遗 传HEREDITAS (Beijing ) 28(12): 1549~1554, 2006
研究报告
DOI: 10.1360/yc-006-1549
用微卫星标记分析皱纹盘鲍群体的遗传变异
李 莉1,2, 孙振兴1, 杨树德1, 常林瑞1, 杨立红1
(1. 鲁东大学生命科学学院, 烟台 264025; 2. 上海水产大学生命科学与技术学院, 上海 200090)
摘 要: 利用微卫星标记技术, 对皱纹盘鲍山东长岛和辽宁獐子岛的两个野生群体以及山东崆峒岛一个养殖群体的遗传变异进行了分析。对6个微卫星基因座的多态性进行了评估, 各基因座的多态信息含量(PIC ) 值均大于0.5, 适合对鲍群体遗传结构的分析。结果表明, 这6个基因座在3个皱纹盘鲍群体中共获得57个等位基因, 等位基因数(A ) 平均为9.50, 有效等位基因数(N e ) 平均为5.8572, 平均杂合度观测值(H o ) 和期望值(H e ) 分别为0.6925和0.7966; 两个野生群体的杂合度观测值(H o ) 和期望值(H e ) 均高于养殖群体。上述结果为保护和利用皱纹盘鲍的遗传多样性提供了依据。
关键词: 皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai); 微卫星基因座; 遗传变异 中图分类号: Q959.3; Q78 文献标识码: A
文章编号: 0253-9772(2006)12-1549-06
Analysis of Genetic Variation of Abalone (Haliotis discus hannai) Populations with Microsatellite Markers
LI Li1,2, SUN Zhen-Xing1, YANG Shu-De1, CHANG Lin-Rui1, YANG Li-Hong1
(1. College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China ; 2. College of Life Science and Technology,
Shanghai Fisheries University, Shanghai 200090, China)
Abstract: Microsatellite markers were used to access the genetic variation in three populations of abalone Haliotis discus hannai. Two wild populations were collected from the sea areas in Changdao, Shandong and Dalian, Liaoning respectively. A cultivated population originated from the sea area in Kongdongdao, Shangdong. Six microsatellite loci were screened for genetic polymorphism. Polymorphic information content (PIC ) value per loci was greater than 0.5 and can be used to analysis of genetic structure of the three abalone populations. Fifty-seven alleles were amplified from the three populations in six microsatellite loci. The average number of alleles (A ) was 9.50 and the effective number of alleles (N e ) was 5.8572. The mean observed heterozygosity (H o ) and the mean expected heterozygosity (H e ) were 0.6925 and 0.7966, respectively. The Ho and He of two wild abalone populations were higher than that of cultured population. All these results provide a basis for conservation and utilization of genetic diversity of Haliotis discus hannai .
Key words: Haliotis discus hannai; microsatellite locus; genetic variation
鲍是海洋贝类中最具经济价值的种类之一, 由于其营养丰富和可观的市场价格, 世界上许多国家都开展了鲍的增养殖与渔业生产。皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)是鲍科贝类在我国北方的唯一种,
收稿日期: 2006-02-27; 修回日期: 2006-04-16
主要分布于我国的辽宁、山东沿海及日本北部沿海, 自20世纪80年代以来, 鲍的人工养殖已成为我国水产养殖的又一新兴产业。但由于近年来海洋环境污染、种质退化等导致鲍的病害频发、抗逆性减退, 使
基金项目: 山东省自然科学基金资助项目(编号: Y2002D12)[Supported by Natural Science Foundation of Shandong Province (No. Y2002D12)] 作者简介: 李 莉(1980－), 女, 硕士研究生, 专业方向: 贝类遗传育种学。Tel: 0535-6681053; E-mail: [email protected] 通讯作者: 孙振兴(1956－), 男, 博士, 教授, 研究方向: 贝类遗传育种学。Tel: 0535-6681053; E-mail: [email protected]
1550 遗 传HEREDITAS (Beijing ) 2006 28卷
鲍养殖业受到了极大的影响。因此, 培育抗病性强、生产性状优良的鲍新品种, 已成为当务之急。进行遗传多样性研究能够为品种改良和育种提供理论指导, 分子标记技术的发展无疑为此提供了一种有效的手段。
微卫星(microsatellite)标记近年来在鱼虾类等水生动物的研究中也逐渐得到了应用[1~3]。在鲍的研究方面, 国外报道了鲍微卫星DNA 的分离[4~5]以及利用微卫星标记研究鲍的遗传多样性等[6~8], 但国内包括鲍在内的水生贝类中仅有零星报道[9], 对鲍的群体遗传研究主要集中在等位酶[10]、RAPD [11,12]和AFLP 标记[13] 等, 迄今尚未见国内有关微卫星研究鲍遗传多样性的报道。本文以我国皱纹盘鲍主产地的两个野生群体和一个养殖群体为对象, 应用微卫星标记对其遗传变异进行了分析, 现报道如下。
活体运回实验室后置于−74℃冰箱中保存备用。 1.2 DNA提取、微卫星标记的选择和引物设计
基因组DNA 的提取参照李莉等[12]的方法。根据文献[4,7,8]报道的皱纹盘鲍微卫星标记及其引物序列, 从中选择了8对等位基因数目多、多态性丰富的微卫星引物, 另外参照GenBank 已公布的皱纹盘鲍相关序列, 用引物设计软件Primer Premier 5.0自行设计了6对引物, 所有14对引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; 经过预实验筛选, 最后选用6对较为理想的微卫星引物, 这6对引物的特性见表2。
1.3 PCR反应条件
PCR 反应总体积为25 µL, 其中10×buffer, 1.5 mmol/L的Mg 2+, 正、反向引物各0.2 µmol/L, 0.2 m mol/L的dNTP, 1.5 U Taq 酶, 40 ng模板DNA 。在PE–9600型PCR 仪上进行扩增, 反应程序为95℃预变性5 min, 94℃变性45 s, 复性45 s, 72℃延伸90 s, 40个循环后, 72℃延伸10 min, 4℃保存。
1 材料和方法
1.1 材料
供实验用的皱纹盘鲍各群体的样品来源见表1,
表1 实验用皱纹盘鲍样品的来源
Table 1 The sources of the Haliotis discus hannai samples used in the present study
编号
No. DW CW KC
群体名称
Name of population 辽宁大连野生群体 Wild population from Dalian, Liaoning 山东长岛野生群体 Wild population from Changdao, Shandong 山东崆峒岛养殖群体 Cultured population from Kongdongdao
样品采集地 Sampled area
辽宁獐子岛海域
Sea area of Zhangzidao, Liaoning
长岛砣矶岛海域
Sea area of Tuojidao, Changdao山东崆峒岛海域 Sea area of
Kongdongdao, Shandong
经度(E) / 纬度(N) Longitude / Latitude
取样个体数 No. of individuals
采样时间(年-月) Date of sampling (Year-Month)
2004-12 2004-12 2004-12
E122°45′ / N39°04′ 14 E120°42′ / N38°12′ 22 E121°23′ / N37°36′ 22
表2 6个微卫星标记的核心序列、引物序列及其PCR 参数
Table 2 The repeats motif, primer sequences and PCR parameter of the 6 microsatellite DNA loci
基因座 Locus
核心重复序列 Repeats motif
引物序列(5′→3′)
Primer sequences (5′→3′)
R: TACTGTCAGTCCACATAGGAT F: TTGCTCCCAAAGGAAAGAAC
R: ATGTTTACAAATCTGTATGTTCAGCT F: TAAAGTCTTGAAACAGATAT R: GACATCGCCTTTAATTAGTC
F: ACCTGACAGCGAAACGTTGTTCT R: TGTGACGGCGGTCTGTAAATTATCTAF: GACGGCATTTCCTCCAAC R: CAGGTACGATTCCCCACAT F: AGGAACAAGTTGGCTCTGAT R: GAAATTGGGTTTTGCGTC
复性温度(℃) Annealing temperatures (℃)
片段长度(bp)
Fragment length(bp)
注册号 GenBank Acc. No.
Hd535[8] (CTCA)14 Hd601[8] (CGCA)5(CA)9 Hd724[8] (TC)7T 2A(CT)14 Hdd114B [4] (CA)13(CGCA)11 Hd-13 (GAGT)8 Hd-20 (CA)8(CG)5
58 160~240 AB178065
58 140~210 AB178069
58 170~230 AB178076
61 190~240 AB025387 63 160~220 61 240~320
12期 李 莉等: 用微卫星标记分析皱纹盘鲍群体的遗传变异 1551
1.4 扩增产物的电泳检测和基因型的判定
PCR 扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离, 电压为8 V/cm, 电泳后用0.2%硝酸银染色。扫描仪记录电泳图谱, 将图谱中的每条DNA 带作为基因座位的一个等位基因, 根据每个个体产生的条带位置确定其基因型。 1.5 数据统计
群体内遗传变异的分析, 用PopGene(V 1.32)软件计算等位基因频率、等位基因数(A ) 、有效等位基因数(N e ) 、杂合度观测值(H o ) 和期望值(H e ) [14]。参照文献[15]计算多态信息含量(polymorphism informa-tion content, PIC ):
的频率, m 为等位基因数。
群体间遗传变异的分析, 计算群体间的Nei 氏标准遗传距离(D s ) 和D A 距离[16], 用DISPAN 软件计算基因分化系数(G st ) 。
2 结 果
2.1 微卫星DNA 多态性的检测
本研究中, 用筛选出的6对微卫星引物对皱纹盘鲍的2个野生群体和1个养殖群体进行扩增, 都能稳定重复地扩增出相应的产物, 部分微卫星引物对3个群体PCR 扩增产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果见图1。在6个基因座位中共检测出57个等位基因, 平均为9.50, 其中, 微卫星Hd535基因座位检测出13个等位基因, 等位基因数目最多; 微卫星Hd-13和Hd-20基因座位均检测出6个等位基因, 等位基因数目最少(表3) 。
PIC =1−∑p i 2−∑
i =1
m m −1m
i =1j =i +1
∑2p i 2p 2j
式中, Pi 和Pj 分别为第i 和第j 个等位基因在群体中
图1 微卫星Hd535和Hd724的PCR 产物电泳图谱
M:标准DNA 样品; A: Hd535对DW 群体的扩增结果; B: Hd535对CW 群体的扩增结果; C: Hd724对KC 群体的扩增结果。
Fig. 1 A profile of PCR product of microsatellite Hd535 and Hd724
M: DNA marker; A: Samples from DW population using Hd535; B: Samples from CW population using Hd535;
C: Samples from KC population using Hd724.
表3 6个微卫星基因座在3个鲍群体中的遗传参数统计
Table 3 Statistics of genetic parameter for six microsatellite loci in three abalone populations
观测杂合度 期望杂合度 基因分化系数 基因座 多态信息含量 等位基因数 有效等位基因数
H o H e G st Locus PIC A N e
Hd535 0.8645 13.0000 7.7068 0.7931 0.8702 0.0302 Hd724 0.8639 11.0000 7.5937 0.6552 Hdd114B 0.8428 11.0000 6.6879
0.7069
Hd601 0.8236 10.0000 6.0018 0.8448 Hd-13 0.7788 6.0000 4.8683 0.5345 Hd-20 0.5336 6.0000 2.2846 0.6207 平均值 Mean
0.7845 9.5000 5.8572 0.6925
0.8683 0.8505 0.8334 0.7946 0.5623 0.7966
0.0156 0.0398 0.0317 0.0534 0.0228 0.0323
1552 遗 传HEREDITAS (Beijing ) 2006 28卷
2.2 6个微卫星基因座位的遗传多态性
根据对3个皱纹盘鲍群体在6个微卫星基因座上的等位基因频率统计结果, 计算了各基因座的多态信息含量、有效等位基因数、杂合度和基因分化系数(表3) 。从表3中可以看出, 6个微卫星基因座的PIC 值均在0.5以上, 变化范围为0.5336~0.8645, 平均为0.7845; 其中Hd535最大, 而Hd-20最小。在6个微卫星基因座中, 有效等位基因数为2.2846~ 7.7068, Hd535最大, Hd-20最小, 平均有效等位基因数为5.8572。多态信息含量和有效等位基因数的大小顺序依次为Hd535>Hd724>Hdd114B>Hd601> Hd-13>Hd-20, 由此可见, 6个微卫星基因座中, Hd535具有较大的遗传变异, Hd-20具有较小的遗传变异。另外, 从表4中还可以看出, 观测杂合度(H o ) 的变化范围为0.5345~0.8448, 平均为0.6925; 期望杂合度(H e ) 的变化范围为0.5623~0.8702, 平均为0.7966。基因分化系数在不同基因座有较大差异, 变化范围为0.0155~0.0535。 2.3 皱纹盘鲍群体的遗传变异
3个皱纹盘鲍群体的平均遗传多态性见表4。从表4的各项遗传参数中可以看出, 野生群体的遗传变异较大, 其中以大连野生群体的遗传变异最大, 而崆峒岛养殖群体的变异最小, 表明野生群体比养殖群体的遗传多样性丰富。
另外, 从表3基因分化系数平均为0.0323来看, 即有3.23%的遗传变异存在于群体之间, 绝大部分
(96.77%)变异存在于群体内, 显示各群体间的分化程度较弱, 而群体内的遗传变异程度较高。
皱纹盘鲍3个群体之间的遗传距离见表5。由表5可见, 无论是D S 标准遗传距离还是D A 距离, 2个野生群体之间的遗传距离最小, 而它们与KC 养殖群体之间的遗传距离都较大, 这与笔者等用RAPD 标记分析上述3个群体所得结果[12]的趋势是一致的。
3 讨 论
3.1 关于遗传变异的度量
PIC 值是等位基因频率和数目变化的函数, 反映出基因变异程度的高低。根据Bostein 等[15]提出的衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标, 当PIC >0.5时, 该基因座为高度多态基因座; 当0.25
杂合度是度量群体变异的一个重要参数。平均杂合度的大小近似反映出群体遗传结构变异程度的高低。杂合度越高, 表明该群体的遗传多样性越高; 反之, 说明群体的遗传一致性越高。本研究得出的平均杂合度观测值为0.53~0.84(表3), 这与Takezaki 等[17]认 为微卫星计算出的杂合度范围为0.3~0.8基本吻合, 而且与微卫星标记研究的日本群体皱纹盘鲍观测杂合度为0.47~0.94[7]、耳鲍(H. asinina) 观测杂合度为0.27~0.85[6]、勘察加鲍(H. kamtschatkana) 观测
表4 3个皱纹盘鲍群体的平均遗传多态性
Table 4 Average genetic polymorphisms in three populations of Haliotis discus hannai
群体 Population
多态信息含量
PIC
等位基因数
A
有效等位基因数
N e
观测杂合度
H o
期望杂合度
H e
DW 0.7747 CW 0.7628
7.5000 8.5000
5.2034 0.7143 0.7832 5.2020 0.6970 0.7784 4.8855 0.6742 0.7540
KC 0.7380 7.3333
表5 3个鲍群体之间的DS 标准遗传距离(对角线下方) 和DA 距离(对角线上方)
Table 5 The DS standard genetic distance (below diagonal) and DA distance (above diagonal) among three abalone populations
群体 Population
DW CW KC
DW ***** 0.0973 0.1296
CW 0.1509 ***** 0.1841
KC 0.1815 0.2226 *****
12期 李 莉等: 用微卫星标记分析皱纹盘鲍群体的遗传变异 1553
杂合度为0.41~0.89 [18]的结果相似, 也说明我国皱纹盘鲍的群体遗传多样性仍处于较高水平, 具有一定的遗传变异潜力。
度量群体遗传变异大小的另一个指标是有效等位基因数, 它反映了基因座等位基因间的相互作用。通常检测到的等位基因数往往大于有效等位基因数, 本研究中的情况也是如此, 这是由于一般把所检测到的等位基因都作为相同效应来分析, 但实际上这是不可能的, 因此出现有效等位基因数小于等位基因数的现象。本研究中, 从群体角度看, 3个群体中检测到的有效等位基因数为4.89~5.20(表4); 从基因座角度看, 除了Hd-20以外, 其它基因座的有效等位基因数都大于4(表3), 从而保证了遗传分析的可靠
选择的潜力也越小。因此, 进行皱纹盘鲍人工繁殖时, 应首选健康的野生个体作为亲本, 并选择遗传距离较大的异地个体作为亲本, 这样既有利于种内不同地理群体之间的基因交流, 也可以避免因近亲交配而导致遗传多样性下降。养殖群体的遗传多样性水平较低, 往往是由于人工繁殖时亲本数量有限、近交机会增加, 以及群体规模较小、特定的环境等因素所致[21]。这也提示我们在实施对皱纹盘鲍种质资源保护策略时, 既要保护皱纹盘鲍的野生群体, 防止人为因素对野生群体的进一步破坏, 也要加强对养殖群体的选择, 避免养殖群体的遗传多样性水平降低。 参 考 文 献(References):
性。另一方面, 检测到的有效等位基因数越接近等位基因数, 则等位基因在群体中的分布越均匀[19]。本研究检测到的等位基因数平均为9.50, 有效等位基因数平均为5.89, 两者有一定差距, 这有可能是等位基因的分布不均匀, 也可能是因本试验所用样本数较少而对结果产生的影响。 3.2 关于鲍群体间的遗传距离
遗传距离是反映群体间遗传变异的重要指标, 一般认为分析种内不同群体的遗传关系时, D A 距离比D S 标准遗传距离更为可靠[17]。从本文结果(表5)
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看, D A 距离和D S 标准遗传距离值虽然略有不同, 但二者所得结果的趋势是相同的, 即2个皱纹盘鲍野生群体间的遗传距离小于它们与养殖群体间的遗传距离, 表明野生群体之间的变异较小, 而野生与养殖群体之间出现了一定程度的变异, 这一现象与养殖群体样本来自人工累代繁殖的后代、丢失了某些遗传多样性有关[20]。另外, 无论是D A 距离还是D S 标准遗传距离, KC养殖群体与CW 野生群体之间的遗传距离都最大, 而实际上KC 群体与CW 群体间的地理距离最小, 这也印证了遗传距离与地理距离并没有显著的相关性[16]。
3.3 关于保护和利用鲍的遗传多样性
从本研究的结果看, 我国北方皱纹盘鲍野生群体的遗传多样性高于养殖群体, 这与笔者等用RAPD 标记分析得到的结果[12]是相同的。从育种的角度而言, 群体的遗传多样性越丰富, 群体变异性也越大, 选择的潜力也越大; 反之, 群体变异性越小,
1554 遗 传HEREDITAS (Beijing ) 2006 28卷
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关键词: 皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai); 微卫星基因座; 遗传变异 中图分类号: Q959.3; Q78 文献标识码: A
文章编号: 0253-9772(2006)12-1549-06
Analysis of Genetic Variation of Abalone (Haliotis discus hannai) Populations with Microsatellite Markers
LI Li1,2, SUN Zhen-Xing1, YANG Shu-De1, CHANG Lin-Rui1, YANG Li-Hong1
(1. College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China ; 2. College of Life Science and Technology,
Shanghai Fisheries University, Shanghai 200090, China)
Abstract: Microsatellite markers were used to access the genetic variation in three populations of abalone Haliotis discus hannai. Two wild populations were collected from the sea areas in Changdao, Shandong and Dalian, Liaoning respectively. A cultivated population originated from the sea area in Kongdongdao, Shangdong. Six microsatellite loci were screened for genetic polymorphism. Polymorphic information content (PIC ) value per loci was greater than 0.5 and can be used to analysis of genetic structure of the three abalone populations. Fifty-seven alleles were amplified from the three populations in six microsatellite loci. The average number of alleles (A ) was 9.50 and the effective number of alleles (N e ) was 5.8572. The mean observed heterozygosity (H o ) and the mean expected heterozygosity (H e ) were 0.6925 and 0.7966, respectively. The Ho and He of two wild abalone populations were higher than that of cultured population. All these results provide a basis for conservation and utilization of genetic diversity of Haliotis discus hannai .
Key words: Haliotis discus hannai; microsatellite locus; genetic variation
鲍是海洋贝类中最具经济价值的种类之一, 由于其营养丰富和可观的市场价格, 世界上许多国家都开展了鲍的增养殖与渔业生产。皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)是鲍科贝类在我国北方的唯一种,
收稿日期: 2006-02-27; 修回日期: 2006-04-16
主要分布于我国的辽宁、山东沿海及日本北部沿海, 自20世纪80年代以来, 鲍的人工养殖已成为我国水产养殖的又一新兴产业。但由于近年来海洋环境污染、种质退化等导致鲍的病害频发、抗逆性减退, 使
基金项目: 山东省自然科学基金资助项目(编号: Y2002D12)[Supported by Natural Science Foundation of Shandong Province (No. Y2002D12)] 作者简介: 李 莉(1980－), 女, 硕士研究生, 专业方向: 贝类遗传育种学。Tel: 0535-6681053; E-mail: [email protected] 通讯作者: 孙振兴(1956－), 男, 博士, 教授, 研究方向: 贝类遗传育种学。Tel: 0535-6681053; E-mail: [email protected]
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鲍养殖业受到了极大的影响。因此, 培育抗病性强、生产性状优良的鲍新品种, 已成为当务之急。进行遗传多样性研究能够为品种改良和育种提供理论指导, 分子标记技术的发展无疑为此提供了一种有效的手段。
微卫星(microsatellite)标记近年来在鱼虾类等水生动物的研究中也逐渐得到了应用[1~3]。在鲍的研究方面, 国外报道了鲍微卫星DNA 的分离[4~5]以及利用微卫星标记研究鲍的遗传多样性等[6~8], 但国内包括鲍在内的水生贝类中仅有零星报道[9], 对鲍的群体遗传研究主要集中在等位酶[10]、RAPD [11,12]和AFLP 标记[13] 等, 迄今尚未见国内有关微卫星研究鲍遗传多样性的报道。本文以我国皱纹盘鲍主产地的两个野生群体和一个养殖群体为对象, 应用微卫星标记对其遗传变异进行了分析, 现报道如下。
活体运回实验室后置于−74℃冰箱中保存备用。 1.2 DNA提取、微卫星标记的选择和引物设计
基因组DNA 的提取参照李莉等[12]的方法。根据文献[4,7,8]报道的皱纹盘鲍微卫星标记及其引物序列, 从中选择了8对等位基因数目多、多态性丰富的微卫星引物, 另外参照GenBank 已公布的皱纹盘鲍相关序列, 用引物设计软件Primer Premier 5.0自行设计了6对引物, 所有14对引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; 经过预实验筛选, 最后选用6对较为理想的微卫星引物, 这6对引物的特性见表2。
1.3 PCR反应条件
PCR 反应总体积为25 µL, 其中10×buffer, 1.5 mmol/L的Mg 2+, 正、反向引物各0.2 µmol/L, 0.2 m mol/L的dNTP, 1.5 U Taq 酶, 40 ng模板DNA 。在PE–9600型PCR 仪上进行扩增, 反应程序为95℃预变性5 min, 94℃变性45 s, 复性45 s, 72℃延伸90 s, 40个循环后, 72℃延伸10 min, 4℃保存。
1 材料和方法
1.1 材料
供实验用的皱纹盘鲍各群体的样品来源见表1,
表1 实验用皱纹盘鲍样品的来源
Table 1 The sources of the Haliotis discus hannai samples used in the present study
编号
No. DW CW KC
群体名称
Name of population 辽宁大连野生群体 Wild population from Dalian, Liaoning 山东长岛野生群体 Wild population from Changdao, Shandong 山东崆峒岛养殖群体 Cultured population from Kongdongdao
样品采集地 Sampled area
辽宁獐子岛海域
Sea area of Zhangzidao, Liaoning
长岛砣矶岛海域
Sea area of Tuojidao, Changdao山东崆峒岛海域 Sea area of
Kongdongdao, Shandong
经度(E) / 纬度(N) Longitude / Latitude
取样个体数 No. of individuals
采样时间(年-月) Date of sampling (Year-Month)
2004-12 2004-12 2004-12
E122°45′ / N39°04′ 14 E120°42′ / N38°12′ 22 E121°23′ / N37°36′ 22
表2 6个微卫星标记的核心序列、引物序列及其PCR 参数
Table 2 The repeats motif, primer sequences and PCR parameter of the 6 microsatellite DNA loci
基因座 Locus
核心重复序列 Repeats motif
引物序列(5′→3′)
Primer sequences (5′→3′)
R: TACTGTCAGTCCACATAGGAT F: TTGCTCCCAAAGGAAAGAAC
R: ATGTTTACAAATCTGTATGTTCAGCT F: TAAAGTCTTGAAACAGATAT R: GACATCGCCTTTAATTAGTC
F: ACCTGACAGCGAAACGTTGTTCT R: TGTGACGGCGGTCTGTAAATTATCTAF: GACGGCATTTCCTCCAAC R: CAGGTACGATTCCCCACAT F: AGGAACAAGTTGGCTCTGAT R: GAAATTGGGTTTTGCGTC
复性温度(℃) Annealing temperatures (℃)
片段长度(bp)
Fragment length(bp)
注册号 GenBank Acc. No.
Hd535[8] (CTCA)14 Hd601[8] (CGCA)5(CA)9 Hd724[8] (TC)7T 2A(CT)14 Hdd114B [4] (CA)13(CGCA)11 Hd-13 (GAGT)8 Hd-20 (CA)8(CG)5
58 160~240 AB178065
58 140~210 AB178069
58 170~230 AB178076
61 190~240 AB025387 63 160~220 61 240~320
12期 李 莉等: 用微卫星标记分析皱纹盘鲍群体的遗传变异 1551
1.4 扩增产物的电泳检测和基因型的判定
PCR 扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离, 电压为8 V/cm, 电泳后用0.2%硝酸银染色。扫描仪记录电泳图谱, 将图谱中的每条DNA 带作为基因座位的一个等位基因, 根据每个个体产生的条带位置确定其基因型。 1.5 数据统计
群体内遗传变异的分析, 用PopGene(V 1.32)软件计算等位基因频率、等位基因数(A ) 、有效等位基因数(N e ) 、杂合度观测值(H o ) 和期望值(H e ) [14]。参照文献[15]计算多态信息含量(polymorphism informa-tion content, PIC ):
的频率, m 为等位基因数。
群体间遗传变异的分析, 计算群体间的Nei 氏标准遗传距离(D s ) 和D A 距离[16], 用DISPAN 软件计算基因分化系数(G st ) 。
2 结 果
2.1 微卫星DNA 多态性的检测
本研究中, 用筛选出的6对微卫星引物对皱纹盘鲍的2个野生群体和1个养殖群体进行扩增, 都能稳定重复地扩增出相应的产物, 部分微卫星引物对3个群体PCR 扩增产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果见图1。在6个基因座位中共检测出57个等位基因, 平均为9.50, 其中, 微卫星Hd535基因座位检测出13个等位基因, 等位基因数目最多; 微卫星Hd-13和Hd-20基因座位均检测出6个等位基因, 等位基因数目最少(表3) 。
PIC =1−∑p i 2−∑
i =1
m m −1m
i =1j =i +1
∑2p i 2p 2j
式中, Pi 和Pj 分别为第i 和第j 个等位基因在群体中
图1 微卫星Hd535和Hd724的PCR 产物电泳图谱
M:标准DNA 样品; A: Hd535对DW 群体的扩增结果; B: Hd535对CW 群体的扩增结果; C: Hd724对KC 群体的扩增结果。
Fig. 1 A profile of PCR product of microsatellite Hd535 and Hd724
M: DNA marker; A: Samples from DW population using Hd535; B: Samples from CW population using Hd535;
C: Samples from KC population using Hd724.
表3 6个微卫星基因座在3个鲍群体中的遗传参数统计
Table 3 Statistics of genetic parameter for six microsatellite loci in three abalone populations
观测杂合度 期望杂合度 基因分化系数 基因座 多态信息含量 等位基因数 有效等位基因数
H o H e G st Locus PIC A N e
Hd535 0.8645 13.0000 7.7068 0.7931 0.8702 0.0302 Hd724 0.8639 11.0000 7.5937 0.6552 Hdd114B 0.8428 11.0000 6.6879
0.7069
Hd601 0.8236 10.0000 6.0018 0.8448 Hd-13 0.7788 6.0000 4.8683 0.5345 Hd-20 0.5336 6.0000 2.2846 0.6207 平均值 Mean
0.7845 9.5000 5.8572 0.6925
0.8683 0.8505 0.8334 0.7946 0.5623 0.7966
0.0156 0.0398 0.0317 0.0534 0.0228 0.0323
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2.2 6个微卫星基因座位的遗传多态性
根据对3个皱纹盘鲍群体在6个微卫星基因座上的等位基因频率统计结果, 计算了各基因座的多态信息含量、有效等位基因数、杂合度和基因分化系数(表3) 。从表3中可以看出, 6个微卫星基因座的PIC 值均在0.5以上, 变化范围为0.5336~0.8645, 平均为0.7845; 其中Hd535最大, 而Hd-20最小。在6个微卫星基因座中, 有效等位基因数为2.2846~ 7.7068, Hd535最大, Hd-20最小, 平均有效等位基因数为5.8572。多态信息含量和有效等位基因数的大小顺序依次为Hd535>Hd724>Hdd114B>Hd601> Hd-13>Hd-20, 由此可见, 6个微卫星基因座中, Hd535具有较大的遗传变异, Hd-20具有较小的遗传变异。另外, 从表4中还可以看出, 观测杂合度(H o ) 的变化范围为0.5345~0.8448, 平均为0.6925; 期望杂合度(H e ) 的变化范围为0.5623~0.8702, 平均为0.7966。基因分化系数在不同基因座有较大差异, 变化范围为0.0155~0.0535。 2.3 皱纹盘鲍群体的遗传变异
3个皱纹盘鲍群体的平均遗传多态性见表4。从表4的各项遗传参数中可以看出, 野生群体的遗传变异较大, 其中以大连野生群体的遗传变异最大, 而崆峒岛养殖群体的变异最小, 表明野生群体比养殖群体的遗传多样性丰富。
另外, 从表3基因分化系数平均为0.0323来看, 即有3.23%的遗传变异存在于群体之间, 绝大部分
(96.77%)变异存在于群体内, 显示各群体间的分化程度较弱, 而群体内的遗传变异程度较高。
皱纹盘鲍3个群体之间的遗传距离见表5。由表5可见, 无论是D S 标准遗传距离还是D A 距离, 2个野生群体之间的遗传距离最小, 而它们与KC 养殖群体之间的遗传距离都较大, 这与笔者等用RAPD 标记分析上述3个群体所得结果[12]的趋势是一致的。
3 讨 论
3.1 关于遗传变异的度量
PIC 值是等位基因频率和数目变化的函数, 反映出基因变异程度的高低。根据Bostein 等[15]提出的衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标, 当PIC >0.5时, 该基因座为高度多态基因座; 当0.25
杂合度是度量群体变异的一个重要参数。平均杂合度的大小近似反映出群体遗传结构变异程度的高低。杂合度越高, 表明该群体的遗传多样性越高; 反之, 说明群体的遗传一致性越高。本研究得出的平均杂合度观测值为0.53~0.84(表3), 这与Takezaki 等[17]认 为微卫星计算出的杂合度范围为0.3~0.8基本吻合, 而且与微卫星标记研究的日本群体皱纹盘鲍观测杂合度为0.47~0.94[7]、耳鲍(H. asinina) 观测杂合度为0.27~0.85[6]、勘察加鲍(H. kamtschatkana) 观测
表4 3个皱纹盘鲍群体的平均遗传多态性
Table 4 Average genetic polymorphisms in three populations of Haliotis discus hannai
群体 Population
多态信息含量
PIC
等位基因数
A
有效等位基因数
N e
观测杂合度
H o
期望杂合度
H e
DW 0.7747 CW 0.7628
7.5000 8.5000
5.2034 0.7143 0.7832 5.2020 0.6970 0.7784 4.8855 0.6742 0.7540
KC 0.7380 7.3333
表5 3个鲍群体之间的DS 标准遗传距离(对角线下方) 和DA 距离(对角线上方)
Table 5 The DS standard genetic distance (below diagonal) and DA distance (above diagonal) among three abalone populations
群体 Population
DW CW KC
DW ***** 0.0973 0.1296
CW 0.1509 ***** 0.1841
KC 0.1815 0.2226 *****
12期 李 莉等: 用微卫星标记分析皱纹盘鲍群体的遗传变异 1553
杂合度为0.41~0.89 [18]的结果相似, 也说明我国皱纹盘鲍的群体遗传多样性仍处于较高水平, 具有一定的遗传变异潜力。
度量群体遗传变异大小的另一个指标是有效等位基因数, 它反映了基因座等位基因间的相互作用。通常检测到的等位基因数往往大于有效等位基因数, 本研究中的情况也是如此, 这是由于一般把所检测到的等位基因都作为相同效应来分析, 但实际上这是不可能的, 因此出现有效等位基因数小于等位基因数的现象。本研究中, 从群体角度看, 3个群体中检测到的有效等位基因数为4.89~5.20(表4); 从基因座角度看, 除了Hd-20以外, 其它基因座的有效等位基因数都大于4(表3), 从而保证了遗传分析的可靠
选择的潜力也越小。因此, 进行皱纹盘鲍人工繁殖时, 应首选健康的野生个体作为亲本, 并选择遗传距离较大的异地个体作为亲本, 这样既有利于种内不同地理群体之间的基因交流, 也可以避免因近亲交配而导致遗传多样性下降。养殖群体的遗传多样性水平较低, 往往是由于人工繁殖时亲本数量有限、近交机会增加, 以及群体规模较小、特定的环境等因素所致[21]。这也提示我们在实施对皱纹盘鲍种质资源保护策略时, 既要保护皱纹盘鲍的野生群体, 防止人为因素对野生群体的进一步破坏, 也要加强对养殖群体的选择, 避免养殖群体的遗传多样性水平降低。 参 考 文 献(References):
性。另一方面, 检测到的有效等位基因数越接近等位基因数, 则等位基因在群体中的分布越均匀[19]。本研究检测到的等位基因数平均为9.50, 有效等位基因数平均为5.89, 两者有一定差距, 这有可能是等位基因的分布不均匀, 也可能是因本试验所用样本数较少而对结果产生的影响。 3.2 关于鲍群体间的遗传距离
遗传距离是反映群体间遗传变异的重要指标, 一般认为分析种内不同群体的遗传关系时, D A 距离比D S 标准遗传距离更为可靠[17]。从本文结果(表5)
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看, D A 距离和D S 标准遗传距离值虽然略有不同, 但二者所得结果的趋势是相同的, 即2个皱纹盘鲍野生群体间的遗传距离小于它们与养殖群体间的遗传距离, 表明野生群体之间的变异较小, 而野生与养殖群体之间出现了一定程度的变异, 这一现象与养殖群体样本来自人工累代繁殖的后代、丢失了某些遗传多样性有关[20]。另外, 无论是D A 距离还是D S 标准遗传距离, KC养殖群体与CW 野生群体之间的遗传距离都最大, 而实际上KC 群体与CW 群体间的地理距离最小, 这也印证了遗传距离与地理距离并没有显著的相关性[16]。
3.3 关于保护和利用鲍的遗传多样性
从本研究的结果看, 我国北方皱纹盘鲍野生群体的遗传多样性高于养殖群体, 这与笔者等用RAPD 标记分析得到的结果[12]是相同的。从育种的角度而言, 群体的遗传多样性越丰富, 群体变异性也越大, 选择的潜力也越大; 反之, 群体变异性越小,
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