代谢途径的终产物或某些中间产物的过量积累，阻止代谢途径中某些酶的合成
酶与非生物催化剂相比的几点共性：
①催化效率高，用量少（细胞中含量低）。
②加快反应速度但不改变化学反应平衡点。
③降低反应活化能。
④反应前后自身结构不变。
产酶细胞（菌株）应具备的条件
1．酶的产量高；
2. 容易培养和管理；
3. 产酶稳定性好；
4. 利于酶的分离纯化；
5. 安全可靠。
安全、经济、易操作
菌种分离 划线 稀释 单孢
培养基成份
一）碳源: 淀粉、石油产品（12～16C ）
二）氮源：有机与无机态氮
三）无机盐：P 、S 、K 、Mg 、Ca 、Na 盐等
四）微量元素：Fe 、Mn 、Zn 、Cu 、Co 、Mo 等
五）生长因子：AA 、维生素、等
六）产酶促进剂：诱导物、表面活性剂
发酵条件对产酶的影响
一）温度：吸热、放热
二）pH ：生理酸（碱）性盐
三）通风：O2
四）搅拌：切应力
五）泡沫：不利于CO2排出，减少溶氧量
六）湿度：固体培养基
酶的发酵生产类型
（一）固体培养发酵（传统方法）
（二）液体深层发酵：
①适用性强，可用于各种细胞的悬浮培养和发酵；
②易于人为控制；
③机械化程度高，酶产品质量较好，酶产率及产品回收率较高。
碳源：
1．选择原则：
①营养：
②对酶生物合成的调节作用：
③原料的供求和价格。
氮源
选择原则：
①根据不同的细胞要求选择
②注意C/N比
溶氧速率不宜过高
提高酶产量的其它措施
1．添加诱导物: 诱导酶
2．控制阻遏物浓度：产物阻遏
3．添加表面活性剂：Triton X-100
4．添加产酶促进剂：植酸钙镁
细胞生长曲线：四期
调整、对数、平衡、衰退
酶生物合成的模式
1．同步合成型：同步、平衡期终止
2．延续合成型：同步、平衡期后continue
3．中期合成型：滞后、平衡期终止
4．滞后合成型：细胞生长进入平衡期后
依据：酶的生产与细胞生长的关系
延续合成型是酶的工业生产中最理想的合成模式。
产酶动力学 四类 （同步、中期、滞后、延续）
微生物细胞发酵产酶
一．菌种的分离纯化：
二．富集培养：
三．菌种纯化：
四．菌种变异：
1．物理或化学方法诱变：
2．基因工程方法：
五．酶的生产
菌种变异：
1．物理或化学方法诱变：
2．基因工程方法
培养基制作、发酵方法、发酵条件是所发酵微生物菌株最适的
酶制剂的工业制备法
一．发酵液的预处理
二．发酵液的分离、过滤：
三．酶液的脱色
四．发酵液的浓缩与初步提纯
五．精制
六．浓缩与干燥
酶虽然具有高效、专一、反应条件温和、活性可调节等特点，但大多数酶存在以下不足。
1、稳定性较差：除α-淀粉酶、Taq 酶和胃蛋白酶可以耐受较低pH ，大多数酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。
2、只能一致性使用：酶一般都是在溶液中与底物、产物共存，„
3、产物分离纯化较困难：
固定化酶(immobilized enzyme)的定义
通过理化手段将酶束缚在水不溶的载体上，或限制在一定空间范围内，但仍具有酶活性。
固定化酶的优缺点（一）优点
1）酶与底物、产物易分开，简化了提纯工艺
2）可反复使用，利于连续化、管道化
3）反应过程可控，利于自动化
4）提高了稳定性
5）效率高、产率高、质量高、成本低
（二）缺点
1）损失酶活力
2）较适应水溶性底物和小分子底物
3）不适于多酶反应
4）对胞内酶需先分离，后固定化
固定化酶的方法 4种：
吸附、共价结合、交联、包埋
（一）吸附法1．物理吸附
通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。
1）有机载体：纤维素、淀粉 等
2）无机载体: 氧化铝、皂土、硅胶 等
2．离子交换吸附
酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合。
1）阴离子交换剂：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶
2）阳离子交换剂：CM-纤维素、
（二）包埋法 适于小分子底物。凝胶包埋法
微囊化 将酶包埋于具有半透性膜的微囊中。
1) 界面沉淀：一些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，将酶包埋。P110, 如：人造细胞
2) 界面聚合：疏水性和亲水性单体在界面聚合形成半透膜，酶包埋于半透膜微囊中。
3) 液体干燥：p111
4) 红血球包埋：p111 p216 图10-1
5) 脂质体包埋：酶包埋于双层脂质体形成的极细球粒中
(三）共价结合法
酶蛋白侧链基团和载体表面的功能基团之间形成共价键而固定。
优：酶与载体结合牢固，酶不易脱落；
缺：反应条件较激烈，酶易失活，制作繁琐。
偶联最普遍的基团：氨基、羧基和苯环。
二步：选择载体、偶联反应
叠氮反应
带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，先在酸性条件下用甲醇处理使其酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO2作用下转变成叠氮衍生物；衍生物低温下与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应，中性羟胺水解即得固定化酶。
交联法常与吸附法、包埋法结合使用。
原生质体固定化常采用凝胶包埋法
固定化酶的性质一、酶活力：
大多数固定化酶活性下降。结构变化、空间位阻、可能的变性。
二. 稳定性
1. 热稳定性、抵抗力、操作稳定性、储藏稳定性等增加
2. 最适温度提高
3. 最适pH 值：*
a. 载体性质对最适pH 的影响（负－碱））
b. 产物性质对最适pH 的影响：
依据酶蛋白和载体的电荷而定
固定化对酶反应系统的影响
构象改变和屏蔽效应 微环境的影响 分配效应与扩散效应
1载体与底物带有相同电荷时，Km 增大；带相反电荷Km 降低。
2载体带正电荷时，酶活性-pH 曲线向酸性偏移；阴离子载体时，曲线向碱性方向偏移。 3 采用疏水载体时，如底物为极性物质，或电荷物质， Km 降低。
酶分子的化学修饰
在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（特别是具有生物相容性的物质），进行共价连接，而改变酶的结构和性质。
酶化学修饰的目的*
1．研究酶的结构与功能
2．增强酶天然构象的稳定性与耐热性。
3．保护酶的活性部位与抗抑制剂。
4．维持酶结构功能的完整性与抗蛋白水解酶。
5．消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
酶分子的修饰方法
3种: 酶的表面修饰、内部修饰、与辅因子相关的修饰
酶的表面修饰 一）化学固定化“阴碱阳酸”；改变Km 值，“同增异减”
二）酶的小分子修饰作用 三）酶的大分子修饰 二类：共价与非共价修饰
PEG 、右旋糖苷 四）酶的分子内交联、增加酶分子表面交联键的数目。
五）分子间交联 六）脂质体包裹 七）反向胶团微囊化（有机相中）
酶分子的内部修饰 一）非催化活性基团的修饰 二）酶蛋白主链修饰 酶法。
三）催化活性基团的修饰（化学突变法）四）肽链伸展后的修饰
修饰反应的条件
尽可能在酶稳定条件下进行，
尽量不破坏酶活性功能必需基团，使修饰率、酶活力回收率高。
酶蛋白肽链的大分子修饰 要求修饰剂具有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。
2类人工酶：半合成酶、全合成酶
用有机化学和生物学的方法合成具有专一催化功能的酶的模拟物。
全合成酶不是蛋白质
用分子印迹技术制备的人工酶。
四氢叶酸THFA Tetrahydrofolate
黄素辅酶FMN 、FAD
生物素Biotin CO2传递体
焦磷酸硫胺素(TPP) 催化縮合、脱羧和还原反应
抗体酶：具有催化功能的抗体分子。
本质上是免疫球蛋白。
半抗原：
本身不能诱导免疫应答的小分子物质，共价结合到具有免疫性的蛋白质后，注射动物能诱导出对该小分子物质的抗体产生。
半抗原是过渡态类似物；
催化抗体与过渡态类似物具有互补结构。
半抗原与催化抗体的关系
1) 半抗原多含有芳香结构；
2) 半抗原与抗体的结合常数Ki ＜10-6 mol/L；
3) 诱导羧酸酯、酰胺水解的催化抗体，考虑四面体高能结构；
4) 考虑催化反应环境与反应机制。
抗体酶的制备方法 拷贝法、引入法、诱导法
单克隆细胞合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
水活度：一定压力下，反应体系中的水蒸汽压和纯水蒸汽压之比。
酶分子印迹：利用酶与配体的相互作用，可以制备具有结合特定配体能力的新酶。 生物酶工程：酶学和DNA 重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的生物工程。 主要研究内容： 克隆酶、突变酶、新酶。
突变酶
定义：酶的选择性遗传修饰以及对酶基因进行定点突变而得到的新酶。
基因定点诱变：通过取代、插入或缺失克隆基因或DNA 序列中的任何一个特定的碱基，实现在体外特异性改变某个碱基。
主要方法：盒式诱变、寡核苷酸引物诱变、PCR 诱变
PCR 诱变 2种: 重组PCR 定点诱变和大引物诱变。
生物反应器：用于完成生物化学反应的核心装置。
生物传感器概述
由感受器和换能器两部分组成
药用酶的新剂型 3个难题：抗原性、体内半衰期、体内定位
载酶人造细胞 人工制造的包含药用酶的细胞。 载酶红细胞、载酶脂质体、载酶微囊。 酶标免疫测定。1、间接ELISA 2、双抗体夹心型ELISA
酶在动物饲料中的应用：消化酶 非淀粉多糖降解酶 植酸酶
药物蛋白质工程 －－－3个实例
一、胰岛素的蛋白质工程
二、天花粉的蛋白质工程
三、抗体的人源化
胰岛素insulin 是治疗胰岛素依赖型糖尿病的特效药物 抗体的人源化 把鼠抗体改造，让改造的结果既不是人抗体也不是鼠抗体，人体可以接受它，不引起过敏反应，同时还有抗体的活性，为人治病。这种抗体就是人源化(humanied)的抗体。
决定抗原特异性的主要是位于V 区上的称为互补决定区(CDRs)的那一部分。
把光能转化成为化学能(质子梯度) 。这一过程是通过一个称为光循环的构象转变来实现的。
原则上，任何有功能的蛋白质都可以作为蛋白质工程的改造对象，但实际上选择目标时往往要考虑以下4个方面: 1）改性对象有没有测定出空间结构。2）结构和生物功能的联系是否明确。3）所选对象的重要性。4）是否易于进行分子设计和最后的基因工程生产。
正在进行设计与改性的与人类健康有关的蛋白质还很多。
核糖核酶、蛇毒、蝎毒的毒蛋白、天麻抗真菌蛋白、水蛭素等，目前国内都有人在研究。
3类结构预测的方法
同源预测 从头预测 结构类识别
血管内皮抑制素（Endostatin ）
糖尿病 diabetes melitus/glycuresis
胰岛素 insulin/insulinum
脲酶来自于植物刀豆
肌红蛋白 myoglobin
血红蛋白 hemoglobin Fe+2价
血红素 heme Fe 为2价