目的
制定一个检测方法验证的管理程序，以指导公司检测方法验证文件的编写。 范围
适用于原料药的鉴别试验、杂质定量检查或限度检查、锌含量测定、含量测定、微生物限度检查和内毒素检查；制剂的鉴别试验、杂质定量检查或限度检查、含量测定、无菌检查、内毒素检查和其他成份（如防腐剂等）；清洁验证相关的检测方法、消毒剂验证相关的检测方法的验证。 职责
质量部验证人员起草，验证领导小组成员审核，质量总监批准，检测方法验证相关人员执行。 内容 1编制依据
1.1 《中国药典》2010版； 1.2 ICH Q2 。 2 常规方法验证
2.2 方法验证
就是根据检验项目的要求，预先设制一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的实验来验证所用的检测方法是否复合检验项目的要求。 《中国药典》2010版检验项目及验证内容
①已有重现性验证，不需验证中间精密度。
②如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。 ③视具体情况予以验证。
2.3 具体项目要有准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。视具体的分析方法拟定验证的内容。详述如下： 2.3.1准确度
指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示，准确度应在规定的范围内测试。 2. 3.1.1含量测定方法的准确度
原料药用已知纯度的对照品或供试品进行测定。
制剂产品中各组分均已知，所以也用已知纯度的对照品或供试品进行测定。 2. 3.1.2杂质定量测定的准确度
可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物，可用待验证方法测得的结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。 2. 3.1.3数据要求
在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价，例如，设计低、中、高3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。应报告已知加入量的回收率（%），或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或可信限。 2. 3.2精密度
精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。
在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。 含量测定和杂质的定量测定应考虑方法的精密度。 2. 3.2.1重复性
在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。例如，设计低、中、高3个不同浓度，每个浓度各分别制定3份供试品溶液，进行测定，或将相当于100%浓度水平的供试品溶液，用至少测定6次的结果进行评价。 2. 3.2.2中间精密度
为考察随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。 2. 3.2.3数据要求
均应报告标准偏差、相对标准偏差。 2. 3.3专属性
专属性系指在其它成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查和含量测定方法，均应考察其专属性。如方法不够专属，应采用多个方法予以补充。 2. 3.3.1鉴别反应
应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的化合物，应均呈负反应。 2. 3.3.2含量测定和杂质测定
色谱法和其他分离方法，应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明诸成分在图中的位置，色谱法中分离度应符合要求。
在杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质或辅料试样比较测定结果。对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的
杂质，考察杂质之间能否得到分离。 2. 3.4检测限
检测限系指试样中被测物能被检查出的最低量。药品的杂质检查方法，应通过测试确定方法的检测限。常用的方法如下： 2. 3.4.1非仪器分析目视法
用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。
2. 3.4.2信噪比法：用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。
2. 3.4.3标准曲线法：仪器分析法的检出限可以通过3条标准曲线来评估，公式如下： DL=SDa×3/Cl
其中：SD 是至少3个校准曲线的Y 轴截距的标准偏差，校准曲线中的药物浓度为接近推测定量限的浓度。也可通过对适当数量的空白样品进行分析而得到标准偏差；Cl 是校准曲线的斜率。
2. 3.4.4数据要求
若有，则应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。 2. 3.5定量限
2. 3.5.1信噪比法：以信噪比为10:1时浓度或注入仪器的量确定定量限。 2. 3.5.2标准曲线法：可通过对3条标准曲线分析进行评估，计算公式如下： DL=SDa×10/Cl
其中：SD 是至少3个校准曲线的Y 轴截距的标准偏差，校准曲线中的药物浓度为接近推测定量限的浓度。也可通过对适当数量的空白样品进行分析而得到标准偏差；Cl 是校准曲线的斜率。
2. 3.5.3数据要求
若有，则应附测试图谱，说明测试过程和定量限结果。
2. 3.6线性：线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 应在规定的范围内测定线性关系。可用以贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5份供试样品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作用，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。
数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。
2. 3.7范围：范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。原料药和制剂含量测定，原料药范围应为测试浓度的80%~120%，制剂范围应为测试浓度的70%~130%；杂质测定，范围应根据初步实测，拟订为规定限度的±20%。
2. 3.8耐用性：耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用以常规检验提供依据。开始研究分析时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品的提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和PH 值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、规定性、不同类型的载体、柱温、进样口和检测器温度等。
经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。 3 其它检测方法验证
包括原料药和注射液的微生物限度检测方法、制剂的无菌检测方法、原料药和制剂的内毒素检测方法、清洁验证相关的表面残留擦拭检测方法和表面微生物取样检测方法、消毒剂消毒效力检测方法等验证。 3.1微生物限度检测方法
当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物测定。 菌种：以下菌种或符合要求的其他菌种源 大肠埃希菌CMCC(B) 44102/ATCC 25922 金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26 003/ATCC 6538 枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63 501/ATCC 9027 白色念株菌CMCC(F) 98 001/ATCC 10231 黑曲霉CMCC(F) 98 003/ATCC 16404
计数培养基的适用性检查符合要求后，进行菌落计数方法验证，各试验菌逐一进行验证。 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 （1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml 和50～100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。 （2）菌液组 测定所加的试验菌数。
（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本身菌数。
（4）稀释剂对照组 若供试液制备需要稀释或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml 供试液含50～100cfu ，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
结果判断：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。当产品的组分或原检查条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新进行验证。 3.2 注射液微生物限度检测方法
当建立产品的微生物限度检查法时，进行细菌、霉菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌测定。 菌种：以下菌种或符合要求的其他菌种源 白色念株菌CMCC(F) 98 001/ATCC 10231； 黑曲霉CMCC(F) 98 003 ATCC 16404。
计数培养基的适用性检查符合要求后，进行菌落计数方法验证，各试验菌逐一进行验证。 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 3.2.1 试验组：取1ml 供试液过滤，冲洗三次，每次100ml ，在最后一次的冲洗液中加入50-100cfu/ml试验菌1ml ，过滤，细菌将滤膜放在胰酪胨大豆琼脂培养基上在30-35℃下培养48小时计数；真菌将滤膜放在沙氏葡萄糖琼脂培养基，在 23-28℃下培养72小时计数，每株试验菌平行制备2个平皿，按薄膜过滤法测定其菌数。
3.2.2 菌液组：测定所加的试验菌数，将50-100cfu 试验菌薄膜过滤，细菌将滤膜放在胰酪胨大豆琼脂培养基上在30-35℃下培养48小时计数；真菌将滤膜放在沙氏葡萄糖琼脂培养基，在 23-28℃下培养72小时计数，每株试验菌平行制备2个平皿，按薄膜过滤法测定其菌数。 3.2.3 供试品对照组：取1ml 供试液过滤，冲洗三次，每次100ml ，培养细菌用滤膜放在胰酪胨大豆琼脂培养基上在30-35℃下培养48小时计数；培养真菌用滤膜放在沙氏葡萄糖琼脂培养基，在 23-28℃下培养72小时计数，每种培养基平行制备2个平皿，按薄膜过滤法测定其菌数。 3.2.4 稀释剂对照组：用稀释剂冲洗三次，每次100ml ，在最后一次的冲洗液中加入50-100cfu/ml试验菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，白色念珠菌、黑曲霉）1ml ，过滤，细菌将滤膜放在胰酪胨大豆琼脂培养基上在30-35℃下培养48小时计数；真菌将滤膜放在 沙氏葡萄糖琼脂培养基，在 23-28℃下培养72小时计数，每株试验菌平行制备2个平皿，按薄膜过滤
法测定其菌数。
结果判断：在3次独立的平行试验中稀释剂对照组的菌回收率和试验组的菌回收率应均不低于70%，若任一次试验中，试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
3.3 制剂无菌检查：薄膜过滤法
当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。
菌种：金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉
按照2010版药典二部附录Ⅺ H 无菌检查法进行培养基灵敏度和无菌性试验，也按照此方法进行菌液制备。 试验：
取一定量的供试品，平均分成两个组，按薄膜过滤法过滤，第一组用100ml 冲洗液冲洗三次，第二组用冲洗液冲洗四次，每次100ml ，每组均在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU 的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照，细菌置30-35℃、真菌置20-25℃培养3-5天，逐日观察各滤筒内试验菌的生长情况。
结果判定：将各试验组与对照管比较，如含供试品的各管中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作可以忽略不计，依据中国药典2010年二部无菌检查法中的规定：含有抑菌剂的供试品须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，再结合验证结果选择冲洗次大于等于三次的最小冲洗次数作为无菌检查法的日常冲洗次数。
3.3内毒素检查（干扰试验）
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
3.3.1干扰实验预实验：
目的：是初步确定供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，为正式干扰实验提供依据。
试验：将样品用内毒素检查用水进行系列稀释，每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照。另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。封闭管口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入37℃±1℃水浴中。保温60±2分钟后，观察并记录结果。
当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此浓度即为最大不干扰浓度。即可在该浓度下进行正式干扰实验。
当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大倍数稀释，或通过其他适宜的方法排除干扰。 3.3.2正式干扰实验：
目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。 制备内毒素标准对照溶液：
取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液，即2λ、λ、0.5λ、0.25λ。
制备含内毒素的供试品溶液：
将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。 鲎试剂的准备：
取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。 加样：
将准备好的鲎试剂取其中18支放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4列4支每列每支分别加入0.1ml 的含2λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支加入0.1ml 检查用水作为阴性对照。
将另外18支鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4列4支每列每支分别加入0.1ml 的含2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液，另一列2支加入0.1ml
供试品溶液作为样品阴性对照。
加样结束后封闭管口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴中，保温60±2分钟后，观察结果。 实验结果计算：
如两组最大浓度2.0λ均为阳性，阳性对照最低浓度0.25λ为阴性，阴性对照与样品阴性对照为阴性时，按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es ）和用供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et ）。 Es=lg-1（∑Xs/4） Et=lg-1（∑Xt/4）
Xs 、Xt 分别为检查用水和供试品溶液制成的内毒素的反应终点浓度的对数值（lg ）。 结果判断：
当Es 在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，且Et 在0.5Es ～2Es （包括0.5Es 和2Es ）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。
当Et 不在0.5Es ～2Es （包括0.5Es 和2Es ），则认为供试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜方法排除干扰。
当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。 3.4 清洁残留检测表面擦拭检测方法
3.4.1 通过回收率试验验证取样过程的回收率和重现性，通常取样回收率和检验方法回收率结合进行，总回收率不低于70%，多次取样回收率的相对标准偏差不大于20%。 3.4.2 验证方法如下：
①准备一块与设备表面材质相同的板材，如平整光洁的316L 不锈钢板； ②在钢板上划出50mm×50mm 的区域；
③将5倍限度量的待检测物溶液，定量装入校验的微量注射量； ④将其溶液尽量均匀地涂布在50mm×50mm 的区域内； ⑤自然干燥或用电吹风温和地吹干不锈钢板；
⑥用选定的擦拭溶剂润湿擦拭拭子，按下图所示进行擦拭取样； ⑦重复以上操作3次；
⑧将擦拭拭子分别放入拭子管中，加入预定溶剂5ml ，超声； ⑨用经验证的检验方法检验，计算回收率和回收率的RSD 。 下图为拭子擦试取样方法：
第一步 第二步 3.5 表面菌取样检测方法
3.5.1选用有代表性的菌种，传代次数不超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为0代）并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌的生物学特性。 菌种：以下菌种或符合要求的其他菌种源 金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26003/ATCC 6538 枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63105/ATCC 6633 黑曲霉CMCC(F) 98003/ATCC 16404 3.5.2菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养琼脂培养基上30-35℃培养18-24小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含菌量5×102 cfu ~1×103cfu 的菌悬液作为工作菌悬液，接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面上，23-28℃培养5-7天，加入3-5ml 含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后用塞有无菌蓬松脱脂棉的漏斗将孢子悬液收集到无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数5×102 cfu ~1×103cfu 的孢子悬液作为工作孢子悬液。菌液制备后在2个小时内使用。 3.5.3接触碟法
3.5.3.1试验组：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及黑曲霉孢子悬液0.1ml 用L 棒分别均匀的涂布于约25cm 2的正方形不锈钢片，约25 cm2的彩钢板以及约25cm 2万级地面。待干燥后用Φ55的接触碟充分接触载片表面，按压10秒钟，每个菌种每种载体制备2个接触碟，细菌于30-35℃培养3天。真菌于23-28℃培养5天。
3.5.3.2对照组：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌工作菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液做适当稀释使每毫升含菌量50~100cfu，分别取1ml 菌悬液加入到无菌平皿内立即加入温度低于45℃的无菌营养琼脂培养基20ml 左右。待凝固后于30-35℃倒置培养3天，计数，每个菌种制备2个平皿。黑曲霉的孢子悬液用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液做适当稀释使每毫升含菌量
50~100cfu，取1ml 菌悬液加入到无菌平皿内立即加入温度低于45℃的无菌虎红琼脂培养基20ml 左右，待凝固后于23-38℃培养5天，计数，制备2个平皿。
3.5.3.3阴性对照：用接触碟分别于约25cm 2的正方形不锈钢片，约25cm 2彩钢板表面，约25cm 2万级地面充分接触按压10秒钟，每个表面各取2个接触碟。
3.5.3.4重复上述实验用不同人平行制备三次。
3.5.4拭子擦拭法
3.5.4.1取样程序：取样人员用无菌生理盐水润湿无菌拭子，并将其靠在溶剂瓶上挤压，以除去多余的溶剂；将拭子按在取样表面上，用力使其稍弯曲，按图A ，平稳而缓慢地擦拭取样表面。在向前移动的同时将其从一边移到另一边。擦拭过程应覆盖整个表面。翻转拭子，按图B ，让棉签的另一面也进行擦拭。但与前次擦拭移动方向垂直，见下图：
擦拭结束后将拭子像上述图A 和图B 在培养基上进行检测。
3.5.4.2试验组：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及黑曲霉孢子悬液0.1ml 分别均匀的涂布于25cm 2的正方形不锈钢片，25 cm2的彩钢板以及25cm 2万级地面。待干燥后用，用拭子按照取样程序取样，按照取样程序在培养基上检测，细菌在营养琼脂培养基，真菌在虎红琼脂培养基上，每个菌种每种载体制备2个平皿，细菌于30-35℃培养3天。真菌于23-28℃培养5天。
3.5.4.3对照组同3.5.3.2。
3.5.4.4阴性对照：用拭子按照取样程序分别于25cm 2的正方形不锈钢片，25cm 2的彩钢板以及25cm 2万级地面取样，按照取样程序检测，每种载体做两个平皿。
3.5.4.5重复上述实验用不同人平行制备三次。
3.5.5菌液回收率的计算：
菌液回收率=试验组-阴性对照组 100% 对照组
3.5.6可接受标准：回收率不低于70%。
4方法确认
4.1适用范围
适用于物料和产品中不需要进行验证的检验方法以及药典方法和其他已验证的法定标准。通过方法确认来证明方法在本实验室条件下的适用性。
4.2 确认方式
通常由两名检验人员分别独立对同一批产品进行验证（如可能，使用不同的仪器），比较两人的检测结果来证明方法在本实验室（人员、分析仪器、试剂等）的适用性。
5验证报告包括的内容
5.1 结果分析、评价、结论及验证有效期；
5.2 验证结论审核批准。
6 再验证
下列情况，一般需要立即进行再验证或再确认：
——检验仪器发生改变时；
——产品工艺发生重大改变时；
——检验方法改变时；
——供试品的配方改变时；
——产品组分改变时；
目的
制定一个检测方法验证的管理程序，以指导公司检测方法验证文件的编写。 范围
适用于原料药的鉴别试验、杂质定量检查或限度检查、锌含量测定、含量测定、微生物限度检查和内毒素检查；制剂的鉴别试验、杂质定量检查或限度检查、含量测定、无菌检查、内毒素检查和其他成份（如防腐剂等）；清洁验证相关的检测方法、消毒剂验证相关的检测方法的验证。 职责
质量部验证人员起草，验证领导小组成员审核，质量总监批准，检测方法验证相关人员执行。 内容 1编制依据
1.1 《中国药典》2010版； 1.2 ICH Q2 。 2 常规方法验证
2.2 方法验证
就是根据检验项目的要求，预先设制一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的实验来验证所用的检测方法是否复合检验项目的要求。 《中国药典》2010版检验项目及验证内容
①已有重现性验证，不需验证中间精密度。
②如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。 ③视具体情况予以验证。
2.3 具体项目要有准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。视具体的分析方法拟定验证的内容。详述如下： 2.3.1准确度
指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示，准确度应在规定的范围内测试。 2. 3.1.1含量测定方法的准确度
原料药用已知纯度的对照品或供试品进行测定。
制剂产品中各组分均已知，所以也用已知纯度的对照品或供试品进行测定。 2. 3.1.2杂质定量测定的准确度
可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物，可用待验证方法测得的结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。 2. 3.1.3数据要求
在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价，例如，设计低、中、高3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。应报告已知加入量的回收率（%），或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或可信限。 2. 3.2精密度
精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。
在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。 含量测定和杂质的定量测定应考虑方法的精密度。 2. 3.2.1重复性
在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。例如，设计低、中、高3个不同浓度，每个浓度各分别制定3份供试品溶液，进行测定，或将相当于100%浓度水平的供试品溶液，用至少测定6次的结果进行评价。 2. 3.2.2中间精密度
为考察随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。 2. 3.2.3数据要求
均应报告标准偏差、相对标准偏差。 2. 3.3专属性
专属性系指在其它成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查和含量测定方法，均应考察其专属性。如方法不够专属，应采用多个方法予以补充。 2. 3.3.1鉴别反应
应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的化合物，应均呈负反应。 2. 3.3.2含量测定和杂质测定
色谱法和其他分离方法，应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明诸成分在图中的位置，色谱法中分离度应符合要求。
在杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质或辅料试样比较测定结果。对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的
杂质，考察杂质之间能否得到分离。 2. 3.4检测限
检测限系指试样中被测物能被检查出的最低量。药品的杂质检查方法，应通过测试确定方法的检测限。常用的方法如下： 2. 3.4.1非仪器分析目视法
用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。
2. 3.4.2信噪比法：用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。
2. 3.4.3标准曲线法：仪器分析法的检出限可以通过3条标准曲线来评估，公式如下： DL=SDa×3/Cl
其中：SD 是至少3个校准曲线的Y 轴截距的标准偏差，校准曲线中的药物浓度为接近推测定量限的浓度。也可通过对适当数量的空白样品进行分析而得到标准偏差；Cl 是校准曲线的斜率。
2. 3.4.4数据要求
若有，则应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。 2. 3.5定量限
2. 3.5.1信噪比法：以信噪比为10:1时浓度或注入仪器的量确定定量限。 2. 3.5.2标准曲线法：可通过对3条标准曲线分析进行评估，计算公式如下： DL=SDa×10/Cl
其中：SD 是至少3个校准曲线的Y 轴截距的标准偏差，校准曲线中的药物浓度为接近推测定量限的浓度。也可通过对适当数量的空白样品进行分析而得到标准偏差；Cl 是校准曲线的斜率。
2. 3.5.3数据要求
若有，则应附测试图谱，说明测试过程和定量限结果。
2. 3.6线性：线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 应在规定的范围内测定线性关系。可用以贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5份供试样品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作用，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。
数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。
2. 3.7范围：范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。原料药和制剂含量测定，原料药范围应为测试浓度的80%~120%，制剂范围应为测试浓度的70%~130%；杂质测定，范围应根据初步实测，拟订为规定限度的±20%。
2. 3.8耐用性：耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用以常规检验提供依据。开始研究分析时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品的提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和PH 值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、规定性、不同类型的载体、柱温、进样口和检测器温度等。
经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。 3 其它检测方法验证
包括原料药和注射液的微生物限度检测方法、制剂的无菌检测方法、原料药和制剂的内毒素检测方法、清洁验证相关的表面残留擦拭检测方法和表面微生物取样检测方法、消毒剂消毒效力检测方法等验证。 3.1微生物限度检测方法
当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物测定。 菌种：以下菌种或符合要求的其他菌种源 大肠埃希菌CMCC(B) 44102/ATCC 25922 金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26 003/ATCC 6538 枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63 501/ATCC 9027 白色念株菌CMCC(F) 98 001/ATCC 10231 黑曲霉CMCC(F) 98 003/ATCC 16404
计数培养基的适用性检查符合要求后，进行菌落计数方法验证，各试验菌逐一进行验证。 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 （1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml 和50～100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。 （2）菌液组 测定所加的试验菌数。
（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本身菌数。
（4）稀释剂对照组 若供试液制备需要稀释或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml 供试液含50～100cfu ，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
结果判断：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。当产品的组分或原检查条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新进行验证。 3.2 注射液微生物限度检测方法
当建立产品的微生物限度检查法时，进行细菌、霉菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌测定。 菌种：以下菌种或符合要求的其他菌种源 白色念株菌CMCC(F) 98 001/ATCC 10231； 黑曲霉CMCC(F) 98 003 ATCC 16404。
计数培养基的适用性检查符合要求后，进行菌落计数方法验证，各试验菌逐一进行验证。 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 3.2.1 试验组：取1ml 供试液过滤，冲洗三次，每次100ml ，在最后一次的冲洗液中加入50-100cfu/ml试验菌1ml ，过滤，细菌将滤膜放在胰酪胨大豆琼脂培养基上在30-35℃下培养48小时计数；真菌将滤膜放在沙氏葡萄糖琼脂培养基，在 23-28℃下培养72小时计数，每株试验菌平行制备2个平皿，按薄膜过滤法测定其菌数。
3.2.2 菌液组：测定所加的试验菌数，将50-100cfu 试验菌薄膜过滤，细菌将滤膜放在胰酪胨大豆琼脂培养基上在30-35℃下培养48小时计数；真菌将滤膜放在沙氏葡萄糖琼脂培养基，在 23-28℃下培养72小时计数，每株试验菌平行制备2个平皿，按薄膜过滤法测定其菌数。 3.2.3 供试品对照组：取1ml 供试液过滤，冲洗三次，每次100ml ，培养细菌用滤膜放在胰酪胨大豆琼脂培养基上在30-35℃下培养48小时计数；培养真菌用滤膜放在沙氏葡萄糖琼脂培养基，在 23-28℃下培养72小时计数，每种培养基平行制备2个平皿，按薄膜过滤法测定其菌数。 3.2.4 稀释剂对照组：用稀释剂冲洗三次，每次100ml ，在最后一次的冲洗液中加入50-100cfu/ml试验菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，白色念珠菌、黑曲霉）1ml ，过滤，细菌将滤膜放在胰酪胨大豆琼脂培养基上在30-35℃下培养48小时计数；真菌将滤膜放在 沙氏葡萄糖琼脂培养基，在 23-28℃下培养72小时计数，每株试验菌平行制备2个平皿，按薄膜过滤
法测定其菌数。
结果判断：在3次独立的平行试验中稀释剂对照组的菌回收率和试验组的菌回收率应均不低于70%，若任一次试验中，试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
3.3 制剂无菌检查：薄膜过滤法
当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。
菌种：金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉
按照2010版药典二部附录Ⅺ H 无菌检查法进行培养基灵敏度和无菌性试验，也按照此方法进行菌液制备。 试验：
取一定量的供试品，平均分成两个组，按薄膜过滤法过滤，第一组用100ml 冲洗液冲洗三次，第二组用冲洗液冲洗四次，每次100ml ，每组均在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU 的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照，细菌置30-35℃、真菌置20-25℃培养3-5天，逐日观察各滤筒内试验菌的生长情况。
结果判定：将各试验组与对照管比较，如含供试品的各管中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作可以忽略不计，依据中国药典2010年二部无菌检查法中的规定：含有抑菌剂的供试品须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，再结合验证结果选择冲洗次大于等于三次的最小冲洗次数作为无菌检查法的日常冲洗次数。
3.3内毒素检查（干扰试验）
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
3.3.1干扰实验预实验：
目的：是初步确定供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，为正式干扰实验提供依据。
试验：将样品用内毒素检查用水进行系列稀释，每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照。另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。封闭管口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入37℃±1℃水浴中。保温60±2分钟后，观察并记录结果。
当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此浓度即为最大不干扰浓度。即可在该浓度下进行正式干扰实验。
当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大倍数稀释，或通过其他适宜的方法排除干扰。 3.3.2正式干扰实验：
目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。 制备内毒素标准对照溶液：
取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液，即2λ、λ、0.5λ、0.25λ。
制备含内毒素的供试品溶液：
将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。 鲎试剂的准备：
取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。 加样：
将准备好的鲎试剂取其中18支放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4列4支每列每支分别加入0.1ml 的含2λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支加入0.1ml 检查用水作为阴性对照。
将另外18支鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4列4支每列每支分别加入0.1ml 的含2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液，另一列2支加入0.1ml
供试品溶液作为样品阴性对照。
加样结束后封闭管口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴中，保温60±2分钟后，观察结果。 实验结果计算：
如两组最大浓度2.0λ均为阳性，阳性对照最低浓度0.25λ为阴性，阴性对照与样品阴性对照为阴性时，按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es ）和用供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et ）。 Es=lg-1（∑Xs/4） Et=lg-1（∑Xt/4）
Xs 、Xt 分别为检查用水和供试品溶液制成的内毒素的反应终点浓度的对数值（lg ）。 结果判断：
当Es 在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，且Et 在0.5Es ～2Es （包括0.5Es 和2Es ）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。
当Et 不在0.5Es ～2Es （包括0.5Es 和2Es ），则认为供试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜方法排除干扰。
当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。 3.4 清洁残留检测表面擦拭检测方法
3.4.1 通过回收率试验验证取样过程的回收率和重现性，通常取样回收率和检验方法回收率结合进行，总回收率不低于70%，多次取样回收率的相对标准偏差不大于20%。 3.4.2 验证方法如下：
①准备一块与设备表面材质相同的板材，如平整光洁的316L 不锈钢板； ②在钢板上划出50mm×50mm 的区域；
③将5倍限度量的待检测物溶液，定量装入校验的微量注射量； ④将其溶液尽量均匀地涂布在50mm×50mm 的区域内； ⑤自然干燥或用电吹风温和地吹干不锈钢板；
⑥用选定的擦拭溶剂润湿擦拭拭子，按下图所示进行擦拭取样； ⑦重复以上操作3次；
⑧将擦拭拭子分别放入拭子管中，加入预定溶剂5ml ，超声； ⑨用经验证的检验方法检验，计算回收率和回收率的RSD 。 下图为拭子擦试取样方法：
第一步 第二步 3.5 表面菌取样检测方法
3.5.1选用有代表性的菌种，传代次数不超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为0代）并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌的生物学特性。 菌种：以下菌种或符合要求的其他菌种源 金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26003/ATCC 6538 枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63105/ATCC 6633 黑曲霉CMCC(F) 98003/ATCC 16404 3.5.2菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养琼脂培养基上30-35℃培养18-24小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含菌量5×102 cfu ~1×103cfu 的菌悬液作为工作菌悬液，接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面上，23-28℃培养5-7天，加入3-5ml 含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后用塞有无菌蓬松脱脂棉的漏斗将孢子悬液收集到无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数5×102 cfu ~1×103cfu 的孢子悬液作为工作孢子悬液。菌液制备后在2个小时内使用。 3.5.3接触碟法
3.5.3.1试验组：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及黑曲霉孢子悬液0.1ml 用L 棒分别均匀的涂布于约25cm 2的正方形不锈钢片，约25 cm2的彩钢板以及约25cm 2万级地面。待干燥后用Φ55的接触碟充分接触载片表面，按压10秒钟，每个菌种每种载体制备2个接触碟，细菌于30-35℃培养3天。真菌于23-28℃培养5天。
3.5.3.2对照组：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌工作菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液做适当稀释使每毫升含菌量50~100cfu，分别取1ml 菌悬液加入到无菌平皿内立即加入温度低于45℃的无菌营养琼脂培养基20ml 左右。待凝固后于30-35℃倒置培养3天，计数，每个菌种制备2个平皿。黑曲霉的孢子悬液用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液做适当稀释使每毫升含菌量
50~100cfu，取1ml 菌悬液加入到无菌平皿内立即加入温度低于45℃的无菌虎红琼脂培养基20ml 左右，待凝固后于23-38℃培养5天，计数，制备2个平皿。
3.5.3.3阴性对照：用接触碟分别于约25cm 2的正方形不锈钢片，约25cm 2彩钢板表面，约25cm 2万级地面充分接触按压10秒钟，每个表面各取2个接触碟。
3.5.3.4重复上述实验用不同人平行制备三次。
3.5.4拭子擦拭法
3.5.4.1取样程序：取样人员用无菌生理盐水润湿无菌拭子，并将其靠在溶剂瓶上挤压，以除去多余的溶剂；将拭子按在取样表面上，用力使其稍弯曲，按图A ，平稳而缓慢地擦拭取样表面。在向前移动的同时将其从一边移到另一边。擦拭过程应覆盖整个表面。翻转拭子，按图B ，让棉签的另一面也进行擦拭。但与前次擦拭移动方向垂直，见下图：
擦拭结束后将拭子像上述图A 和图B 在培养基上进行检测。
3.5.4.2试验组：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及黑曲霉孢子悬液0.1ml 分别均匀的涂布于25cm 2的正方形不锈钢片，25 cm2的彩钢板以及25cm 2万级地面。待干燥后用，用拭子按照取样程序取样，按照取样程序在培养基上检测，细菌在营养琼脂培养基，真菌在虎红琼脂培养基上，每个菌种每种载体制备2个平皿，细菌于30-35℃培养3天。真菌于23-28℃培养5天。
3.5.4.3对照组同3.5.3.2。
3.5.4.4阴性对照：用拭子按照取样程序分别于25cm 2的正方形不锈钢片，25cm 2的彩钢板以及25cm 2万级地面取样，按照取样程序检测，每种载体做两个平皿。
3.5.4.5重复上述实验用不同人平行制备三次。
3.5.5菌液回收率的计算：
菌液回收率=试验组-阴性对照组 100% 对照组
3.5.6可接受标准：回收率不低于70%。
4方法确认
4.1适用范围
适用于物料和产品中不需要进行验证的检验方法以及药典方法和其他已验证的法定标准。通过方法确认来证明方法在本实验室条件下的适用性。
4.2 确认方式
通常由两名检验人员分别独立对同一批产品进行验证（如可能，使用不同的仪器），比较两人的检测结果来证明方法在本实验室（人员、分析仪器、试剂等）的适用性。
5验证报告包括的内容
5.1 结果分析、评价、结论及验证有效期；
5.2 验证结论审核批准。
6 再验证
下列情况，一般需要立即进行再验证或再确认：
——检验仪器发生改变时；
——产品工艺发生重大改变时；
——检验方法改变时；
——供试品的配方改变时；
——产品组分改变时；