昆虫学报Acta Ento m ologica S inica, July 2009, 52(7) :736-742I SS N 045426296
甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A 和B 启动子的克隆
唐 斌
1, 2
, 王世贵, 张文庆
12, 3
(1. 杭州师范大学杭州市动物科学与技术重点实验室, 杭州 310036;
2. 中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室, )
摘要:几丁质不仅是昆虫的表皮和围食膜的主要成分(chitin synthase, CHS ) (SeCHSA 和SeCHSB ) c , 5, 采用PCR 的方法获得了′SeCHSA 和SeCHSB 基因的转录起始位点后, 获到了启动子序列。。
关键词:甜菜夜蛾; 几丁质; 几丁质合成酶; 启动子; 克隆中图分类号:Q966 文献标识码:A 文章编号:045426296(2009) 0720736207
C lon i n g of ch iti n syn tha se gene A and B pro m oters fro m Spodoptera exigua (L ep i doptera :Noctu i dae)
1, 212, 3
T ANG B in , WANG Shi 2Gui , ZHANG W en 2Q ing (1. Hangzhou Munici pal Key Laborat ory of Ani m al Science and Technol ogy, Hangzhou Nor mal University, Hangzhou 310036, China; 2. State Key Laborat ory of B i ocontr ol, Sun Yat 2sen University, Guangzhou 510275, China )
Abstract:Chitin, synthesized by chitin synthase (CHS ) , is not only the essential component for ep ider m is and peritr ophic me mbrane of the m idgut in insects, but als o a very p ivotal target f or insect pest contr ol . Based on the c DNA sequences and genom ic sequences of the t w o CHS genes in Spodoptera exigua , the 5′flanking sequences were cl oned using s pecific p ri m ers . Pr omoter sequences of SeCHSA and S eCHSB were obtained after initiati on sites of transcri p ti onal regulati on were verified by means of 5′RACE . These results are i m portant for the research of chitin synthesis and transcri p ti onal regulati on in insects . Key words :Spodoptera exigua ; chitin; chitin synthase; p r o moter; cl oning
β2 几丁质, N 2乙酰基2D 2葡萄糖胺聚合物, 为昆
虫表皮和围食膜的主要组份(Tella m et al . , 2000) 。昆虫的表皮(也称为外骨骼) 也由于几丁质和鞣化蛋白的存在而呈刚性结构, 对昆虫的发育有着至关重要的作用。在生长发育过程中, 昆虫通过蜕皮, 周期性的更换表皮, 以适应新的虫态。蜕皮发生时, 新的并没有硬化的表皮藏在旧表皮的下面, 当旧表皮退掉之后, 慢慢展开形成新的表皮。昆虫的生长发育和形态形成决定于几丁质结构的可塑性。因此, 昆虫以一定的规律不断地合成和降解几丁质, 以确保蜕皮的完成和围食膜的再生。
几丁质的合成是一个高度复杂、多方面联系的系列生理和生化过程, 但是它不存在于植物和脊椎动物中(Andersen, 1979) 。Candy 和Kilby (1962) 首次提出了昆虫体内几丁质的生物合成通路, 始于海藻糖, 终止于几丁质, 其中共有8个酶参与。Tellam 等(2000) 首先从铜绿丽蝇L ucilia cuprina 中克隆获得几丁质合成酶基因。而后, 几丁质合成酶基因相继在冈比亚按蚊A nopheles gam biae , 埃及伊蚊A edes aegypti (I brahi m et al . , 2000) , 黑腹果蝇D rosophila m elanogaster (Gagou et al . , 2002) , 鳞翅目的草地贪夜蛾S podoptera frugiperda (Hogenka mp et a l . , 2005) , 甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Chen et al . , 2007; Ku mar et al . , 2008) 和烟草天蛾M anduca sexta (Zhu et al . , 2002; Hogenka mp et a l . , 2005) 以及鞘翅目的赤拟谷盗Tribolium castaneum (A rakane et al . , 2004) 等昆虫中被克隆和研究。
已知的几丁质合成酶基因的研究结果表明, 昆
基金项目:“973”计划项目子课题(2006CB102001) ; 杭州师范大学高层次人才引进科研启动项目(YS05203105) 作者简介:唐斌, 男, 1980年生, 湖南永州人, 博士, 研究方向为害虫生物防治和昆虫生理生化与分子生物学, E 2mail:tbz [email protected] 3通讯作者Author for corres pondence, Tel . :[1**********]3; E 2mail:lssz wq@mail. sysu . edu . cn 收稿日期Received:2009202217; 接受日期Accep ted:2009204230
7期唐 斌等:甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A 和B 启动子的克隆 737
虫中含有2个几丁质合成酶基因———几丁质合成酶
基因A (CHSA ) 和基因B (CHSB ) , 前者主要负责表皮和气管几丁质的合成, 而后者则负责中肠围食膜的形成。中山大学昆虫学研究所利用RNA i 技术研究了甜菜夜蛾几丁质合成酶基因SeCHSA 的功能, 发现SeCHSA 沉默后, 昆虫的生长发育受到抑制, 表现在发育畸形、化蛹延迟、表皮的几丁质层不能正常形成(Chen et al . , 2008) 。
启动子(p r omoter ) 域, 位于基因5′侧, 启动和(吴乃虎, 1998) 。动物在生长发育过程中, 感受内、外环境或其他的生理变化, 要通过对基因的精确调控来产生相应的反应。这表现为通过一系列传递激发转录因子与顺式作用元件激活后, 激活RNA 聚合酶Ⅱ转录复合物, 从而启动基因的转录表达, 最后通过基因产物的作用对外界信号在生理生化等方面作出适合的调节反应。众所周知, 几丁质合成酶基因对于昆虫的生长发育至关重要, 但是目前多是mRNA 和蛋白水平表达及功能的研究, 对基因的转录调控却研究很少。为了从转录水平上研究昆虫几丁质的合成, 本研究克隆了甜菜夜蛾两个几丁质合成酶基因的5′端侧翼序列, 并采用5′RACE 的方法确定了基因的转录起始位点, 从而获到了启动子的核心序列。
(pH 8. 0) 饱和酚, 缓慢地上下颠倒离心管10m in, 使两相混匀。用直径较粗的吸管(0. 3c m ) 或1mL
的枪头转移水相到另一新的50mL 离心管中, 重复用酚抽提一次。再转移上清到新的50mL 离心管中, 取5μL 用0. 3%的琼脂糖凝胶电泳检测, 确定基因组DNA 完整后, 在上清中加入1/5体积的10mol/L的醋酸铵, 并加入, 缓慢DNA 。室温下m , 的乙醇洗5g 再离心5m in, 室温干燥, 。加入1mL 双蒸水溶解DNA 样品, 并测定DNA 的浓度和纯度。1. 3 甜菜夜蛾基因组文库的构建及验证采用Cl ontech 的Genome W alker Universal Kit 构建甜菜夜蛾基因组文库。主要方法是先采用D ra Ⅰ, Eco RV , Pvu Ⅱ和S tu Ⅰ分别酶切5μg 的甜菜夜蛾基因组DNA, 同时用Pvu Ⅱ酶切试剂盒中的人类基因组DNA, 37℃水浴酶切过夜; 酶切后进行纯化和电泳检测。然后将酶切完全后的小片段
T M
DNA 与Genome W alker Adap t ors 16℃连接过夜(16h ) , 再放入70℃水浴中5m in, 使连接酶失活, -80℃冰箱永久保存。
以试剂盒中的人类基因组DNA 文库和本次构建的文库分别作为模板, PCR 一次和二次扩增, 电泳检测。1. 4 甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A 和B (SeCH SA 和SeCH SB ) 启动子序列克隆的策略
利用c DNA 序列获得启动子序列的方法通常有两种。传统的方法是构建噬菌体的基因组文库, 利用已知的c DNA 序列作为探针, 并采用同位素标记探针和噬菌体杂交筛选阳性斑, 再测序获得基因的基因组全长和启动子序列。我们采用这种方法的改
T M
进版, 采用Cl ontech 的Genome W alker Universal Kit 构建甜菜夜蛾基因组文库, 再从c DNA 序列的5′端设计特异性引物往启动子序列方向扩增, 从而获得其序列(图1)
。
T M
1 材料与方法
1. 1 材料
甜菜夜蛾为实验室内采用人工饲料饲养。取刚
化蛹的甜菜夜蛾20头迅速放入液氮中处理5m in, 然后放入-80℃冰箱保存直至使用。1. 2 基因组D NA 提取
从-80℃取20头甜菜夜蛾蛹, 放入冰预冷的研钵中, 加入液氮快速将其研磨成细粉, 待液氮挥发后, 将组织粉末加入到含抽提缓冲液(10mmol/LTris 2Cl; 100mmol/LEDT A; 20μg/mLRNase A; 0. 5%S DS ) 的50mL 离心管中, 轻轻摇匀, 并让组织粉末完全浸入到抽提液中。放入37℃水浴中保温1h 后, 加入蛋白酶K 至终浓度100μg/mL,用玻璃棒温和地搅拌粘稠的溶液使其均匀分布。再放入50℃水浴中保温3h, 并不断地轻摇溶液。然后, 放在室温冷却, 加入等体积的0. 5mol/L的Tris 2Cl
图1 启动子克隆方法
Fig . 1 A method t o cl one a p r omoter sequence
1. 5 SeCH SA 和SeCH SB 特异性引物的设计
根据已经获得的SeCHSA (DQ062153) 和
738昆虫学报A cta Ento m ologica S inica
表2 SeCH SA 和SeCH SB 5′RACE 扩增引物
52卷
S eCHSB (DQ912929) c DNA 序列的5′端非翻译区序
列, 分别设计反向特异性引物(表1) , 由上海英骏公司合成。
表1 S eCH SA 和S eCH SB 启动子扩增引物
Table 1PCR pr i m ers used i n the am pli f i ca ti on of
SeCH SA and SeCH SB pro m oters
名称
SeCHS A 2P1SeCHS A 2P2SeCHS A 2P3SeCHS B 2P1SeCHS B 2P2SeCHS B 2P3AP1AP2
Table 2PCR pr i m ers of SeCHSA and SeCHSB 5′RACE
名称
SeCHS A5R 2A SeCHS A5R 2B SeCHS B5R 2A 2B
序列
) (CGG AAC ACG TCC CAT CCT TTC G CAG T AT GTT GTG G AG AT A AGC TGG ACA CAA CAG AAC CG TG A GG A TC
序列
) (GG A G AT AAG CGT TGT TGT AAT CCG TGT C AC TT C AC A ATG T AA CG A A C C TG C T CG GT A AA T C A T CG C CT A G AG CCC T AA AT C C AG G AG GGT TT C G CC ATT CG A G ATATT T CT
T AA TG C GT A AT A CG A CT C ACT AT A GGG C ACT AT A GGG C AC G CG TGG T
B5R A SeCHSB 基因的5′2B 和SeCHS B5R 2B 分别是SeCHSA
5′RACE 二次扩增引物。Pri m ers SeCHS A5R 2A and
SeCHS B5R 2A are used in the first PCR amp lificati on for SeCHSA and
SeCHSB , res pectively . Pri m ers SeCHS A5R 2B and SeCHS B5R 2B are used
in the second PCR a mp lificati on f or SeCHSA and SeCHSB , res pectively .
15kb 之间, 可以很好地用于基因组DNA 文库的构建。
AP1和AP2为Geno me Walker T M Universal Kit 中的通用引物; SeCHS A 2P1
构建好后的文库分别标记为DL1, DL2, DL3, DL4, 对应相应的内切酶D r a Ⅰ, Eco R V, Pvu Ⅱ和S tu Ⅰ。
和SeCHS A 2P2用于巢式PCR 扩增SeCHS A 启动子; SeCHS A 2P3用于菌落PCR 中的巢式验证。SeCHS B 2P1, SeCHS B 2P2和SeCHS B 2P3的作用同上。AP1and AP2are the universal pri m ers of Geno me Walker T M Universal
Kit; SeCHS A 2P1and SeCHS A 2P2are used t o cl one SeCHS A pr o moter by means of Nest 2PCR; SeCHS A 2P3is used t o verify col ony in Nest PCR a mplificati on .
The functi ons of pri m ers SeCHS B 2P1, SeCHS B 2P2and
SeCHS B 2P3f or SeCHS B are the sa me as above .
1. 6 S eCH SA 5′端序列的克隆
采用SeCHS A 的特异性引物与Adap t or Pri m er 1
(AP1) 和Nested Adap t or Pri m er 2(AP2) 进行巢式PCR, 模板采用构建好的4个甜菜夜蛾基因组DNA
文库, 获得的特异性条带克隆到p MD182T 载体上, 连接转化, 送往上海英骏公司测序。
1. 7 S eCH SA 和SeCH SB 转录起始位点的确定
表2中的4条引物从CHS 基因mRNA 的5′端设计, 目的是为了确定5′RACE 的转录起始位点。
2 结果与分析
2. 1 基因组D NA 抽提与酶切
基因组DNA 采用RNase 和蛋白酶K 消化, 酚、氯仿抽提, 乙醇沉淀回收基因组DNA , 电泳检测如图2。结果表明, 抽提的基因组DNA 分子都在23kb 以上, 可以用于基因组DNA 文库的构建。
图3的结果是甜菜夜蛾和人类基因组DNA 分别经D ra Ⅰ, Eco R V, Pvu Ⅱ和S tu Ⅰ酶切纯化后的电泳结果。结果显示, 基因组DNA 完全酶切纯化后, 出现弥散的条带, 片段大小集中在0. 5～
7期唐 斌等:甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A 和B 启动子的克隆 739
2. 2 甜菜夜蛾基因组D NA 文库质量检测
利用试剂盒中的人类基因组DNA 文库作为阳性对照, 来检测本文构建的文库质量。采用
Adap t or Pri m er 1, Nested Adap t or Pri m er 2和人类特异性的基因引物Positive Contr ol tP A Pri m er (PCP1) 与Positive Contr ol tP A Nested Pri m er (PCP2) PCR 扩增。结果显示本文构建的人类基因组DNA 文库与试剂盒中所配置的文库一样, 都能扩增出一条1. 5kb 的目的条带(图4) , 菜夜蛾基因组DNA 克隆
。
子扩增中, 以DL2和DL3作为模板时分别扩增出约500bp 和600bp 的条带。将这3条可能的目的条带回收后, 分别将其连接到p MD182T 载体(大连宝生物
α感受态细胞转化后, 挑斑采用公司) , 采用DH5
SeCHS A 2P3/SeCHS B 2P3和Nested Adap t or Pri m er 2进行菌落PCR 验证, 选择阳性克隆送往上海英骏公司测序。3, 可以根据已, -DL4作为模
图4 甜菜夜蛾和人类基因组DNA 文库质量验证
Fig . 4 The quality verificati on on genom ic DNA libraries
of Spodoptera exigua and hu man
M:DNA 分子量标准物DNA molecularweight marker; 1, 2:分别是试
剂盒所带的人类基因组DNA 文库与本文构建的文库作为PCR 的模板扩增出的特异条带The results of PCR amp lificati on fr om t w o different
human genom ic libraries; C:用灭菌水作为模板的PCR 扩增结果The results of PCR a mp lificati on using sterilized water as the te mp late .
2. 3 S eCH SA 和SeCH SB 基因启动子序列的获得
甜菜夜蛾CHSA 和CHSB 基因启动子序列的克隆方法如图1。先用设计好的引物SeCHS A 2P1/SeCHS B 2P1和Adap t or Pri m er 1, 利用构建好的DL1-DL4作为模板进行PCR 扩增。CHS 基因启动子一
次PCR 电泳的结果如图5。利用一次PCR 的产物稀释50倍作为模板, SeCHS A 2P2/SeCHS B 2P2和Nested Adap t or Pri m er 2进行二次巢式PCR 扩增的结果如图6。结果表明:SeCHSA 启动子扩增中, 只有以DL1作
为模板时扩增出一条约700bp 的亮带; SeCHSB 启动
740昆虫学报A cta Ento m ologica S inica 52卷
2. 4 SeCHSA 和SeCHAB 基因转录起始位点的确定
转录起始位点的确定通常有两种方法:Pri m er Extensi on 和5′RACE 。本文采用5′RACE 的方法来确
中有600bp 左右的条带。将这些条带回收, 连接转
化测序, 各测5个阳性斑, 并从测序结果选择最长的基因5′非翻译区(UT R ) 序列, 去掉接头的序列, 第1个核苷酸就是基因的转录起始密码子。由此获得了SeCHSA 和SeCHSB 基因的转录起始位点分别位于起始密码子ATG 前160bp 和161bp 处, 如图7和图8。c , 发现SeCHSB ATG 1个长(图
定SeCHSA 和SeCHAB 基因的转录起始位点。分别在靠近基因的5′端设计两条特异性引物, 用甜菜夜蛾的5′RACE 文库作为模板, 通用引物为试剂盒所带的UP M 和NUP 。SeCHSA 基因的5′RACE 的一次PCR 中, 有一条约400bp 的条带, 二次PCR 检测出约200bp 的条带; SeCHSB 基因的5′RACE DNA 的完整性; 其次是基因组DNA 的质量, 主要
3 讨论
3. 1 昆虫基因组D NA 的抽提和文库的构建从纯度和浓度来衡量, 纯度越高有利于内切酶的切
割效率, 浓度高能减少酶切的体积(Chomczynski et a l . , 1997) 。
传统的基因组文库是采用噬菌体作为寄主, 将基因组DNA 酶切成10～20kb 的片段, 连接到特定的载体中, 再组装成噬菌体, 而通过寄主噬菌体的繁殖就可以将特定物种的基因组DNA 序列保存在噬菌体中, 并且可以根据需要大量扩增。因此, 这种文库才是真正意义上的文库, 基本能够永久保存特定物种的基因组序列(Zhang et al . , 2007) 。采用
不同的基因组抽提方法获得的DNA 质量和大
小均有所区别(林万华等, 2006; 周志湘等, 2007; Rodr íguez 2P érez and Beckage, 2008) 。根据不同的实验要求, 对基因组DNA 质量的要求也不一样(McCarthy and Romanowski, 2008) 。基因组文库的构建对基因组DNA 的要求最高, 首先在DNA 的大小上, 要求至少大于60kb, 目的是保证基因组
7期唐 斌等:甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A 和B 启动子的克隆
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741
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Insect B ioche m. M ol .
库仅在DNA 片段的两端加上一个接头, 从而获得特定基因的未知序列, 不是真正意义上的基因组文
T M
库(Genome W alker Universal Kit, Cl ontech ) 。但是, 这种文库非常方便, 也能满足获得目的基因的启动子序列和基因组序列的基本要求。3. 2 基因转录起始位点的确定基因的启动子属于基因组序列的一部分, 准确地说这段序列位于基因的转录起始位点之前。特定基因启动子的前提, c DNA 序列交文库, (包括启动子序列) , c DNA 序列的比对就能确定启动子序列。
转录起始位点, 就是基因转录开始的位点, 一般定义为mRNA 序列的5′最末端的一个核苷酸。在这个核苷酸的5′端就是基因的启动子序列(Kutach and Kadonaga, 2000) 。一般的基因通常只有一个转录起始位点, 但是某些基因也含有多个转录起始位点。鉴定转录起始位点对研究启动子的活性及分析基因的转录调控是非常重要的。转录起始位点的确定方法主要为引物延伸法(Ghosh et al . , 1978) 和S1核酸酶法(Berk and Shar p, 1977) , 后来又产生了两种间接的方法:RNase 保护(Melt on et al . , 1984) 和RACE 法(Fr oh man et a l . , 1988) 。与其他几种方法相比, RACE 方法是唯一依赖于PCR 技术的方法, 并且灵敏度非常高, 目前利用该方法通过与基因组序列比对来鉴定转录起始位点已被众多的专家所接受(Cho et a l . , 2004) 。本文采用5′RACE 法确定了SeCHS A 和SeCHS B 基因的转录起始位点和启动子序列, 是一种非常简单和便捷的方法。
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(责任编辑:赵利辉)
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C lon i n g of ch iti n syn tha se gene A and B pro m oters fro m Spodoptera exigua (L ep i doptera :Noctu i dae)
1, 212, 3
T ANG B in , WANG Shi 2Gui , ZHANG W en 2Q ing (1. Hangzhou Munici pal Key Laborat ory of Ani m al Science and Technol ogy, Hangzhou Nor mal University, Hangzhou 310036, China; 2. State Key Laborat ory of B i ocontr ol, Sun Yat 2sen University, Guangzhou 510275, China )
Abstract:Chitin, synthesized by chitin synthase (CHS ) , is not only the essential component for ep ider m is and peritr ophic me mbrane of the m idgut in insects, but als o a very p ivotal target f or insect pest contr ol . Based on the c DNA sequences and genom ic sequences of the t w o CHS genes in Spodoptera exigua , the 5′flanking sequences were cl oned using s pecific p ri m ers . Pr omoter sequences of SeCHSA and S eCHSB were obtained after initiati on sites of transcri p ti onal regulati on were verified by means of 5′RACE . These results are i m portant for the research of chitin synthesis and transcri p ti onal regulati on in insects . Key words :Spodoptera exigua ; chitin; chitin synthase; p r o moter; cl oning
β2 几丁质, N 2乙酰基2D 2葡萄糖胺聚合物, 为昆
虫表皮和围食膜的主要组份(Tella m et al . , 2000) 。昆虫的表皮(也称为外骨骼) 也由于几丁质和鞣化蛋白的存在而呈刚性结构, 对昆虫的发育有着至关重要的作用。在生长发育过程中, 昆虫通过蜕皮, 周期性的更换表皮, 以适应新的虫态。蜕皮发生时, 新的并没有硬化的表皮藏在旧表皮的下面, 当旧表皮退掉之后, 慢慢展开形成新的表皮。昆虫的生长发育和形态形成决定于几丁质结构的可塑性。因此, 昆虫以一定的规律不断地合成和降解几丁质, 以确保蜕皮的完成和围食膜的再生。
几丁质的合成是一个高度复杂、多方面联系的系列生理和生化过程, 但是它不存在于植物和脊椎动物中(Andersen, 1979) 。Candy 和Kilby (1962) 首次提出了昆虫体内几丁质的生物合成通路, 始于海藻糖, 终止于几丁质, 其中共有8个酶参与。Tellam 等(2000) 首先从铜绿丽蝇L ucilia cuprina 中克隆获得几丁质合成酶基因。而后, 几丁质合成酶基因相继在冈比亚按蚊A nopheles gam biae , 埃及伊蚊A edes aegypti (I brahi m et al . , 2000) , 黑腹果蝇D rosophila m elanogaster (Gagou et al . , 2002) , 鳞翅目的草地贪夜蛾S podoptera frugiperda (Hogenka mp et a l . , 2005) , 甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Chen et al . , 2007; Ku mar et al . , 2008) 和烟草天蛾M anduca sexta (Zhu et al . , 2002; Hogenka mp et a l . , 2005) 以及鞘翅目的赤拟谷盗Tribolium castaneum (A rakane et al . , 2004) 等昆虫中被克隆和研究。
已知的几丁质合成酶基因的研究结果表明, 昆
基金项目:“973”计划项目子课题(2006CB102001) ; 杭州师范大学高层次人才引进科研启动项目(YS05203105) 作者简介:唐斌, 男, 1980年生, 湖南永州人, 博士, 研究方向为害虫生物防治和昆虫生理生化与分子生物学, E 2mail:tbz [email protected] 3通讯作者Author for corres pondence, Tel . :[1**********]3; E 2mail:lssz wq@mail. sysu . edu . cn 收稿日期Received:2009202217; 接受日期Accep ted:2009204230
7期唐 斌等:甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A 和B 启动子的克隆 737
虫中含有2个几丁质合成酶基因———几丁质合成酶
基因A (CHSA ) 和基因B (CHSB ) , 前者主要负责表皮和气管几丁质的合成, 而后者则负责中肠围食膜的形成。中山大学昆虫学研究所利用RNA i 技术研究了甜菜夜蛾几丁质合成酶基因SeCHSA 的功能, 发现SeCHSA 沉默后, 昆虫的生长发育受到抑制, 表现在发育畸形、化蛹延迟、表皮的几丁质层不能正常形成(Chen et al . , 2008) 。
启动子(p r omoter ) 域, 位于基因5′侧, 启动和(吴乃虎, 1998) 。动物在生长发育过程中, 感受内、外环境或其他的生理变化, 要通过对基因的精确调控来产生相应的反应。这表现为通过一系列传递激发转录因子与顺式作用元件激活后, 激活RNA 聚合酶Ⅱ转录复合物, 从而启动基因的转录表达, 最后通过基因产物的作用对外界信号在生理生化等方面作出适合的调节反应。众所周知, 几丁质合成酶基因对于昆虫的生长发育至关重要, 但是目前多是mRNA 和蛋白水平表达及功能的研究, 对基因的转录调控却研究很少。为了从转录水平上研究昆虫几丁质的合成, 本研究克隆了甜菜夜蛾两个几丁质合成酶基因的5′端侧翼序列, 并采用5′RACE 的方法确定了基因的转录起始位点, 从而获到了启动子的核心序列。
(pH 8. 0) 饱和酚, 缓慢地上下颠倒离心管10m in, 使两相混匀。用直径较粗的吸管(0. 3c m ) 或1mL
的枪头转移水相到另一新的50mL 离心管中, 重复用酚抽提一次。再转移上清到新的50mL 离心管中, 取5μL 用0. 3%的琼脂糖凝胶电泳检测, 确定基因组DNA 完整后, 在上清中加入1/5体积的10mol/L的醋酸铵, 并加入, 缓慢DNA 。室温下m , 的乙醇洗5g 再离心5m in, 室温干燥, 。加入1mL 双蒸水溶解DNA 样品, 并测定DNA 的浓度和纯度。1. 3 甜菜夜蛾基因组文库的构建及验证采用Cl ontech 的Genome W alker Universal Kit 构建甜菜夜蛾基因组文库。主要方法是先采用D ra Ⅰ, Eco RV , Pvu Ⅱ和S tu Ⅰ分别酶切5μg 的甜菜夜蛾基因组DNA, 同时用Pvu Ⅱ酶切试剂盒中的人类基因组DNA, 37℃水浴酶切过夜; 酶切后进行纯化和电泳检测。然后将酶切完全后的小片段
T M
DNA 与Genome W alker Adap t ors 16℃连接过夜(16h ) , 再放入70℃水浴中5m in, 使连接酶失活, -80℃冰箱永久保存。
以试剂盒中的人类基因组DNA 文库和本次构建的文库分别作为模板, PCR 一次和二次扩增, 电泳检测。1. 4 甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A 和B (SeCH SA 和SeCH SB ) 启动子序列克隆的策略
利用c DNA 序列获得启动子序列的方法通常有两种。传统的方法是构建噬菌体的基因组文库, 利用已知的c DNA 序列作为探针, 并采用同位素标记探针和噬菌体杂交筛选阳性斑, 再测序获得基因的基因组全长和启动子序列。我们采用这种方法的改
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进版, 采用Cl ontech 的Genome W alker Universal Kit 构建甜菜夜蛾基因组文库, 再从c DNA 序列的5′端设计特异性引物往启动子序列方向扩增, 从而获得其序列(图1)
。
T M
1 材料与方法
1. 1 材料
甜菜夜蛾为实验室内采用人工饲料饲养。取刚
化蛹的甜菜夜蛾20头迅速放入液氮中处理5m in, 然后放入-80℃冰箱保存直至使用。1. 2 基因组D NA 提取
从-80℃取20头甜菜夜蛾蛹, 放入冰预冷的研钵中, 加入液氮快速将其研磨成细粉, 待液氮挥发后, 将组织粉末加入到含抽提缓冲液(10mmol/LTris 2Cl; 100mmol/LEDT A; 20μg/mLRNase A; 0. 5%S DS ) 的50mL 离心管中, 轻轻摇匀, 并让组织粉末完全浸入到抽提液中。放入37℃水浴中保温1h 后, 加入蛋白酶K 至终浓度100μg/mL,用玻璃棒温和地搅拌粘稠的溶液使其均匀分布。再放入50℃水浴中保温3h, 并不断地轻摇溶液。然后, 放在室温冷却, 加入等体积的0. 5mol/L的Tris 2Cl
图1 启动子克隆方法
Fig . 1 A method t o cl one a p r omoter sequence
1. 5 SeCH SA 和SeCH SB 特异性引物的设计
根据已经获得的SeCHSA (DQ062153) 和
738昆虫学报A cta Ento m ologica S inica
表2 SeCH SA 和SeCH SB 5′RACE 扩增引物
52卷
S eCHSB (DQ912929) c DNA 序列的5′端非翻译区序
列, 分别设计反向特异性引物(表1) , 由上海英骏公司合成。
表1 S eCH SA 和S eCH SB 启动子扩增引物
Table 1PCR pr i m ers used i n the am pli f i ca ti on of
SeCH SA and SeCH SB pro m oters
名称
SeCHS A 2P1SeCHS A 2P2SeCHS A 2P3SeCHS B 2P1SeCHS B 2P2SeCHS B 2P3AP1AP2
Table 2PCR pr i m ers of SeCHSA and SeCHSB 5′RACE
名称
SeCHS A5R 2A SeCHS A5R 2B SeCHS B5R 2A 2B
序列
) (CGG AAC ACG TCC CAT CCT TTC G CAG T AT GTT GTG G AG AT A AGC TGG ACA CAA CAG AAC CG TG A GG A TC
序列
) (GG A G AT AAG CGT TGT TGT AAT CCG TGT C AC TT C AC A ATG T AA CG A A C C TG C T CG GT A AA T C A T CG C CT A G AG CCC T AA AT C C AG G AG GGT TT C G CC ATT CG A G ATATT T CT
T AA TG C GT A AT A CG A CT C ACT AT A GGG C ACT AT A GGG C AC G CG TGG T
B5R A SeCHSB 基因的5′2B 和SeCHS B5R 2B 分别是SeCHSA
5′RACE 二次扩增引物。Pri m ers SeCHS A5R 2A and
SeCHS B5R 2A are used in the first PCR amp lificati on for SeCHSA and
SeCHSB , res pectively . Pri m ers SeCHS A5R 2B and SeCHS B5R 2B are used
in the second PCR a mp lificati on f or SeCHSA and SeCHSB , res pectively .
15kb 之间, 可以很好地用于基因组DNA 文库的构建。
AP1和AP2为Geno me Walker T M Universal Kit 中的通用引物; SeCHS A 2P1
构建好后的文库分别标记为DL1, DL2, DL3, DL4, 对应相应的内切酶D r a Ⅰ, Eco R V, Pvu Ⅱ和S tu Ⅰ。
和SeCHS A 2P2用于巢式PCR 扩增SeCHS A 启动子; SeCHS A 2P3用于菌落PCR 中的巢式验证。SeCHS B 2P1, SeCHS B 2P2和SeCHS B 2P3的作用同上。AP1and AP2are the universal pri m ers of Geno me Walker T M Universal
Kit; SeCHS A 2P1and SeCHS A 2P2are used t o cl one SeCHS A pr o moter by means of Nest 2PCR; SeCHS A 2P3is used t o verify col ony in Nest PCR a mplificati on .
The functi ons of pri m ers SeCHS B 2P1, SeCHS B 2P2and
SeCHS B 2P3f or SeCHS B are the sa me as above .
1. 6 S eCH SA 5′端序列的克隆
采用SeCHS A 的特异性引物与Adap t or Pri m er 1
(AP1) 和Nested Adap t or Pri m er 2(AP2) 进行巢式PCR, 模板采用构建好的4个甜菜夜蛾基因组DNA
文库, 获得的特异性条带克隆到p MD182T 载体上, 连接转化, 送往上海英骏公司测序。
1. 7 S eCH SA 和SeCH SB 转录起始位点的确定
表2中的4条引物从CHS 基因mRNA 的5′端设计, 目的是为了确定5′RACE 的转录起始位点。
2 结果与分析
2. 1 基因组D NA 抽提与酶切
基因组DNA 采用RNase 和蛋白酶K 消化, 酚、氯仿抽提, 乙醇沉淀回收基因组DNA , 电泳检测如图2。结果表明, 抽提的基因组DNA 分子都在23kb 以上, 可以用于基因组DNA 文库的构建。
图3的结果是甜菜夜蛾和人类基因组DNA 分别经D ra Ⅰ, Eco R V, Pvu Ⅱ和S tu Ⅰ酶切纯化后的电泳结果。结果显示, 基因组DNA 完全酶切纯化后, 出现弥散的条带, 片段大小集中在0. 5～
7期唐 斌等:甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A 和B 启动子的克隆 739
2. 2 甜菜夜蛾基因组D NA 文库质量检测
利用试剂盒中的人类基因组DNA 文库作为阳性对照, 来检测本文构建的文库质量。采用
Adap t or Pri m er 1, Nested Adap t or Pri m er 2和人类特异性的基因引物Positive Contr ol tP A Pri m er (PCP1) 与Positive Contr ol tP A Nested Pri m er (PCP2) PCR 扩增。结果显示本文构建的人类基因组DNA 文库与试剂盒中所配置的文库一样, 都能扩增出一条1. 5kb 的目的条带(图4) , 菜夜蛾基因组DNA 克隆
。
子扩增中, 以DL2和DL3作为模板时分别扩增出约500bp 和600bp 的条带。将这3条可能的目的条带回收后, 分别将其连接到p MD182T 载体(大连宝生物
α感受态细胞转化后, 挑斑采用公司) , 采用DH5
SeCHS A 2P3/SeCHS B 2P3和Nested Adap t or Pri m er 2进行菌落PCR 验证, 选择阳性克隆送往上海英骏公司测序。3, 可以根据已, -DL4作为模
图4 甜菜夜蛾和人类基因组DNA 文库质量验证
Fig . 4 The quality verificati on on genom ic DNA libraries
of Spodoptera exigua and hu man
M:DNA 分子量标准物DNA molecularweight marker; 1, 2:分别是试
剂盒所带的人类基因组DNA 文库与本文构建的文库作为PCR 的模板扩增出的特异条带The results of PCR amp lificati on fr om t w o different
human genom ic libraries; C:用灭菌水作为模板的PCR 扩增结果The results of PCR a mp lificati on using sterilized water as the te mp late .
2. 3 S eCH SA 和SeCH SB 基因启动子序列的获得
甜菜夜蛾CHSA 和CHSB 基因启动子序列的克隆方法如图1。先用设计好的引物SeCHS A 2P1/SeCHS B 2P1和Adap t or Pri m er 1, 利用构建好的DL1-DL4作为模板进行PCR 扩增。CHS 基因启动子一
次PCR 电泳的结果如图5。利用一次PCR 的产物稀释50倍作为模板, SeCHS A 2P2/SeCHS B 2P2和Nested Adap t or Pri m er 2进行二次巢式PCR 扩增的结果如图6。结果表明:SeCHSA 启动子扩增中, 只有以DL1作
为模板时扩增出一条约700bp 的亮带; SeCHSB 启动
740昆虫学报A cta Ento m ologica S inica 52卷
2. 4 SeCHSA 和SeCHAB 基因转录起始位点的确定
转录起始位点的确定通常有两种方法:Pri m er Extensi on 和5′RACE 。本文采用5′RACE 的方法来确
中有600bp 左右的条带。将这些条带回收, 连接转
化测序, 各测5个阳性斑, 并从测序结果选择最长的基因5′非翻译区(UT R ) 序列, 去掉接头的序列, 第1个核苷酸就是基因的转录起始密码子。由此获得了SeCHSA 和SeCHSB 基因的转录起始位点分别位于起始密码子ATG 前160bp 和161bp 处, 如图7和图8。c , 发现SeCHSB ATG 1个长(图
定SeCHSA 和SeCHAB 基因的转录起始位点。分别在靠近基因的5′端设计两条特异性引物, 用甜菜夜蛾的5′RACE 文库作为模板, 通用引物为试剂盒所带的UP M 和NUP 。SeCHSA 基因的5′RACE 的一次PCR 中, 有一条约400bp 的条带, 二次PCR 检测出约200bp 的条带; SeCHSB 基因的5′RACE DNA 的完整性; 其次是基因组DNA 的质量, 主要
3 讨论
3. 1 昆虫基因组D NA 的抽提和文库的构建从纯度和浓度来衡量, 纯度越高有利于内切酶的切
割效率, 浓度高能减少酶切的体积(Chomczynski et a l . , 1997) 。
传统的基因组文库是采用噬菌体作为寄主, 将基因组DNA 酶切成10～20kb 的片段, 连接到特定的载体中, 再组装成噬菌体, 而通过寄主噬菌体的繁殖就可以将特定物种的基因组DNA 序列保存在噬菌体中, 并且可以根据需要大量扩增。因此, 这种文库才是真正意义上的文库, 基本能够永久保存特定物种的基因组序列(Zhang et al . , 2007) 。采用
不同的基因组抽提方法获得的DNA 质量和大
小均有所区别(林万华等, 2006; 周志湘等, 2007; Rodr íguez 2P érez and Beckage, 2008) 。根据不同的实验要求, 对基因组DNA 质量的要求也不一样(McCarthy and Romanowski, 2008) 。基因组文库的构建对基因组DNA 的要求最高, 首先在DNA 的大小上, 要求至少大于60kb, 目的是保证基因组
7期唐 斌等:甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A 和B 启动子的克隆
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741
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Insect B ioche m. M ol .
库仅在DNA 片段的两端加上一个接头, 从而获得特定基因的未知序列, 不是真正意义上的基因组文
T M
库(Genome W alker Universal Kit, Cl ontech ) 。但是, 这种文库非常方便, 也能满足获得目的基因的启动子序列和基因组序列的基本要求。3. 2 基因转录起始位点的确定基因的启动子属于基因组序列的一部分, 准确地说这段序列位于基因的转录起始位点之前。特定基因启动子的前提, c DNA 序列交文库, (包括启动子序列) , c DNA 序列的比对就能确定启动子序列。
转录起始位点, 就是基因转录开始的位点, 一般定义为mRNA 序列的5′最末端的一个核苷酸。在这个核苷酸的5′端就是基因的启动子序列(Kutach and Kadonaga, 2000) 。一般的基因通常只有一个转录起始位点, 但是某些基因也含有多个转录起始位点。鉴定转录起始位点对研究启动子的活性及分析基因的转录调控是非常重要的。转录起始位点的确定方法主要为引物延伸法(Ghosh et al . , 1978) 和S1核酸酶法(Berk and Shar p, 1977) , 后来又产生了两种间接的方法:RNase 保护(Melt on et al . , 1984) 和RACE 法(Fr oh man et a l . , 1988) 。与其他几种方法相比, RACE 方法是唯一依赖于PCR 技术的方法, 并且灵敏度非常高, 目前利用该方法通过与基因组序列比对来鉴定转录起始位点已被众多的专家所接受(Cho et a l . , 2004) 。本文采用5′RACE 法确定了SeCHS A 和SeCHS B 基因的转录起始位点和启动子序列, 是一种非常简单和便捷的方法。
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(责任编辑:赵利辉)