摘要：目的确定冠心益寿丸（浓缩丸）的最佳提取工艺。方法采用正交试验法，参照《中华人民共和国药典》2015 年版一部的相关规定，采用薄层色谱法对醇提物中丹参、白芍的有效成分及水提物中当归、山楂的有效成分鉴别，优选冠心益寿丸醇提及水提工艺。结果在综合考虑醇提中丹参和白芍主要有效成分含量的情况下选取加60%乙醇水8倍量在80℃条件下提取1 h作为醇提的最优工艺条件；选取加水8倍量，每次提取1 h，共提取2次作为水提的最优工艺条件。 关键词：冠心益寿丸；提取工艺；薄层色谱法 中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）10-0075-03 近年来，冠心病已位于致死疾病之首，因而受到全球医学界的密切关注。冠心病术后冠脉再狭窄（RS）率高，可达20%～30%，因此，冠心病术后再狭窄防治成为冠心病治疗的难点和热点[1]。中医学认为冠脉介入术后再狭窄属中医“胸痹”、“心痛”、“真心痛”的范畴，由心脉痹阻引起，为血瘀证，介入术只是解决局部病变，其机械损伤致新的瘀血形成[2]，患者的体质与病机没有改变，尚需整体调治。 冠心益寿丸源自本院名老中医来春茂的经验方，临床应用20余年，以益气化瘀为主，临床对治疗冠脉介入术后再狭窄具有显著疗效。对冠心病的治疗具有独特疗效。前期研究表明冠心益寿丸能明显改善或消除冠心病人的临床症状，显著减少心绞痛的发作次数及缩短心绞痛的持续时间并使患者心电图ST-T得到显著改善，长期服用能明显降低总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）值[3]。由于传统汤剂存在着服用及携带不方便等多种不足，将汤剂改成体积小、携带方便，不添加任何防腐剂并能保持中药天然特色的浓缩丸将更加便于临床应用，方便患者服用，提高患者依从性。本文依据浓缩丸的剂型特点和质量要求，对冠心益寿丸的药材提取工艺进行了研究，通过薄层色谱法对当归、山楂、丹参、白芍的检测确定了最佳提取工艺。 1仪器与试药 1.1实验设备水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司，DZKW-3-4），电子分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司，FA2001B）。 1.2药材与试剂阿魏酸对照品（批号：110773），熊果酸对照品（批号：110742），丹参酮ⅡA对照品（批号：110766），芍药苷对照品（批号：110736），当归对照药材（批号：120927）（供薄层色谱鉴定用，均购自云南省药品检验所）。本实验所用试剂均为分析纯，药材均购自云南泰华丰功中药饮片公司，符合中国药典2015年版相关规定。 2方法与结果 综合考虑处方中各药的有效成分及极性，为保证处方药效不变，且最大限度地确保有效成分的提取，本研究在保留了原水提工艺的基础上成分提取前移，将方中黄芪、丹参、白芍按方中比例先进行醇提，再将药渣与方中其他药材按比例合并进行水提。 2.1醇提因素水平选择本实验在预实验考察的基础上，采用正交试验优化醇提工艺，选取醇浓度（A），提取时间（B），提取温度（C）作为考察因素，各因素取3个水平，以L9（34）正交试验表安排实验，筛选最佳醇提工艺条件，因素水平见表1。 2.1.2丹参的TLC鉴别取丹参酮ⅡA对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液作为对照品溶液10号。照薄层色谱法（《中国药典》2015版）试验，分别吸取对照品溶液及供试品溶液各5 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（6：4：8：1：4）为展开剂，展开，展至约4 cm，取出，晾干，再以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，展至约8 cm，取出，晾干，分别在日光及紫外光灯（365 nm）下检视（日光下检视见图1，紫外光灯下检视见图2）。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。 2.1.3白芍的TLC鉴别取芍药苷对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液作为对照品溶液10号。照薄层色谱法（《中国药典》2015版）试验，分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰（见图3）。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。 2.2醇提工艺选择结果根据图1可以看出，在日光下检视时1～3号样品斑点显示最为清晰，其余样品无明显差别；根据图2可以看到，6、7号样品斑点最为明显；根据图3可以看到5～7号样品斑点显示最为清晰。在综合考虑醇提中丹参和白芍主要有效成分含量的情况下选取7号实验条件（A1B3C3），即60%乙醇在80℃条件下提取1 h作为醇提的最优工艺条件。 2.3水提因素水平选择本实验在预实验考察的基础上，采用正交试验优化水提工艺，选取加水量（A），提取时间（B），提取次数（C）作为考察因素，各因素取3个水平，以L9（34）正交试验表安排实验，筛选最佳水提工艺条件，因素水平见表2. 提取次数/次1611281.52310232.3.1提取样品的制备称取处方量七味药材9份，合并醇提后的三味药材共220 g。按表2实验条件设计9组水提实验A1B1C1，A2B3C1，A3B2C1，A1B2C2，A2B1C2，A3B3C2，A1B3C3，A2B2C3，A3B1C3，并编号1～9。将1～9号提取液浓缩至约50 mL后分2次加入40 mL乙酸乙酯萃取，取上层液，合并2次萃取液加入20 mL水再次萃取，取上层液。将萃取液水浴蒸干，残渣以1 mL甲醇溶解作为供试品溶液1～9号。 2.3.2当归的TLC鉴别 2.3.2.1阿魏酸对照品鉴别当归取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg阿魏酸的溶液作为对照品溶液10号。照薄层色谱法（《中国药典》2015版）试验，分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4：1：1：0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视（见图4）。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。 2.3.2.2当归对照药材鉴别当归取当归对照药材0.5 g，加乙醚20 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇使溶解，作为对照药材溶液10号。照薄层色谱法（《中国药典》2015版）试验，分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视（见图5）。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。 2.3.3山楂的TLC鉴别取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液10号。照薄层色谱法（《中国药典》2015版）试验，分别吸取对照品溶液及供试品溶液各4 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20：4：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，在80℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点（见图6）；置紫外光灯（365 nm）下检视，显相同的橙黄色荧光斑点（见图7）。 2.4水提工艺选择结果根据图4可以看出，用阿魏酸检测当归时5，6，7，9号样品斑点显示最清晰；根据图5可以看出，用当归对照药材检测当归时5，7，9号样品斑点显示最清晰；根据图6和图7可以看出，在5、7、8、9号实验条件下斑点最为明显。在综合考虑时间和经济成本的情况下，我们选取最为节省时间和水量的5号实验条件（A2B1C2），即加8倍水量，每次提取1小时，共提取2次作为水提的最优工艺条件。 3讨论 冠心益寿丸从前在本院应用时采用全粉入药制成大蜜丸，现已越来越不符合中药现代化的发展要求，其体积大，有效成分含量低，影响人体吸收等缺点显而易见。而且在制备过程中极易染菌，影响产品质量。本研究将冠心益寿丸制成每克含原生药材2 g的浓缩丸将克服大蜜丸不易服用，难以储存的缺点，更加便于临床使用。由于方中既有醇溶性成份又有水溶性成份，根据处方中各药的有效成分及其极性，设计相应的提取方法，最大程度地确保有效成分提取率成为冠心益寿丸研制中的关键性问题。本研究通过正交试验，采用薄层色谱法建立了丹参，白芍，当归的鉴别方法，确定冠心益寿丸的最佳提取工艺参数，做到工艺科学，合理，确保各药味主要有效成分的富集，为冠心益寿丸（浓缩丸）的成型工艺及质量标准研究打下了坚实的基础。不足之处在于设计工艺中仅有TLC进行定性鉴别，没有采用HPLC（高效液相色谱法）对有效成分进行定量，在后期实验中会考虑加入HPLC，使本实验数据更加合理完善。 参考文献： [1]王昀，颜乾麟，沈雅静.论冠脉介入术后再狭窄的中医药防治思路[J].中医杂志，2007，48（6）：552-554. [2]贾海忠.冠状动脉成形术后再狭窄的辨识及对策[J].中医杂志，2001，42（8）：494～496. [3]曹东，来圣吉，来圣丽，等.冠心益寿丸治疗冠心病318例疗效总结[J].云南中医中药杂志，1995，16（6）：32-33. [4]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2015年版（一部）.北京：化学工业出版社，2010；37，76，105，133.
摘要：目的确定冠心益寿丸（浓缩丸）的最佳提取工艺。方法采用正交试验法，参照《中华人民共和国药典》2015 年版一部的相关规定，采用薄层色谱法对醇提物中丹参、白芍的有效成分及水提物中当归、山楂的有效成分鉴别，优选冠心益寿丸醇提及水提工艺。结果在综合考虑醇提中丹参和白芍主要有效成分含量的情况下选取加60%乙醇水8倍量在80℃条件下提取1 h作为醇提的最优工艺条件；选取加水8倍量，每次提取1 h，共提取2次作为水提的最优工艺条件。 关键词：冠心益寿丸；提取工艺；薄层色谱法 中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）10-0075-03 近年来，冠心病已位于致死疾病之首，因而受到全球医学界的密切关注。冠心病术后冠脉再狭窄（RS）率高，可达20%～30%，因此，冠心病术后再狭窄防治成为冠心病治疗的难点和热点[1]。中医学认为冠脉介入术后再狭窄属中医“胸痹”、“心痛”、“真心痛”的范畴，由心脉痹阻引起，为血瘀证，介入术只是解决局部病变，其机械损伤致新的瘀血形成[2]，患者的体质与病机没有改变，尚需整体调治。 冠心益寿丸源自本院名老中医来春茂的经验方，临床应用20余年，以益气化瘀为主，临床对治疗冠脉介入术后再狭窄具有显著疗效。对冠心病的治疗具有独特疗效。前期研究表明冠心益寿丸能明显改善或消除冠心病人的临床症状，显著减少心绞痛的发作次数及缩短心绞痛的持续时间并使患者心电图ST-T得到显著改善，长期服用能明显降低总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）值[3]。由于传统汤剂存在着服用及携带不方便等多种不足，将汤剂改成体积小、携带方便，不添加任何防腐剂并能保持中药天然特色的浓缩丸将更加便于临床应用，方便患者服用，提高患者依从性。本文依据浓缩丸的剂型特点和质量要求，对冠心益寿丸的药材提取工艺进行了研究，通过薄层色谱法对当归、山楂、丹参、白芍的检测确定了最佳提取工艺。 1仪器与试药 1.1实验设备水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司，DZKW-3-4），电子分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司，FA2001B）。 1.2药材与试剂阿魏酸对照品（批号：110773），熊果酸对照品（批号：110742），丹参酮ⅡA对照品（批号：110766），芍药苷对照品（批号：110736），当归对照药材（批号：120927）（供薄层色谱鉴定用，均购自云南省药品检验所）。本实验所用试剂均为分析纯，药材均购自云南泰华丰功中药饮片公司，符合中国药典2015年版相关规定。 2方法与结果 综合考虑处方中各药的有效成分及极性，为保证处方药效不变，且最大限度地确保有效成分的提取，本研究在保留了原水提工艺的基础上成分提取前移，将方中黄芪、丹参、白芍按方中比例先进行醇提，再将药渣与方中其他药材按比例合并进行水提。 2.1醇提因素水平选择本实验在预实验考察的基础上，采用正交试验优化醇提工艺，选取醇浓度（A），提取时间（B），提取温度（C）作为考察因素，各因素取3个水平，以L9（34）正交试验表安排实验，筛选最佳醇提工艺条件，因素水平见表1。 2.1.2丹参的TLC鉴别取丹参酮ⅡA对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液作为对照品溶液10号。照薄层色谱法（《中国药典》2015版）试验，分别吸取对照品溶液及供试品溶液各5 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（6：4：8：1：4）为展开剂，展开，展至约4 cm，取出，晾干，再以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，展至约8 cm，取出，晾干，分别在日光及紫外光灯（365 nm）下检视（日光下检视见图1，紫外光灯下检视见图2）。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。 2.1.3白芍的TLC鉴别取芍药苷对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液作为对照品溶液10号。照薄层色谱法（《中国药典》2015版）试验，分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰（见图3）。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。 2.2醇提工艺选择结果根据图1可以看出，在日光下检视时1～3号样品斑点显示最为清晰，其余样品无明显差别；根据图2可以看到，6、7号样品斑点最为明显；根据图3可以看到5～7号样品斑点显示最为清晰。在综合考虑醇提中丹参和白芍主要有效成分含量的情况下选取7号实验条件（A1B3C3），即60%乙醇在80℃条件下提取1 h作为醇提的最优工艺条件。 2.3水提因素水平选择本实验在预实验考察的基础上，采用正交试验优化水提工艺，选取加水量（A），提取时间（B），提取次数（C）作为考察因素，各因素取3个水平，以L9（34）正交试验表安排实验，筛选最佳水提工艺条件，因素水平见表2. 提取次数/次1611281.52310232.3.1提取样品的制备称取处方量七味药材9份，合并醇提后的三味药材共220 g。按表2实验条件设计9组水提实验A1B1C1，A2B3C1，A3B2C1，A1B2C2，A2B1C2，A3B3C2，A1B3C3，A2B2C3，A3B1C3，并编号1～9。将1～9号提取液浓缩至约50 mL后分2次加入40 mL乙酸乙酯萃取，取上层液，合并2次萃取液加入20 mL水再次萃取，取上层液。将萃取液水浴蒸干，残渣以1 mL甲醇溶解作为供试品溶液1～9号。 2.3.2当归的TLC鉴别 2.3.2.1阿魏酸对照品鉴别当归取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg阿魏酸的溶液作为对照品溶液10号。照薄层色谱法（《中国药典》2015版）试验，分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4：1：1：0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视（见图4）。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。 2.3.2.2当归对照药材鉴别当归取当归对照药材0.5 g，加乙醚20 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇使溶解，作为对照药材溶液10号。照薄层色谱法（《中国药典》2015版）试验，分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视（见图5）。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。 2.3.3山楂的TLC鉴别取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液10号。照薄层色谱法（《中国药典》2015版）试验，分别吸取对照品溶液及供试品溶液各4 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20：4：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，在80℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点（见图6）；置紫外光灯（365 nm）下检视，显相同的橙黄色荧光斑点（见图7）。 2.4水提工艺选择结果根据图4可以看出，用阿魏酸检测当归时5，6，7，9号样品斑点显示最清晰；根据图5可以看出，用当归对照药材检测当归时5，7，9号样品斑点显示最清晰；根据图6和图7可以看出，在5、7、8、9号实验条件下斑点最为明显。在综合考虑时间和经济成本的情况下，我们选取最为节省时间和水量的5号实验条件（A2B1C2），即加8倍水量，每次提取1小时，共提取2次作为水提的最优工艺条件。 3讨论 冠心益寿丸从前在本院应用时采用全粉入药制成大蜜丸，现已越来越不符合中药现代化的发展要求，其体积大，有效成分含量低，影响人体吸收等缺点显而易见。而且在制备过程中极易染菌，影响产品质量。本研究将冠心益寿丸制成每克含原生药材2 g的浓缩丸将克服大蜜丸不易服用，难以储存的缺点，更加便于临床使用。由于方中既有醇溶性成份又有水溶性成份，根据处方中各药的有效成分及其极性，设计相应的提取方法，最大程度地确保有效成分提取率成为冠心益寿丸研制中的关键性问题。本研究通过正交试验，采用薄层色谱法建立了丹参，白芍，当归的鉴别方法，确定冠心益寿丸的最佳提取工艺参数，做到工艺科学，合理，确保各药味主要有效成分的富集，为冠心益寿丸（浓缩丸）的成型工艺及质量标准研究打下了坚实的基础。不足之处在于设计工艺中仅有TLC进行定性鉴别，没有采用HPLC（高效液相色谱法）对有效成分进行定量，在后期实验中会考虑加入HPLC，使本实验数据更加合理完善。 参考文献： [1]王昀，颜乾麟，沈雅静.论冠脉介入术后再狭窄的中医药防治思路[J].中医杂志，2007，48（6）：552-554. [2]贾海忠.冠状动脉成形术后再狭窄的辨识及对策[J].中医杂志，2001，42（8）：494～496. [3]曹东，来圣吉，来圣丽，等.冠心益寿丸治疗冠心病318例疗效总结[J].云南中医中药杂志，1995，16（6）：32-33. [4]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2015年版（一部）.北京：化学工业出版社，2010；37，76，105，133.