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本科毕业设计（论文）
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二O 一 年 月 日
摘 要
生物质原料作为地球上数量最大的可再生资源之一，逐渐受到人们的重视。目前，采用木质素细菌降解酶作为预处理微生物，正成为新的研究方向。本实验以南京紫金山土壤为原料，通过稀释平板法，固体培养基培养以及试管斜面保种等步骤，筛选得到纯种细菌。在筛选细菌过程中，挑选部分采用液体培养基培养，得到细菌降解酶，并测其漆酶和锰过氧化物酶的酶活力，结果发现酶活力都不高。最后通过正交试验优化菌28的产酶条件，发现在pH 为3、Cu 2+ 浓度为5mol/100mL、Mn 2+浓度为1mg/100mL的条件下，细菌产漆酶量最大。
关键字： 木质素；稀释分离；酶活；优化
Abstract
As one of the largest number of renewable resources on the earth, biological raw material has been paid more and more attention. At present, biological pretreatment used by bacteria lignin degrading enzymes is becoming a new kind of research interest. In this paper, raw material was obtained the soil in the Nanjing Zijin Mountain, and then finally lignin degradation bacterium were isolated. in test tubes which were preserved in refrigerator with suitable centigrade by means like dilution，screening and solid nutrient medium. During the process in screening,we selected some bacteria to be fostered in liquid nutrient medium and measured their laccase enzymes activity and manganese peroxidase activity.The result indicated that both laccase enzymes activity and manganese peroxidase activity were not high .At last, we tried to optimize the requirement that the bacteria No.28 need to produce enzymes by orthogonal test,and discovered that the bacteria could produce the largest quantity of Lac in the condition where the pH was 3,and the consistence of Cu 2+ was 5mol/100mL,and the consistence of Mn 2+ was 1mg/100mL.
Key words: lignin，isolation ，enzymes activity，optimization
目 录
第一章 绪论 . .......................................................................................................................... 1
1.1 本课题的目的、意义 ............................................................................................. 1
1.2 本课题的研究内容 .................................................................................................. 1
1.3 文献综述 .................................................................................................................. 1
1.3.1 木质素的生物降解 ....................................................................................... 1
1.3.2 木质素降解菌 ............................................................................................... 2
1.3.3 国内外研究概况 ........................................................................................... 2
1.3.4 木质素降解酶及其作用机理 ....................................................................... 3
1.3.5 微生物产木质素降解酶的影响因素 . .......................................................... 4
1.3.6 木质素降解酶的应用 ................................................................................... 5
第二章 实验部分 ................................................................................................................... 5
2.1 实验仪器 .................................................................................................................. 5
2.2 实验试剂及材料 ...................................................................................................... 6
2.3 实验内容与步骤（第一部分） .............................................................................. 6
2.3.1 菌种土壤的采集 ........................................................................................... 6
2.3.2 培养基的制备 ............................................................................................... 6
2.3.3 细菌的初步纯种分离 ................................................................................... 8
2.3.4 细菌的纯种分离 ........................................................................................... 8
2.3.5 纯种细菌的保种 ........................................................................................... 8
2.3.6 液体接种 ....................................................................................................... 9
2.4 实验内容与步骤（第二部分） .............................................................................. 9
2.4.1 漆酶（Lac ）酶活的测定 ............................................................................. 9
2.4.2 锰过氧化物酶(Mnp)酶活的测定 . .............................................................. 11
2.4.3 木质素提纯 ................................................................................................. 11
2.4.4 产酶条件的优化 ......................................................................................... 12
第三章 实验数据及分析 ..................................................................................................... 13
3.1 漆酶酶活 ........................................................................................................ 13
3.2 锰过氧化物酶活 ............................................................................................ 14
3.3 正交试验漆酶酶活 ........................................................................................ 16
3.4 正交试验锰过氧化物酶活 ............................................................................ 18
3.5 数据与分析 .................................................................................................... 18
3.6结论与展望 ..................................................................................................... 20
参考文献 ............................................................................................................................... 21
致 谢 ..................................................................................................................................... 24
第一章 绪论
1.1 本课题的目的、意义
生物质原料作为地球上数量最大的可再生资源之一，逐渐受到人们的重视。尤其是农作物秸杆正在成为潜在的石化替代燃料，利用秸杆生成乙醇和沼气的技术已逐渐得到应用和发展。但需通过生物化学或物理预处理方法对秸杆进行处理, 以提高沼气或乙醇产率。木质素的完全降解是由真菌、细菌及微生物群落共同作用的结果，其中真菌的降解研究最为广泛。细菌降解木质素的能力比真菌差，但是细菌来源广泛、生长迅速，易于大规模应用。细菌能够产生木质素过氧化物酶，锰过氧化物酶，漆酶等参与木质素降解的生物催化剂。通过改性、增溶等作用降解木质素成为低分子量的聚合木素片段。目前，采用木质素细菌降解酶作为预处理微生物，正成为新的研究方向。
1.2 本课题的研究内容
（1）木质素细菌降解酶的分离方法研究。
（2）木质素细菌降解酶的提纯研究。
（3）木质素细菌降解酶的产酶条件优化。
1.3 文献综述
1.3.1 木质素的生物降解
木质素是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的有机再生资源，同样也是微生物最难降解的成分之一[1]。
影响人们对植物纤维素高效利用的关键问题之一是木质素的阻碍作用。要突破木质素的束缚，有效利用原料中的纤维素和半纤维素，传统的物理方法能耗过高，污染较大。所以使得人们越来越倾向于研究木质素生物降解的研究[2]。
卢雪梅[3]等和马登波[4]等对木质素生物降解的反应机制做了综述:（1）木质素模型化合物的C α—C β 断裂。（2）C α—氧化机制。（3）氧的活化。（4）藜芦醇及其衍生物的活化。（5）醌/氢醌的形成。
1.3.2 木质素降解菌
自然界中，只有少数微生物能够降解木质素。木质素的完全降解需要通过真菌、细菌等微生物群落的共同作用[5]。细菌降解木质素的能力与真菌相比较差，但是细菌来源广泛、生长周期短，易于大规模应用[6]。
降解木质素的的霉菌可分为：白腐霉、褐腐霉、软腐霉。其中，白腐霉是最主要的木质素降解物。
降解木质素的细菌中，放线菌是公认降解能力较强的细菌，包括链霉菌、节杆菌、小单孢菌、诺卡氏菌等。另外，还存在厌氧细菌如梭菌，假单胞菌、不动杆菌、杆菌等。
1.3.3 国内外研究概况
20世纪50~60年代，证实木材腐朽与细菌有关；80~90年代，研究表明细菌能够代谢杨木二氧己烷木质素、低分子量的磺化木质素和Kraft 木质素[7]片段。
Crawford 等[8]，从土壤中分离得到的两株放线菌绿孢链霉菌T7A 和西唐氏链霉菌75Vi2可以降解软木、硬木、草类木质素，特别是降解草类木质素的能力很强。其中绿孢链霉菌八个星期内木质素降解率能够达到19.7%，木质纤维素损失总量可达36.2%。
Lokesh [9]从被糖厂排出物污染的土壤中分离得到的四种细菌：粘膜炎布兰汉氏球菌，环丝菌，藤黄微球菌，坚强芽孢杆菌。它们均可以在以引杜林为唯一碳源的固体培养基上生长。
Kukolya [10]从热的马粪便中分离出12种耐热的放线菌，这些菌种可以在以稻草为唯一碳源的培养基中生长，具有不尽相同的木质素增溶能力。菌种生长所需温度在27℃~67℃。
Gonz ·lez 等[11]用新技术从富含木质素的造纸厂废水中筛选出能降解木质素和木质素类芳单体的细菌，并且发现和描述了一种新的细菌属。
陈敏等[12]采用自然筛选、紫外诱变选育和高效筛选技术，从活性污泥中选育高效降解黑液中木质素的优势混合菌。结果选育得到的混合菌的活性明显高于自然筛选混合菌的活性，更能适应含高浓度木质素的溶液的处理。
Anthony 等[13]第一次广泛研究了主要调控因子对绿孢链霉菌产木质素降解酶和聚合物形成的影响，包括氮源、碳源和pH 值。研究结果得出，以酵母膏为氮源替代NH 4Cl 可以大大增强降解效果；在pH 为8.4-8.8之间，木质纤维素的降解率最高，在酸性条件下适宜木质纤维素的矿化，在碱性条件下增溶能力增强。
罗宇煊等[14]对一嗜碱细菌的营养调控机理做了充分的研究工作，包含氮源、碳氮比、碳源、第一碳源浓度、摇床转速、金属离子浓度等。研究结果表明，在高氮低碳条件下，细菌的产酶能力较强，加入适量表面活性剂、Mn 2+、Cu 2+有助于产酶和降解。
1.3.4 木质素降解酶及其作用机理
白腐菌的木质素降解酶系是当前木质素微生物降解研究的重点。一般认为[15]白腐菌主要产生三种木质素降解酶，分别为木质素过氧化物酶（Lip ），锰过氧化物酶（Mnp ），漆酶（Lac ）。Lip ，Mnp ，Lac 各自代表一系列的同工酶。
Lip [16-18]是一种糖蛋白，分子量约为41000，由一个血红素构成其活性中心，可连接最少一个藜芦醇，木质素大分子不能接近活性中心，但在接近活性中心通道的表面缝隙中，含有一段有序的残糖基，也许是木质素结合点，另外还有两个起稳定结构作用的Ca 2+。
木质素降解的启动反应属于单电子氧化，在木质素高聚物生成较稳定的芳香环正离子，充当单电子氧化剂，从而使氧化反应发生在远离酶的位置。藜芦醇和过氧化氢对Lip 降解木质素的反应具有重要作用。Lip 使藜芦醇氧化为正离子，而使得氧化反应扩散，藜芦基醇在此充当单电子氧化的中间媒介物。过氧化氢是随着木质素酶系的产生而由白腐菌受刺激生成的，即碳源，氮源的短缺促使葡萄糖氧化酶形成的，而葡萄糖氧化酶是产生过氧化氢的主导因素。因为过氧化氢的形成，Lip 降解木质素的反应才能进行。一般pH 为
4.5是木质素过氧化物酶引起木质素单电子氧化的关键。
Mnp [16-18]也是一种糖蛋白，分子量约为46000，由一个血红素基和一个Mn 2+构成其活性中心，另外还有两个Ca 2+起稳定结构作用，其分子中有十条长的，一条短的蛋白质单链。Mnp 在过氧化氢存在时能氧化酚型木质素和木质素模型物，即依靠Mn 2+及一种整合物催化木质素发生降解反应。Mn 2+被氧化成Mn 3+，Mn 3+则反过来氧化酚型化合物，并保护Mnp 使其不受到反应活性自由基的破坏。
Lac [19-20]是以O 2作电子受体，催化多酚化合物，经四次单电子传递形成醌及自由基的含酮蛋白酶。一般的漆酶含有四个铜离子，这四个铜离子均位于漆酶的活性部位，在氧化反应中起决定作用。漆酶催化氧化反应的机理表现在底物自由基的生成和漆酶分子中四个铜离子的协同配合作用。当漆酶催化酚类如氢醌氧化时，首先是底物向漆酶转移一对电子，生成半醌一氧自由基中间体。其次是不均等非酶反应，二分子半醌生成一分子对本醌及一分子氢醌。氧自由基中间体还原转化成碳自由基中间体，它能够自身结合或相互偶联，产物中有醌，还有聚合物和C-O 、C-C 偶联产物。
1.3.5 微生物产木质素降解酶的影响因素
（1）碳源和氮源
碳源和氮源的来源和营养限制对微生物降解木质素和产酶效果有极大的影响。有研究表明[21]，木质素本身并非是白腐菌的直接氮源和碳源。国内在此方面也做了大量研究[22]，结果表明酵母浸汁、牛肉膏等有机氮和酒石酸铵都有利于产酶，其中酒石酸铵的菌丝体产酶效率最高。吴昆[23]等研究结果显示鼠李糖和阿拉伯糖产Lac 的效果好于葡萄糖；蛋白胨、氯化铵作为氮源对Lac 活力最高。在无机氮中，无氧离子铵盐对Lac 产生作用较好。
木质素降解酶都是次生代谢产物，一些白腐菌在限制氮源的情况下，更有利于酶的合成[24]。
（2）温度
微生物产酶也受温度的影响。有研究[25]称：P.chrysosporium INA-12在37℃培养下菌体生长最好，在30℃培养更有利于木质素降解酶的产生。Brown J.A等[26]利用Northern Blot技术，探究突变温度对P.chrysosporium 产Mnp 的影响后，发现短时的温度刺激可以提升酶的产量，可以在缺少Mn 2+的状态下，提高编码Mnp 的mRNA 。温度刺激以及Mn 2+对Mnp 的mRNA 的增加有叠加效果。
（3）金属离子
金属离子对微生物产木质素降解酶的影响较为复杂。越来越多的研究结果表明。Mn 在木质素的降解过程当中起重要作用。有报道[27]指出Mn 2+的浓度和加入时间有关。每隔24h 向培养基加入8.5ppmMn 2+, 当培养基中没有Mn 2+时，Lip 酶活力最高；小于1.66ppm 的Mn 2+对Lip 具一定的促进作用；当Mn 2+超过8ppm 时，Lip 则完全被抑制。高浓度的Mn 2+强烈抑制限氮条件下培养的P.chrysosporium 的Lip 酶活力。另有报道[28]表明MnO 2也能提高木质素降解酶活力，使之产酶过程稳定。
余惠生[29]等研究了Cu 2+对白腐菌Panus conchatus产木素降解酶的影响。结果指出，Mnp 的产生受Cu 2+的影响不是很大，而Lac 收到显著的影响。没有Cu 2+的存在，Lac 酶活力很低，适中的Cu 2+浓度能增大漆酶活性，而过多的Cu 2+又会抑制漆酶的产生。
（4）氧气和培养方式
氧气和培养方式也是影响木质素降解酶产生的相关因素。很多研究[30-31]表明氧气对产生Lip 不可或缺. 静止培养时，定时通入纯氧有助于促进降解木质素。珂世省等的研究表明固定化的P.chrysosporium 在限制碳的培养条件下，在生长期通入纯氧对Lip 的影响不大，无氧不能形Lip 或Mnp ；产酶期通入空气能够满足形成Lip 的要求，且比限制氮培养条件下得到的Lip 还要多。震荡培养会抑制降解酶的产生，静止培养则不利于大量产酶。
1.3.6 木质素降解酶的应用
（1）在造纸行业上的应用[32]
a. 生物制浆。Lac 能在常温环境，选择性地降解木质素而不干扰半纤维素和纤维素，可以提高制浆有效得率并且降低造纸成本。另外，通过漆酶处理的制浆具备良好的抗张强度和平滑度。
b. 生物漂白。通过Lac 进行漂白，能减少氯及氯化物和其他化学漂白剂的用量，还能提升纸浆的白度。Lac 介体体系与聚木糖的相互作用能够处理蔗渣硫酸盐浆，可在一定范围上提高纸浆的强度和漂白度。
c. 废水处理。Lac 可去除漂白废水所具有的毒性，能催化氯酚生成低聚物，聚合产生的不溶沉淀可以经过沉降和过滤筛除。
（2）环境保护
Lac 除了处理造纸业废污水外，还能处理燃料、除草剂、杀菌剂和防腐剂中所含有的酚氯类化合物和苯胺取代物。Lac 也可以进行废水脱色。另外，固体废物如秸秆，禽畜粪便等，由于含有一定量的木质素，大大拖后了堆肥过程中纤维素的降解速度，而延长了发酵时间。所以，筛选分离和培育可降解木质素的优良菌剂可提高木质素的降解速度，减短堆肥发酵周期，提升发酵效率。
（3）其他应用
在食品行业中，Lac 能够净化饮料、检测食品中的抗坏血酸含量；以及在食用菌、医用菌制种过程中加快菌丝吃料，发育，从而缩短培育时间；在饲料工业中，木质素分解酶能够提高动物对饲料的消化率；Lac 还可以用于生物监测；在免疫检测中，Lac 正在被研究代替辣根过氧化物酶，成为新的标记酶。
第二章 实验部分
2.1 实验仪器
电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；紫外可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司TV-1810）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司
DHG-9123A ）；数显pH 计（上海雷磁创益仪器仪表有限公司）；离心机（常州国华电器有限公司80-3）；研磨机（德国IKA ）；高压灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司YM-30）；
光照培养箱（上海精宏实验设备有限公司GZP-250）；冰箱；摇床（上海智诚分析仪器制造有限公司ZHW-2102C ）；无菌操作台（苏州安泰空气技术有限公司SW-CT-2F ）；调温电热器（上海平环燃烧设备有限公司）；数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司HH-4）
2.2 实验试剂及材料
三水合磷酸氢二钾（西陇化工股份有限公司）；七水合硫酸镁（上海美兴化工股份有限公司）；磷酸二氢钾（南京化学试剂有限公司）；二水合氯化钙（上海泗联化工厂有限公司）；硫酸铵（南京化学试剂有限公司）；酵母膏（上海化学试剂公司）；氯化钠（南京化学试剂公司）；秸秆；L-半胱氨酸（上海慧兴生化试剂有限公司）；琼脂（国药集团化学试剂有限公司）；真菌抑制剂-纳他霉素（连云港友进食品添加剂技术开发有限公司）；ABTS （aladdin industrial corporation）；浓硫酸（南京化学试剂有限公司）；柠檬酸（国药集团化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司）；一水合硫酸锰（西陇化工股份有限公司）；木质素；氯化铜（上海振欣试剂厂）；过氧化氢（国药集团化学试剂有限公司）；
2.3 木质素降解细菌的分离与纯化
2.3.1 菌种土壤的采集
菌种土壤采集自南京紫金山山脚，有大量落叶覆盖，干燥土壤表面下20cm 处的土壤。用塑料袋大致装满，贴好标签，放入冰箱保存。
2.3.2 培养基的制备
（1）称量培养基配方（1000mL)
三水合磷酸氢二钾0.2948g ；七水合硫酸镁0.090g ；磷酸二氢钾0.225g ；二水合氯化钙0.030g ；硫酸铵0.225g ；酵母膏0.100g ；氯化钠0.450g ；秸秆粉末15g ；L-半胱氨酸0.5g ；琼脂15g ，蒸馏水1000L
（2）高温灭菌
将20个培养皿，5根试管，1支1mL 移液管，1支三角刮刀，一个250ml 锥形瓶，清洗烘干。向锥形瓶中倒入90mL 蒸馏水，向5根试管里各加入9ml 蒸馏水，做好棉花塞后，
全部用牛皮纸包扎紧后，放入高压灭菌锅，灭菌3h 。
（3）倒平板
取出灭菌后的所有待用仪器于无菌操作台。向已煮1h ，融化并冷却至40℃左右的培养基中加入30mg 的真菌抑制剂，充分搅拌后倒入培养皿（约培养皿容积的一半），倒好的培养皿自然冷却凝固。
（4）稀释水样
将锥形瓶和5根试管排列好，按10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6依次编号，然后稀释。（示意图见图2-1）
（5）平板表面涂布
在无菌操作条件下，从浓度小的10-6菌液开始，吸取1mL 菌液于相应编号的培养皿内，用三角刮刀在平板上涂布均匀，每个浓度做三到四个平皿，每个皿贴好标签。涂布完毕，待菌液自然吸收后，将平板倒置，送恒温培养箱37℃培养三天。
（6）筛除非目的平板
培养好的平板，在无菌条件下观察，将不是以细菌生长为主或菌种生长混乱的平板去除，剩余平板则继续培养。
图2-1 水样稀释示意图
2.3.3 细菌的初步纯种分离
（1）平板的制作
将融化并冷却约至50℃的培养基（配方见2.3.2）倒入培养皿内，使凝固成平板。 （2）平板第一次划线
将新平板在皿底用记号分成4个不同面积的区域，使A 〈B 〈C 〈D ，且夹角为120°左右。然后取出培养好菌种的平板，在无菌操作条件下挑取少量菌样。先划A 区，然后依次划其余区。（示意图见图2-2）
图2-2 划线示意图
每个一次划线过的平板分别取菌种两次到两个新的平板，将划线后的平板贴上标签纸，写好对应序号。然后将新平板放置37℃恒温培养箱，倒置培养3天。良好的结果应在C 区出现部分单菌落，而在D 区出现较多独立分布的单菌落。
2.3.4 细菌的纯种分离
（1）平板的制作
将融化并冷却约至50℃的培养基（配方见2.3.2）倒入培养皿内，使自然冷却凝固成平板。
（2）平板第二次划线
步骤与2.3.4大致相同，划线后的平板贴上标签纸，对应好序号。用保鲜膜包好，放置37℃恒温培养箱，倒置培养3天。
2.3.5 纯种细菌的保种
（1）制作斜面培养基
准备足够的干净的试管，做好棉花塞，排列在试管架上。准确称量培养基并煮过1h （配方参照2.3.2）后，趁热依次倒入各试管（约占试管1/3），塞好棉花塞，用牛皮纸包好
后，用高压灭菌锅灭菌。
（2）斜面接种
将灭菌后的斜面培养基整齐有序地在操作台上摆好斜面，操作台紫外灭菌1h 后，斜面培养基自然冷却凝固。然后进行斜面接种，至接种完毕后，全部试管送37℃恒温培养箱3d 。平板则全部放入冰箱4℃保存。
（3) 斜面低温保藏法
待斜面上的菌充分生长后，将所有试管移入冰箱4℃保存。
2.3.6 液体接种
（1）制作液体培养基
培养基配方（1000mL ）：三水合磷酸氢二钾0.2948g ；七水合硫酸镁0.090g ；磷酸二氢钾0.225g ；二水合氯化钙0.030g ；硫酸铵0.225g ；酵母膏0.100g ；氯化钠0.450g ；L-半胱氨酸0.5g ；，蒸馏水1000mL 。
准备10个干净的250mL 锥形瓶，做好棉花塞。将煮过1h 后的液体培养基冷却至约40℃，加入真菌抑制剂40mg ，充分搅拌。取100mL 液体培养基于第一个锥形瓶，加入1.5g 麦粉，塞好棉塞，搅拌剩余的液体培养基。重复该过程十次，即为1组。共做4组。做好后用牛皮纸依个包扎好，高压灭菌3h 。
（2）液体接种
无菌环境下，取出冰箱中的纯菌种平板进行液体接种，接种后的液体培养全部贴上对应菌种号码的标签，并送入摇床培养，设置摇床温度30℃，转速160r/min,培养3-4d 。
2.4 木质素细菌降解酶的研究
2.4.1 漆酶（Lac ）酶活的测定
Lac 酶活的测定原理为Lac 分解ABTS 的产物为ABTS 自由基，然而在波长420nm 处，ABTS 自由基的吸光系数远大于底物ABTS 。随着ABTS 自由基浓度的增加，吸光度值变大。吸光度值在某一段时间的变化表示为Lac 的活力。采用不同吸光度值变化范围，在某一底物浓度下测定不同稀释倍数时酶液的酶活力，根据酶活力去比那个相应的吸光度值变化范围。为了增加同一漆酶活力的稳定性以及不同漆酶活力的可比性，测定过程尽量要求测定条件一致。吸光度变化过程中，ABTS 浓度不断降低，产物量却不断增加，因而所测
出的吸光度值不断变化。由于反应时间较快，短暂的时间内，反应迅速，测量时大部分只能捕捉到反应尾声或结束时的底物吸光度，但是漆酶酶活较大的菌种底物浓度相较其他菌种的吸光度较大，所以只需要寻找所测细菌中，在波长420nm 处，吸光度较大的细菌菌种即可。
（1）缓冲液的配制
A 液：0.1mol/L柠檬酸溶液1000mL ； B 液：0.1mol/L磷酸氢二钠溶液625mL ；
配制好的A 、B 液混合与2000mL 大烧杯中，插入数显pH 计，控制添加的A 、B 液，使pH 最终在4-5的范围，装入干净试剂瓶中，贴上标签，保存备用。
（2）ABTS 的配置
称取0.0823gABTS （冰箱保存），再加10ml 蒸馏水，最终浓度为1mmol/L，充分溶解，装入棕色试剂瓶，贴好标签，避光保存。
（3）移入底物ABTS
取ABTS 试剂瓶，用移液枪取200μL 于干净试管中，然后再加入缓冲液2780μL 。按此步骤做40个试管，贴好标签，放入恒温水浴锅中，设置温度为30℃。
（4）粗酶液的提取
取出2.3.7中摇床里的所有接种过的液体培养基，在无菌操作条件下，依次取上清液，如取菌28#锥形瓶，将上层清液倒入离心管中，以2500r/min转速离心30min 后，用无菌的塑料滴管吸取离心管上层清液于无菌试管中，试管上做好相应的菌种标记如28#。同一批可以离心6个。根据实际情况，提取粗酶液的菌号为1#、3#、4#、5#、6#、8#、9#、10#、11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、19-1#、20-1#、20-2#、21#、22#、23#、24#、25#、26#、27#、28#、29#、30#、31#、32#、33#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#。按上述步骤操作直到取出所有菌种的粗酶液于试管中。另外做一个空白对照，即不加入酶液，而是缓冲液。
（5）测定
紫外分光光度计设置波长为420nm ，设置10s 取样一次，共6次。取空白对照试管校零。用移液枪吸取粗酶液50μL 于对应的底物试管中，启动反应，注意不碰到试管壁，轻微震荡后将试管中溶液倒入比色皿，立即测4min 内吸光度。记录数据。
（6）注意事项
因为实验实际操作和液体培养基的损坏，粗酶液并不是按序号提取的；水浴时间不超
过5min ；ABTS 试剂在冰箱里保存；比色皿在测量后一定要清洗干净。
2.4.2 锰过氧化物酶(Mnp)酶活的测定
Mnp 酶活力测定原理为二价锰离子是在Mnp 作用下，变成三价锰离子，在波长238nm 处测三价锰离子的吸光值。测定锰过氧化物酶酶活的时候，只需分辨出哪些菌种的锰过氧化物酶的酶活较高即可。此方法可用于连续测定，称为乳酸钠法。
（1）缓冲液的配制
A 液：称取80%~90%乳酸10.6g ，加水定容至1000mL; B 液：称取70%乳酸钠16g ，加水定容至1000mL ；
然后将配制好的A 、B 液取适量混合于2000mL 大烧杯，插入数显pH 计，控制好A 、B 液的添加量，使pH 最终浓度在4-5的范围，即得到所需缓冲液，倒入试剂瓶中，贴好标签，保存待用。
最后配好1.6mmol/L的硫酸锰溶液和1.6mmol/L的过氧化氢溶液，分别贴好标签待用。 （2）粗酶液的提取
酶液的提取过程与漆酶酶活的提取方法相同，根据实际情况，提取粗酶液的菌号为4#、5#、6#、7#、8#、9#、11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、19-1#、20#、20-1#、21#、22#、23#、24#、25#、26#、27#、28#、29#、30#、31#、32#、33#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#。即取40种接种过的液体培养基的上清液，离心后再取上清液，分别装入试管，对应菌种编号。
（3）测定
在4mL 反应体系中含有50mmol/L的乳酸钠缓冲液3.4mL ，1.6mmol/L的硫酸锰溶液0.1mL ，粗酶液0.4mL ，预热至37℃后，加1.6mmol/L的过氧化氢溶液0.1mL 启动反应。在238nm 处用紫外可见分光光度仪测定反应4min 内的吸光光度值（OD ）。记录好数据后，关闭仪器。
2.4.3 木质素提纯
取出实验室存有的粗木质素于700mL 蒸馏水中，溶于2000mL 大烧杯中，加入20%~30%稀硫酸溶液，调节PH 至3，此时出现沉淀，充分搅拌后，将大烧杯中溶液倒入离心杯，准确称量使对应离心杯重量相同，然后用大离心机5000r/min分离沉淀30min 。分离出的沉淀物可继续用20%~30%稀硫酸进行酸洗，然后再用离心机分离沉淀。最后移出纯
木质素与大玻璃皿中，放入60℃真空干燥机中干燥，干燥好的木质素研磨成粉，贴好标签，保存，为同组实验组员所用。
2.4.4 产酶条件的优化
由之前的实验数据得出，菌28#产出的Lac 和Mnp 酶活力相对较高。所以针对菌28#作产酶条件的优化，以得到可实际操作的最佳的产酶条件。
（1）正交试验法
根据实际情况，采用L 9(34) 正交试验表，三个因素及各自水平（见表2-1）：
A: pH 值；B: Cu2+浓度（试剂为CuCl 2·H 2O ）；C: Mn2+浓度（试剂为MnSO 4·H 2O ）
表2-1 试验因素表
其中，PH 的配制步骤为：配制A 液即0.1mol/L柠檬酸溶液、B 液即0.1mol/L磷酸氢二钠溶液。在不同的三个烧杯中分别加入适量A 、B 液，用数显pH 计调pH 使三个烧杯中的pH 分别等于3、4、5。配置好后分别装入试剂瓶，贴好对应标签，保存备用；
将B 因素浓度换算，即B 1，B 2，B 3分别对应称量试剂17.048g ，34.096g ，85.24g ； 将C 因素浓度换算，即C 1，C 2，C 3分别对应称量试剂0.0031g ，0.0062g ，0.0124g 。 （2）液体培养基及接种 配方（见表2-2）
表2-2 液体培养基配方
按照表-2称量3组不同配方与3个500mL 烧杯中，充分搅拌后，测量pH 值，用3个调温电热器分别加热至沸。煮好的1组、2组、3组液体培养基分别用100mL 量筒取100mL 分入经过高压灭菌的9个250mL 锥形瓶，贴好对应标签如A 1。
按照不同因素水平组合，即A 1B 1C 1，A 1B 3C 1，A 1B 3C 3，A 2B 1C 2，A 2B 2C 2，A 3B 1C 3，A 3B 2C 1，A 3B 2C 3，A 3B 3C 2。准确称量试剂CuCl 2·H 2O ，MnSO 4·H 2O 于各锥形瓶中。然后在9个锥形瓶中趁热各加入1g 麦粉，轻微摇晃。
待温度降到30℃左右，在无菌操作条件下，将菌28#进行液体接种，步骤同2.3.7（2），接种后的锥形瓶，放入摇床，设置温度30℃，转速160r/min，培养3天。
（3）测量Lac 及Mnp 酶活
步骤与2.4.1和2.4.2大致相同，记录测量结果，比较出最优的产酶条件。
第三章 结果与讨论
3.1木质素降解细菌的分离
3.2 漆酶酶活
(1）根据实验数据，除去由于操作原因而得到的负吸光度，即菌号5#、8#、10#、11#、15#、19#、20-1#、21#、22#、23#、29#、30#、35#、36#、38#、40#。其余值见表3-1；
表3-1 漆酶吸光度
时间 1# 3# 4#
10s 0.017 0.010 0.029
20s 0.016 0.009 0.027
30s 0.016 0.009 0.024
40s 0.016 0.008 0.021
50s 0.016 0.008 0.018
60s 0.016 0.008 0.016
70s 0.014
80s 0.012
6# 9# 12# 时间 13# 14# 16# 17# 18# 19-1# 20-2# 24# 25# 26# 27# 28# 31# 32# 33# 34# 37# 39#
0.008 0.008 0.017 10s 0.017 0.010 0.016 0.008 0.004 0.004 0.008 0.030 0.015 0.011 0.017 0.077 0.010 0.017 0.013 0.006 0.030 0.021
0.007 0.007 0.016 20s 0.016 0.009 0.013 0.007 0.004 0.004 0.008 0.029 0.015 0.010 0.016 0.076 0.009 0.016 0.012 0.004 0.031 0.021
0.007 0.007 0.016 30s 0.015 0.009 0.013 0.007 0.004 0.004 0.008 0.029 0.015 0.010 0.016 0.075 0.009 0.015 0.012 0.004 0.030 0.020
0.007 0.007 0.015 40s 0.015 0.008 0.011 0.006 0.003 0.004 0.008 0.029 0.015 0.010 0.016 0.074 0.009 0.015 0.012 0.004 0.030 0.020
0.006 0.006 0.015 50s 0.015 0.008 0.011 0.006 0.003 0.004 0.008 0.029 0.015 0.010 0.016 0.074 0.009 0.014 0.011 0.004 0.030 0.020
0.006 0.006 0.015 60s 0.014 0.008 0.011 0.006 0.003 0.004 0.008 0.029 0.015 0.010 0.016 0.074 0.008 0.014 0.011 0.004 0.030 0.020
0.006 0.006 0.015 70s 0.014 0.008 0.010 0.006 0.003 0.008 0.029 0.014 0.010 0.074 0.008 0.014 0.011 0.003 0.030 0.020
0.006 0.006 0.014 80s 0.014 0.008 0.010 0.006 0.003 0.008 0.029 0.014 0.010 0.074 0.008 0.014 0.010 0.003 0.030 0.020
由表3-1可以发现，漆酶吸光度较高的额菌种有4#、24#、25#、28#、37#、39#，而吸光度变化均很小，且都是下降的趋势，可以以此推测菌产漆酶的活性可能都不高，甚至没有活性。
3.2 锰过氧化物酶活
（1）根据实验数据，除去由操作原因而得到的负吸光度，即菌号21。其余吸光度值见表3-2；
表3-2 锰过氧化物酶吸光度值
时间 15s 4# 0.51 时间 15s 5# 0.637 6# 0.481 7# 0.434 8# 0.538 9# 0.639 11# 0.636 12# 0.640 13# 0.642 14# 0.558 15# 0.642 16# 0.531 17# 0.467 18# 0.638 19# 0.637 19-1# 0.653 20# 0.637 20-1# 0.379 22# 0.640 23# 0.394 24# 0.432 25# 0.436 26# 0.638 27# 0.482 28# 0.554 29# 0.435 30# 0.639 31#
0.358
30s 45s 0.51 0.51 30s 45s 0.636 0.636 0.477 0.476 0.434 0.434 0.358 0.358 0.638 0.638 0.636 0.636 0.640 0.640 0.642 0.642 0.558 0.558 0.642 0.642 0.531 0.531 0.464 0.465 0.638 0.637 0.638 0.638 0.653 0.653 0.637 0.636 0.377 0.377 0.640 0.639 0.395 0.395 0.432 0.431 0.436 0.436 0.638 0.638 0.481 0.481 0.553 0.554 0.434 0.435 0.639 0.639 0.358
0.358 60s 75s 0.51 0.509 60s 75s 0.636 0.636 0.476 0.476 0.434 0.434 0.358 0.358 0.638 0.638 0.636 0.637 0.640 0.640 0.642 0.642 0.558 0.558 0.642 0.642 0.530 0.530 0.464 0.463 0.637 0.637 0.637 0.636 0.653 0.653 0.637 0.637 0.377 0.377 0.639 0.639 0.395 0.395 0.431 0.431 0.436 0.436 0.638 0.638 0.481 0.481 0.554 0.553 0.435 0.435 0.639 0.639 0.358
0.358
90s 0.509 90s 0.636 0.477 0.434 0.358 0.638 0.637 0.640 0.642 0.558 0.641 0.531 0.465 0.638 0.637 0.653 0.637 0.377 0.639 0.395 0.431 0.436 0.638 0.481 0.553 0.435 0.639 0.358
32# 33# 时间 34# 35# 36# 37# 38# 39# 40#
0.454 0.643 15s 0.647 0.638 0.637 0.649 0.636 0.477 0.652
0.450 0.643 30s 0.646 0.638 0.637 0.649 0.636 0.477 0.651
0.449 0.644 45s 0.646 0.638 0.637 0.649 0.636 0.476 0.651
0.449 0.644 60s 0.646 0.638 0.638 0..648 0.636 0.477 0.651
0.449 0.643 75s 0.646 0.638 0.637 0.649 0.636 0.477 0.651
0.448 0.463 90s 0.647 0.638 0.637 0.648 0.636 0.477 0.651
由表-2可以发现，锰过氧化物酶吸光度较高的菌号有5#、9#、11#、12#、13#、14#、15#、18#、19#、20#、22#、26#、28#、30#、33#、34#、35#、36#、37#、38#、40#。但是吸光度变化量也很小，且都是呈下降趋势，可以推测其酶活力也不高，甚至没有活性；与表-1结合比较可以看出，一种菌产的漆酶吸光度比较高的，锰过氧化物酶吸光度也高，但是锰过氧化物酶吸光度高的，漆酶吸光度不一定也高；同时发现，菌28的漆酶吸光度和锰过氧化物吸光度均比较具有代表性，所以后续的产酶优化是针对菌28所做。
3.3 正交试验漆酶酶活
（1）菌28在正交试验条件下的吸光度（OD ）值见表3-3；
表3-3 正交试验漆酶吸光度
时间 A 1B 1C 1 A 1B 3C 1 A 2B 1C 2 A 2B 2C 2 A 3B 2C 3 A 3B 2C 1 A 3B 1C 3 A 3B 3C 2
10s 0.030 0.202 0.035 0.030 0.054 0.054 0.027 0.109
20s 0.030 0.204 0.036 0.031 0.051 0.054 0.028 0.110
30s 0.030 0.205 0.037 0.032 0.050 0.055 0.028 0.112
40s 0.031 0.207 0.037 0.033 0.048 0.056 0.029 0.113
50s 0.031 0.208 0.038 0.035 0.048 0.057 0.029 0.114
60s 0.032 0.209 0.039 0.036 0.048 0.058 0.030 0.115
变化量 +0.002 +0.007 +0.004 +0.006 -0.006 +0.004 +0.003 +0.006
斜率 1/3000 7/6000 1/1500 1/1000 -1/1000 1/1500 1/2000 1/1000
A 1B 3C 3 0.111 0.113 0.114 0.115 0.116 0.117 +0.006 1/1000
由表3-3和表3-1结合可以看出，在改变了产酶条件的情况下，菌28可能在A 1B 3C 1条件下所产漆酶量最大，A 3B 1C 3条件下产酶最少，A 3B 3C 2、A 1B 3C 3条件下产酶量菌增加，其余条件下产酶则反而减小；A 3B 2C 3条件下的吸光度变化呈下降趋势，说明此条件不适于产酶，而其余条件下，吸光度变化量均呈上升趋势，其中A 1B 3C 1条件下，吸光度变化量最大，可以推测这个条件下产的漆酶酶活最高。
直观分析见表3-4。表中K =∑yi ，如Kj1=1/3000+1/1000+7/6000=1/400；R 为极差。
i =19
表3-4 正交试验计算表
R 值越大，表示因素ABC 所起作用越大，由表3-4可以得出，影响因素B>A>C；Kj1平均值最大，Kj3平均值最大，即在pH=3，Cu 2+浓度=5mo/100mL下为最优，所以最优组
合搭配为A 1B 3C 1，A 1B 3C 3，A 1B 3C 2。
3.4 正交试验锰过氧化物酶活
（1）吸光度（OD ）值见表3-5
表3-5 正交试验锰过氧化物酶吸光度
时间 A 1B 1C 1 A 1B 3C 1 A 2B 1C 2 A 2B 2C 2 A 3B 2C 3 A 3B 2C 1 A 3B 1C 3 A 3B 3C 2 A 1B 3C 3
15s 1.263 2.024 2.084 2.030 2.051 2.117 2.046 2.086 2.007
30s 1.268 2.024 2.080 2.028 2.050 2.112 2.048 2.087 2.004
45s 1.266 2.021 2.082 2.025 2.050 2.110 2.045 2.085 2.003
60s 1.258 2.022 2.080 2.026 2.047 2.108 2.046 2.085 2.005
75s 1.259 2.019 2.075 2.027 2.047 2.106 2.0435 2.083 2.005
90s 1.256 2.023 2.079 2.027 2.046 2.107 2.043 2.080 2003
105s 1.252 2.019 2.078 2.023 2.044 2.103 2.043 2.082 2.005
120s 1.254 2.019 2.079 2.026 2.043 2.104 2.049 2.082 2.002
由表3-4可以发现，测出的锰过氧化物吸光度变化并不是单一的下降或升高趋势；与表3-2比较可以得出，所有正交实验条件下的锰过氧化物吸光度均大于普通条件下所测吸光度，其中以组合A 2B 1C 2、A 3B 2C 1和A 3B 3C 2最优，实验因素影响大小关系为因素A>因素C>因素B ，即影响菌28产酶条件最主要的因素为pH 大小和锰离子浓度的大小，其次是铜离子的大小。
3.5 小结
（1）由表3-1和表3-2比较可知，一个菌种，如果其对应漆酶吸光度高，那么其对应锰过氧化物吸光度也高；而锰过氧化物吸光度高的，其对应漆酶吸光度不一定高；
（2）由表3-2和表3-5比较可知，菌28在正交试验条件下所测的所有锰过氧化物酶吸光度均大于普通培养条件下所测吸光度；由表3-1和表3-3比较可知，菌28在正交条件下所测漆酶的部分吸光度明显高于普通培养条件下所测吸光度，而有些则反而低，说明正交试验中，部分组合因素能大量促进漆酶的产生，部分则反而抑制漆酶的产生。
（3）表3-1，表3-2，表3-3，表3-5表明，测出的吸光度变化量都很小，说明细菌产出的酶活活性都不高；表3-4表明，影响28号菌产酶条件的最主要的影响因素为铜离子的浓度，其次是pH 的影响。
（4）将实验结果与白腐菌实验结果比较，白腐真菌产酶的最适pH 范围为4~5。二价锰离子的浓度在0~40mg/L范围；浓度越高越有利于Mnp 的合成，当二价锰离子浓度大于200mg/L时，酶活力下降。二价铜离子的浓度在0~5mol/L范围内，酶活力随二价铜离子浓度的增加迅速提高，当大于10mol/L后，酶活力降低。而本实验得出的结果PH 为3~5之间，铜离子浓度在1~5mol/100mL范围内，浓度越高酶活越高，锰离子浓度在0~40mg/100mL范围内，浓度越高酶活越高。所得实验结果与白腐真菌的实验结果相差不大。
（4）实验中有些部分，因为实验条件和设备的限制，并没有完全按照参考文献的步骤，而选择进行改变，所以可能出现实验数据的不合理或偏差。
（5）因为实验是从3月到5月份，期间气温从低到高，而除去在摇床中培养的时间之外，有部分时间，液体培养基是放置室温条件下的，所以可能会受到气温的影响而对细菌产酶造成干扰。
第四章结论与展望
结论：
（1）正交试验下，A 1B 3C 1、A 1B 3C 3、A 1B 3C 2件为最优条件，其中A 1B 3C 1下所产漆酶量最大；A 3B 1C 3条件下产酶最少；其余条件下产酶则反而受到抑制。
（2）正交试验下，所有条件都使产锰过氧化物酶增加。
（3）不论是普通培养条件还是正交试验培养条件下，菌28生产的漆酶和锰过氧化物酶的酶活均很低。
展望：
（1）正交试验中，研究的因素包括了pH ，Cu 2+，Mn 2+。在这些因素的交互作用下，得到了能有效促进产酶的组合方式。那么，如果在增加一个因素，比如温度，则可能会出现更好的培养条件；或者仅仅只是改变单个因素，如只是改变金属离子的浓度这个条件，产酶效果也会发生变化。
（2）实验中所提取的粗酶液均为胞外酶液，但是酶活力都不高，而如果通过超声破碎微生物提取胞内酶，则可能酶活力会比较高。
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致 谢
XX
本科毕业设计（论文）
题 目：
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二O 一 年 月 日
摘 要
生物质原料作为地球上数量最大的可再生资源之一，逐渐受到人们的重视。目前，采用木质素细菌降解酶作为预处理微生物，正成为新的研究方向。本实验以南京紫金山土壤为原料，通过稀释平板法，固体培养基培养以及试管斜面保种等步骤，筛选得到纯种细菌。在筛选细菌过程中，挑选部分采用液体培养基培养，得到细菌降解酶，并测其漆酶和锰过氧化物酶的酶活力，结果发现酶活力都不高。最后通过正交试验优化菌28的产酶条件，发现在pH 为3、Cu 2+ 浓度为5mol/100mL、Mn 2+浓度为1mg/100mL的条件下，细菌产漆酶量最大。
关键字： 木质素；稀释分离；酶活；优化
Abstract
As one of the largest number of renewable resources on the earth, biological raw material has been paid more and more attention. At present, biological pretreatment used by bacteria lignin degrading enzymes is becoming a new kind of research interest. In this paper, raw material was obtained the soil in the Nanjing Zijin Mountain, and then finally lignin degradation bacterium were isolated. in test tubes which were preserved in refrigerator with suitable centigrade by means like dilution，screening and solid nutrient medium. During the process in screening,we selected some bacteria to be fostered in liquid nutrient medium and measured their laccase enzymes activity and manganese peroxidase activity.The result indicated that both laccase enzymes activity and manganese peroxidase activity were not high .At last, we tried to optimize the requirement that the bacteria No.28 need to produce enzymes by orthogonal test,and discovered that the bacteria could produce the largest quantity of Lac in the condition where the pH was 3,and the consistence of Cu 2+ was 5mol/100mL,and the consistence of Mn 2+ was 1mg/100mL.
Key words: lignin，isolation ，enzymes activity，optimization
目 录
第一章 绪论 . .......................................................................................................................... 1
1.1 本课题的目的、意义 ............................................................................................. 1
1.2 本课题的研究内容 .................................................................................................. 1
1.3 文献综述 .................................................................................................................. 1
1.3.1 木质素的生物降解 ....................................................................................... 1
1.3.2 木质素降解菌 ............................................................................................... 2
1.3.3 国内外研究概况 ........................................................................................... 2
1.3.4 木质素降解酶及其作用机理 ....................................................................... 3
1.3.5 微生物产木质素降解酶的影响因素 . .......................................................... 4
1.3.6 木质素降解酶的应用 ................................................................................... 5
第二章 实验部分 ................................................................................................................... 5
2.1 实验仪器 .................................................................................................................. 5
2.2 实验试剂及材料 ...................................................................................................... 6
2.3 实验内容与步骤（第一部分） .............................................................................. 6
2.3.1 菌种土壤的采集 ........................................................................................... 6
2.3.2 培养基的制备 ............................................................................................... 6
2.3.3 细菌的初步纯种分离 ................................................................................... 8
2.3.4 细菌的纯种分离 ........................................................................................... 8
2.3.5 纯种细菌的保种 ........................................................................................... 8
2.3.6 液体接种 ....................................................................................................... 9
2.4 实验内容与步骤（第二部分） .............................................................................. 9
2.4.1 漆酶（Lac ）酶活的测定 ............................................................................. 9
2.4.2 锰过氧化物酶(Mnp)酶活的测定 . .............................................................. 11
2.4.3 木质素提纯 ................................................................................................. 11
2.4.4 产酶条件的优化 ......................................................................................... 12
第三章 实验数据及分析 ..................................................................................................... 13
3.1 漆酶酶活 ........................................................................................................ 13
3.2 锰过氧化物酶活 ............................................................................................ 14
3.3 正交试验漆酶酶活 ........................................................................................ 16
3.4 正交试验锰过氧化物酶活 ............................................................................ 18
3.5 数据与分析 .................................................................................................... 18
3.6结论与展望 ..................................................................................................... 20
参考文献 ............................................................................................................................... 21
致 谢 ..................................................................................................................................... 24
第一章 绪论
1.1 本课题的目的、意义
生物质原料作为地球上数量最大的可再生资源之一，逐渐受到人们的重视。尤其是农作物秸杆正在成为潜在的石化替代燃料，利用秸杆生成乙醇和沼气的技术已逐渐得到应用和发展。但需通过生物化学或物理预处理方法对秸杆进行处理, 以提高沼气或乙醇产率。木质素的完全降解是由真菌、细菌及微生物群落共同作用的结果，其中真菌的降解研究最为广泛。细菌降解木质素的能力比真菌差，但是细菌来源广泛、生长迅速，易于大规模应用。细菌能够产生木质素过氧化物酶，锰过氧化物酶，漆酶等参与木质素降解的生物催化剂。通过改性、增溶等作用降解木质素成为低分子量的聚合木素片段。目前，采用木质素细菌降解酶作为预处理微生物，正成为新的研究方向。
1.2 本课题的研究内容
（1）木质素细菌降解酶的分离方法研究。
（2）木质素细菌降解酶的提纯研究。
（3）木质素细菌降解酶的产酶条件优化。
1.3 文献综述
1.3.1 木质素的生物降解
木质素是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的有机再生资源，同样也是微生物最难降解的成分之一[1]。
影响人们对植物纤维素高效利用的关键问题之一是木质素的阻碍作用。要突破木质素的束缚，有效利用原料中的纤维素和半纤维素，传统的物理方法能耗过高，污染较大。所以使得人们越来越倾向于研究木质素生物降解的研究[2]。
卢雪梅[3]等和马登波[4]等对木质素生物降解的反应机制做了综述:（1）木质素模型化合物的C α—C β 断裂。（2）C α—氧化机制。（3）氧的活化。（4）藜芦醇及其衍生物的活化。（5）醌/氢醌的形成。
1.3.2 木质素降解菌
自然界中，只有少数微生物能够降解木质素。木质素的完全降解需要通过真菌、细菌等微生物群落的共同作用[5]。细菌降解木质素的能力与真菌相比较差，但是细菌来源广泛、生长周期短，易于大规模应用[6]。
降解木质素的的霉菌可分为：白腐霉、褐腐霉、软腐霉。其中，白腐霉是最主要的木质素降解物。
降解木质素的细菌中，放线菌是公认降解能力较强的细菌，包括链霉菌、节杆菌、小单孢菌、诺卡氏菌等。另外，还存在厌氧细菌如梭菌，假单胞菌、不动杆菌、杆菌等。
1.3.3 国内外研究概况
20世纪50~60年代，证实木材腐朽与细菌有关；80~90年代，研究表明细菌能够代谢杨木二氧己烷木质素、低分子量的磺化木质素和Kraft 木质素[7]片段。
Crawford 等[8]，从土壤中分离得到的两株放线菌绿孢链霉菌T7A 和西唐氏链霉菌75Vi2可以降解软木、硬木、草类木质素，特别是降解草类木质素的能力很强。其中绿孢链霉菌八个星期内木质素降解率能够达到19.7%，木质纤维素损失总量可达36.2%。
Lokesh [9]从被糖厂排出物污染的土壤中分离得到的四种细菌：粘膜炎布兰汉氏球菌，环丝菌，藤黄微球菌，坚强芽孢杆菌。它们均可以在以引杜林为唯一碳源的固体培养基上生长。
Kukolya [10]从热的马粪便中分离出12种耐热的放线菌，这些菌种可以在以稻草为唯一碳源的培养基中生长，具有不尽相同的木质素增溶能力。菌种生长所需温度在27℃~67℃。
Gonz ·lez 等[11]用新技术从富含木质素的造纸厂废水中筛选出能降解木质素和木质素类芳单体的细菌，并且发现和描述了一种新的细菌属。
陈敏等[12]采用自然筛选、紫外诱变选育和高效筛选技术，从活性污泥中选育高效降解黑液中木质素的优势混合菌。结果选育得到的混合菌的活性明显高于自然筛选混合菌的活性，更能适应含高浓度木质素的溶液的处理。
Anthony 等[13]第一次广泛研究了主要调控因子对绿孢链霉菌产木质素降解酶和聚合物形成的影响，包括氮源、碳源和pH 值。研究结果得出，以酵母膏为氮源替代NH 4Cl 可以大大增强降解效果；在pH 为8.4-8.8之间，木质纤维素的降解率最高，在酸性条件下适宜木质纤维素的矿化，在碱性条件下增溶能力增强。
罗宇煊等[14]对一嗜碱细菌的营养调控机理做了充分的研究工作，包含氮源、碳氮比、碳源、第一碳源浓度、摇床转速、金属离子浓度等。研究结果表明，在高氮低碳条件下，细菌的产酶能力较强，加入适量表面活性剂、Mn 2+、Cu 2+有助于产酶和降解。
1.3.4 木质素降解酶及其作用机理
白腐菌的木质素降解酶系是当前木质素微生物降解研究的重点。一般认为[15]白腐菌主要产生三种木质素降解酶，分别为木质素过氧化物酶（Lip ），锰过氧化物酶（Mnp ），漆酶（Lac ）。Lip ，Mnp ，Lac 各自代表一系列的同工酶。
Lip [16-18]是一种糖蛋白，分子量约为41000，由一个血红素构成其活性中心，可连接最少一个藜芦醇，木质素大分子不能接近活性中心，但在接近活性中心通道的表面缝隙中，含有一段有序的残糖基，也许是木质素结合点，另外还有两个起稳定结构作用的Ca 2+。
木质素降解的启动反应属于单电子氧化，在木质素高聚物生成较稳定的芳香环正离子，充当单电子氧化剂，从而使氧化反应发生在远离酶的位置。藜芦醇和过氧化氢对Lip 降解木质素的反应具有重要作用。Lip 使藜芦醇氧化为正离子，而使得氧化反应扩散，藜芦基醇在此充当单电子氧化的中间媒介物。过氧化氢是随着木质素酶系的产生而由白腐菌受刺激生成的，即碳源，氮源的短缺促使葡萄糖氧化酶形成的，而葡萄糖氧化酶是产生过氧化氢的主导因素。因为过氧化氢的形成，Lip 降解木质素的反应才能进行。一般pH 为
4.5是木质素过氧化物酶引起木质素单电子氧化的关键。
Mnp [16-18]也是一种糖蛋白，分子量约为46000，由一个血红素基和一个Mn 2+构成其活性中心，另外还有两个Ca 2+起稳定结构作用，其分子中有十条长的，一条短的蛋白质单链。Mnp 在过氧化氢存在时能氧化酚型木质素和木质素模型物，即依靠Mn 2+及一种整合物催化木质素发生降解反应。Mn 2+被氧化成Mn 3+，Mn 3+则反过来氧化酚型化合物，并保护Mnp 使其不受到反应活性自由基的破坏。
Lac [19-20]是以O 2作电子受体，催化多酚化合物，经四次单电子传递形成醌及自由基的含酮蛋白酶。一般的漆酶含有四个铜离子，这四个铜离子均位于漆酶的活性部位，在氧化反应中起决定作用。漆酶催化氧化反应的机理表现在底物自由基的生成和漆酶分子中四个铜离子的协同配合作用。当漆酶催化酚类如氢醌氧化时，首先是底物向漆酶转移一对电子，生成半醌一氧自由基中间体。其次是不均等非酶反应，二分子半醌生成一分子对本醌及一分子氢醌。氧自由基中间体还原转化成碳自由基中间体，它能够自身结合或相互偶联，产物中有醌，还有聚合物和C-O 、C-C 偶联产物。
1.3.5 微生物产木质素降解酶的影响因素
（1）碳源和氮源
碳源和氮源的来源和营养限制对微生物降解木质素和产酶效果有极大的影响。有研究表明[21]，木质素本身并非是白腐菌的直接氮源和碳源。国内在此方面也做了大量研究[22]，结果表明酵母浸汁、牛肉膏等有机氮和酒石酸铵都有利于产酶，其中酒石酸铵的菌丝体产酶效率最高。吴昆[23]等研究结果显示鼠李糖和阿拉伯糖产Lac 的效果好于葡萄糖；蛋白胨、氯化铵作为氮源对Lac 活力最高。在无机氮中，无氧离子铵盐对Lac 产生作用较好。
木质素降解酶都是次生代谢产物，一些白腐菌在限制氮源的情况下，更有利于酶的合成[24]。
（2）温度
微生物产酶也受温度的影响。有研究[25]称：P.chrysosporium INA-12在37℃培养下菌体生长最好，在30℃培养更有利于木质素降解酶的产生。Brown J.A等[26]利用Northern Blot技术，探究突变温度对P.chrysosporium 产Mnp 的影响后，发现短时的温度刺激可以提升酶的产量，可以在缺少Mn 2+的状态下，提高编码Mnp 的mRNA 。温度刺激以及Mn 2+对Mnp 的mRNA 的增加有叠加效果。
（3）金属离子
金属离子对微生物产木质素降解酶的影响较为复杂。越来越多的研究结果表明。Mn 在木质素的降解过程当中起重要作用。有报道[27]指出Mn 2+的浓度和加入时间有关。每隔24h 向培养基加入8.5ppmMn 2+, 当培养基中没有Mn 2+时，Lip 酶活力最高；小于1.66ppm 的Mn 2+对Lip 具一定的促进作用；当Mn 2+超过8ppm 时，Lip 则完全被抑制。高浓度的Mn 2+强烈抑制限氮条件下培养的P.chrysosporium 的Lip 酶活力。另有报道[28]表明MnO 2也能提高木质素降解酶活力，使之产酶过程稳定。
余惠生[29]等研究了Cu 2+对白腐菌Panus conchatus产木素降解酶的影响。结果指出，Mnp 的产生受Cu 2+的影响不是很大，而Lac 收到显著的影响。没有Cu 2+的存在，Lac 酶活力很低，适中的Cu 2+浓度能增大漆酶活性，而过多的Cu 2+又会抑制漆酶的产生。
（4）氧气和培养方式
氧气和培养方式也是影响木质素降解酶产生的相关因素。很多研究[30-31]表明氧气对产生Lip 不可或缺. 静止培养时，定时通入纯氧有助于促进降解木质素。珂世省等的研究表明固定化的P.chrysosporium 在限制碳的培养条件下，在生长期通入纯氧对Lip 的影响不大，无氧不能形Lip 或Mnp ；产酶期通入空气能够满足形成Lip 的要求，且比限制氮培养条件下得到的Lip 还要多。震荡培养会抑制降解酶的产生，静止培养则不利于大量产酶。
1.3.6 木质素降解酶的应用
（1）在造纸行业上的应用[32]
a. 生物制浆。Lac 能在常温环境，选择性地降解木质素而不干扰半纤维素和纤维素，可以提高制浆有效得率并且降低造纸成本。另外，通过漆酶处理的制浆具备良好的抗张强度和平滑度。
b. 生物漂白。通过Lac 进行漂白，能减少氯及氯化物和其他化学漂白剂的用量，还能提升纸浆的白度。Lac 介体体系与聚木糖的相互作用能够处理蔗渣硫酸盐浆，可在一定范围上提高纸浆的强度和漂白度。
c. 废水处理。Lac 可去除漂白废水所具有的毒性，能催化氯酚生成低聚物，聚合产生的不溶沉淀可以经过沉降和过滤筛除。
（2）环境保护
Lac 除了处理造纸业废污水外，还能处理燃料、除草剂、杀菌剂和防腐剂中所含有的酚氯类化合物和苯胺取代物。Lac 也可以进行废水脱色。另外，固体废物如秸秆，禽畜粪便等，由于含有一定量的木质素，大大拖后了堆肥过程中纤维素的降解速度，而延长了发酵时间。所以，筛选分离和培育可降解木质素的优良菌剂可提高木质素的降解速度，减短堆肥发酵周期，提升发酵效率。
（3）其他应用
在食品行业中，Lac 能够净化饮料、检测食品中的抗坏血酸含量；以及在食用菌、医用菌制种过程中加快菌丝吃料，发育，从而缩短培育时间；在饲料工业中，木质素分解酶能够提高动物对饲料的消化率；Lac 还可以用于生物监测；在免疫检测中，Lac 正在被研究代替辣根过氧化物酶，成为新的标记酶。
第二章 实验部分
2.1 实验仪器
电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；紫外可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司TV-1810）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司
DHG-9123A ）；数显pH 计（上海雷磁创益仪器仪表有限公司）；离心机（常州国华电器有限公司80-3）；研磨机（德国IKA ）；高压灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司YM-30）；
光照培养箱（上海精宏实验设备有限公司GZP-250）；冰箱；摇床（上海智诚分析仪器制造有限公司ZHW-2102C ）；无菌操作台（苏州安泰空气技术有限公司SW-CT-2F ）；调温电热器（上海平环燃烧设备有限公司）；数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司HH-4）
2.2 实验试剂及材料
三水合磷酸氢二钾（西陇化工股份有限公司）；七水合硫酸镁（上海美兴化工股份有限公司）；磷酸二氢钾（南京化学试剂有限公司）；二水合氯化钙（上海泗联化工厂有限公司）；硫酸铵（南京化学试剂有限公司）；酵母膏（上海化学试剂公司）；氯化钠（南京化学试剂公司）；秸秆；L-半胱氨酸（上海慧兴生化试剂有限公司）；琼脂（国药集团化学试剂有限公司）；真菌抑制剂-纳他霉素（连云港友进食品添加剂技术开发有限公司）；ABTS （aladdin industrial corporation）；浓硫酸（南京化学试剂有限公司）；柠檬酸（国药集团化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司）；一水合硫酸锰（西陇化工股份有限公司）；木质素；氯化铜（上海振欣试剂厂）；过氧化氢（国药集团化学试剂有限公司）；
2.3 木质素降解细菌的分离与纯化
2.3.1 菌种土壤的采集
菌种土壤采集自南京紫金山山脚，有大量落叶覆盖，干燥土壤表面下20cm 处的土壤。用塑料袋大致装满，贴好标签，放入冰箱保存。
2.3.2 培养基的制备
（1）称量培养基配方（1000mL)
三水合磷酸氢二钾0.2948g ；七水合硫酸镁0.090g ；磷酸二氢钾0.225g ；二水合氯化钙0.030g ；硫酸铵0.225g ；酵母膏0.100g ；氯化钠0.450g ；秸秆粉末15g ；L-半胱氨酸0.5g ；琼脂15g ，蒸馏水1000L
（2）高温灭菌
将20个培养皿，5根试管，1支1mL 移液管，1支三角刮刀，一个250ml 锥形瓶，清洗烘干。向锥形瓶中倒入90mL 蒸馏水，向5根试管里各加入9ml 蒸馏水，做好棉花塞后，
全部用牛皮纸包扎紧后，放入高压灭菌锅，灭菌3h 。
（3）倒平板
取出灭菌后的所有待用仪器于无菌操作台。向已煮1h ，融化并冷却至40℃左右的培养基中加入30mg 的真菌抑制剂，充分搅拌后倒入培养皿（约培养皿容积的一半），倒好的培养皿自然冷却凝固。
（4）稀释水样
将锥形瓶和5根试管排列好，按10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6依次编号，然后稀释。（示意图见图2-1）
（5）平板表面涂布
在无菌操作条件下，从浓度小的10-6菌液开始，吸取1mL 菌液于相应编号的培养皿内，用三角刮刀在平板上涂布均匀，每个浓度做三到四个平皿，每个皿贴好标签。涂布完毕，待菌液自然吸收后，将平板倒置，送恒温培养箱37℃培养三天。
（6）筛除非目的平板
培养好的平板，在无菌条件下观察，将不是以细菌生长为主或菌种生长混乱的平板去除，剩余平板则继续培养。
图2-1 水样稀释示意图
2.3.3 细菌的初步纯种分离
（1）平板的制作
将融化并冷却约至50℃的培养基（配方见2.3.2）倒入培养皿内，使凝固成平板。 （2）平板第一次划线
将新平板在皿底用记号分成4个不同面积的区域，使A 〈B 〈C 〈D ，且夹角为120°左右。然后取出培养好菌种的平板，在无菌操作条件下挑取少量菌样。先划A 区，然后依次划其余区。（示意图见图2-2）
图2-2 划线示意图
每个一次划线过的平板分别取菌种两次到两个新的平板，将划线后的平板贴上标签纸，写好对应序号。然后将新平板放置37℃恒温培养箱，倒置培养3天。良好的结果应在C 区出现部分单菌落，而在D 区出现较多独立分布的单菌落。
2.3.4 细菌的纯种分离
（1）平板的制作
将融化并冷却约至50℃的培养基（配方见2.3.2）倒入培养皿内，使自然冷却凝固成平板。
（2）平板第二次划线
步骤与2.3.4大致相同，划线后的平板贴上标签纸，对应好序号。用保鲜膜包好，放置37℃恒温培养箱，倒置培养3天。
2.3.5 纯种细菌的保种
（1）制作斜面培养基
准备足够的干净的试管，做好棉花塞，排列在试管架上。准确称量培养基并煮过1h （配方参照2.3.2）后，趁热依次倒入各试管（约占试管1/3），塞好棉花塞，用牛皮纸包好
后，用高压灭菌锅灭菌。
（2）斜面接种
将灭菌后的斜面培养基整齐有序地在操作台上摆好斜面，操作台紫外灭菌1h 后，斜面培养基自然冷却凝固。然后进行斜面接种，至接种完毕后，全部试管送37℃恒温培养箱3d 。平板则全部放入冰箱4℃保存。
（3) 斜面低温保藏法
待斜面上的菌充分生长后，将所有试管移入冰箱4℃保存。
2.3.6 液体接种
（1）制作液体培养基
培养基配方（1000mL ）：三水合磷酸氢二钾0.2948g ；七水合硫酸镁0.090g ；磷酸二氢钾0.225g ；二水合氯化钙0.030g ；硫酸铵0.225g ；酵母膏0.100g ；氯化钠0.450g ；L-半胱氨酸0.5g ；，蒸馏水1000mL 。
准备10个干净的250mL 锥形瓶，做好棉花塞。将煮过1h 后的液体培养基冷却至约40℃，加入真菌抑制剂40mg ，充分搅拌。取100mL 液体培养基于第一个锥形瓶，加入1.5g 麦粉，塞好棉塞，搅拌剩余的液体培养基。重复该过程十次，即为1组。共做4组。做好后用牛皮纸依个包扎好，高压灭菌3h 。
（2）液体接种
无菌环境下，取出冰箱中的纯菌种平板进行液体接种，接种后的液体培养全部贴上对应菌种号码的标签，并送入摇床培养，设置摇床温度30℃，转速160r/min,培养3-4d 。
2.4 木质素细菌降解酶的研究
2.4.1 漆酶（Lac ）酶活的测定
Lac 酶活的测定原理为Lac 分解ABTS 的产物为ABTS 自由基，然而在波长420nm 处，ABTS 自由基的吸光系数远大于底物ABTS 。随着ABTS 自由基浓度的增加，吸光度值变大。吸光度值在某一段时间的变化表示为Lac 的活力。采用不同吸光度值变化范围，在某一底物浓度下测定不同稀释倍数时酶液的酶活力，根据酶活力去比那个相应的吸光度值变化范围。为了增加同一漆酶活力的稳定性以及不同漆酶活力的可比性，测定过程尽量要求测定条件一致。吸光度变化过程中，ABTS 浓度不断降低，产物量却不断增加，因而所测
出的吸光度值不断变化。由于反应时间较快，短暂的时间内，反应迅速，测量时大部分只能捕捉到反应尾声或结束时的底物吸光度，但是漆酶酶活较大的菌种底物浓度相较其他菌种的吸光度较大，所以只需要寻找所测细菌中，在波长420nm 处，吸光度较大的细菌菌种即可。
（1）缓冲液的配制
A 液：0.1mol/L柠檬酸溶液1000mL ； B 液：0.1mol/L磷酸氢二钠溶液625mL ；
配制好的A 、B 液混合与2000mL 大烧杯中，插入数显pH 计，控制添加的A 、B 液，使pH 最终在4-5的范围，装入干净试剂瓶中，贴上标签，保存备用。
（2）ABTS 的配置
称取0.0823gABTS （冰箱保存），再加10ml 蒸馏水，最终浓度为1mmol/L，充分溶解，装入棕色试剂瓶，贴好标签，避光保存。
（3）移入底物ABTS
取ABTS 试剂瓶，用移液枪取200μL 于干净试管中，然后再加入缓冲液2780μL 。按此步骤做40个试管，贴好标签，放入恒温水浴锅中，设置温度为30℃。
（4）粗酶液的提取
取出2.3.7中摇床里的所有接种过的液体培养基，在无菌操作条件下，依次取上清液，如取菌28#锥形瓶，将上层清液倒入离心管中，以2500r/min转速离心30min 后，用无菌的塑料滴管吸取离心管上层清液于无菌试管中，试管上做好相应的菌种标记如28#。同一批可以离心6个。根据实际情况，提取粗酶液的菌号为1#、3#、4#、5#、6#、8#、9#、10#、11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、19-1#、20-1#、20-2#、21#、22#、23#、24#、25#、26#、27#、28#、29#、30#、31#、32#、33#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#。按上述步骤操作直到取出所有菌种的粗酶液于试管中。另外做一个空白对照，即不加入酶液，而是缓冲液。
（5）测定
紫外分光光度计设置波长为420nm ，设置10s 取样一次，共6次。取空白对照试管校零。用移液枪吸取粗酶液50μL 于对应的底物试管中，启动反应，注意不碰到试管壁，轻微震荡后将试管中溶液倒入比色皿，立即测4min 内吸光度。记录数据。
（6）注意事项
因为实验实际操作和液体培养基的损坏，粗酶液并不是按序号提取的；水浴时间不超
过5min ；ABTS 试剂在冰箱里保存；比色皿在测量后一定要清洗干净。
2.4.2 锰过氧化物酶(Mnp)酶活的测定
Mnp 酶活力测定原理为二价锰离子是在Mnp 作用下，变成三价锰离子，在波长238nm 处测三价锰离子的吸光值。测定锰过氧化物酶酶活的时候，只需分辨出哪些菌种的锰过氧化物酶的酶活较高即可。此方法可用于连续测定，称为乳酸钠法。
（1）缓冲液的配制
A 液：称取80%~90%乳酸10.6g ，加水定容至1000mL; B 液：称取70%乳酸钠16g ，加水定容至1000mL ；
然后将配制好的A 、B 液取适量混合于2000mL 大烧杯，插入数显pH 计，控制好A 、B 液的添加量，使pH 最终浓度在4-5的范围，即得到所需缓冲液，倒入试剂瓶中，贴好标签，保存待用。
最后配好1.6mmol/L的硫酸锰溶液和1.6mmol/L的过氧化氢溶液，分别贴好标签待用。 （2）粗酶液的提取
酶液的提取过程与漆酶酶活的提取方法相同，根据实际情况，提取粗酶液的菌号为4#、5#、6#、7#、8#、9#、11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、19-1#、20#、20-1#、21#、22#、23#、24#、25#、26#、27#、28#、29#、30#、31#、32#、33#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#。即取40种接种过的液体培养基的上清液，离心后再取上清液，分别装入试管，对应菌种编号。
（3）测定
在4mL 反应体系中含有50mmol/L的乳酸钠缓冲液3.4mL ，1.6mmol/L的硫酸锰溶液0.1mL ，粗酶液0.4mL ，预热至37℃后，加1.6mmol/L的过氧化氢溶液0.1mL 启动反应。在238nm 处用紫外可见分光光度仪测定反应4min 内的吸光光度值（OD ）。记录好数据后，关闭仪器。
2.4.3 木质素提纯
取出实验室存有的粗木质素于700mL 蒸馏水中，溶于2000mL 大烧杯中，加入20%~30%稀硫酸溶液，调节PH 至3，此时出现沉淀，充分搅拌后，将大烧杯中溶液倒入离心杯，准确称量使对应离心杯重量相同，然后用大离心机5000r/min分离沉淀30min 。分离出的沉淀物可继续用20%~30%稀硫酸进行酸洗，然后再用离心机分离沉淀。最后移出纯
木质素与大玻璃皿中，放入60℃真空干燥机中干燥，干燥好的木质素研磨成粉，贴好标签，保存，为同组实验组员所用。
2.4.4 产酶条件的优化
由之前的实验数据得出，菌28#产出的Lac 和Mnp 酶活力相对较高。所以针对菌28#作产酶条件的优化，以得到可实际操作的最佳的产酶条件。
（1）正交试验法
根据实际情况，采用L 9(34) 正交试验表，三个因素及各自水平（见表2-1）：
A: pH 值；B: Cu2+浓度（试剂为CuCl 2·H 2O ）；C: Mn2+浓度（试剂为MnSO 4·H 2O ）
表2-1 试验因素表
其中，PH 的配制步骤为：配制A 液即0.1mol/L柠檬酸溶液、B 液即0.1mol/L磷酸氢二钠溶液。在不同的三个烧杯中分别加入适量A 、B 液，用数显pH 计调pH 使三个烧杯中的pH 分别等于3、4、5。配置好后分别装入试剂瓶，贴好对应标签，保存备用；
将B 因素浓度换算，即B 1，B 2，B 3分别对应称量试剂17.048g ，34.096g ，85.24g ； 将C 因素浓度换算，即C 1，C 2，C 3分别对应称量试剂0.0031g ，0.0062g ，0.0124g 。 （2）液体培养基及接种 配方（见表2-2）
表2-2 液体培养基配方
按照表-2称量3组不同配方与3个500mL 烧杯中，充分搅拌后，测量pH 值，用3个调温电热器分别加热至沸。煮好的1组、2组、3组液体培养基分别用100mL 量筒取100mL 分入经过高压灭菌的9个250mL 锥形瓶，贴好对应标签如A 1。
按照不同因素水平组合，即A 1B 1C 1，A 1B 3C 1，A 1B 3C 3，A 2B 1C 2，A 2B 2C 2，A 3B 1C 3，A 3B 2C 1，A 3B 2C 3，A 3B 3C 2。准确称量试剂CuCl 2·H 2O ，MnSO 4·H 2O 于各锥形瓶中。然后在9个锥形瓶中趁热各加入1g 麦粉，轻微摇晃。
待温度降到30℃左右，在无菌操作条件下，将菌28#进行液体接种，步骤同2.3.7（2），接种后的锥形瓶，放入摇床，设置温度30℃，转速160r/min，培养3天。
（3）测量Lac 及Mnp 酶活
步骤与2.4.1和2.4.2大致相同，记录测量结果，比较出最优的产酶条件。
第三章 结果与讨论
3.1木质素降解细菌的分离
3.2 漆酶酶活
(1）根据实验数据，除去由于操作原因而得到的负吸光度，即菌号5#、8#、10#、11#、15#、19#、20-1#、21#、22#、23#、29#、30#、35#、36#、38#、40#。其余值见表3-1；
表3-1 漆酶吸光度
时间 1# 3# 4#
10s 0.017 0.010 0.029
20s 0.016 0.009 0.027
30s 0.016 0.009 0.024
40s 0.016 0.008 0.021
50s 0.016 0.008 0.018
60s 0.016 0.008 0.016
70s 0.014
80s 0.012
6# 9# 12# 时间 13# 14# 16# 17# 18# 19-1# 20-2# 24# 25# 26# 27# 28# 31# 32# 33# 34# 37# 39#
0.008 0.008 0.017 10s 0.017 0.010 0.016 0.008 0.004 0.004 0.008 0.030 0.015 0.011 0.017 0.077 0.010 0.017 0.013 0.006 0.030 0.021
0.007 0.007 0.016 20s 0.016 0.009 0.013 0.007 0.004 0.004 0.008 0.029 0.015 0.010 0.016 0.076 0.009 0.016 0.012 0.004 0.031 0.021
0.007 0.007 0.016 30s 0.015 0.009 0.013 0.007 0.004 0.004 0.008 0.029 0.015 0.010 0.016 0.075 0.009 0.015 0.012 0.004 0.030 0.020
0.007 0.007 0.015 40s 0.015 0.008 0.011 0.006 0.003 0.004 0.008 0.029 0.015 0.010 0.016 0.074 0.009 0.015 0.012 0.004 0.030 0.020
0.006 0.006 0.015 50s 0.015 0.008 0.011 0.006 0.003 0.004 0.008 0.029 0.015 0.010 0.016 0.074 0.009 0.014 0.011 0.004 0.030 0.020
0.006 0.006 0.015 60s 0.014 0.008 0.011 0.006 0.003 0.004 0.008 0.029 0.015 0.010 0.016 0.074 0.008 0.014 0.011 0.004 0.030 0.020
0.006 0.006 0.015 70s 0.014 0.008 0.010 0.006 0.003 0.008 0.029 0.014 0.010 0.074 0.008 0.014 0.011 0.003 0.030 0.020
0.006 0.006 0.014 80s 0.014 0.008 0.010 0.006 0.003 0.008 0.029 0.014 0.010 0.074 0.008 0.014 0.010 0.003 0.030 0.020
由表3-1可以发现，漆酶吸光度较高的额菌种有4#、24#、25#、28#、37#、39#，而吸光度变化均很小，且都是下降的趋势，可以以此推测菌产漆酶的活性可能都不高，甚至没有活性。
3.2 锰过氧化物酶活
（1）根据实验数据，除去由操作原因而得到的负吸光度，即菌号21。其余吸光度值见表3-2；
表3-2 锰过氧化物酶吸光度值
时间 15s 4# 0.51 时间 15s 5# 0.637 6# 0.481 7# 0.434 8# 0.538 9# 0.639 11# 0.636 12# 0.640 13# 0.642 14# 0.558 15# 0.642 16# 0.531 17# 0.467 18# 0.638 19# 0.637 19-1# 0.653 20# 0.637 20-1# 0.379 22# 0.640 23# 0.394 24# 0.432 25# 0.436 26# 0.638 27# 0.482 28# 0.554 29# 0.435 30# 0.639 31#
0.358
30s 45s 0.51 0.51 30s 45s 0.636 0.636 0.477 0.476 0.434 0.434 0.358 0.358 0.638 0.638 0.636 0.636 0.640 0.640 0.642 0.642 0.558 0.558 0.642 0.642 0.531 0.531 0.464 0.465 0.638 0.637 0.638 0.638 0.653 0.653 0.637 0.636 0.377 0.377 0.640 0.639 0.395 0.395 0.432 0.431 0.436 0.436 0.638 0.638 0.481 0.481 0.553 0.554 0.434 0.435 0.639 0.639 0.358
0.358 60s 75s 0.51 0.509 60s 75s 0.636 0.636 0.476 0.476 0.434 0.434 0.358 0.358 0.638 0.638 0.636 0.637 0.640 0.640 0.642 0.642 0.558 0.558 0.642 0.642 0.530 0.530 0.464 0.463 0.637 0.637 0.637 0.636 0.653 0.653 0.637 0.637 0.377 0.377 0.639 0.639 0.395 0.395 0.431 0.431 0.436 0.436 0.638 0.638 0.481 0.481 0.554 0.553 0.435 0.435 0.639 0.639 0.358
0.358
90s 0.509 90s 0.636 0.477 0.434 0.358 0.638 0.637 0.640 0.642 0.558 0.641 0.531 0.465 0.638 0.637 0.653 0.637 0.377 0.639 0.395 0.431 0.436 0.638 0.481 0.553 0.435 0.639 0.358
32# 33# 时间 34# 35# 36# 37# 38# 39# 40#
0.454 0.643 15s 0.647 0.638 0.637 0.649 0.636 0.477 0.652
0.450 0.643 30s 0.646 0.638 0.637 0.649 0.636 0.477 0.651
0.449 0.644 45s 0.646 0.638 0.637 0.649 0.636 0.476 0.651
0.449 0.644 60s 0.646 0.638 0.638 0..648 0.636 0.477 0.651
0.449 0.643 75s 0.646 0.638 0.637 0.649 0.636 0.477 0.651
0.448 0.463 90s 0.647 0.638 0.637 0.648 0.636 0.477 0.651
由表-2可以发现，锰过氧化物酶吸光度较高的菌号有5#、9#、11#、12#、13#、14#、15#、18#、19#、20#、22#、26#、28#、30#、33#、34#、35#、36#、37#、38#、40#。但是吸光度变化量也很小，且都是呈下降趋势，可以推测其酶活力也不高，甚至没有活性；与表-1结合比较可以看出，一种菌产的漆酶吸光度比较高的，锰过氧化物酶吸光度也高，但是锰过氧化物酶吸光度高的，漆酶吸光度不一定也高；同时发现，菌28的漆酶吸光度和锰过氧化物吸光度均比较具有代表性，所以后续的产酶优化是针对菌28所做。
3.3 正交试验漆酶酶活
（1）菌28在正交试验条件下的吸光度（OD ）值见表3-3；
表3-3 正交试验漆酶吸光度
时间 A 1B 1C 1 A 1B 3C 1 A 2B 1C 2 A 2B 2C 2 A 3B 2C 3 A 3B 2C 1 A 3B 1C 3 A 3B 3C 2
10s 0.030 0.202 0.035 0.030 0.054 0.054 0.027 0.109
20s 0.030 0.204 0.036 0.031 0.051 0.054 0.028 0.110
30s 0.030 0.205 0.037 0.032 0.050 0.055 0.028 0.112
40s 0.031 0.207 0.037 0.033 0.048 0.056 0.029 0.113
50s 0.031 0.208 0.038 0.035 0.048 0.057 0.029 0.114
60s 0.032 0.209 0.039 0.036 0.048 0.058 0.030 0.115
变化量 +0.002 +0.007 +0.004 +0.006 -0.006 +0.004 +0.003 +0.006
斜率 1/3000 7/6000 1/1500 1/1000 -1/1000 1/1500 1/2000 1/1000
A 1B 3C 3 0.111 0.113 0.114 0.115 0.116 0.117 +0.006 1/1000
由表3-3和表3-1结合可以看出，在改变了产酶条件的情况下，菌28可能在A 1B 3C 1条件下所产漆酶量最大，A 3B 1C 3条件下产酶最少，A 3B 3C 2、A 1B 3C 3条件下产酶量菌增加，其余条件下产酶则反而减小；A 3B 2C 3条件下的吸光度变化呈下降趋势，说明此条件不适于产酶，而其余条件下，吸光度变化量均呈上升趋势，其中A 1B 3C 1条件下，吸光度变化量最大，可以推测这个条件下产的漆酶酶活最高。
直观分析见表3-4。表中K =∑yi ，如Kj1=1/3000+1/1000+7/6000=1/400；R 为极差。
i =19
表3-4 正交试验计算表
R 值越大，表示因素ABC 所起作用越大，由表3-4可以得出，影响因素B>A>C；Kj1平均值最大，Kj3平均值最大，即在pH=3，Cu 2+浓度=5mo/100mL下为最优，所以最优组
合搭配为A 1B 3C 1，A 1B 3C 3，A 1B 3C 2。
3.4 正交试验锰过氧化物酶活
（1）吸光度（OD ）值见表3-5
表3-5 正交试验锰过氧化物酶吸光度
时间 A 1B 1C 1 A 1B 3C 1 A 2B 1C 2 A 2B 2C 2 A 3B 2C 3 A 3B 2C 1 A 3B 1C 3 A 3B 3C 2 A 1B 3C 3
15s 1.263 2.024 2.084 2.030 2.051 2.117 2.046 2.086 2.007
30s 1.268 2.024 2.080 2.028 2.050 2.112 2.048 2.087 2.004
45s 1.266 2.021 2.082 2.025 2.050 2.110 2.045 2.085 2.003
60s 1.258 2.022 2.080 2.026 2.047 2.108 2.046 2.085 2.005
75s 1.259 2.019 2.075 2.027 2.047 2.106 2.0435 2.083 2.005
90s 1.256 2.023 2.079 2.027 2.046 2.107 2.043 2.080 2003
105s 1.252 2.019 2.078 2.023 2.044 2.103 2.043 2.082 2.005
120s 1.254 2.019 2.079 2.026 2.043 2.104 2.049 2.082 2.002
由表3-4可以发现，测出的锰过氧化物吸光度变化并不是单一的下降或升高趋势；与表3-2比较可以得出，所有正交实验条件下的锰过氧化物吸光度均大于普通条件下所测吸光度，其中以组合A 2B 1C 2、A 3B 2C 1和A 3B 3C 2最优，实验因素影响大小关系为因素A>因素C>因素B ，即影响菌28产酶条件最主要的因素为pH 大小和锰离子浓度的大小，其次是铜离子的大小。
3.5 小结
（1）由表3-1和表3-2比较可知，一个菌种，如果其对应漆酶吸光度高，那么其对应锰过氧化物吸光度也高；而锰过氧化物吸光度高的，其对应漆酶吸光度不一定高；
（2）由表3-2和表3-5比较可知，菌28在正交试验条件下所测的所有锰过氧化物酶吸光度均大于普通培养条件下所测吸光度；由表3-1和表3-3比较可知，菌28在正交条件下所测漆酶的部分吸光度明显高于普通培养条件下所测吸光度，而有些则反而低，说明正交试验中，部分组合因素能大量促进漆酶的产生，部分则反而抑制漆酶的产生。
（3）表3-1，表3-2，表3-3，表3-5表明，测出的吸光度变化量都很小，说明细菌产出的酶活活性都不高；表3-4表明，影响28号菌产酶条件的最主要的影响因素为铜离子的浓度，其次是pH 的影响。
（4）将实验结果与白腐菌实验结果比较，白腐真菌产酶的最适pH 范围为4~5。二价锰离子的浓度在0~40mg/L范围；浓度越高越有利于Mnp 的合成，当二价锰离子浓度大于200mg/L时，酶活力下降。二价铜离子的浓度在0~5mol/L范围内，酶活力随二价铜离子浓度的增加迅速提高，当大于10mol/L后，酶活力降低。而本实验得出的结果PH 为3~5之间，铜离子浓度在1~5mol/100mL范围内，浓度越高酶活越高，锰离子浓度在0~40mg/100mL范围内，浓度越高酶活越高。所得实验结果与白腐真菌的实验结果相差不大。
（4）实验中有些部分，因为实验条件和设备的限制，并没有完全按照参考文献的步骤，而选择进行改变，所以可能出现实验数据的不合理或偏差。
（5）因为实验是从3月到5月份，期间气温从低到高，而除去在摇床中培养的时间之外，有部分时间，液体培养基是放置室温条件下的，所以可能会受到气温的影响而对细菌产酶造成干扰。
第四章结论与展望
结论：
（1）正交试验下，A 1B 3C 1、A 1B 3C 3、A 1B 3C 2件为最优条件，其中A 1B 3C 1下所产漆酶量最大；A 3B 1C 3条件下产酶最少；其余条件下产酶则反而受到抑制。
（2）正交试验下，所有条件都使产锰过氧化物酶增加。
（3）不论是普通培养条件还是正交试验培养条件下，菌28生产的漆酶和锰过氧化物酶的酶活均很低。
展望：
（1）正交试验中，研究的因素包括了pH ，Cu 2+，Mn 2+。在这些因素的交互作用下，得到了能有效促进产酶的组合方式。那么，如果在增加一个因素，比如温度，则可能会出现更好的培养条件；或者仅仅只是改变单个因素，如只是改变金属离子的浓度这个条件，产酶效果也会发生变化。
（2）实验中所提取的粗酶液均为胞外酶液，但是酶活力都不高，而如果通过超声破碎微生物提取胞内酶，则可能酶活力会比较高。
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