实验 胃蛋白酶片的测定
实验目的：掌握以胃蛋白酶测定法测定胃蛋白酶片中胃蛋白酶的效价。
实验原理：精密称取本品适量，加盐酸溶液制成每1mL 中约含0.2-0.4个单位的溶液，照胃蛋白酶测定法，测定胃蛋白酶的效价。
实验部分：
1. 材料与设备
血红蛋白试液、三氟醋酸溶液、盐酸溶液
紫外可见分光光度计
2. 操作步骤
1）. 供试品溶液的制备
取本品5片，置研钵中，加盐酸溶液少许，研磨均匀，移至250mL 量瓶中，加上述盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密称取适量，用上述盐酸溶液稀释制成每1mL 中约含0.2-0.4个单位的溶液，作为供试品溶液。
2）. 对照品溶液的制备
精密称取酪氨酸对照品适量，加盐酸溶液稀释制成每1mL 中约含0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。
3）供试品的测定
取大小相同的试管6支，其中3支精密加入对照品溶液1mL ，另3支精密加入供试品溶液1mL ，置37℃±0.5℃水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5mL ，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟，立即精密加入5%三氟醋酸溶液5mL ，摇匀，滤过，取续滤液备用。另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5mL ，置37℃±0.5℃水浴中保温10分钟，再精密加入5%三氟醋酸溶液5mL ，其中一支加供试品溶液1mL ，另一支加上述盐酸溶液1mL ，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照紫外-可见分光光度法，在275nm 的波长处测定吸光度，按下列公式计算，即得。
注意事项：
思考题：
实验 三磷酸腺苷二钠片总核苷酸含量测定
实验目的：掌握以胃蛋白酶测定法测定胃蛋白酶片中胃蛋白酶的效价。
实验原理：精密称取本品适量，加盐酸溶液制成每1mL 中约含0.2-0.4个单位的溶液，照胃蛋白酶测定法，测定胃蛋白酶的效价。
实验部分：
1. 材料与设备
血红蛋白试液、三氟醋酸溶液、盐酸溶液
紫外可见分光光度计
2. 操作步骤
1）. 供试品溶液的制备
取本品5片，置研钵中，加盐酸溶液少许，研磨均匀，移至250mL 量瓶中，加上述盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密称取适量，用上述盐酸溶液稀释制成每1mL 中约含0.2-0.4个单位的溶液，作为供试品溶液。
2）. 对照品溶液的制备
精密称取酪氨酸对照品适量，加盐酸溶液稀释制成每1mL 中约含0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。
3）供试品的测定
取大小相同的试管6支，其中3支精密加入对照品溶液1mL ，另3支精密加入供试品溶液1mL ，置37℃±0.5℃水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5mL ，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟，立即精密加入5%三氟醋酸溶液5mL ，摇匀，滤过，取续滤液备用。另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5mL ，置37℃±0.5℃水浴中保温10分钟，再精密加入5%三氟醋酸溶液5mL ，其中一支加供试品溶液1mL ，另一支加上述盐酸溶液1mL ，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照紫外-可见分光光度法，在275nm 的波长处测定吸光度，按下列公式计算，即得。
注意事项：
思考题：
实验七 药物的一般杂质检查
一、实验目的：
1. 掌握药物的一般杂质检查原理与实验方法。
2. 熟悉一般杂质检查项目与意义。
二、实验原理：
药物的一般杂质：是指在自然界中分布较广泛，在多种药物的生产和贮藏过程中容易引入的杂质，如酸、碱、水分、氯化物、硫酸盐、砷盐、铁盐、重金属等。
1. 比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比浊法是指测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，本法主要是用于测定能形成悬浮体的沉淀物质。
a 、酸碱度检查：是用药典规定的方法对药物中的酸度、碱度及酸碱度等酸碱性杂质进行检查。检查时应以新沸并放冷至室温的水为溶剂。不溶于水的药物，可用中性乙醇等有机溶剂溶解。常用的方法有酸碱滴定法，指示剂法以及pH 值测定法。
b 、氯化物检查法：氯化物在硝酸溶液中与硝酸银作用，生成氯化银沉淀而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠溶液和硝酸银在同样条件下用同法处理生成的氯化银浑浊程度相比较，测定供试品中氯化物的限量。
反应离子方程式：Cl + Ag → AgCl↓（白色）
c 、铁盐检查法：三价铁盐在硝酸酸性溶液中与硫氰酸盐生成红色可溶性的硫氰酸铁络离子，与一定量标准铁溶液用同法处理后进行比色。
反应离子方程式：Fe + 3SCN → Fe（SCN ）3（红棕色）。
2. 限量计算:杂质限量%=((V
准3+--+标准×C 标准)/W样) ×100%。式中V 标准为标准液体积，C 标为标准液浓度，W 样为样品取样量。
三、实验内容：
1. 实验材料、设备：
葡萄糖、氯化钠原料药。
25ml 、50mL 纳氏比色管、刻度吸管、电子天平。
2. 实验操作步骤：
（一）葡萄糖
1、酸度
取本品2.0g ，加水20mL 溶解后，加酚酞指示液3滴与氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）0.20mL ，应显粉红色。
2、溶液的澄清度与颜色
取本品5g ，加热水溶解后，放冷，用水稀释至10mL ，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（附录H ）比较，不得更浓；如显色，与对照液（取比色用氯化钴液3mL 、比色用重铬酸钾液3mL 与比色用硫酸铜液6mL ，加水稀释成50mL ）1.0mL 加水稀释至10mL 比较，不得更深。
3、乙醇溶液的澄清度
取本品1.0g ，加90%乙醇30mL ，置水浴上加热回流约10分钟，溶液应澄清。
4、氯化物
取本品0.6g ，加水溶解使成25mL ，再加稀硝酸10mL ；溶液如不澄清，应滤过；置50mL 纳氏比色管中，加水使成约40mL ，摇匀，即得供试溶液。另取标准氯化钠溶液6.0mL ，置50mL 纳氏比色管中，加稀硝酸10mL ，加水使成40mL ，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0mL ，用水稀释，使成50mL ，摇匀，在暗处放置5分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较。供试溶液所显浑浊度不得较对照液更浓（0.01%）。
5、干燥失重
取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过9.5%。
6、硫酸盐
取本品2.0g ，加水溶解使成约40mL ；溶液如不澄清，应滤过；置50mL 纳氏比色管中，加稀盐酸2mL ，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液2.0mL ，置50mL 纳氏比色管中，加水使成约40mL ，加稀盐酸2mL ，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液5mL ，用水稀释至50mL ，充分摇匀，放置10分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较。供试溶液所显浑浊度不得较对照液更浓（0.01%）。
7、亚硫酸盐与可溶性淀粉
取本品1.0g ，加水10mL 溶解后，加碘试液1滴，应即显黄色。
8、铁盐
取本品2.0g ，加水20mL 溶解后，加硝酸3滴，缓缓煮沸5分钟，放冷，加水稀释使成45mL ，加硫氰酸铵溶液（30→100）3mL ，摇匀，如显色，与标准铁溶液2.0mL 用同一方法制成的对照液比较，不得更深（0.001%）。
9、 蛋白质
取本品 1.0g ，加水 10ml 溶解后，加磺基水杨酸溶液（1→5）3ml ，不得发生沉淀。
（二）氯化钠杂质检查
1、溶液的澄清度
取本品5.0g ，加水25ml 溶解后，溶液应澄清。
2、碘化物
取本品的细粉5.0g ，置瓷蒸发皿内，滴加新配制的淀粉混合液适量使晶粉湿润，置日光下（或日光灯下）观察，5分钟内晶粒不得显蓝色痕迹。
3、硫酸盐
取本品5.0g ，加水溶解成约40ml （溶解如显碱性，可滴加盐酸使成中性），溶液如不澄清，应滤过，置50ml 纳氏比色管中，加稀盐酸2ml ，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液1.0ml 置50ml 纳氏比色管中，加水使成约40ml ，加稀盐酸2ml ，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液5ml ，用水稀释使成50ml ，充分摇匀，放置10分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，供试品管不得更浓（0.002%）。
4、钡盐
取本品4.0g ，加水20ml ，溶解后，滤过，滤液分为两等份，1份中加稀硫酸2ml ，另一份中加水2ml ，静置15分钟，两液应同样澄清。
四、实验注意事项：
1、比色管的正确使用——选择配对的两支纳氏比色管，用清洁液荡洗除去污物，再用水冲洗干净。采用旋摇的方法使管内液体混合均匀。
2、平行操作——标准与样品必须同时进行实验，加入试剂量等均应一致。观察时，两管受光照的程度应一致，使光线从正面照入，比色时置白色背景上，比浊时置黑色背景上，自上而下地观察。
五、思考题
4.1 中国药典（2000 年版）在葡萄糖杂质检查中规定检查十二项，是根据什么原则制订的？目的何在？
4.2 重金属与砷盐检查的原理是什么？如何计算其限量？
5 参考文献
5.1 葡萄糖：《中国药典（2000 年版）》二部，第 815 页
实验 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）
一、实验目的
掌握比色法测定过氧化物酶活性的原理和操作方法
二、实验原理
过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。过氧化氢酶（catalase ）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧
化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H 2O 2的消耗量或O 2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H 2O 2的量。
三、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：小麦叶片
（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
（三）试剂：10%H2SO 4；0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；0.1mol/L 高锰酸钾标准液(称：取KMnO 4（AR ）3.1605g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ，再用0.1mol/L 草酸溶液标定) ；
4. 0.1mol/L H2O 2市售30%H2O 2大约等于17.6mol/L，取30%H2O 2溶液5.68ml ，稀释至1000ml ，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H 2C 2O 4. 2H 2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml 。
三、实验步骤
（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g 加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心15min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml 三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml ，对照加煮死酶液2.5ml ，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O 2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min ，立即加入10%H2SO 42.5ml 。
用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min 内不消失）为终点。
四、结果处理
酶活性用每g 鲜重样品1min 内分解H 2O 2的mg 数表示：
过氧化氢酶活性（H 2O 2mg/g/min）＝（A-B ）×V T /(W×V S ×1.7×t)
式中：A 对照KMnO 4滴定ml 数；B 酶反应后KMnO 4滴定ml 数；V T 提取酶液总量（ml ）； V S 反应时所用酶液量（ml ）；W 样品鲜重（g ）；t 反应时间（min ）；
1.71ml 0.1mol/L KMnO4相当于1.7mgH 2O 2。
过氧化氢酶的活性测定:
在植物体中，黄素氧化酶类的代谢产物常包含H 2O 2，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、醛氧化酶等。H 2O 2的积累可导致破坏性的氧化作用，而过氧化物酶和过氧化氢酶则可以清除H 2O 2，是植物体内重要的活性氧清除系统之
一。其活性还与植物的抗逆性有密切关系，本实验利用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。
一、原理：过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧， 在此过程中起传递电子的作用，H 2O 2则既是氧化剂，又是还原剂。
R(Fe+2)＋H 2O 2=====R(Fe+3OH-) 2
R(Fe+3OH-)2＋H 2O 2===R(Fe+2)2＋2H 2O ＋O 2
合并上式：2H 2O 2====2H2O ＋O 2
据此，可根据H 2O 2的消耗量或O 2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量） 的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
5H 2O 2＋2KMnO 4＋4H 2SO 4→5O2＋2KHSO 4＋8H 2O ＋2MnSO 4
即可求出消耗的H 2O 2量。
二、仪器和用具：研钵、三角瓶50cm 3×4、铁架、酸式滴定管、恒温水浴、容量瓶
三、试剂：
10％H 2SO 4；0.2mol/l磷酸缓冲液pH7.8；
0.1mol/L高锰酸钾标准液： 3.1605gKMnO 4 (AR) 用新煮沸的蒸馏水配制成1000mL ， 用0.1mol/L的草酸溶液标定；
0.1mol/LH2O 2： 市售30％H 2O 2大约等于17.6mol/L， 取30％H 2O 2溶液5.68mL 稀释至1000mL ，用标准0.1mol/l KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。
四、方法：
1. 酶液提取： 取小麦叶片2.5g 加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转移至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000rpm 离心，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
2. 取50ml 三角瓶4个（两个测定，两个对照），测定加入酶液2.5ml ，对照为煮死酶液
2.5ml ； 再加入2.5ml 0.1mol/l H2O 2，同时计时间，于30℃恒温水浴中保温10分钟，立即加入10％H 2SO 4 2.5ml。
3. 用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定H 2O 2，至出现粉红色（在30分钟内不消失）为终点。
4. 结果计算：
酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解H 2O 2的毫克数表示：
(A-B)*Vt/V1*1.7
酶活（酶分解的H 2O 2 mg/g鲜重）＝-------------------
W
式中： Ａ-----对照用KMnO 4 ml 数
Ｂ-----酶反应后KMnO 4滴定ml 数
Ｖt----酶液总量ml
Ｖ1----反应所用酶液量ml
Ｗ-----样品鲜重(g)
1.7----1ml 0.1mol/l KMnO4相当于1.7mg H2O 2
[注意]．所用KMnO 4溶液及H 2O 2溶液使用前要经过标定，0.1mol/l H2O 2要新配制。
实验 比色法测定过氧化物酶活性
一、实验目的
掌握比色法测定过氧化物酶活性的原理和操作
二、原理
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
三、实验内容
（一）实验材料
马铃薯块茎。
（二）试剂、设备
1 .100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）。
2 .反应混合液：100 mmol／L 磷酸缓冲液（pH6.0）50mL 于烧杯中，加入愈创木酚28μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30 %过氧化氢19μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL容量瓶，吸管，离心机。
（三）实验步骤
1．称取植物材料1g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000r ／min 离心15 min ，上清液转入100mL 容量瓶中，残渣再用5mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2．取光径1cm 比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL 和磷酸缓冲液1mL ，作为对照，另1只中加入反应混合液3mL 和上述酶液1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470nm 下吸光度值，每隔1min 读数一次。
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min·g （鲜重）]表示之。也可以用每1 min 内 A 470 变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u ）表示。
过氧化物酶活性 [u/（g·min ）
]=
式中： ΔA 470—反应时间内吸光度的变化。
W —植物鲜重，g 。
V T —提取酶液总体积，mL 。
V s —测定时取用酶液体积, mL 。
t —反应时间，min 。
实验 葡萄糖的一般杂质检查
一、实验要求
1．掌握一般杂质检查的项目及杂质限量计算方法。
2．掌握一般杂质检查的原理和方法。
二、实验原理
1．酸碱度检查
是指用药典规定的方法对药物中的酸度、碱度及酸碱度等酸碱性杂质进行检查。检查时应以新沸并放冷至室温的水为溶剂。不溶于水的药物，可用中性乙醇等有机溶剂溶解。常用的方法有酸碱滴定法，指示剂法以及pH 值测定法。
2．氯化物检查
是指药物中微量氯化物在硝酸溶液中与硝酸银试液作用，生成氯化银白色浑浊液，与一定量的标准氯化钠溶液在相同条件下生成的氯化银浑浊相比较，以判断供试品中氯化物的限量
Cl -+AgNO3→AgCl↓
3．硫酸盐检查
是指药物中微量硫酸盐与氯化钡试液在酸性溶液中作用生成的白色浑浊液，与一定量的标准硫酸钾溶液与氯化钡试液在相同的条件下生成的浑浊比较，以判断供试品中硫酸盐的限量。
SO 2
4+BaCI2→BaSO4↓
4．铁盐检查
是指药物中三价铁盐在酸性溶液中与硫氰酸盐试液生成红色可溶性的硫氰酸铁配离子，与一定量的标准铁溶液，用同法处理后进行比色，以判断供试品中三价铁盐的限量。
Fe 3++6SCN-→[Fe (SCN) 6]3-
5．重金属检查
是指重金属（以铅为代表）在弱酸性（pH3~3.5）溶液中与硫代乙酰胺或硫化钠作用，生成黄色到棕黑色的硫化物混悬液，与一定量的标准铅溶液经同法处理后的颜色比较，以控制药品中重金属含量。
CH 3CSNH 2→CH3CONH 2+H2S
Pb 2++H2S→PbS↓
6．砷盐检查（古蔡氏法）
是利用金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐作用生成具挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸，产生黄色至棕色的砷斑，与定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，以判断药物中砷盐的限量。
AsO 33-+3Zn+9H+→AsH3↓+3Zn2++3H2O
AsH 3+2HgBr2→2HBr+AsH (HgBr)2 （黄色）
AsH 3+3HgBr2→3HBr+As (HgBr)3 （棕色）
五价砷在酸性溶液中也能被金属锌还原为砷化氢，但生成砷化氢的速度较三价砷慢，故在反应液中加入碘化钾及酸性氯化亚锡将五价砷还原为三价砷，碘化钾被氧化生成碘，碘又可被氯化亚锡还原为碘离子。
AsO 43++2I-+2H+→AsO33-+I2+H2O
AsO 43-+Sn2+→AsO33-+Sn4++H2O
I 2+Sn2+→2I-+Sn4+
溶液中的碘离子，又可与反应中产生的锌离子生成稳定的配离子，有利于生成砷化氢的反应不断进行。
4I -+Zn2+→ZnI42-
7．炽灼残渣检查
在机药物经炽灼炭化，再加硫酸湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，于高温（700~800℃）炽灼至完全灰化，使有机物破坏分解变为挥发性物质逸出，残留的非挥发性无机杂质（多为金属的氧化物或无机盐类）称为炽灼残渣，或称为硫酸盐灰分。
三、实验步骤
1．酸度
取本品2g ，加新沸过的冷水20ml 溶解后，加酚酞指示液3滴与氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）0.2ml ，应显粉红色。
2．氯化物
取本品0.60g ，加水溶解使成25ml （溶解加显碱性，可滴加硝酸使成中性），再加稀硝酸10ml ；溶液如不澄清，应滤过；置50ml 纳氏比色管中，加水使成约40ml ，摇匀，即得供试溶液。另取标准氯化钠溶液（10μgCl-/ml）6.0ml ，置50ml 纳氏比色管中，加稀硝酸10ml ，加水使成40ml ，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0ml ，用水稀释使成50ml ，摇匀，在暗处放置5分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，供试溶液不得比对照液更浓（0.01%）。
3．硫酸盐
取本品2.0g ，加水溶解使成约40ml （溶液如显碱性，可滴加盐酸使成中性）；溶液如不澄清，应滤过；置50ml 纳氏比色管中，加稀盐酸2ml 、摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液（100μgSO42-/ml）2.0ml ，置50ml 纳氏比色管中，加水使成约40ml ，加稀盐酸2ml ，摇匀，即得对照溶液，于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%的氯化钡溶液5ml ，用水稀释成50ml ，充分摇匀，放置10分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，供试溶液不得比对照溶液更浓（0.01%）。
4．铁盐
取本品2.0g ，加水20ml 溶解后，加硝酸3滴，缓缓煮沸5分钟，放冷，加水稀释使成45ml ，加硫氰酸铵溶液（30→100）3ml ，摇匀，如显色、与标准铁溶液2.0ml 用同一方法制成的对照液比较，不得更深（0.001%）。
5．重金属
取25ml 纳氏比色管两支，甲管中加标准铅溶液（10ug pb/ml）2ml ，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml ，加水稀释成25ml 。取本品4.0g 置于乙管中，加水23ml 溶解，加醋酸盐缓
冲液（pH3.5）2ml ，若供试液带颜色，可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其它无干扰的有色溶液，使之与乙管一致；再在甲乙两管中分别加硫代乙酰胺试液各2ml ，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自上向下透视，乙管中显示的颜色与甲管比较，不得更深（含重金属不得过百万分之五）。
6．砷盐
取本品2.0g ，置检砷瓶中，加水5ml 溶解后，加稀硫酸5ml 与溴化钾溴试液0.5ml ，置水浴上加热约20分钟，使保持稍过量的溴存在，必要时，再补加溴化钾溴试液适量，并随时补充蒸散的水分，放冷，加盐酸5ml 与水适量使成28ml ，加碘化钾试液5ml 与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g ，迅速将瓶塞塞紧（瓶塞上已置有醋酸铅棉花及溴化汞试纸的检砷管），并在25~40℃的水浴中反应45分钟，取出溴化汞试纸，将生成的砷斑与标准砷溶液一定量制成的标准砷斑比较，颜色不得更深，含砷量不得过百万分之一。
标准砷斑制备：精密量取标准砷溶液（1μg/ml）2ml ，置另一检砷瓶中，加盐酸5ml 与水21ml ，照上述方法自“加碘化钾试液5ml……”起依法操作，即得标准砷斑。
7．炽灼残渣
取本品1.0g ，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全灰化，放冷至室温，加硫酸0.5~1ml使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在700~800℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在700~800℃炽灼至恒重，即得。
所得炽灼残渣不得超过0.1%。
四、注意事项
1．比色或比浊操作，均应在纳氏比色管中进行。选择比色管时，应注意样品管与标准管的体积相等，玻璃色质一致，管上刻度均匀，高低一致，如有差别，不得超过2mm 。
2．样品液与对照品液的操作应遵循平行操作的原则，并应注意按操作顺序加入各种试剂。
3．比色、比浊前应使比色管内试剂充分混匀，然后将两管同置于黑色或白色背景上，自上而下观察。
4．砷盐检查时，取用的样品管与标准管应力求一致，管的长短，内经一定要相同，以免生成的色斑大小不同，影响比色。锌粒加入后，应立即将检砷管盖上，塞紧，以免AsH 3气体逸出。
5．炽灼残渣时，恒重的操作条件，如所用的干燥器、坩埚钳、坩埚置于干燥器内放置时间等，必须一致。
五、问题与讨论
1．一般杂质检查的主要项目有哪些？
2．比色、比浊操作应遵循的原则是什么？
3．简述古蔡氏法检砷所加各个试剂的作用与操作注意点。
4．炽灼残渣的成败关键是什么？恒重的概念和意义是什么？
实验三 药物的特殊杂质检查
一、实验目的
1．熟悉某些药物中的特殊杂质。
2．掌握特殊杂质检查的几种主要方法及操作。
二、实验原理
1. 麻醉乙醚在空气、日光及湿气的作用下，易氧化分解为有毒的过氧化物，过氧化物与碘化钾淀粉溶液反应，可产生兰蓝色。反应式可表示如下：
C 2H 5OOC 2H 5+2KI+H2O→C2H 5OC 2H 5+5KOH+I2
I 2+淀粉→兰色
2. 乙酰水杨酸属芳酸酯类药物，在生产和贮存过程中均会产生水杨酸。水杨酸对人体有毒。应对其进行限度检查。其检查原理是利用水杨酸具有酚羟基，可与高铁盐溶液作用形成紫蓝色，而乙酰水杨酸因无酚羟基，不呈此反应。
3. 肾上腺素是由肾上腺酮经氢化还原制成。若氢化不完全，可能引进酮体杂质，所以药典规定应检查酮体。其检查原理是利用酮体杂质在310nm 波长处有最大吸收，而肾上腺素药物本身在此波长处几乎没有吸收。根据杂质的吸光度，可控制肾上腺素中酮体的限量。
三、实验内容
操作步骤
1．麻醉乙醚中过氧化物的检查
取本品5ml ，置总容量不超过15ml 的具塞比色管中，加新制的碘化钾淀粉溶液（取碘化钾10g ，加水溶解成95ml ，再加淀粉指示液5ml ，混合）8ml ，密塞，强力振摇1分钟，在暗处放置30分钟，两液层均不得染色。
2．阿司匹林肠溶片中游离水杨酸的检查
取本品5片，研细，用乙醇30ml 分次研磨，并移入100ml 量瓶中，充分振摇，用水稀释至刻度，摇匀，立即滤过，精密量取续滤液2ml ，置50ml 纳氏比色管中，用水稀释至50ml ，立即加新制的稀硫酸铁铵溶液（取1ml/L盐酸溶液1ml ，加硫酸铁铵指示液2ml 后，再加水适量使成100ml ）3ml ，摇匀，30秒钟内如显色，与对照液（精密量取0.01%水杨酸溶液4.5ml ，加乙醇3ml 、0.05%酒石酸溶液1ml ，用水稀释至50ml ，再加上述新制的稀硫酸铁铵溶液3ml ，摇匀）比较，不得更深（1.5%）
3．肾上腺素中酮体的检查
取本品，加盐酸溶液（9→2000）制成每1ml 中含2.0mg 的溶液，照紫外-可见分光光度法（中国药典2005年版附录22~23页），在310nm 的波长处测定，吸光度不得过0.05。
四、注意事项
1．进行水杨酸检查时，应在中性或弱酸性溶液（pH4~6）中进行。若在强酸性溶液中，生成的紫兰色配合物会分解褪色。
2．测定吸光度时，应注意吸收峰波长位置的准确性，除另有规定外，吸收峰波长应在
该品种项下规定的波长±1nm 以内。
五、问题与讨论
1．特殊杂质检查的常用方法有哪些？
2．利用紫外-可见分光光度法检查杂质有何优点？
3．薄层色谱法检查杂质常用的方法有哪几种？其结果如何判断？
实验 苯甲酸钠的含量测定
一、目的
掌握双相滴定法测定苯甲酸钠含量的原理和操作
二、原理
苯甲酸钠为有机酸的碱金属盐，显碱性，可用盐酸标准液滴定。
COONa COOH
+ HCl +NaCl
在水溶液中滴定时，由于碱性较弱(pkb =9.80)突跃不明显，故加入与水不相溶混的溶剂乙醚提除反应生成物苯甲酸，使反应定量完成，同时也避免了苯甲酸在瓶中析出影响终点的观察。
三、实验材料、设备
苯甲酸钠、盐酸（0.5mol/L）、乙醚、甲基橙指示液
分液漏斗、酸式滴定管、具塞锥形瓶、
四、操作步骤
取本品1.5g ，精密称定，置分液漏斗中，加水约25ml ，乙醚50ml 与甲基橙指示液2滴，用盐酸滴定液 (0.5mol/L)滴定，随滴随振摇，至水层显持续橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，乙醚层用水5ml 洗涤，洗涤液并入锥形瓶中，加乙醚20ml ，继续用盐酸滴定液(0.5mol/L)滴定，随滴随振摇，至水层显持续橙红色，即得，每1ml 的盐酸滴定液(0.5mol/L)相当于72.06mg 的C 7H 5O 2Na 。
本品按干燥品计算，含C 7H 5O 2Na 不得少于99.0％
四、注意事项
1. 滴定时应充分振摇，使生成的苯甲酸转入乙醚层。
2. 在振摇和分取水层时，应避免样品的损失，滴定前，应用乙醚检查分液漏斗是否严密。
五、思考题
1. 乙醚为什么要分两次加入? 第一次滴定至水层显持续橙红色时，是否已达终点? 为什么?
2. 分取水层后乙醚层用5ml 水洗涤的目的是什么?
实验 双波长分光光度法测定复方磺胺甲噁唑片的含量
一、目的
1. 掌握复方制剂的分析特点及赋形剂的干扰与排除方法。
2. 掌握双波长分光光度法测定复方磺胺甲噁 唑片中磺胺甲噁唑与甲氧苄啶含量的原理与方法。
二、实验内容
1. 供试品溶液的制备
取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于磺胺甲噁 唑50mg 与氧苄啶10mg) ，置于100ml 量瓶中，加乙醇适量，振摇15分钟磺胺甲口恶唑与甲氧苄啶溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2. 对照品溶液的制备
精密称取105℃干燥至恒重的磺胺甲噁 唑对照品50mg 与甲氧苄啶对照品10mg ，分置100ml 量瓶中，各加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为对照品溶液(1)与对照品溶液(2)。
3. 磺胺甲噁 唑的测定
精密量取供试品溶液与对照品溶液(1)、(2)各2ml ，分置100ml 量瓶中，各加0.4％氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀。取对照品溶液(2)的稀释液；以257nm 为测定波长(λ2) ， 在304nm 波长附近(每间隔0.5nm) 选择等吸收点波长为参与波长(λ1) ，要求△A=Aλ2－Aλ1=0。再在λ2与λ1波长处分别测定供试品溶液的稀释液与对照品溶液(1)的稀释液的吸收度，求出各自的吸收度差值(△A) ，计算，即得。
4. 甲氧苄啶的测定
精密量取上述供试品溶液与对照品溶液(1)(2)各5ml ，分置100ml 量瓶中，各加盐酸一氯化钾溶液 [取盐酸液(0.1mol/L)75ml与氯化钾6.9g ，加水至1000ml 摇匀] 稀释至刻度，摇匀。取对照品溶液(1)的稀释液，以239.0nm 为测定波长(λ2) ，在295nm 波长附近(每间隔0.2nm) 选择等吸收点波长为参比波长(λ1) ，要求△A=Aλ2－Aλ1=0。再在λ2与λ1波长处分别测定供试品溶液的稀释液与对照品溶液(2)的稀释液的吸收度，求出各自的吸收度差值(△A) ，计算，即得。
本品每片中含磺胺甲噁 唑(C10H 11N 3O 2S) 应为0.360～0.440g ，含甲氧苄啶(C14H 12N 4O 3) 应为72.0～88.0mg 。
三 说明
1. 磺胺甲噁 唑与甲氧苄啶的结构分别为：
O N
NH 223(SMZ)
OCH 3
CH 32N 2CH 3O (TMP)
2
SMZ 与TMP
的紫外吸收图谱分别为：
图1.SMZ 的紫外吸收图谱 图2.TMP 的紫外吸收图谱
1 TMP(2.0μg/ml) ； 2 SMZ(10.0μg/ml) 1 TMP(5.0μg/ml)； 2 SMZ(25.0μg/ml) 3 SMZ＋TMP ； 4 辅料 3 SMZ ＋TMP ； 4 辅料
2. 复方磺胺甲噁唑片的处方为：
磺胺甲噁唑 400g
甲氧苄啶 80g 制成1000片
3. 本实验采用双波长分光光度法测定SMZ 和TMP 的含量。由于干扰组分在测定波长和参比波长处吸收度相等，可在计算△A 时消去，所以应用本法可以不经分离，直接测定复方制剂中SMZ 和TMP 的含量。
四、思考题
1. 试简述双波长分光光度法的原理。
2. 试查阅本品的其它分析方法，从中了解复方制剂分析的特点及发展趋势。
实验 维生素C 片的质量分析
一、目的要求
1、掌握碘量法的原理和操作方法。
2、掌握常用辅料对制剂含量测定的影响和排除方法。
3、掌握制剂的含量计算方法。
二、实验原理
维生素C （Vc ）又称抗坏血酸，分子式为C 6H 8O 6。Vc 具有还原性，可被I 2定量氧化，因而可用I 2标准溶液直接滴定。其滴定反应式为：C 6H 8O 6+I2=C6H 6O 6+2HI。用直接碘量法可测定药物中的Vc 含量。
由于Vc 的还原性很强，较易被溶液和空气中的氧氧化，在碱性介质中这种氧化作用更强，因此滴定宜在酸性介质中进行，以减少副反应的发生。考虑到I -在强酸性溶液中也易被氧化，故一般选在pH=3～4的弱酸性溶液中进行滴定。
三、主要仪器与药品
棕色滴定管：25 mL、移液管：50 mL、刻度吸管、量瓶100ml
维生素C 片、维生素C 注射液、I 2溶液、淀粉指示液
四、操作
维生素C 为白色或略带淡黄色片，含维生素C 应为标示量的93.0%-107.0%。
（一）维生素C 片
取本品适量相当于含Vc1.0g ，加水20ml ，振摇使溶解；将溶液滤过，取滤液，照紫外-可见分光光度法（附录IVA ），在420nm 的波长处测定吸光度，不得过0.07。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于维生素C 0.2g），置100 mL量瓶中，加新沸过的冷水100 mL与2mol·L -1稀醋酸10 mL的混合液适量，振摇使维生素C 溶解并稀释至刻度，摇匀，经干燥滤纸迅速滤过，精密量取续滤液50 mL，加淀粉指示液1 mL ，用（0.05 mol/L碘滴定液）滴定，至溶液显蓝色并持续30s 不褪。每1mL 碘滴定液相当于8.806 mg的维生素C 。
（二）维生素C 注射液
本品为维生素 C 的灭菌水溶液，无色或微黄色的澄明液体。含维生素C 应为标示量的90.0%110.0%。本品中可加适量的焦亚硫酸钠为稳定剂。
精密量取本品适量（约相当于维生素C 0.2 g），加水15 mL与丙酮2 mL ，摇匀，放置5 min，加稀醋酸4 mL与淀粉指示液1 mL ，用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色并持续30 s不褪。每1 mL碘滴定液相当于8.806 mg的维生素C 。
五、注意事项
维生素C 在空气中易被氧化，过滤、滴定等操作应迅速。
六、思考题
1. 溶解I 2时，加入过量KI 的作用是什么？
2. 维生素C 固体试样溶解时为何要加入新煮沸并冷却的蒸馏水？
3. 碘量法的误差来源有哪些？应采取哪些措施减小误差？
I 2溶液(约0.05mol·L -1) ：称取3.3g I2和5g KI，置于研钵中，加少量水，在通风橱中研磨。待I 2全部溶解后，将溶液转入棕色试剂瓶中，加水稀释至250mL ，充分摇匀，放暗处保存。
实验 非水滴定法测定诺氟沙星(氟哌酸) 胶囊含量
一、目的
1. 掌握非水滴定法的原理及操作;
2. 熟悉非水滴定在药物分析中的应用。
二、实验原理
1. 定义：非水溶液滴定法即在非水溶剂中进行的滴定分析方法。
一些很弱的酸或碱以及某些盐类，在水溶液中进行滴定时，没有明显的滴定突跃，难于掌握滴定终点；另外还有一些有机化合物，在水中溶解度很小，因此，以水作溶剂的滴定分析受到一定的限制。所以，滴定分析法逐渐采用了各种非水溶剂作为滴定分析的介质，不仅能增大有机化合物的溶解度，而且能改变物质的化学性质（例如酸碱性及其强度），使在水中不能进行完全的滴定反应能够顺利进行。
2. 非水溶液酸碱滴定法：是利用非水溶剂来改变物质的酸碱相对强度，即在水溶液中呈弱酸性或弱碱性的化合物，由于酸碱度太弱，不可能得到滴定的终点。如果选择某些适当的非水溶剂为溶剂使化合物增加相对的酸度成为强酸，或者增加相对的碱度成为强碱，就可以顺利地进行滴定的分析方法。
3. 应用：本法主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐或有机酸盐以及有机酸碱金属盐类药物的含量，也用于测定某些有机弱酸含量。
三、实验材料、设备
诺氟沙星胶囊、丙二酸、醋酐、冰醋酸、高氯酸、橙黄Ⅳ指示液
酸式滴定管、试管、烧杯、水浴锅等
四、操作步骤
1. 诺氟沙星的鉴别
(1)取本品内容物适量(约相当于诺氟沙星0.15g) 置干燥试管中，加丙二酸0.1g 与醋酐2ml ，振摇，并在80－90℃水浴中加热10－15mm ，显红棕色。
(2)取本品内容物适量，加0.4％氢氧化钠溶液适量，振摇使诺氧沙星溶解，稀释成每1ml 中含诺氟沙星5μg，滤过，弃去初滤液，取续滤液，在273，325与336nm 波长处测定有最大吸收。
2. 含量测定 精密称取本品内容物适量(约相当于诺氟沙星0.25g) ，加冰醋酸30ml ，振摇使诺氟沙星溶解，加橙黄Ⅳ指示液10滴，用高氯酸液(0.1mol/L)滴定，至溶液显紫红色，并
将滴定的结果用空白试验校正。
五、注意事项
1.ChP2010版规定本品含诺氟沙星应为标示量的90.0—110.0％, 滴定时, 每1ml0.1mol/L的高氯酸液相当于31.93mg 的C 16H 18FN 3O 3。
2. 0.1mol/L的高氯酸溶液的配制及标定参见ChP2010版附录。高氯酸不稳定，注意避光保存。
3. 水的体膨胀系数较小（0.21×10-3/0C ），一般酸碱标准溶液的浓度受室温改变的影响不大。而多数有机溶剂的体膨胀系数较大，例如，冰醋酸的体膨胀系数为（1.1×10-3/0C ）其体积随温度改变较大。所以高氯酸冰醋酸溶液滴定样品时和标定时温度若有差别，则应重新标定或按下式将标准溶液的浓度加以校正：
C 1=C 0 t 1-t 01+0. 0011
式中：0.0011为冰醋酸的体膨胀系数，t 0为标定时的温度，t 1为测定时的温度，C 0为标定时的浓度，C 1为测定时的浓度。
4. 现行药典对本品含量测定的方法为HPLC 法。
五、思考题
非水滴定应用于药物分析有何特点? 哪几类药物适合用非水滴定法测定其含
量。
实验 槐花的质量检验
一、目的
1. 了解中药分析检验常用的方法与特点;
2. 熟悉连续回流提取法；
3. 掌握黄酮类化合物的性质鉴别及比色法测定含量的原理及方法。
二、实验原理
按中华人民共和国药典，槐花项下规定了于槐花质量相关的项目有：形状、鉴别、检查、浸出物、含量测定等。
1. 槐花中主要含有黄酮类化合物，其典型的代表性化合物为芦丁。芦丁可以发生的特征反应：
盐酸-镁粉反应
2. 该法主要使用索氏提取器通过连续回流提取法对槐花中的总黄酮进行提取，然后以分光光度法，以芦丁为对照品，在500nm 处进行测定。本品于60℃干燥 6小时，含芦丁(C27H 30O 16) 槐花不得少于8.0％ ，槐米不得少于20.0％。
三、实验材料、设备
槐花、硝酸铝、亚硝酸钠、盐酸、氢氧化钠
水浴锅、电加热套、显微镜、索氏提取器、冷凝管、碘量瓶等
四、操作步骤
1. 性状
槐花 本品皱缩而卷曲，花瓣多散落。完整者花萼钟状，黄绿色，先端5 浅裂；花瓣5 ，
黄色或黄白色，1 片较大，近圆形，先端微凹，其余 4片长圆形。雄蕊10，其中9 个基部连合，花丝细长。雌蕊圆柱形，弯曲。体轻。无臭，味微苦。
槐米 呈卵形或椭圆形，长2～6mm ，直径约2mm 。花萼下部有数条纵纹。萼的上方为黄白色未开放的花瓣。花梗细小。体轻，手捻即碎。无臭，味微苦涩。
2. 鉴别
(1) 本品粉末黄绿色。花粉粒类球形或钝三角形，直径14～19μm 。具3 个萌发孔。非腺毛1～3细胞，长86～660μm ，气孔不定式，副卫细胞4～8个。草酸钙方晶少见。
(2) 取本品粉末0.1g ，加乙醇10ml ，加热5 分钟，滤过。取滤液1ml ，加镁粉少量与盐酸2～3滴，即显樱红色。
(3) 取本品粉末0.2g ，加甲醇5ml, 密塞，振摇10分钟，放置10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取芦丁对照品，加甲醇制成每1ml 含4mg 的溶液，作为对照品溶液。 照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各10μl, 分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以醋酸乙酯－甲酸－水(8:1:1) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置紫外光灯(365nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2. 浸出物
取供试品约2~4克，精密称定，置100-250ml 锥形瓶中，精密加30%甲醇50-100ml ，密塞，称定重量，静置一小时后连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸一小时，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25ml ，至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴上干燥后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量，除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物含量%。用30%甲醇作溶剂，槐花不得少于37.0%；槐米不得少于43.0%。
3. 含量测定 对照品溶液的制备 精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品200mg, 置100ml 量瓶中，加甲醇70ml ，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密吸取10ml ，置100ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每1ml 中含无水芦丁0.2mg ）。 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0ml 、1.0ml 、2.0ml 、3.0ml 、4.0ml 、5.0ml 与6.0ml, 分别置25ml 量瓶中，各加水至6ml, 加 5％亚硝酸钠溶液1ml, 使混匀，放置 6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml, 摇匀，放置6 分钟，加氢氧化钠试液10ml ，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法（附录ⅤB），在500nm 的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
取本品粗粉约1g ，于60℃干燥6 小时，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚120ml, 加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲醇90ml ，加热回流至提取液无色，移置100ml 量瓶中，用甲醇少量洗涤容器，洗液并入量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10ml ，置100ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3ml, 置25ml 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至 6ml”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量(μg) ，计算，即得。本品于60℃干燥 6小时，含芦丁(C27H 30O 16) 槐花不得少于8.0％ ，槐米不得少于20.0％。
五、思考题
为何以分光光度法测定总黄酮含量，需要添加硝酸铝？
实验 胃蛋白酶片的测定
实验目的：掌握以胃蛋白酶测定法测定胃蛋白酶片中胃蛋白酶的效价。
实验原理：精密称取本品适量，加盐酸溶液制成每1mL 中约含0.2-0.4个单位的溶液，照胃蛋白酶测定法，测定胃蛋白酶的效价。
实验部分：
1. 材料与设备
血红蛋白试液、三氟醋酸溶液、盐酸溶液
紫外可见分光光度计
2. 操作步骤
1）. 供试品溶液的制备
取本品5片，置研钵中，加盐酸溶液少许，研磨均匀，移至250mL 量瓶中，加上述盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密称取适量，用上述盐酸溶液稀释制成每1mL 中约含0.2-0.4个单位的溶液，作为供试品溶液。
2）. 对照品溶液的制备
精密称取酪氨酸对照品适量，加盐酸溶液稀释制成每1mL 中约含0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。
3）供试品的测定
取大小相同的试管6支，其中3支精密加入对照品溶液1mL ，另3支精密加入供试品溶液1mL ，置37℃±0.5℃水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5mL ，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟，立即精密加入5%三氟醋酸溶液5mL ，摇匀，滤过，取续滤液备用。另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5mL ，置37℃±0.5℃水浴中保温10分钟，再精密加入5%三氟醋酸溶液5mL ，其中一支加供试品溶液1mL ，另一支加上述盐酸溶液1mL ，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照紫外-可见分光光度法，在275nm 的波长处测定吸光度，按下列公式计算，即得。
注意事项：
思考题：
实验 三磷酸腺苷二钠片总核苷酸含量测定
实验目的：掌握以胃蛋白酶测定法测定胃蛋白酶片中胃蛋白酶的效价。
实验原理：精密称取本品适量，加盐酸溶液制成每1mL 中约含0.2-0.4个单位的溶液，照胃蛋白酶测定法，测定胃蛋白酶的效价。
实验部分：
1. 材料与设备
血红蛋白试液、三氟醋酸溶液、盐酸溶液
紫外可见分光光度计
2. 操作步骤
1）. 供试品溶液的制备
取本品5片，置研钵中，加盐酸溶液少许，研磨均匀，移至250mL 量瓶中，加上述盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密称取适量，用上述盐酸溶液稀释制成每1mL 中约含0.2-0.4个单位的溶液，作为供试品溶液。
2）. 对照品溶液的制备
精密称取酪氨酸对照品适量，加盐酸溶液稀释制成每1mL 中约含0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。
3）供试品的测定
取大小相同的试管6支，其中3支精密加入对照品溶液1mL ，另3支精密加入供试品溶液1mL ，置37℃±0.5℃水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5mL ，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟，立即精密加入5%三氟醋酸溶液5mL ，摇匀，滤过，取续滤液备用。另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5mL ，置37℃±0.5℃水浴中保温10分钟，再精密加入5%三氟醋酸溶液5mL ，其中一支加供试品溶液1mL ，另一支加上述盐酸溶液1mL ，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照紫外-可见分光光度法，在275nm 的波长处测定吸光度，按下列公式计算，即得。
注意事项：
思考题：
实验七 药物的一般杂质检查
一、实验目的：
1. 掌握药物的一般杂质检查原理与实验方法。
2. 熟悉一般杂质检查项目与意义。
二、实验原理：
药物的一般杂质：是指在自然界中分布较广泛，在多种药物的生产和贮藏过程中容易引入的杂质，如酸、碱、水分、氯化物、硫酸盐、砷盐、铁盐、重金属等。
1. 比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比浊法是指测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，本法主要是用于测定能形成悬浮体的沉淀物质。
a 、酸碱度检查：是用药典规定的方法对药物中的酸度、碱度及酸碱度等酸碱性杂质进行检查。检查时应以新沸并放冷至室温的水为溶剂。不溶于水的药物，可用中性乙醇等有机溶剂溶解。常用的方法有酸碱滴定法，指示剂法以及pH 值测定法。
b 、氯化物检查法：氯化物在硝酸溶液中与硝酸银作用，生成氯化银沉淀而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠溶液和硝酸银在同样条件下用同法处理生成的氯化银浑浊程度相比较，测定供试品中氯化物的限量。
反应离子方程式：Cl + Ag → AgCl↓（白色）
c 、铁盐检查法：三价铁盐在硝酸酸性溶液中与硫氰酸盐生成红色可溶性的硫氰酸铁络离子，与一定量标准铁溶液用同法处理后进行比色。
反应离子方程式：Fe + 3SCN → Fe（SCN ）3（红棕色）。
2. 限量计算:杂质限量%=((V
准3+--+标准×C 标准)/W样) ×100%。式中V 标准为标准液体积，C 标为标准液浓度，W 样为样品取样量。
三、实验内容：
1. 实验材料、设备：
葡萄糖、氯化钠原料药。
25ml 、50mL 纳氏比色管、刻度吸管、电子天平。
2. 实验操作步骤：
（一）葡萄糖
1、酸度
取本品2.0g ，加水20mL 溶解后，加酚酞指示液3滴与氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）0.20mL ，应显粉红色。
2、溶液的澄清度与颜色
取本品5g ，加热水溶解后，放冷，用水稀释至10mL ，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（附录H ）比较，不得更浓；如显色，与对照液（取比色用氯化钴液3mL 、比色用重铬酸钾液3mL 与比色用硫酸铜液6mL ，加水稀释成50mL ）1.0mL 加水稀释至10mL 比较，不得更深。
3、乙醇溶液的澄清度
取本品1.0g ，加90%乙醇30mL ，置水浴上加热回流约10分钟，溶液应澄清。
4、氯化物
取本品0.6g ，加水溶解使成25mL ，再加稀硝酸10mL ；溶液如不澄清，应滤过；置50mL 纳氏比色管中，加水使成约40mL ，摇匀，即得供试溶液。另取标准氯化钠溶液6.0mL ，置50mL 纳氏比色管中，加稀硝酸10mL ，加水使成40mL ，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0mL ，用水稀释，使成50mL ，摇匀，在暗处放置5分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较。供试溶液所显浑浊度不得较对照液更浓（0.01%）。
5、干燥失重
取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过9.5%。
6、硫酸盐
取本品2.0g ，加水溶解使成约40mL ；溶液如不澄清，应滤过；置50mL 纳氏比色管中，加稀盐酸2mL ，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液2.0mL ，置50mL 纳氏比色管中，加水使成约40mL ，加稀盐酸2mL ，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液5mL ，用水稀释至50mL ，充分摇匀，放置10分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较。供试溶液所显浑浊度不得较对照液更浓（0.01%）。
7、亚硫酸盐与可溶性淀粉
取本品1.0g ，加水10mL 溶解后，加碘试液1滴，应即显黄色。
8、铁盐
取本品2.0g ，加水20mL 溶解后，加硝酸3滴，缓缓煮沸5分钟，放冷，加水稀释使成45mL ，加硫氰酸铵溶液（30→100）3mL ，摇匀，如显色，与标准铁溶液2.0mL 用同一方法制成的对照液比较，不得更深（0.001%）。
9、 蛋白质
取本品 1.0g ，加水 10ml 溶解后，加磺基水杨酸溶液（1→5）3ml ，不得发生沉淀。
（二）氯化钠杂质检查
1、溶液的澄清度
取本品5.0g ，加水25ml 溶解后，溶液应澄清。
2、碘化物
取本品的细粉5.0g ，置瓷蒸发皿内，滴加新配制的淀粉混合液适量使晶粉湿润，置日光下（或日光灯下）观察，5分钟内晶粒不得显蓝色痕迹。
3、硫酸盐
取本品5.0g ，加水溶解成约40ml （溶解如显碱性，可滴加盐酸使成中性），溶液如不澄清，应滤过，置50ml 纳氏比色管中，加稀盐酸2ml ，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液1.0ml 置50ml 纳氏比色管中，加水使成约40ml ，加稀盐酸2ml ，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液5ml ，用水稀释使成50ml ，充分摇匀，放置10分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，供试品管不得更浓（0.002%）。
4、钡盐
取本品4.0g ，加水20ml ，溶解后，滤过，滤液分为两等份，1份中加稀硫酸2ml ，另一份中加水2ml ，静置15分钟，两液应同样澄清。
四、实验注意事项：
1、比色管的正确使用——选择配对的两支纳氏比色管，用清洁液荡洗除去污物，再用水冲洗干净。采用旋摇的方法使管内液体混合均匀。
2、平行操作——标准与样品必须同时进行实验，加入试剂量等均应一致。观察时，两管受光照的程度应一致，使光线从正面照入，比色时置白色背景上，比浊时置黑色背景上，自上而下地观察。
五、思考题
4.1 中国药典（2000 年版）在葡萄糖杂质检查中规定检查十二项，是根据什么原则制订的？目的何在？
4.2 重金属与砷盐检查的原理是什么？如何计算其限量？
5 参考文献
5.1 葡萄糖：《中国药典（2000 年版）》二部，第 815 页
实验 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）
一、实验目的
掌握比色法测定过氧化物酶活性的原理和操作方法
二、实验原理
过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。过氧化氢酶（catalase ）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧
化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H 2O 2的消耗量或O 2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H 2O 2的量。
三、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：小麦叶片
（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
（三）试剂：10%H2SO 4；0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；0.1mol/L 高锰酸钾标准液(称：取KMnO 4（AR ）3.1605g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ，再用0.1mol/L 草酸溶液标定) ；
4. 0.1mol/L H2O 2市售30%H2O 2大约等于17.6mol/L，取30%H2O 2溶液5.68ml ，稀释至1000ml ，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H 2C 2O 4. 2H 2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml 。
三、实验步骤
（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g 加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心15min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml 三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml ，对照加煮死酶液2.5ml ，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O 2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min ，立即加入10%H2SO 42.5ml 。
用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min 内不消失）为终点。
四、结果处理
酶活性用每g 鲜重样品1min 内分解H 2O 2的mg 数表示：
过氧化氢酶活性（H 2O 2mg/g/min）＝（A-B ）×V T /(W×V S ×1.7×t)
式中：A 对照KMnO 4滴定ml 数；B 酶反应后KMnO 4滴定ml 数；V T 提取酶液总量（ml ）； V S 反应时所用酶液量（ml ）；W 样品鲜重（g ）；t 反应时间（min ）；
1.71ml 0.1mol/L KMnO4相当于1.7mgH 2O 2。
过氧化氢酶的活性测定:
在植物体中，黄素氧化酶类的代谢产物常包含H 2O 2，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、醛氧化酶等。H 2O 2的积累可导致破坏性的氧化作用，而过氧化物酶和过氧化氢酶则可以清除H 2O 2，是植物体内重要的活性氧清除系统之
一。其活性还与植物的抗逆性有密切关系，本实验利用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。
一、原理：过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧， 在此过程中起传递电子的作用，H 2O 2则既是氧化剂，又是还原剂。
R(Fe+2)＋H 2O 2=====R(Fe+3OH-) 2
R(Fe+3OH-)2＋H 2O 2===R(Fe+2)2＋2H 2O ＋O 2
合并上式：2H 2O 2====2H2O ＋O 2
据此，可根据H 2O 2的消耗量或O 2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量） 的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
5H 2O 2＋2KMnO 4＋4H 2SO 4→5O2＋2KHSO 4＋8H 2O ＋2MnSO 4
即可求出消耗的H 2O 2量。
二、仪器和用具：研钵、三角瓶50cm 3×4、铁架、酸式滴定管、恒温水浴、容量瓶
三、试剂：
10％H 2SO 4；0.2mol/l磷酸缓冲液pH7.8；
0.1mol/L高锰酸钾标准液： 3.1605gKMnO 4 (AR) 用新煮沸的蒸馏水配制成1000mL ， 用0.1mol/L的草酸溶液标定；
0.1mol/LH2O 2： 市售30％H 2O 2大约等于17.6mol/L， 取30％H 2O 2溶液5.68mL 稀释至1000mL ，用标准0.1mol/l KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。
四、方法：
1. 酶液提取： 取小麦叶片2.5g 加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转移至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000rpm 离心，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
2. 取50ml 三角瓶4个（两个测定，两个对照），测定加入酶液2.5ml ，对照为煮死酶液
2.5ml ； 再加入2.5ml 0.1mol/l H2O 2，同时计时间，于30℃恒温水浴中保温10分钟，立即加入10％H 2SO 4 2.5ml。
3. 用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定H 2O 2，至出现粉红色（在30分钟内不消失）为终点。
4. 结果计算：
酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解H 2O 2的毫克数表示：
(A-B)*Vt/V1*1.7
酶活（酶分解的H 2O 2 mg/g鲜重）＝-------------------
W
式中： Ａ-----对照用KMnO 4 ml 数
Ｂ-----酶反应后KMnO 4滴定ml 数
Ｖt----酶液总量ml
Ｖ1----反应所用酶液量ml
Ｗ-----样品鲜重(g)
1.7----1ml 0.1mol/l KMnO4相当于1.7mg H2O 2
[注意]．所用KMnO 4溶液及H 2O 2溶液使用前要经过标定，0.1mol/l H2O 2要新配制。
实验 比色法测定过氧化物酶活性
一、实验目的
掌握比色法测定过氧化物酶活性的原理和操作
二、原理
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
三、实验内容
（一）实验材料
马铃薯块茎。
（二）试剂、设备
1 .100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）。
2 .反应混合液：100 mmol／L 磷酸缓冲液（pH6.0）50mL 于烧杯中，加入愈创木酚28μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30 %过氧化氢19μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL容量瓶，吸管，离心机。
（三）实验步骤
1．称取植物材料1g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000r ／min 离心15 min ，上清液转入100mL 容量瓶中，残渣再用5mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2．取光径1cm 比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL 和磷酸缓冲液1mL ，作为对照，另1只中加入反应混合液3mL 和上述酶液1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470nm 下吸光度值，每隔1min 读数一次。
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min·g （鲜重）]表示之。也可以用每1 min 内 A 470 变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u ）表示。
过氧化物酶活性 [u/（g·min ）
]=
式中： ΔA 470—反应时间内吸光度的变化。
W —植物鲜重，g 。
V T —提取酶液总体积，mL 。
V s —测定时取用酶液体积, mL 。
t —反应时间，min 。
实验 葡萄糖的一般杂质检查
一、实验要求
1．掌握一般杂质检查的项目及杂质限量计算方法。
2．掌握一般杂质检查的原理和方法。
二、实验原理
1．酸碱度检查
是指用药典规定的方法对药物中的酸度、碱度及酸碱度等酸碱性杂质进行检查。检查时应以新沸并放冷至室温的水为溶剂。不溶于水的药物，可用中性乙醇等有机溶剂溶解。常用的方法有酸碱滴定法，指示剂法以及pH 值测定法。
2．氯化物检查
是指药物中微量氯化物在硝酸溶液中与硝酸银试液作用，生成氯化银白色浑浊液，与一定量的标准氯化钠溶液在相同条件下生成的氯化银浑浊相比较，以判断供试品中氯化物的限量
Cl -+AgNO3→AgCl↓
3．硫酸盐检查
是指药物中微量硫酸盐与氯化钡试液在酸性溶液中作用生成的白色浑浊液，与一定量的标准硫酸钾溶液与氯化钡试液在相同的条件下生成的浑浊比较，以判断供试品中硫酸盐的限量。
SO 2
4+BaCI2→BaSO4↓
4．铁盐检查
是指药物中三价铁盐在酸性溶液中与硫氰酸盐试液生成红色可溶性的硫氰酸铁配离子，与一定量的标准铁溶液，用同法处理后进行比色，以判断供试品中三价铁盐的限量。
Fe 3++6SCN-→[Fe (SCN) 6]3-
5．重金属检查
是指重金属（以铅为代表）在弱酸性（pH3~3.5）溶液中与硫代乙酰胺或硫化钠作用，生成黄色到棕黑色的硫化物混悬液，与一定量的标准铅溶液经同法处理后的颜色比较，以控制药品中重金属含量。
CH 3CSNH 2→CH3CONH 2+H2S
Pb 2++H2S→PbS↓
6．砷盐检查（古蔡氏法）
是利用金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐作用生成具挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸，产生黄色至棕色的砷斑，与定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，以判断药物中砷盐的限量。
AsO 33-+3Zn+9H+→AsH3↓+3Zn2++3H2O
AsH 3+2HgBr2→2HBr+AsH (HgBr)2 （黄色）
AsH 3+3HgBr2→3HBr+As (HgBr)3 （棕色）
五价砷在酸性溶液中也能被金属锌还原为砷化氢，但生成砷化氢的速度较三价砷慢，故在反应液中加入碘化钾及酸性氯化亚锡将五价砷还原为三价砷，碘化钾被氧化生成碘，碘又可被氯化亚锡还原为碘离子。
AsO 43++2I-+2H+→AsO33-+I2+H2O
AsO 43-+Sn2+→AsO33-+Sn4++H2O
I 2+Sn2+→2I-+Sn4+
溶液中的碘离子，又可与反应中产生的锌离子生成稳定的配离子，有利于生成砷化氢的反应不断进行。
4I -+Zn2+→ZnI42-
7．炽灼残渣检查
在机药物经炽灼炭化，再加硫酸湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，于高温（700~800℃）炽灼至完全灰化，使有机物破坏分解变为挥发性物质逸出，残留的非挥发性无机杂质（多为金属的氧化物或无机盐类）称为炽灼残渣，或称为硫酸盐灰分。
三、实验步骤
1．酸度
取本品2g ，加新沸过的冷水20ml 溶解后，加酚酞指示液3滴与氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）0.2ml ，应显粉红色。
2．氯化物
取本品0.60g ，加水溶解使成25ml （溶解加显碱性，可滴加硝酸使成中性），再加稀硝酸10ml ；溶液如不澄清，应滤过；置50ml 纳氏比色管中，加水使成约40ml ，摇匀，即得供试溶液。另取标准氯化钠溶液（10μgCl-/ml）6.0ml ，置50ml 纳氏比色管中，加稀硝酸10ml ，加水使成40ml ，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0ml ，用水稀释使成50ml ，摇匀，在暗处放置5分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，供试溶液不得比对照液更浓（0.01%）。
3．硫酸盐
取本品2.0g ，加水溶解使成约40ml （溶液如显碱性，可滴加盐酸使成中性）；溶液如不澄清，应滤过；置50ml 纳氏比色管中，加稀盐酸2ml 、摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液（100μgSO42-/ml）2.0ml ，置50ml 纳氏比色管中，加水使成约40ml ，加稀盐酸2ml ，摇匀，即得对照溶液，于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%的氯化钡溶液5ml ，用水稀释成50ml ，充分摇匀，放置10分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，供试溶液不得比对照溶液更浓（0.01%）。
4．铁盐
取本品2.0g ，加水20ml 溶解后，加硝酸3滴，缓缓煮沸5分钟，放冷，加水稀释使成45ml ，加硫氰酸铵溶液（30→100）3ml ，摇匀，如显色、与标准铁溶液2.0ml 用同一方法制成的对照液比较，不得更深（0.001%）。
5．重金属
取25ml 纳氏比色管两支，甲管中加标准铅溶液（10ug pb/ml）2ml ，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml ，加水稀释成25ml 。取本品4.0g 置于乙管中，加水23ml 溶解，加醋酸盐缓
冲液（pH3.5）2ml ，若供试液带颜色，可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其它无干扰的有色溶液，使之与乙管一致；再在甲乙两管中分别加硫代乙酰胺试液各2ml ，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自上向下透视，乙管中显示的颜色与甲管比较，不得更深（含重金属不得过百万分之五）。
6．砷盐
取本品2.0g ，置检砷瓶中，加水5ml 溶解后，加稀硫酸5ml 与溴化钾溴试液0.5ml ，置水浴上加热约20分钟，使保持稍过量的溴存在，必要时，再补加溴化钾溴试液适量，并随时补充蒸散的水分，放冷，加盐酸5ml 与水适量使成28ml ，加碘化钾试液5ml 与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g ，迅速将瓶塞塞紧（瓶塞上已置有醋酸铅棉花及溴化汞试纸的检砷管），并在25~40℃的水浴中反应45分钟，取出溴化汞试纸，将生成的砷斑与标准砷溶液一定量制成的标准砷斑比较，颜色不得更深，含砷量不得过百万分之一。
标准砷斑制备：精密量取标准砷溶液（1μg/ml）2ml ，置另一检砷瓶中，加盐酸5ml 与水21ml ，照上述方法自“加碘化钾试液5ml……”起依法操作，即得标准砷斑。
7．炽灼残渣
取本品1.0g ，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全灰化，放冷至室温，加硫酸0.5~1ml使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在700~800℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在700~800℃炽灼至恒重，即得。
所得炽灼残渣不得超过0.1%。
四、注意事项
1．比色或比浊操作，均应在纳氏比色管中进行。选择比色管时，应注意样品管与标准管的体积相等，玻璃色质一致，管上刻度均匀，高低一致，如有差别，不得超过2mm 。
2．样品液与对照品液的操作应遵循平行操作的原则，并应注意按操作顺序加入各种试剂。
3．比色、比浊前应使比色管内试剂充分混匀，然后将两管同置于黑色或白色背景上，自上而下观察。
4．砷盐检查时，取用的样品管与标准管应力求一致，管的长短，内经一定要相同，以免生成的色斑大小不同，影响比色。锌粒加入后，应立即将检砷管盖上，塞紧，以免AsH 3气体逸出。
5．炽灼残渣时，恒重的操作条件，如所用的干燥器、坩埚钳、坩埚置于干燥器内放置时间等，必须一致。
五、问题与讨论
1．一般杂质检查的主要项目有哪些？
2．比色、比浊操作应遵循的原则是什么？
3．简述古蔡氏法检砷所加各个试剂的作用与操作注意点。
4．炽灼残渣的成败关键是什么？恒重的概念和意义是什么？
实验三 药物的特殊杂质检查
一、实验目的
1．熟悉某些药物中的特殊杂质。
2．掌握特殊杂质检查的几种主要方法及操作。
二、实验原理
1. 麻醉乙醚在空气、日光及湿气的作用下，易氧化分解为有毒的过氧化物，过氧化物与碘化钾淀粉溶液反应，可产生兰蓝色。反应式可表示如下：
C 2H 5OOC 2H 5+2KI+H2O→C2H 5OC 2H 5+5KOH+I2
I 2+淀粉→兰色
2. 乙酰水杨酸属芳酸酯类药物，在生产和贮存过程中均会产生水杨酸。水杨酸对人体有毒。应对其进行限度检查。其检查原理是利用水杨酸具有酚羟基，可与高铁盐溶液作用形成紫蓝色，而乙酰水杨酸因无酚羟基，不呈此反应。
3. 肾上腺素是由肾上腺酮经氢化还原制成。若氢化不完全，可能引进酮体杂质，所以药典规定应检查酮体。其检查原理是利用酮体杂质在310nm 波长处有最大吸收，而肾上腺素药物本身在此波长处几乎没有吸收。根据杂质的吸光度，可控制肾上腺素中酮体的限量。
三、实验内容
操作步骤
1．麻醉乙醚中过氧化物的检查
取本品5ml ，置总容量不超过15ml 的具塞比色管中，加新制的碘化钾淀粉溶液（取碘化钾10g ，加水溶解成95ml ，再加淀粉指示液5ml ，混合）8ml ，密塞，强力振摇1分钟，在暗处放置30分钟，两液层均不得染色。
2．阿司匹林肠溶片中游离水杨酸的检查
取本品5片，研细，用乙醇30ml 分次研磨，并移入100ml 量瓶中，充分振摇，用水稀释至刻度，摇匀，立即滤过，精密量取续滤液2ml ，置50ml 纳氏比色管中，用水稀释至50ml ，立即加新制的稀硫酸铁铵溶液（取1ml/L盐酸溶液1ml ，加硫酸铁铵指示液2ml 后，再加水适量使成100ml ）3ml ，摇匀，30秒钟内如显色，与对照液（精密量取0.01%水杨酸溶液4.5ml ，加乙醇3ml 、0.05%酒石酸溶液1ml ，用水稀释至50ml ，再加上述新制的稀硫酸铁铵溶液3ml ，摇匀）比较，不得更深（1.5%）
3．肾上腺素中酮体的检查
取本品，加盐酸溶液（9→2000）制成每1ml 中含2.0mg 的溶液，照紫外-可见分光光度法（中国药典2005年版附录22~23页），在310nm 的波长处测定，吸光度不得过0.05。
四、注意事项
1．进行水杨酸检查时，应在中性或弱酸性溶液（pH4~6）中进行。若在强酸性溶液中，生成的紫兰色配合物会分解褪色。
2．测定吸光度时，应注意吸收峰波长位置的准确性，除另有规定外，吸收峰波长应在
该品种项下规定的波长±1nm 以内。
五、问题与讨论
1．特殊杂质检查的常用方法有哪些？
2．利用紫外-可见分光光度法检查杂质有何优点？
3．薄层色谱法检查杂质常用的方法有哪几种？其结果如何判断？
实验 苯甲酸钠的含量测定
一、目的
掌握双相滴定法测定苯甲酸钠含量的原理和操作
二、原理
苯甲酸钠为有机酸的碱金属盐，显碱性，可用盐酸标准液滴定。
COONa COOH
+ HCl +NaCl
在水溶液中滴定时，由于碱性较弱(pkb =9.80)突跃不明显，故加入与水不相溶混的溶剂乙醚提除反应生成物苯甲酸，使反应定量完成，同时也避免了苯甲酸在瓶中析出影响终点的观察。
三、实验材料、设备
苯甲酸钠、盐酸（0.5mol/L）、乙醚、甲基橙指示液
分液漏斗、酸式滴定管、具塞锥形瓶、
四、操作步骤
取本品1.5g ，精密称定，置分液漏斗中，加水约25ml ，乙醚50ml 与甲基橙指示液2滴，用盐酸滴定液 (0.5mol/L)滴定，随滴随振摇，至水层显持续橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，乙醚层用水5ml 洗涤，洗涤液并入锥形瓶中，加乙醚20ml ，继续用盐酸滴定液(0.5mol/L)滴定，随滴随振摇，至水层显持续橙红色，即得，每1ml 的盐酸滴定液(0.5mol/L)相当于72.06mg 的C 7H 5O 2Na 。
本品按干燥品计算，含C 7H 5O 2Na 不得少于99.0％
四、注意事项
1. 滴定时应充分振摇，使生成的苯甲酸转入乙醚层。
2. 在振摇和分取水层时，应避免样品的损失，滴定前，应用乙醚检查分液漏斗是否严密。
五、思考题
1. 乙醚为什么要分两次加入? 第一次滴定至水层显持续橙红色时，是否已达终点? 为什么?
2. 分取水层后乙醚层用5ml 水洗涤的目的是什么?
实验 双波长分光光度法测定复方磺胺甲噁唑片的含量
一、目的
1. 掌握复方制剂的分析特点及赋形剂的干扰与排除方法。
2. 掌握双波长分光光度法测定复方磺胺甲噁 唑片中磺胺甲噁唑与甲氧苄啶含量的原理与方法。
二、实验内容
1. 供试品溶液的制备
取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于磺胺甲噁 唑50mg 与氧苄啶10mg) ，置于100ml 量瓶中，加乙醇适量，振摇15分钟磺胺甲口恶唑与甲氧苄啶溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2. 对照品溶液的制备
精密称取105℃干燥至恒重的磺胺甲噁 唑对照品50mg 与甲氧苄啶对照品10mg ，分置100ml 量瓶中，各加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为对照品溶液(1)与对照品溶液(2)。
3. 磺胺甲噁 唑的测定
精密量取供试品溶液与对照品溶液(1)、(2)各2ml ，分置100ml 量瓶中，各加0.4％氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀。取对照品溶液(2)的稀释液；以257nm 为测定波长(λ2) ， 在304nm 波长附近(每间隔0.5nm) 选择等吸收点波长为参与波长(λ1) ，要求△A=Aλ2－Aλ1=0。再在λ2与λ1波长处分别测定供试品溶液的稀释液与对照品溶液(1)的稀释液的吸收度，求出各自的吸收度差值(△A) ，计算，即得。
4. 甲氧苄啶的测定
精密量取上述供试品溶液与对照品溶液(1)(2)各5ml ，分置100ml 量瓶中，各加盐酸一氯化钾溶液 [取盐酸液(0.1mol/L)75ml与氯化钾6.9g ，加水至1000ml 摇匀] 稀释至刻度，摇匀。取对照品溶液(1)的稀释液，以239.0nm 为测定波长(λ2) ，在295nm 波长附近(每间隔0.2nm) 选择等吸收点波长为参比波长(λ1) ，要求△A=Aλ2－Aλ1=0。再在λ2与λ1波长处分别测定供试品溶液的稀释液与对照品溶液(2)的稀释液的吸收度，求出各自的吸收度差值(△A) ，计算，即得。
本品每片中含磺胺甲噁 唑(C10H 11N 3O 2S) 应为0.360～0.440g ，含甲氧苄啶(C14H 12N 4O 3) 应为72.0～88.0mg 。
三 说明
1. 磺胺甲噁 唑与甲氧苄啶的结构分别为：
O N
NH 223(SMZ)
OCH 3
CH 32N 2CH 3O (TMP)
2
SMZ 与TMP
的紫外吸收图谱分别为：
图1.SMZ 的紫外吸收图谱 图2.TMP 的紫外吸收图谱
1 TMP(2.0μg/ml) ； 2 SMZ(10.0μg/ml) 1 TMP(5.0μg/ml)； 2 SMZ(25.0μg/ml) 3 SMZ＋TMP ； 4 辅料 3 SMZ ＋TMP ； 4 辅料
2. 复方磺胺甲噁唑片的处方为：
磺胺甲噁唑 400g
甲氧苄啶 80g 制成1000片
3. 本实验采用双波长分光光度法测定SMZ 和TMP 的含量。由于干扰组分在测定波长和参比波长处吸收度相等，可在计算△A 时消去，所以应用本法可以不经分离，直接测定复方制剂中SMZ 和TMP 的含量。
四、思考题
1. 试简述双波长分光光度法的原理。
2. 试查阅本品的其它分析方法，从中了解复方制剂分析的特点及发展趋势。
实验 维生素C 片的质量分析
一、目的要求
1、掌握碘量法的原理和操作方法。
2、掌握常用辅料对制剂含量测定的影响和排除方法。
3、掌握制剂的含量计算方法。
二、实验原理
维生素C （Vc ）又称抗坏血酸，分子式为C 6H 8O 6。Vc 具有还原性，可被I 2定量氧化，因而可用I 2标准溶液直接滴定。其滴定反应式为：C 6H 8O 6+I2=C6H 6O 6+2HI。用直接碘量法可测定药物中的Vc 含量。
由于Vc 的还原性很强，较易被溶液和空气中的氧氧化，在碱性介质中这种氧化作用更强，因此滴定宜在酸性介质中进行，以减少副反应的发生。考虑到I -在强酸性溶液中也易被氧化，故一般选在pH=3～4的弱酸性溶液中进行滴定。
三、主要仪器与药品
棕色滴定管：25 mL、移液管：50 mL、刻度吸管、量瓶100ml
维生素C 片、维生素C 注射液、I 2溶液、淀粉指示液
四、操作
维生素C 为白色或略带淡黄色片，含维生素C 应为标示量的93.0%-107.0%。
（一）维生素C 片
取本品适量相当于含Vc1.0g ，加水20ml ，振摇使溶解；将溶液滤过，取滤液，照紫外-可见分光光度法（附录IVA ），在420nm 的波长处测定吸光度，不得过0.07。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于维生素C 0.2g），置100 mL量瓶中，加新沸过的冷水100 mL与2mol·L -1稀醋酸10 mL的混合液适量，振摇使维生素C 溶解并稀释至刻度，摇匀，经干燥滤纸迅速滤过，精密量取续滤液50 mL，加淀粉指示液1 mL ，用（0.05 mol/L碘滴定液）滴定，至溶液显蓝色并持续30s 不褪。每1mL 碘滴定液相当于8.806 mg的维生素C 。
（二）维生素C 注射液
本品为维生素 C 的灭菌水溶液，无色或微黄色的澄明液体。含维生素C 应为标示量的90.0%110.0%。本品中可加适量的焦亚硫酸钠为稳定剂。
精密量取本品适量（约相当于维生素C 0.2 g），加水15 mL与丙酮2 mL ，摇匀，放置5 min，加稀醋酸4 mL与淀粉指示液1 mL ，用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色并持续30 s不褪。每1 mL碘滴定液相当于8.806 mg的维生素C 。
五、注意事项
维生素C 在空气中易被氧化，过滤、滴定等操作应迅速。
六、思考题
1. 溶解I 2时，加入过量KI 的作用是什么？
2. 维生素C 固体试样溶解时为何要加入新煮沸并冷却的蒸馏水？
3. 碘量法的误差来源有哪些？应采取哪些措施减小误差？
I 2溶液(约0.05mol·L -1) ：称取3.3g I2和5g KI，置于研钵中，加少量水，在通风橱中研磨。待I 2全部溶解后，将溶液转入棕色试剂瓶中，加水稀释至250mL ，充分摇匀，放暗处保存。
实验 非水滴定法测定诺氟沙星(氟哌酸) 胶囊含量
一、目的
1. 掌握非水滴定法的原理及操作;
2. 熟悉非水滴定在药物分析中的应用。
二、实验原理
1. 定义：非水溶液滴定法即在非水溶剂中进行的滴定分析方法。
一些很弱的酸或碱以及某些盐类，在水溶液中进行滴定时，没有明显的滴定突跃，难于掌握滴定终点；另外还有一些有机化合物，在水中溶解度很小，因此，以水作溶剂的滴定分析受到一定的限制。所以，滴定分析法逐渐采用了各种非水溶剂作为滴定分析的介质，不仅能增大有机化合物的溶解度，而且能改变物质的化学性质（例如酸碱性及其强度），使在水中不能进行完全的滴定反应能够顺利进行。
2. 非水溶液酸碱滴定法：是利用非水溶剂来改变物质的酸碱相对强度，即在水溶液中呈弱酸性或弱碱性的化合物，由于酸碱度太弱，不可能得到滴定的终点。如果选择某些适当的非水溶剂为溶剂使化合物增加相对的酸度成为强酸，或者增加相对的碱度成为强碱，就可以顺利地进行滴定的分析方法。
3. 应用：本法主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐或有机酸盐以及有机酸碱金属盐类药物的含量，也用于测定某些有机弱酸含量。
三、实验材料、设备
诺氟沙星胶囊、丙二酸、醋酐、冰醋酸、高氯酸、橙黄Ⅳ指示液
酸式滴定管、试管、烧杯、水浴锅等
四、操作步骤
1. 诺氟沙星的鉴别
(1)取本品内容物适量(约相当于诺氟沙星0.15g) 置干燥试管中，加丙二酸0.1g 与醋酐2ml ，振摇，并在80－90℃水浴中加热10－15mm ，显红棕色。
(2)取本品内容物适量，加0.4％氢氧化钠溶液适量，振摇使诺氧沙星溶解，稀释成每1ml 中含诺氟沙星5μg，滤过，弃去初滤液，取续滤液，在273，325与336nm 波长处测定有最大吸收。
2. 含量测定 精密称取本品内容物适量(约相当于诺氟沙星0.25g) ，加冰醋酸30ml ，振摇使诺氟沙星溶解，加橙黄Ⅳ指示液10滴，用高氯酸液(0.1mol/L)滴定，至溶液显紫红色，并
将滴定的结果用空白试验校正。
五、注意事项
1.ChP2010版规定本品含诺氟沙星应为标示量的90.0—110.0％, 滴定时, 每1ml0.1mol/L的高氯酸液相当于31.93mg 的C 16H 18FN 3O 3。
2. 0.1mol/L的高氯酸溶液的配制及标定参见ChP2010版附录。高氯酸不稳定，注意避光保存。
3. 水的体膨胀系数较小（0.21×10-3/0C ），一般酸碱标准溶液的浓度受室温改变的影响不大。而多数有机溶剂的体膨胀系数较大，例如，冰醋酸的体膨胀系数为（1.1×10-3/0C ）其体积随温度改变较大。所以高氯酸冰醋酸溶液滴定样品时和标定时温度若有差别，则应重新标定或按下式将标准溶液的浓度加以校正：
C 1=C 0 t 1-t 01+0. 0011
式中：0.0011为冰醋酸的体膨胀系数，t 0为标定时的温度，t 1为测定时的温度，C 0为标定时的浓度，C 1为测定时的浓度。
4. 现行药典对本品含量测定的方法为HPLC 法。
五、思考题
非水滴定应用于药物分析有何特点? 哪几类药物适合用非水滴定法测定其含
量。
实验 槐花的质量检验
一、目的
1. 了解中药分析检验常用的方法与特点;
2. 熟悉连续回流提取法；
3. 掌握黄酮类化合物的性质鉴别及比色法测定含量的原理及方法。
二、实验原理
按中华人民共和国药典，槐花项下规定了于槐花质量相关的项目有：形状、鉴别、检查、浸出物、含量测定等。
1. 槐花中主要含有黄酮类化合物，其典型的代表性化合物为芦丁。芦丁可以发生的特征反应：
盐酸-镁粉反应
2. 该法主要使用索氏提取器通过连续回流提取法对槐花中的总黄酮进行提取，然后以分光光度法，以芦丁为对照品，在500nm 处进行测定。本品于60℃干燥 6小时，含芦丁(C27H 30O 16) 槐花不得少于8.0％ ，槐米不得少于20.0％。
三、实验材料、设备
槐花、硝酸铝、亚硝酸钠、盐酸、氢氧化钠
水浴锅、电加热套、显微镜、索氏提取器、冷凝管、碘量瓶等
四、操作步骤
1. 性状
槐花 本品皱缩而卷曲，花瓣多散落。完整者花萼钟状，黄绿色，先端5 浅裂；花瓣5 ，
黄色或黄白色，1 片较大，近圆形，先端微凹，其余 4片长圆形。雄蕊10，其中9 个基部连合，花丝细长。雌蕊圆柱形，弯曲。体轻。无臭，味微苦。
槐米 呈卵形或椭圆形，长2～6mm ，直径约2mm 。花萼下部有数条纵纹。萼的上方为黄白色未开放的花瓣。花梗细小。体轻，手捻即碎。无臭，味微苦涩。
2. 鉴别
(1) 本品粉末黄绿色。花粉粒类球形或钝三角形，直径14～19μm 。具3 个萌发孔。非腺毛1～3细胞，长86～660μm ，气孔不定式，副卫细胞4～8个。草酸钙方晶少见。
(2) 取本品粉末0.1g ，加乙醇10ml ，加热5 分钟，滤过。取滤液1ml ，加镁粉少量与盐酸2～3滴，即显樱红色。
(3) 取本品粉末0.2g ，加甲醇5ml, 密塞，振摇10分钟，放置10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取芦丁对照品，加甲醇制成每1ml 含4mg 的溶液，作为对照品溶液。 照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各10μl, 分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以醋酸乙酯－甲酸－水(8:1:1) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置紫外光灯(365nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2. 浸出物
取供试品约2~4克，精密称定，置100-250ml 锥形瓶中，精密加30%甲醇50-100ml ，密塞，称定重量，静置一小时后连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸一小时，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25ml ，至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴上干燥后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量，除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物含量%。用30%甲醇作溶剂，槐花不得少于37.0%；槐米不得少于43.0%。
3. 含量测定 对照品溶液的制备 精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品200mg, 置100ml 量瓶中，加甲醇70ml ，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密吸取10ml ，置100ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每1ml 中含无水芦丁0.2mg ）。 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0ml 、1.0ml 、2.0ml 、3.0ml 、4.0ml 、5.0ml 与6.0ml, 分别置25ml 量瓶中，各加水至6ml, 加 5％亚硝酸钠溶液1ml, 使混匀，放置 6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml, 摇匀，放置6 分钟，加氢氧化钠试液10ml ，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法（附录ⅤB），在500nm 的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
取本品粗粉约1g ，于60℃干燥6 小时，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚120ml, 加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲醇90ml ，加热回流至提取液无色，移置100ml 量瓶中，用甲醇少量洗涤容器，洗液并入量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10ml ，置100ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3ml, 置25ml 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至 6ml”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量(μg) ，计算，即得。本品于60℃干燥 6小时，含芦丁(C27H 30O 16) 槐花不得少于8.0％ ，槐米不得少于20.0％。
五、思考题
为何以分光光度法测定总黄酮含量，需要添加硝酸铝？