菠菜中叶绿体色素的提取、分离及鉴定
一 实验目的
1 通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯原理和方法
2 了解薄层色谱的基本原理，掌握薄层色谱和柱层谱的基本操作
3 熟悉紫外光谱、荧光光谱在化合物分析鉴定中的应用
二 实验原理
菠菜的叶片中含有叶绿素（包括叶绿素a和叶绿素b）、叶黄素及胡萝卜素等天然色素。
叶绿素是绿色植物的主要色素，分子由脱镁叶绿素母环、叶绿酸、叶绿醇、甲醇、二价镁离子等部分构成。高等植物中有两种叶绿素即叶绿素a和叶绿素b共存，它们的含量约3：1，叶绿素a为一蓝黑色固体粉末，在乙醇溶液中为蓝绿色，并有深红色荧光，而叶绿素b为暗绿色固体粉末，其乙醇溶液为黄绿色，并有红色荧光。叶绿素不溶于水，易溶于有机溶剂，常可用极性有机溶剂（例如丙酮、乙醇、乙酸乙酯等）从植物匀浆中提取它。叶绿素存在于植物细胞的叶绿体中，与类胡萝卜素、类脂物质及脂蛋白复合在一起，分布在叶绿体内的蝶形体的片层膜上。叶绿素a和叶绿素b及衍生物在600~700mm（红光）和400~500mm（蓝光）有尖锐的吸收峰，可借助这一特性来鉴定它们。游离叶绿素很不稳定，对光和热都较敏感。
叶绿素机构
胡萝卜素是一种橙色的天然色素，属于四萜，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，，其中β异构体最多。在植物组织中，它们可能以固态微粒或者以与蛋白质、脂质、或者糖类复合的形式存在，特别是在有色体中存在。其为典型的脂溶性色素，易溶于石油醚，、乙醚而难溶于乙醇。如遇氧化条件，易受氧化和光化学氧化形成加氧产物或者进一步分解为更小的分子，在受强热时可分解为多种挥发性小分子化合物。
叶黄素是一种黄色色素，与叶绿素同存在与植物体内，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在石油醚中溶解度较小。
色素所呈现的颜色和在叶绿体中的含量见下表：
高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量比例
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。
薄层层析是一种微量、快速和简便的色谱方法。由于各种化合物的极性不同，吸附能力不相同，在展开剂上移动，进行不同程度的解析，根据原点至斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Ｒf）：
化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小。在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。
吸附柱层析法是分离、纯化和鉴定有机物的重要方法。它是根据混合物中各组分的分子结构和性质（极性）来选择合适的吸附剂和洗脱剂，从而利用吸附剂对各组分吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同达到分离目的。吸附柱层析法通常是在玻璃层析柱中装入表面积很大、经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂（常用的吸附剂 有氧化铝、硅胶等）。当混合物溶液流过吸附柱时，各组分同时被吸附在柱的上端，然后从柱顶不断加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物吸附能力不同，从而随着溶剂下移的速度不同，于是混合物中各组分按吸附剂对它们所吸附的强弱顺序在柱中自上而下形成了若干色带。
在洗脱过程中，柱中连续不断地发生吸附和溶解的交替现象。被吸附的组分被溶解吸出来，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒，把组分从溶液中吸附出来，而继续流下的新溶剂又使组分溶解而向下移动，这样经过适当时间移动后，各种组分就可以完全分开，继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出，再继续加溶剂直至各组分依次全部由柱中洗出为止，分别收集各组分。
三 主要试剂与仪器
仪器:研钵1个、电热套1台、100mL圆底烧瓶1个、125mL分液漏斗1个、直形冷凝管1个、层析柱1个、50mL烧杯2个、铁架台1个、7.5cm×2.5cm载玻片4个、滴管、锥形瓶4个、500mL大烧杯1个、烘箱、点样毛细管、直尺、层析缸、铁架台、玻璃棒、漏斗、紫外分光光度计
试剂：层析中性氧化铝（100目）、硅胶G、95%乙醇、石油醚（60-90℃）、丙酮、0.5%CMC水溶液、无水硫钠、石英砂、饱和的NaCl溶液、乙醚、脱脂棉、滤纸、丁醇、叶绿素a标样、叶绿素b标样、叶黄素标样
四 实验步骤
1 叶绿素色素的提取
在研钵中放入5g新鲜的清洗剪碎的菠菜叶片,加入约20ml的乙醇和1.0g石英砂适当研磨,然后用脱脂棉过滤，滤渣用10mL乙醇再提取一次，合并两次滤液。溶剂前沿至原点中心的距离
Rf溶质的最高浓度中心至原点中心的距离
滤液置于125mL分液漏斗中.向分液漏斗中加入20mL石油醚萃取，同时加入10mL饱和NaCl溶液(防止乳化)，适当振摇后静置分层，弃去水层。石油醚层再用蒸馏水洗涤两次.将有机层转入干燥的小锥形瓶中,加2 g无水硫酸钠干燥,干燥后的液体过滤至另一锥形瓶中。
2 薄层层析分离
取四块载玻片（7.5cm×2.5cm），洗净后用蒸馏水淋洗，再用少量的乙醇淋洗，晾干备用。
（1）铺板 在小烧杯中，放置适量硅胶G，逐渐加入0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液6~7mL，调成均匀的糊状，其稀稠为在振动下可流动，倒在洁净的载玻片上，用食指和拇指拿住玻璃板，前后左右振摇、摆动，并不时转动方向，制成薄厚均匀、表面光洁平整、无气泡的薄层板，厚度为0.25~1.0mm。铺层后的薄板在室温下自然晾干0.5h后，置于105~110℃的烘箱中活化30~60min。
（2）点样 取活化过的硅胶薄板，分别在一端1.5cm处用铅笔轻轻画一横线作为起始线，在距点样线5cm处画一道前沿线。用内径约1mm的毛细管插入样品溶液中，在一块板上的起点线上点两个点。样点间距1~1.5cm。样点直径不超过2mm。点样完毕使斑点干燥即可展层。如果一次点样不够，可以待样品挥发后重复地那样。
（3）展层 薄层色谱可在层析缸中进行，在层析缸中加入10mL石油醚—丙酮—乙醚（3：1：1）；将薄板点样端向下放入缸内，使薄层板的底边平行接触展开剂，盖好缸盖，进行展开，当展开剂到达前沿线时，取出薄板层，置通风处晾干。计算个斑点的Rf值。
根据公式：
溶剂前沿至原点中心的距离
3 柱色谱法分离植物色素
（1）装柱 取一洗净的、干燥的层析柱，垂直固定在铁架台上，关闭柱下面的活塞，在柱内加入约3/4高的石油醚。另取少量脱脂棉，经石油醚洗涤后放入柱底（要赶净气泡）,用长玻璃棒压平，再盖上一片比柱内径略小的圆形滤纸。称取一定量的氧化铝，通过一干燥的漏斗，连续而缓慢的加入柱中。同时将柱下端的活塞打开，使石油醚以每秒1滴的速度流出，并用木棒轻轻敲打柱身各部，使氧化铝装填的均匀而紧密，最后在氧化铝上面再加1cm高的无水硫酸钠。继续放出石油醚，直到距柱表面仅1-2mm高，无论如何不能使液面低于柱表面。
（2）上样 取处理好的提取液2cm3,用长滴管沿柱壁小心的柱顶部。加完后，稍稍打开活塞，使液面下降至柱表面约1mm处，关闭活塞，用少量石油醚冲洗柱壁，使液面下降至原高度。重复两次该操作，使色素全部进入柱内。
（3）洗脱 在柱顶装一滴液漏斗（或分液漏斗），待色素全部进入柱体后,在柱顶小心加1.5 cm高度的洗脱剂石油醚,然后在层析柱上面装一滴液漏斗,内装15 mL洗脱剂,打开上下两个活塞,让洗脱剂逐滴放出,层析即开始进行,用锥型瓶收集.当第一个有色圈(橙黄色)将滴出时,取另一锥形瓶收集,它就是胡萝卜素,约用洗脱剂10 mL.用1:1(体积比)石油醚—丙酮作洗脱剂,绿色圈下端呈黄色,再加10mL洗脱剂洗脱,颜色分层更明显,但速度很慢,总共用去洗脱剂约10mL.分出第二个黄色带,它是叶黄素.再用乙醇作洗脱剂,洗脱叶绿素,速度很快,用洗脱剂约10mL.将各组分分别收集到试管中，用黑纸包好，低温保存。
五、色素的分析 Rf溶质的最高浓度中心至原点中心的距离
1、色素的紫外光谱测定
将柱层析所得个色素组分进行紫外可见光谱分析，扫描波长为400-700nm，将扫描谱图与标准图谱进行对照。
2、荧光激发和发射光谱的测定
（1）叶绿素a采用428nm为激发波长，在600-800nm范围内扫描其荧光发射光谱；采用667nm为发射波长，在350-600nm范围内扫描荧光范围内其荧光激发光谱。
（2）叶绿素b采用457nm为激发波长，在600-800nm范围内扫描其荧光发射光谱；采用650nm为发射光谱，在350-600nm范围内扫描其荧光激发光谱。
菠菜中叶绿体色素的提取、分离及鉴定
一 实验目的
1 通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯原理和方法
2 了解薄层色谱的基本原理，掌握薄层色谱和柱层谱的基本操作
3 熟悉紫外光谱、荧光光谱在化合物分析鉴定中的应用
二 实验原理
菠菜的叶片中含有叶绿素（包括叶绿素a和叶绿素b）、叶黄素及胡萝卜素等天然色素。
叶绿素是绿色植物的主要色素，分子由脱镁叶绿素母环、叶绿酸、叶绿醇、甲醇、二价镁离子等部分构成。高等植物中有两种叶绿素即叶绿素a和叶绿素b共存，它们的含量约3：1，叶绿素a为一蓝黑色固体粉末，在乙醇溶液中为蓝绿色，并有深红色荧光，而叶绿素b为暗绿色固体粉末，其乙醇溶液为黄绿色，并有红色荧光。叶绿素不溶于水，易溶于有机溶剂，常可用极性有机溶剂（例如丙酮、乙醇、乙酸乙酯等）从植物匀浆中提取它。叶绿素存在于植物细胞的叶绿体中，与类胡萝卜素、类脂物质及脂蛋白复合在一起，分布在叶绿体内的蝶形体的片层膜上。叶绿素a和叶绿素b及衍生物在600~700mm（红光）和400~500mm（蓝光）有尖锐的吸收峰，可借助这一特性来鉴定它们。游离叶绿素很不稳定，对光和热都较敏感。
叶绿素机构
胡萝卜素是一种橙色的天然色素，属于四萜，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，，其中β异构体最多。在植物组织中，它们可能以固态微粒或者以与蛋白质、脂质、或者糖类复合的形式存在，特别是在有色体中存在。其为典型的脂溶性色素，易溶于石油醚，、乙醚而难溶于乙醇。如遇氧化条件，易受氧化和光化学氧化形成加氧产物或者进一步分解为更小的分子，在受强热时可分解为多种挥发性小分子化合物。
叶黄素是一种黄色色素，与叶绿素同存在与植物体内，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在石油醚中溶解度较小。
色素所呈现的颜色和在叶绿体中的含量见下表：
高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量比例
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。
薄层层析是一种微量、快速和简便的色谱方法。由于各种化合物的极性不同，吸附能力不相同，在展开剂上移动，进行不同程度的解析，根据原点至斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Ｒf）：
化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小。在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。
吸附柱层析法是分离、纯化和鉴定有机物的重要方法。它是根据混合物中各组分的分子结构和性质（极性）来选择合适的吸附剂和洗脱剂，从而利用吸附剂对各组分吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同达到分离目的。吸附柱层析法通常是在玻璃层析柱中装入表面积很大、经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂（常用的吸附剂 有氧化铝、硅胶等）。当混合物溶液流过吸附柱时，各组分同时被吸附在柱的上端，然后从柱顶不断加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物吸附能力不同，从而随着溶剂下移的速度不同，于是混合物中各组分按吸附剂对它们所吸附的强弱顺序在柱中自上而下形成了若干色带。
在洗脱过程中，柱中连续不断地发生吸附和溶解的交替现象。被吸附的组分被溶解吸出来，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒，把组分从溶液中吸附出来，而继续流下的新溶剂又使组分溶解而向下移动，这样经过适当时间移动后，各种组分就可以完全分开，继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出，再继续加溶剂直至各组分依次全部由柱中洗出为止，分别收集各组分。
三 主要试剂与仪器
仪器:研钵1个、电热套1台、100mL圆底烧瓶1个、125mL分液漏斗1个、直形冷凝管1个、层析柱1个、50mL烧杯2个、铁架台1个、7.5cm×2.5cm载玻片4个、滴管、锥形瓶4个、500mL大烧杯1个、烘箱、点样毛细管、直尺、层析缸、铁架台、玻璃棒、漏斗、紫外分光光度计
试剂：层析中性氧化铝（100目）、硅胶G、95%乙醇、石油醚（60-90℃）、丙酮、0.5%CMC水溶液、无水硫钠、石英砂、饱和的NaCl溶液、乙醚、脱脂棉、滤纸、丁醇、叶绿素a标样、叶绿素b标样、叶黄素标样
四 实验步骤
1 叶绿素色素的提取
在研钵中放入5g新鲜的清洗剪碎的菠菜叶片,加入约20ml的乙醇和1.0g石英砂适当研磨,然后用脱脂棉过滤，滤渣用10mL乙醇再提取一次，合并两次滤液。溶剂前沿至原点中心的距离
Rf溶质的最高浓度中心至原点中心的距离
滤液置于125mL分液漏斗中.向分液漏斗中加入20mL石油醚萃取，同时加入10mL饱和NaCl溶液(防止乳化)，适当振摇后静置分层，弃去水层。石油醚层再用蒸馏水洗涤两次.将有机层转入干燥的小锥形瓶中,加2 g无水硫酸钠干燥,干燥后的液体过滤至另一锥形瓶中。
2 薄层层析分离
取四块载玻片（7.5cm×2.5cm），洗净后用蒸馏水淋洗，再用少量的乙醇淋洗，晾干备用。
（1）铺板 在小烧杯中，放置适量硅胶G，逐渐加入0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液6~7mL，调成均匀的糊状，其稀稠为在振动下可流动，倒在洁净的载玻片上，用食指和拇指拿住玻璃板，前后左右振摇、摆动，并不时转动方向，制成薄厚均匀、表面光洁平整、无气泡的薄层板，厚度为0.25~1.0mm。铺层后的薄板在室温下自然晾干0.5h后，置于105~110℃的烘箱中活化30~60min。
（2）点样 取活化过的硅胶薄板，分别在一端1.5cm处用铅笔轻轻画一横线作为起始线，在距点样线5cm处画一道前沿线。用内径约1mm的毛细管插入样品溶液中，在一块板上的起点线上点两个点。样点间距1~1.5cm。样点直径不超过2mm。点样完毕使斑点干燥即可展层。如果一次点样不够，可以待样品挥发后重复地那样。
（3）展层 薄层色谱可在层析缸中进行，在层析缸中加入10mL石油醚—丙酮—乙醚（3：1：1）；将薄板点样端向下放入缸内，使薄层板的底边平行接触展开剂，盖好缸盖，进行展开，当展开剂到达前沿线时，取出薄板层，置通风处晾干。计算个斑点的Rf值。
根据公式：
溶剂前沿至原点中心的距离
3 柱色谱法分离植物色素
（1）装柱 取一洗净的、干燥的层析柱，垂直固定在铁架台上，关闭柱下面的活塞，在柱内加入约3/4高的石油醚。另取少量脱脂棉，经石油醚洗涤后放入柱底（要赶净气泡）,用长玻璃棒压平，再盖上一片比柱内径略小的圆形滤纸。称取一定量的氧化铝，通过一干燥的漏斗，连续而缓慢的加入柱中。同时将柱下端的活塞打开，使石油醚以每秒1滴的速度流出，并用木棒轻轻敲打柱身各部，使氧化铝装填的均匀而紧密，最后在氧化铝上面再加1cm高的无水硫酸钠。继续放出石油醚，直到距柱表面仅1-2mm高，无论如何不能使液面低于柱表面。
（2）上样 取处理好的提取液2cm3,用长滴管沿柱壁小心的柱顶部。加完后，稍稍打开活塞，使液面下降至柱表面约1mm处，关闭活塞，用少量石油醚冲洗柱壁，使液面下降至原高度。重复两次该操作，使色素全部进入柱内。
（3）洗脱 在柱顶装一滴液漏斗（或分液漏斗），待色素全部进入柱体后,在柱顶小心加1.5 cm高度的洗脱剂石油醚,然后在层析柱上面装一滴液漏斗,内装15 mL洗脱剂,打开上下两个活塞,让洗脱剂逐滴放出,层析即开始进行,用锥型瓶收集.当第一个有色圈(橙黄色)将滴出时,取另一锥形瓶收集,它就是胡萝卜素,约用洗脱剂10 mL.用1:1(体积比)石油醚—丙酮作洗脱剂,绿色圈下端呈黄色,再加10mL洗脱剂洗脱,颜色分层更明显,但速度很慢,总共用去洗脱剂约10mL.分出第二个黄色带,它是叶黄素.再用乙醇作洗脱剂,洗脱叶绿素,速度很快,用洗脱剂约10mL.将各组分分别收集到试管中，用黑纸包好，低温保存。
五、色素的分析 Rf溶质的最高浓度中心至原点中心的距离
1、色素的紫外光谱测定
将柱层析所得个色素组分进行紫外可见光谱分析，扫描波长为400-700nm，将扫描谱图与标准图谱进行对照。
2、荧光激发和发射光谱的测定
（1）叶绿素a采用428nm为激发波长，在600-800nm范围内扫描其荧光发射光谱；采用667nm为发射波长，在350-600nm范围内扫描荧光范围内其荧光激发光谱。
（2）叶绿素b采用457nm为激发波长，在600-800nm范围内扫描其荧光发射光谱；采用650nm为发射光谱，在350-600nm范围内扫描其荧光激发光谱。