氨基酸生物发酵上的研究
第一部分，通过各种微生物生产L谷氨酸
木下肃雄, 早川冒三, 下农直万
东京研究工作实验室，共和生物发酵实业公司
投稿时间1957年6月27日
简介
微生物法用于氨基酸制备的优势在于产物是纯旋光性.我们的主要研究对象涉及L谷氨酸的生物发酵生产,它作为调味剂拥有巨大的商业价值并且完全可从植物资源上供应.
众所周知谷氨酸是活细胞中氮代谢的主要产物之一并且谷氨脱氢酶系统在氨基酸和糖代谢中表现出一个重要的联系。同样被公认的是，这种方式形成的谷氨酸容易转化成各种氨基酸和蛋白质原料。因此，谷氨酸产品的直接碳源和氮源还未被认真考虑。由于生物发酵产品α-酮戊二酸的高产已成为可能，几种用α-酮戊二酸制备L谷氨酸的方法被报道在学术交流和专业文献上。
氨基酸中的谷氨酸，其形成的合成媒介包含的葡萄糖和无机氮源以各种微生物为来源，一分钟内在细胞内或周围介质中被频繁地检测到。然而，培养基中谷氨酸的积累所需的大量直接碳源和氮源从未被描述，直到最近亚瑟等人的报告。亚瑟等人发表了谷氨酸通过各种微生物发酵生产的报道，独立于这些工人，作者对这一主题进行了广泛的研究，结果发现，L谷氨酸以及某些其他氨基酸可以直接通过多种被选择的微生物提供的碳源和氮源氨源大量生产。
实验和方法
所使用的已知菌株主要来自美联社生物研究所，东京大学和大阪生物发酵研究所。 隔离的生物
细菌；土壤、污水、动物粪便等悬浮液，划线平板上含1%的蛋白胨，0.5%肉类提取物、0.2%酵母提取液，0.25%氯化钠，调节ph值7，培养板在28°C培养2个或三天，培养的生物生长在平板上，转移至相同的琼脂斜面。链霉菌；菌株的原种培养从土壤转移到新鲜的班尼特琼脂斜面。酵母和真菌；通过常规技术从水果，土壤中分离出生物体，用于隔离酒曲提
取物和蛋白胨培养基。
筛选实验
在筛选试验中使用的介质的组合物，在表1中给出.当介质的ph值低于7，人工添加稀氨水来保持中性或稍碱性的使用环境。
所有的介质都含有15mg苯酚红/升
指示剂，苯酚红。50毫升锥形瓶中的15毫升培养基上接种两铂环量的生物，每个倾斜的培养基由旋转振动筛在200转条件下培养，倾斜培养基是为生长在28°C琼脂培养基上所有生物体的分离而准备的，分析了氨基酸和有机酸的肉汤在A、B介质中两天的细菌；A、C介质中培养三天的链霉菌，E介质中培养30小时的尿素分解酵母（测试D介质中的尿酶
活性）；F介质中培养一天的不能分解尿素的酵母（培养18小时后在无菌环境下添加3%的葡萄糖）；C、G介质中培养3天的真菌。
发酵研究
类似介质的筛选被用于生物发酵过程的研究中,使用10%葡萄糖,而不是5%葡萄糖.每分钟150200转转动培养基维持培养基的温度在28~33摄氏度.将20~30毫升的培养基倒入250毫升容量的锥形瓶中,并且接种5%或10%细菌和酵母的肉汤培养液,还有链霉菌和真菌的10%孢子悬浮液（一个倾斜的孢子收集和悬浮在10毫升生理盐水溶液上）.培养液介质包含2%葡萄糖,1%蛋白胨,0.5%肉浸液,0.25%氯化钠,调节ph值为7,细菌包含2%葡萄糖,0.5%蛋白胨,0.1%磷酸钾,0.05%硫酸镁,调节酵母液ph值为6.
分析方法
用纸色谱法对氨基酸进行常规鉴定和粗定量估计,使用50号东洋滤纸,显影溶剂是4正丁醇混合液上层,1乙酸,5水.28摄氏度下显影18~24小时后,纸色谱处理0.15%茚三酮丁醇.对于筛选实验,滴2~4微升肉汤到纸上. 谷氨酸和其他氨基酸的定量分析是由普通的生物测定技术完成,使用肠系膜明串珠菌P-60, 除丙氨酸色谱分析根据丸田等人的方法,有机酸的粗识别由马格和昂伯格的方法一色谱法完成,葡萄糖交由苏木杰的方法,在每分钟3000转的离心分离条件下细胞体积被定义为5毫升肉汤中沉淀的细胞的表观体积.
结果
（1）细菌的生物发酵
在筛选实验中，约有50株已知细菌约600进行了测试.对五分之一株细菌的发酵液进行纸色谱上的谷氨酸点的检测,而且发现菌落呈犬齿状. 检测到的氨基酸的种类和数量各种各样，每个生物体在培养条件下显示出它的特点.
图1 细菌产生的氨基酸的纸色谱
A:藤黄八叠球菌 ,B：1-4号, C:液化荧光假单胞菌 ,D：2-45号,E：肠炎沙门氏菌,F：305号,G：239-2号,H：大肠杆菌,I：液化荧光假单胞菌,J：粘质沙雷氏菌.
滴在纸上的发酵液体积约为1-8微升. 纸层析的条件是文本中所描述的.
1：谷氨酸,2：丙氨酸,3：天冬氨酸,甘氨酸,或丝氨酸4：缬氨酸,5：亮氨酸,6：碱性氨基酸等,7：r-氨基丁酸.
图2 细菌发酵期间的代谢变化
一株微球菌发酵培养基是表1中的介质A,包含的是0.5%蛋白胨和0.2%玉米浆而不是0.2%蛋白胨和肉浆提取物.用于巨大芽孢杆菌和其他细菌的介质是表1中的介质A、B,单独的.
● 每分钟180转转动培养基
● 静置培养
● 断线：葡萄糖
● 实线：L谷氨酸
● 虚线：细胞容积
● 文本中描述的其他培养条件
.
图1所显示的结果,如下图所示,谷氨酸,甘氨酸和缬氨酸各自都是K-12大肠杆菌的主要产物,液化荧光假单胞菌和粘质沙雷氏菌产生的氨基酸.
摇晃中的培养基,在大量细菌发酵液中L谷氨酸的产量约为1毫克/毫升,并且几株细菌中每毫升不超过5毫克.一种属于微球菌属的新品种显示了谷氨酸积累的最高水平.通过改善培养条件,在一定程度上提高了谷氨酸产量.通过某一特定细菌进行发酵的详细描述将会在之后呈上.10%的葡萄糖,每毫升发酵液中的谷氨酸由各种细菌产生.谷氨酸发酵的生产实例见图
2.ph曲线未记录，介质的ph值保持中性.在静止培养基中,根据测试谷氨酸的产量可忽略不计,但这种情况下却形成了大量的丙氨酸.
(2)通过链霉菌发酵
对72种类型的菌约300株进行测试,结果显示, 约三分之一的生物检测到谷氨酸点，约五分之一是丙氨酸的强力生产者.以上结果见图3,图4显示了链霉菌菌株中谷氨酸发酵的一些典型的例子.
图3 链霉菌生产的氨基酸的纸层析
A：链霉菌属,B：淡黄色链霉菌,C：42号C1,D：261号B2,E：261号B3
图例见图
1
图4 发酵过程中链霉菌的代谢变化
介质含有10%葡萄糖,0.1%磷酸钾,0.05%七水硫酸镁,0.5%尿素,有机养分,调节ph至6-7,其他的培养条件均为实验所描述,曲线符号如图2.
图5 酵母液生产的氨基酸的纸层析
A：酿酒酵母, B：赭色掷孢酵母, C:圆酵母, D：粘红酵母, E：No.105-2 F：No.103-1, G：白色隐球菌, H：No.105-2
图例如图
1
图6 酵母液发酵的代谢变化
图例和图4相似，由于培养基非常粘稠，出芽霉的细胞体积不能被测量。
（3）酵母液生物发酵
对78个已知酵母菌种约400株进行了测试,大多数的尿素分解酵母显示了谷氨酸点和剩下的2~3%的葡萄糖（测试的100株大多是红酵母）.370株非尿素分解酵母菌大约有四分之一产生了谷氨酸.尽管这些被测菌株生长的并不好.每毫升液体培养基也能独立生产几毫克谷氨酸.总而言之,在谷氨酸产量上无孢子酵母菌比孢子酵母菌更高.详情见图5图6.
（4）真菌的生物发酵
对75株已知种类的真菌和400株新分离的真菌进行了检测.大约十分之一的真菌能清晰地检测到谷氨酸点.正如酵母的例子所示,许多真菌形成了各种氨基酸尤其以丙氨酸最常见.图7显示了纸层析结果,许多真菌的培养基每毫升能产出几毫克谷氨酸.
图7 真菌生产的氨基酸的层析图
A：黑色根霉菌，B：根霉，C：42号，D：青霉菌，E：91号，F：产黄青霉，G：总状毛霉，H：根霉孢子
图例跟图1相似
图8 真菌生物发酵的代谢变化
（5）氨基酸发酵的一般特性
图9 有机营养物的种类和氮源对氨基酸生物发酵的影响
培养条件与本文中一致，酵母液培养基中的营养物质包括（10%葡萄糖，0.1%磷酸钾，0.05%7水硫酸镁）105-2号如下所示；A：0.5%酵母提取物，B：0.5%玉米浸泡液，C：0.5%蛋白胨。
培养基中其他生物体和组分，它包括0.1%磷酸钾，0.05%7水硫酸镁，0.5%玉米浸泡液，如下所示;
●
●
● D：球拟酵母菌，5%葡萄糖和3%乙酸铵， E：213号真菌，5%葡萄糖和3%乙酸铵， F：571号真菌，10%葡萄糖和2%硝酸铵，纸层析点上液体培养基体积为2微升。每个氨基酸的数值
数据是一样的。
不同微生物产生的氨基酸相当多是丙氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，亮氨酸，缬氨酸，氨基丁酸，和基本的必须氨基酸（纸层析上可以看到尽可能多的点）。一旦形成谷氨酸是否会被分解，经过长时间孵化，取决于所使用的菌株。在许多情况下，谷氨酸产量不会显著改变。但在某些情况下，它会迅速消失，且没有任何污染的迹象。
不同种类菌株培养基有时会被检测到有机酸，检测到的射频乳酸，α同戊二酸和葡萄糖酸点有相近的数值。
培养机组分常对谷氨酸产量有巨大影响，为了生物体更好的生产而添加的有机营养物质对谷氨酸产量通常是有效的，但过量的营养有时会导致谷氨酸产量减少。图9中ABC的色谱显示了由于有机营养物质的种类的增加，谷氨酸和丙氨酸的数量比例明显变化。多种氮源是现成的，如硝酸铵，有机酸铵盐，都能作为氨基酸生产的主要氮源。图9显示了氮源除了用于筛选实验还生产氨基酸的例子。
氨基酸生物发酵上的研究
第一部分，通过各种微生物生产L谷氨酸
木下肃雄, 早川冒三, 下农直万
东京研究工作实验室，共和生物发酵实业公司
投稿时间1957年6月27日
简介
微生物法用于氨基酸制备的优势在于产物是纯旋光性.我们的主要研究对象涉及L谷氨酸的生物发酵生产,它作为调味剂拥有巨大的商业价值并且完全可从植物资源上供应.
众所周知谷氨酸是活细胞中氮代谢的主要产物之一并且谷氨脱氢酶系统在氨基酸和糖代谢中表现出一个重要的联系。同样被公认的是，这种方式形成的谷氨酸容易转化成各种氨基酸和蛋白质原料。因此，谷氨酸产品的直接碳源和氮源还未被认真考虑。由于生物发酵产品α-酮戊二酸的高产已成为可能，几种用α-酮戊二酸制备L谷氨酸的方法被报道在学术交流和专业文献上。
氨基酸中的谷氨酸，其形成的合成媒介包含的葡萄糖和无机氮源以各种微生物为来源，一分钟内在细胞内或周围介质中被频繁地检测到。然而，培养基中谷氨酸的积累所需的大量直接碳源和氮源从未被描述，直到最近亚瑟等人的报告。亚瑟等人发表了谷氨酸通过各种微生物发酵生产的报道，独立于这些工人，作者对这一主题进行了广泛的研究，结果发现，L谷氨酸以及某些其他氨基酸可以直接通过多种被选择的微生物提供的碳源和氮源氨源大量生产。
实验和方法
所使用的已知菌株主要来自美联社生物研究所，东京大学和大阪生物发酵研究所。 隔离的生物
细菌；土壤、污水、动物粪便等悬浮液，划线平板上含1%的蛋白胨，0.5%肉类提取物、0.2%酵母提取液，0.25%氯化钠，调节ph值7，培养板在28°C培养2个或三天，培养的生物生长在平板上，转移至相同的琼脂斜面。链霉菌；菌株的原种培养从土壤转移到新鲜的班尼特琼脂斜面。酵母和真菌；通过常规技术从水果，土壤中分离出生物体，用于隔离酒曲提
取物和蛋白胨培养基。
筛选实验
在筛选试验中使用的介质的组合物，在表1中给出.当介质的ph值低于7，人工添加稀氨水来保持中性或稍碱性的使用环境。
所有的介质都含有15mg苯酚红/升
指示剂，苯酚红。50毫升锥形瓶中的15毫升培养基上接种两铂环量的生物，每个倾斜的培养基由旋转振动筛在200转条件下培养，倾斜培养基是为生长在28°C琼脂培养基上所有生物体的分离而准备的，分析了氨基酸和有机酸的肉汤在A、B介质中两天的细菌；A、C介质中培养三天的链霉菌，E介质中培养30小时的尿素分解酵母（测试D介质中的尿酶
活性）；F介质中培养一天的不能分解尿素的酵母（培养18小时后在无菌环境下添加3%的葡萄糖）；C、G介质中培养3天的真菌。
发酵研究
类似介质的筛选被用于生物发酵过程的研究中,使用10%葡萄糖,而不是5%葡萄糖.每分钟150200转转动培养基维持培养基的温度在28~33摄氏度.将20~30毫升的培养基倒入250毫升容量的锥形瓶中,并且接种5%或10%细菌和酵母的肉汤培养液,还有链霉菌和真菌的10%孢子悬浮液（一个倾斜的孢子收集和悬浮在10毫升生理盐水溶液上）.培养液介质包含2%葡萄糖,1%蛋白胨,0.5%肉浸液,0.25%氯化钠,调节ph值为7,细菌包含2%葡萄糖,0.5%蛋白胨,0.1%磷酸钾,0.05%硫酸镁,调节酵母液ph值为6.
分析方法
用纸色谱法对氨基酸进行常规鉴定和粗定量估计,使用50号东洋滤纸,显影溶剂是4正丁醇混合液上层,1乙酸,5水.28摄氏度下显影18~24小时后,纸色谱处理0.15%茚三酮丁醇.对于筛选实验,滴2~4微升肉汤到纸上. 谷氨酸和其他氨基酸的定量分析是由普通的生物测定技术完成,使用肠系膜明串珠菌P-60, 除丙氨酸色谱分析根据丸田等人的方法,有机酸的粗识别由马格和昂伯格的方法一色谱法完成,葡萄糖交由苏木杰的方法,在每分钟3000转的离心分离条件下细胞体积被定义为5毫升肉汤中沉淀的细胞的表观体积.
结果
（1）细菌的生物发酵
在筛选实验中，约有50株已知细菌约600进行了测试.对五分之一株细菌的发酵液进行纸色谱上的谷氨酸点的检测,而且发现菌落呈犬齿状. 检测到的氨基酸的种类和数量各种各样，每个生物体在培养条件下显示出它的特点.
图1 细菌产生的氨基酸的纸色谱
A:藤黄八叠球菌 ,B：1-4号, C:液化荧光假单胞菌 ,D：2-45号,E：肠炎沙门氏菌,F：305号,G：239-2号,H：大肠杆菌,I：液化荧光假单胞菌,J：粘质沙雷氏菌.
滴在纸上的发酵液体积约为1-8微升. 纸层析的条件是文本中所描述的.
1：谷氨酸,2：丙氨酸,3：天冬氨酸,甘氨酸,或丝氨酸4：缬氨酸,5：亮氨酸,6：碱性氨基酸等,7：r-氨基丁酸.
图2 细菌发酵期间的代谢变化
一株微球菌发酵培养基是表1中的介质A,包含的是0.5%蛋白胨和0.2%玉米浆而不是0.2%蛋白胨和肉浆提取物.用于巨大芽孢杆菌和其他细菌的介质是表1中的介质A、B,单独的.
● 每分钟180转转动培养基
● 静置培养
● 断线：葡萄糖
● 实线：L谷氨酸
● 虚线：细胞容积
● 文本中描述的其他培养条件
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图1所显示的结果,如下图所示,谷氨酸,甘氨酸和缬氨酸各自都是K-12大肠杆菌的主要产物,液化荧光假单胞菌和粘质沙雷氏菌产生的氨基酸.
摇晃中的培养基,在大量细菌发酵液中L谷氨酸的产量约为1毫克/毫升,并且几株细菌中每毫升不超过5毫克.一种属于微球菌属的新品种显示了谷氨酸积累的最高水平.通过改善培养条件,在一定程度上提高了谷氨酸产量.通过某一特定细菌进行发酵的详细描述将会在之后呈上.10%的葡萄糖,每毫升发酵液中的谷氨酸由各种细菌产生.谷氨酸发酵的生产实例见图
2.ph曲线未记录，介质的ph值保持中性.在静止培养基中,根据测试谷氨酸的产量可忽略不计,但这种情况下却形成了大量的丙氨酸.
(2)通过链霉菌发酵
对72种类型的菌约300株进行测试,结果显示, 约三分之一的生物检测到谷氨酸点，约五分之一是丙氨酸的强力生产者.以上结果见图3,图4显示了链霉菌菌株中谷氨酸发酵的一些典型的例子.
图3 链霉菌生产的氨基酸的纸层析
A：链霉菌属,B：淡黄色链霉菌,C：42号C1,D：261号B2,E：261号B3
图例见图
1
图4 发酵过程中链霉菌的代谢变化
介质含有10%葡萄糖,0.1%磷酸钾,0.05%七水硫酸镁,0.5%尿素,有机养分,调节ph至6-7,其他的培养条件均为实验所描述,曲线符号如图2.
图5 酵母液生产的氨基酸的纸层析
A：酿酒酵母, B：赭色掷孢酵母, C:圆酵母, D：粘红酵母, E：No.105-2 F：No.103-1, G：白色隐球菌, H：No.105-2
图例如图
1
图6 酵母液发酵的代谢变化
图例和图4相似，由于培养基非常粘稠，出芽霉的细胞体积不能被测量。
（3）酵母液生物发酵
对78个已知酵母菌种约400株进行了测试,大多数的尿素分解酵母显示了谷氨酸点和剩下的2~3%的葡萄糖（测试的100株大多是红酵母）.370株非尿素分解酵母菌大约有四分之一产生了谷氨酸.尽管这些被测菌株生长的并不好.每毫升液体培养基也能独立生产几毫克谷氨酸.总而言之,在谷氨酸产量上无孢子酵母菌比孢子酵母菌更高.详情见图5图6.
（4）真菌的生物发酵
对75株已知种类的真菌和400株新分离的真菌进行了检测.大约十分之一的真菌能清晰地检测到谷氨酸点.正如酵母的例子所示,许多真菌形成了各种氨基酸尤其以丙氨酸最常见.图7显示了纸层析结果,许多真菌的培养基每毫升能产出几毫克谷氨酸.
图7 真菌生产的氨基酸的层析图
A：黑色根霉菌，B：根霉，C：42号，D：青霉菌，E：91号，F：产黄青霉，G：总状毛霉，H：根霉孢子
图例跟图1相似
图8 真菌生物发酵的代谢变化
（5）氨基酸发酵的一般特性
图9 有机营养物的种类和氮源对氨基酸生物发酵的影响
培养条件与本文中一致，酵母液培养基中的营养物质包括（10%葡萄糖，0.1%磷酸钾，0.05%7水硫酸镁）105-2号如下所示；A：0.5%酵母提取物，B：0.5%玉米浸泡液，C：0.5%蛋白胨。
培养基中其他生物体和组分，它包括0.1%磷酸钾，0.05%7水硫酸镁，0.5%玉米浸泡液，如下所示;
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● D：球拟酵母菌，5%葡萄糖和3%乙酸铵， E：213号真菌，5%葡萄糖和3%乙酸铵， F：571号真菌，10%葡萄糖和2%硝酸铵，纸层析点上液体培养基体积为2微升。每个氨基酸的数值
数据是一样的。
不同微生物产生的氨基酸相当多是丙氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，亮氨酸，缬氨酸，氨基丁酸，和基本的必须氨基酸（纸层析上可以看到尽可能多的点）。一旦形成谷氨酸是否会被分解，经过长时间孵化，取决于所使用的菌株。在许多情况下，谷氨酸产量不会显著改变。但在某些情况下，它会迅速消失，且没有任何污染的迹象。
不同种类菌株培养基有时会被检测到有机酸，检测到的射频乳酸，α同戊二酸和葡萄糖酸点有相近的数值。
培养机组分常对谷氨酸产量有巨大影响，为了生物体更好的生产而添加的有机营养物质对谷氨酸产量通常是有效的，但过量的营养有时会导致谷氨酸产量减少。图9中ABC的色谱显示了由于有机营养物质的种类的增加，谷氨酸和丙氨酸的数量比例明显变化。多种氮源是现成的，如硝酸铵，有机酸铵盐，都能作为氨基酸生产的主要氮源。图9显示了氮源除了用于筛选实验还生产氨基酸的例子。