菌 物 学 报 23（2）：219~225, 2004 Mycosystema
纯培养拟茎点霉属真菌的产孢条件
罗利娟1,2 习平根1 姜子德1* 戚佩坤1
（1华南农业大学植物病理学系 广州 510642；2中山出入境检验检疫局 中山 528400）
摘 要：对8种拟茎点霉纯培养下的产孢条件进行了筛选和比较。结果表明，拟茎点霉产孢的最佳培养基为苜蓿煎汁+Czapek培养基，其次为燕麦片琼脂培养基和苜蓿杆+水琼脂培养基；最适温度范围为22~25℃；最佳光照时间为每天12h （日光灯40W ，与培养物间的距离约为30cm ）；合适的pH 值范围为5.6~6.8。
关键词：培养条件，最适培养基，最适温度，最佳光照，最适pH 值
中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2004）02-0219-0225
拟茎点霉属 Phomopsis (Sacc.) Bubak 真菌主要为害植物，引起枝枯、溃疡、果腐、叶枯等一系列症状（Uecker, 1988）。种类多，寄主广，形态差异小；而一些种类生于植物的茎、枝，子实体形成少且不易检出，给该属真菌的种类鉴定造成了较大的困难。研究纯培养下的拟茎点霉产孢条件，并将其标准化，不仅可减少生境不同可能造成的形态差异，也有助于解决一些拟茎点霉在自然条件下难产生子实体而无法进行鉴定的问题。关于拟茎点霉在培养条件下子实体的形成，国内外已做了一些工作。Gindrat & Moody (1973) 将新鲜的菜豆荚烘干，灭菌后置于水琼脂上，诱导一种引起温室栽培黄瓜根腐病的病菌快速形成子实体，根据病症和纯培养下产生的子实体形态，鉴定该菌为Phomopsis sclerotioides Kesteren. ；Morin (1990)研究Phomopsis convolvulus Petrak. 时发现，在大麦粒培养基和改良的Richard (V-8)液体培养基上该菌均可形成大量分生孢子；Brayford (1990)根据在PDA 、OMA 、Czapek-Dox 和MA （麦芽汁琼脂）培养基上的培养性状和形态将来自英国和意大利榆树上300多个Phomopsis 菌株分为两个群。 Coelho（1997）比较了Phomopsis 和Phoma 于不同培养基（OMA 、MA 、PDA 、胡萝卜琼脂和V 8汁）、培养温度及照光时间条件下载孢体和孢子形成情况，认为培养基为OMA 、21-25℃、连续照光有利于载孢体的产生。为了获得纯培养条件下拟茎点霉属真菌产孢的最佳条件，作者以多种拟茎点霉为材料对培养基、温度、光照时间、pH 值等培养条件进行了较系统的筛选实验。
1 材料与方法
1.1 供试菌种
供试菌株均为华南农业大学真菌研究室采集、分离，见表1。 1.2 温度
自PDA 上生长3天的拟茎点霉菌落取直径为0.5cm 的菌块，接到适于腔孢纲真菌产孢的OMA 基金项目：国家自然科学基金项目（39870001， 39899400）和高等学校骨干教师资助计划项目的部分内容 收原稿日期：2003-07-10，收修改稿日期：2003-10-31 *
通讯作者（E-mail: [email protected]）
220 菌 物 学 报 23卷
上（Sutton, 1980），分别置于14℃, 18℃, 22℃, 25℃, 28℃, 32℃的人工气候箱中（温度误差为±1℃）培养，每一处理重复3次，定期检查载孢体的形成数量。 1.3 光照
接菌方法和培养基同1.2，培养温度为25℃，光源为40w 日光灯（与培养物间的距离约为30cm ），照光时间分别为24h/d、12h /d和0h /d（朱宗源等, 1985）。定期检查其载孢体产生的情况。
表1 实验菌株及其来源
Table 1 Hosts and sources of tested isolates of Phomopsis
序号 No. 1 2 3 4 5 6 7 8
种 名 Species
Phomopsis cassiae de Camara P . bombacis Z.D. Jiang et P.K. Chi P . euphorbiae (Sacc.) Traverso P . mangiferae Ahmad
P . destructum Rao, Agrawal et Saksena P . psidii de Camara P . asparagus (Sacc.) Bubak P . sterculicola Z.D. Jiang et P.K. Chi
寄主植物/部位 Host and position Twig of Cassia fistula L.
Twig of Bombax malabaricum DC. T wig of Euphorbia pulcherrima Willd. Fruit of Mangifera indica L. Fruit of Psidium guajava L. Leaf of Psidium guajava L. Stem of Asparagus officinalis L. Leaf of Sterculia lychnocarpa Hance
来源 Source
Guangzhou, Guangdong Guangzhou, Guangdong Guangzhou, Guangdong Guangzhou, Guangdong Guangzhou, Guangdong Guangzhou, Guangdong Fogang, Guangdong Guangzhou, Guangdong
1.4 pH值
以50%的伯坦-罗比森缓冲液配制Czapek 培养基，pH 值分别为4.4, 5.0, 5.6, 6.2, 6.8, 7.4，8.0, 8.6, 9.2。灭菌后进行pH 值的再测定(何欣，1987) ，变化为原值。接菌方法和培养温度同1.3，光照为12h /d（40w 日光灯）。 1.5 培养基
接菌方法、培养温度和照光处理同1.4，定期检查子实体形成情况。
1.5.1 常用培养基：PDA 、OMA 、CMA 、PDYA 、V 8汁琼脂培养基（方中达，1998）。 1.5.2 合成培养基：配制查彼克（Czapek ）培养液（方中达，1998），调pH 值至6.0，分别加入V B1、V C 、烟酸 (nicotinic acid)、叶酸 (folic acid)、D-生物素 (biotin) 和染料刚果红(Congo red)，维生素和染料的浓度均为50µg/ml (Gambhir & Patil, 1983；Suryanarayanan & Muruganandam, 1986) ，再加琼脂，灭菌。
1.5.3 植物材料培养基：选取了紫花苜蓿杆、大豆杆、小麦杆，水稻杆。将上述植物材料自然风干后，切成2cm 左右的小段，灭菌后置于水琼脂平板上。
1.5.4混合培养基：选择上述几种培养基，进行改良或组合，形成混合培养基：（1）将苜蓿杆剪成1cm 左右的小段，加入Czapek 培养基中灭菌，摇匀后倒平板；（2）将苜蓿杆剪成1cm 左右的小段，加入OMA 培养基中灭菌，摇匀后倒平板；（3）干苜蓿杆、叶共100g ，加水煮沸0.5h ，过滤后将滤汁加入到Czapek 培养基中，补水至1000ml ，pH 值调至6.0-6.5。（4）干苜蓿杆、叶共100g ，加水煮沸0.5h ，过滤后将滤汁加入到OMA 培养基中，补水至1000ml ，pH 值调至6.0-6.5。
2 结果和分析
2.1 温度
温度对菌株的生长及产孢均有影响。在OMA 上，28℃时菌丝生长快，但只有3个菌株产生载孢体；14℃时菌株生长速度虽很慢，但大多数菌株能产生载孢体；产生载孢体的适合温度范围
2期 罗利娟等：纯培养拟茎点霉属真菌的产孢条件 221
为22-25℃（表2）。
表2 不同温度下拟茎点霉载孢体的形成情况（OMA, 14d）
Table 2 Conidioma formation of Phomopsis at different temperature (OMA, 14d)
Isolate No. 1 2 3 4 5 6 7 8
14℃ ＋ ＋ － ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋
18℃ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋
22℃ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋
25℃ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋
28℃ － － ＋ ＋ － ＋ － －
32℃ － － － － － － － －
36℃ － － － － － － － －
“－”：不形成载孢体； “+”： 1-20个载孢体/皿； “++”：21-50个载孢体/皿； “+++”：51-80个载孢体/皿； “++++”：81-120个载孢体/皿； “+++++”：120个载孢体以上/皿 “－”： no conidiomata formed; “+”：1-20 conidiomata/petri-dish; “++”：21-50 conidiomata/petri-dish; “+++”：51-80 conidiomata/petri-dish; “++++”： 81-120 conidiomata/petri-dish; “+++++”： more than 120 conidiomata/petri-dish.
2.2 pH 值
pH 值在4.4-7.4时多数供试菌株可产生载孢体，其中pH 值为5.6-6.8时产生的数量最多，当pH 值为8或超过8时，各菌株均不产生载孢体（表3）。 2.3 光照
12h/d光照利于拟茎点霉生长和产孢。连续光照菌丝生长很浓密，菌落白色、棉絮状，变异较大，形成的载孢体不能突出琼脂表面；连续黑暗对载孢体产生数量影响虽不大，但成熟慢(表4) 。 2.4 培养基
2.4.1 常用培养基：8种拟茎点霉均能在OMA 和CMA 上较好地形成载孢体，但OMA 上形成载孢体所需时间较短，一般6~7 d开始形成，而CMA 上则需要10~12d；在PDA 、PDYA 上菌丝生长快，但形成载孢体所需时间更长；V 8汁培养基上，载孢体的个体小，产生的数目也较少（见表5）。可见OMA 确实是一种较适合拟茎点霉等腔孢菌产生子实体的培养基。
表3 不同pH 值条件下拟茎点霉的载孢体形成情况 （25℃, OMA, 18d）
Table 3 Conidioma formation of Phomopsis in different pH value (25℃, OMA, 18d)
Isolate 1 2 3 4 5 6 7 8
4.4 ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
5.0 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋
5.6 ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋
6.2 ＋＋ － ＋＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋
6.8 ＋＋ － ＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋
7.4 ＋ － ＋＋ ＋ － ＋ ＋＋ ＋＋
8.0 － － － － － － － －
8.6 － － － － － － － －
9.2 － － － － － － － －
“－”、“+”、“++”、“+++” 和“++++”所表示的意义同表2。 “－”、“+”、“++”、“+++” and “++++” symbolized the same meaning as Table2.
222 菌 物 学 报
表4 不同光照时间拟茎点霉载孢体形成情况（25℃, OMA, 14d）
Table 4 Conidioma formation of Phomopsis under different lighting time (25℃, OMA, 14d)
载孢体数量 number of conidiomata + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
23卷
菌株 isolates
光照时间 lighting time
备 注 remarks
载孢体埋生 conidiomata immerse.
载孢体明显突出 conidiomata distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生conidiomata small, mostly immerse. 载孢体埋生 conidiomata immerse.
载孢体明显突出 conidiomata distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生 conidiomata small, mostly immerse. 载孢体较小, 多埋生conidiomata small, mostly immerse 载孢体较大, 明显突出conidiomata large, distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生 conidiomata small, mostly immerse. 载孢体很小, 埋生 conidiomata very small., immerse. 载孢体较大, 明显突出conidiomata large, distinctly protrudent. 载孢体较小, 埋生conidiomata small, immerse. 载孢体埋生 conidiomata immerse. 载孢体多突出 conidiomata mostly protrudent,
载孢体较小, 多埋生 conidiomata small, mostly immerse. 载孢体埋生 conidiomata immerse.
载孢体较大, 明显突出 conidiomata large, distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生 conidiomata small, mostly immerse. 载孢体埋生 conidiomata immerse.
载孢体较大, 明显突出conidiomata large, distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生conidiomata small, mostly immerse. 载孢体埋生 conidiomata immerse.
载孢体较大, 明显突出 conidiomata large, distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生 conidiomata small, mostly immerse.
1 12 0 24
2 12 0 24
3 12 0 24
4 12 0 24
5 12 0 24
6 12 0 24
7 12 0 24
8 12 0
“－”、“+”、“++”、“+++” 和“++++”所表示的意义同表2. “－”、“+”、“++”、“+++” and “++++” symbolized the same meaning as Table 2.
2.4.2 合成培养基：与Czapek 培养基相比，添加了维生素和染料对拟茎点霉产生载孢体有一定促进作用，但菌株间有较大的差异，其中生物素、VB 1、V C 、刚果红对大多数菌株产孢的促进作用比较明显（图1），其对形成乙型分生孢子是否也有促进作用，值得进一步研究。
2.4.3 植物组织培养基：4种植物材料中以苜蓿杆+WA上形成载孢体数量最多，所需时间最短，一般在5 d左右开始形成小黑点，7~8 d后有的载孢体开始分泌孢子角。而在小麦秆、大豆杆和水稻杆上，产生载孢体和孢子所需时间至少需12 d，孢子数量也少（图2）。
2.4.4 混合培养基：与其他混合培养基相比较，苜蓿煎汁+Czapek培养基上产生载孢体的数量并无明显优势，但载孢体的显微观察可见：苜蓿煎汁+Czapek培养基上形成的分生孢子类型与苜蓿杆+OMA、苜蓿杆+Czapek培养基有所不同，对拟茎点霉的种类鉴定具有重要意义（另文讨论），为
2期 罗利娟等：纯培养拟茎点霉属真菌的产孢条件 223
拟茎点霉产孢的最佳培养基（表6）。
表5 几种常用培养基上拟茎点霉属真菌载孢体形成数量（个/皿）（14 d，25℃）
Table 5 The number of conidiomata of Phomopsis on several common culture media (14d, 25℃)
Isolate 1 2 3 4 5 6 7 8
PDA － 46 12 16 8 5 － 7
P D Y A － 9 11 8 35 3 － 8
OMA 138 145 165 98 148 167 182 176
CMA 145 130 134 147 86 147 177 156
V 8 12 67 25 11 77 34 35 44
－： 表示不产生载孢体 （No conidiomata formed）
表6 混合培养基上拟茎点霉属真菌载孢体形成数量（个/皿）（14d ，25℃）
Table 6 The number of conidiomata of Phomopsis on mixed culture media (14d, 25℃)
菌株 isolate 1 2 3 4 5 6 7 8
苜蓿煎汁+Czapek alfalfa extract+Czapek 167 154 197 145 123 154 189 170
苜蓿杆+Czapek alfalfa stem+ Czapek 118 126 156 89 32 127 104 86
苜蓿煎汁+OMA alfalfa extract+OMA 152 178 190 132 143 164 199 157
苜蓿杆+OMA alfalfa stem+ OMA 119 85 58 106 54 87 96 90
3 讨论
拟茎点霉纯培养产孢条件以22~25℃、每天12h 光照/d、pH 值5.6~6.8为佳。Kuropatwa （1995）在研究pH 值对Phomopsis viticola Sacc.产孢的影响时指出，Czapek 培养基的pH 值在3.18~7.19范围内该菌形成的甲型孢子数量比乙型孢子多，而在7.73~9.2之间则乙型孢子数量多；本研究的8种拟茎点霉未出现这一情况，当pH 值为8时供试的8种拟茎点霉均不形成载孢体，一种真菌产生子实体的合适pH 值能有如此大的变化范围也许只是个别现象。Coelho （1997）在对Phomopsis 和Phoma 在不同温度和光照时间条件下的产孢研究中指出，21~25℃下连续日光灯照射能够诱导产生孢子。本研究结果表明22~25℃的确有利于孢子的产生，但每天光照时间过长（16h 或以上）菌丝生长将会过于旺盛，载孢体被掩没在菌丝中，个体小且成熟慢。
224 菌 物 学 报 23卷
图1 不同维生素及染料对拟茎点霉载孢体形成的影响 （14d ，25℃）
Fig.1 Effect of different vitamin and dyestuff on conidioma formation of Phomopsis (14 d, 25℃ )
图2 不同植物材料上拟茎点霉的载孢体形成情况 （14d ，25℃）
Fig.2 Conidioma formation of Phomopsis on different plant material (14d, 25℃)
培养基是影响拟茎点霉产生载孢体很重要的因素。Gindrat & Moody（1973）和 Ushiyama（1995）的研究认为在水琼脂上加植物材料，如菜豆荚、植物叶片等可以诱导拟茎点霉产生载孢体；该观点为本研究结果所支持，本研究所采用的苜蓿杆、大豆杆等4种植物材料均能诱导产孢，尤以苜蓿杆为佳，不失为一种诱导拟茎点霉属产孢的良好材料，但其产生的孢子类型单一（多是甲型孢子），故对拟茎点霉种的鉴定意义不大。就OMA 而言，虽被认为是拟茎点霉属真菌产生孢子的最佳培养基（Sutton, 1980； Coelho, 1997）； 但从本研究14种培养基上8种拟茎点霉菌株载孢体产生的情况来看，苜蓿煎汁+Czapek培养基最有利于载孢体的产生。一般说来，拟茎点霉在PDA 上便可产生载孢体，但形成载孢体的数量比较少，所需的时间也较长；苜蓿煎汁+Czapek和OMA 培养基上产生载孢体和孢子数目相差不大，但形成的分生孢子类型有所不同，前者能诱导更多的菌株产生两种类型的孢子而有利于拟茎点霉的种类鉴定（将另文讨论）。可见，在纯培养下研究拟茎点霉的分生孢子类型及种鉴定，可采用苜蓿煎汁+Czapek培养基；若只是为获得载孢体和甲型分生孢子，则可采用OMA 或苜蓿杆+WA培养基。
2期 罗利娟等：纯培养拟茎点霉属真菌的产孢条件
[REFERENCES]
225
Brayford D, 1990. Variation in Phomopsis isolates from Ulmus species in the British Isles and Italy. Mycol Res, 94: 691-697
Coelho R M S, 1997. Sporulation of Phomopsis and Phoma on different culture media, temperature and luminosity conditions. Summa
Phytopathologica , 23: 176-180
Fang ZD, 1998. Methods in plant disease research. 3ed. Beijing: China Agricultural Press. 1-427 (in Chinese)
Gambhir S P, Patil N N, 1983. Influence of vitamins on growth and sporulation of Pestalotiopsis species. India J Mycol Pl Pathol , 13: 113-114 Gindrat D, Moody A R, 1973. Rapid induction of sporulation of Phomopsis sclerotioides van Kesteren in pure culture. Ann Phytopathol ,
5 (2): 219-222
He X, 1987. Studies on the biological characteristics of Phomopsis vexans. Master dissertation in phytopathology. Shenyang Agricultural
University (in Chinese)
Kuropatwa E, 1995. The effect of pH of the culture media on the growth and sporulation of Phomopsis viticola Sacc. (Sphaeropsidales,
Deuteromycotina ). Materialy z sympozjum, Olsztyn, Biotyczne srodowisko uprawne a zagrozenie chorobowe roslin”Olsztyn, 7-9 wrzesnia 1993.
Morin L, 1990. Production of conidia by Phomopsis convolvulus. Can J Microb, 36: 86-91
Suryanarayanan T S, Muruganandam V, 1986. Effect of Congo red on hyphal morphogenesis and sporulation of Botryodiplodia theobromae.
Can J Bot , 65: 815-816
Sutton B C, 1980. The coelomycetes. Kew, Surrey : CMI, 1-696
Ushiyama K, 1995. Mass production of conidiophores of Phomopsis spp., Colletotrichum and Pestalotiopsis spp. by agar leaf disk method.
Proceeding of the Kanto-Tosan Plant Protection Society. No.42, 101-103
Zhu ZY, Huang XM, Lu YH, 1985. An efficient technique for inducing profuse sporulation of Alternaria solani in pure culture. Acta Mycol
Sinica , 4: 180-184 (in Chinese)
［附中文参考文献］
方中达, 1998. 植病研究方法. 第三版, 北京：中国农业出版社
何欣, 1987. 茄子褐纹病菌（Phomopsis vexans）的生物学特性研究. 沈阳农业大学硕士学位论文 朱宗源, 黄晓敏, 吕云华, 1985. 诱导茄链格孢菌分生孢子形成的新技术. 真菌学报, 4: 180-184
SPORULATION CONDITIONS OF PHOMOPSIS IN PURE CULTURE
LUO Li-Juan1, 2 XI Ping-Gen1 JIANG Zi-De1 QI Pei-Kun1
（1Department of Plant Pathology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642. 2Zhongshan Entry - Exit Inspection
and Quarantine Bureau, Zhongshan 528400）
ABSTRACT: The sporulation conditions of 8 species of Phomopsis in pure culture were compared. The optimum media for Phomopsis sporulation was alfalfa extract+Czapek medium, and were OMA and alfalfa stem+WA media. The optimum range of temperature was 22℃-25℃. The optimum illumination time was 12 hours each day (fluorescent light, 40W; interval: 30cm ). The befitting pH value was 5.6-6.8.
KEY WORDS: Culture conditions, optimum media, optimum temperature, optimum illumination, befitting pH value
菌 物 学 报 23（2）：219~225, 2004 Mycosystema
纯培养拟茎点霉属真菌的产孢条件
罗利娟1,2 习平根1 姜子德1* 戚佩坤1
（1华南农业大学植物病理学系 广州 510642；2中山出入境检验检疫局 中山 528400）
摘 要：对8种拟茎点霉纯培养下的产孢条件进行了筛选和比较。结果表明，拟茎点霉产孢的最佳培养基为苜蓿煎汁+Czapek培养基，其次为燕麦片琼脂培养基和苜蓿杆+水琼脂培养基；最适温度范围为22~25℃；最佳光照时间为每天12h （日光灯40W ，与培养物间的距离约为30cm ）；合适的pH 值范围为5.6~6.8。
关键词：培养条件，最适培养基，最适温度，最佳光照，最适pH 值
中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2004）02-0219-0225
拟茎点霉属 Phomopsis (Sacc.) Bubak 真菌主要为害植物，引起枝枯、溃疡、果腐、叶枯等一系列症状（Uecker, 1988）。种类多，寄主广，形态差异小；而一些种类生于植物的茎、枝，子实体形成少且不易检出，给该属真菌的种类鉴定造成了较大的困难。研究纯培养下的拟茎点霉产孢条件，并将其标准化，不仅可减少生境不同可能造成的形态差异，也有助于解决一些拟茎点霉在自然条件下难产生子实体而无法进行鉴定的问题。关于拟茎点霉在培养条件下子实体的形成，国内外已做了一些工作。Gindrat & Moody (1973) 将新鲜的菜豆荚烘干，灭菌后置于水琼脂上，诱导一种引起温室栽培黄瓜根腐病的病菌快速形成子实体，根据病症和纯培养下产生的子实体形态，鉴定该菌为Phomopsis sclerotioides Kesteren. ；Morin (1990)研究Phomopsis convolvulus Petrak. 时发现，在大麦粒培养基和改良的Richard (V-8)液体培养基上该菌均可形成大量分生孢子；Brayford (1990)根据在PDA 、OMA 、Czapek-Dox 和MA （麦芽汁琼脂）培养基上的培养性状和形态将来自英国和意大利榆树上300多个Phomopsis 菌株分为两个群。 Coelho（1997）比较了Phomopsis 和Phoma 于不同培养基（OMA 、MA 、PDA 、胡萝卜琼脂和V 8汁）、培养温度及照光时间条件下载孢体和孢子形成情况，认为培养基为OMA 、21-25℃、连续照光有利于载孢体的产生。为了获得纯培养条件下拟茎点霉属真菌产孢的最佳条件，作者以多种拟茎点霉为材料对培养基、温度、光照时间、pH 值等培养条件进行了较系统的筛选实验。
1 材料与方法
1.1 供试菌种
供试菌株均为华南农业大学真菌研究室采集、分离，见表1。 1.2 温度
自PDA 上生长3天的拟茎点霉菌落取直径为0.5cm 的菌块，接到适于腔孢纲真菌产孢的OMA 基金项目：国家自然科学基金项目（39870001， 39899400）和高等学校骨干教师资助计划项目的部分内容 收原稿日期：2003-07-10，收修改稿日期：2003-10-31 *
通讯作者（E-mail: [email protected]）
220 菌 物 学 报 23卷
上（Sutton, 1980），分别置于14℃, 18℃, 22℃, 25℃, 28℃, 32℃的人工气候箱中（温度误差为±1℃）培养，每一处理重复3次，定期检查载孢体的形成数量。 1.3 光照
接菌方法和培养基同1.2，培养温度为25℃，光源为40w 日光灯（与培养物间的距离约为30cm ），照光时间分别为24h/d、12h /d和0h /d（朱宗源等, 1985）。定期检查其载孢体产生的情况。
表1 实验菌株及其来源
Table 1 Hosts and sources of tested isolates of Phomopsis
序号 No. 1 2 3 4 5 6 7 8
种 名 Species
Phomopsis cassiae de Camara P . bombacis Z.D. Jiang et P.K. Chi P . euphorbiae (Sacc.) Traverso P . mangiferae Ahmad
P . destructum Rao, Agrawal et Saksena P . psidii de Camara P . asparagus (Sacc.) Bubak P . sterculicola Z.D. Jiang et P.K. Chi
寄主植物/部位 Host and position Twig of Cassia fistula L.
Twig of Bombax malabaricum DC. T wig of Euphorbia pulcherrima Willd. Fruit of Mangifera indica L. Fruit of Psidium guajava L. Leaf of Psidium guajava L. Stem of Asparagus officinalis L. Leaf of Sterculia lychnocarpa Hance
来源 Source
Guangzhou, Guangdong Guangzhou, Guangdong Guangzhou, Guangdong Guangzhou, Guangdong Guangzhou, Guangdong Guangzhou, Guangdong Fogang, Guangdong Guangzhou, Guangdong
1.4 pH值
以50%的伯坦-罗比森缓冲液配制Czapek 培养基，pH 值分别为4.4, 5.0, 5.6, 6.2, 6.8, 7.4，8.0, 8.6, 9.2。灭菌后进行pH 值的再测定(何欣，1987) ，变化为原值。接菌方法和培养温度同1.3，光照为12h /d（40w 日光灯）。 1.5 培养基
接菌方法、培养温度和照光处理同1.4，定期检查子实体形成情况。
1.5.1 常用培养基：PDA 、OMA 、CMA 、PDYA 、V 8汁琼脂培养基（方中达，1998）。 1.5.2 合成培养基：配制查彼克（Czapek ）培养液（方中达，1998），调pH 值至6.0，分别加入V B1、V C 、烟酸 (nicotinic acid)、叶酸 (folic acid)、D-生物素 (biotin) 和染料刚果红(Congo red)，维生素和染料的浓度均为50µg/ml (Gambhir & Patil, 1983；Suryanarayanan & Muruganandam, 1986) ，再加琼脂，灭菌。
1.5.3 植物材料培养基：选取了紫花苜蓿杆、大豆杆、小麦杆，水稻杆。将上述植物材料自然风干后，切成2cm 左右的小段，灭菌后置于水琼脂平板上。
1.5.4混合培养基：选择上述几种培养基，进行改良或组合，形成混合培养基：（1）将苜蓿杆剪成1cm 左右的小段，加入Czapek 培养基中灭菌，摇匀后倒平板；（2）将苜蓿杆剪成1cm 左右的小段，加入OMA 培养基中灭菌，摇匀后倒平板；（3）干苜蓿杆、叶共100g ，加水煮沸0.5h ，过滤后将滤汁加入到Czapek 培养基中，补水至1000ml ，pH 值调至6.0-6.5。（4）干苜蓿杆、叶共100g ，加水煮沸0.5h ，过滤后将滤汁加入到OMA 培养基中，补水至1000ml ，pH 值调至6.0-6.5。
2 结果和分析
2.1 温度
温度对菌株的生长及产孢均有影响。在OMA 上，28℃时菌丝生长快，但只有3个菌株产生载孢体；14℃时菌株生长速度虽很慢，但大多数菌株能产生载孢体；产生载孢体的适合温度范围
2期 罗利娟等：纯培养拟茎点霉属真菌的产孢条件 221
为22-25℃（表2）。
表2 不同温度下拟茎点霉载孢体的形成情况（OMA, 14d）
Table 2 Conidioma formation of Phomopsis at different temperature (OMA, 14d)
Isolate No. 1 2 3 4 5 6 7 8
14℃ ＋ ＋ － ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋
18℃ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋
22℃ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋
25℃ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋＋
28℃ － － ＋ ＋ － ＋ － －
32℃ － － － － － － － －
36℃ － － － － － － － －
“－”：不形成载孢体； “+”： 1-20个载孢体/皿； “++”：21-50个载孢体/皿； “+++”：51-80个载孢体/皿； “++++”：81-120个载孢体/皿； “+++++”：120个载孢体以上/皿 “－”： no conidiomata formed; “+”：1-20 conidiomata/petri-dish; “++”：21-50 conidiomata/petri-dish; “+++”：51-80 conidiomata/petri-dish; “++++”： 81-120 conidiomata/petri-dish; “+++++”： more than 120 conidiomata/petri-dish.
2.2 pH 值
pH 值在4.4-7.4时多数供试菌株可产生载孢体，其中pH 值为5.6-6.8时产生的数量最多，当pH 值为8或超过8时，各菌株均不产生载孢体（表3）。 2.3 光照
12h/d光照利于拟茎点霉生长和产孢。连续光照菌丝生长很浓密，菌落白色、棉絮状，变异较大，形成的载孢体不能突出琼脂表面；连续黑暗对载孢体产生数量影响虽不大，但成熟慢(表4) 。 2.4 培养基
2.4.1 常用培养基：8种拟茎点霉均能在OMA 和CMA 上较好地形成载孢体，但OMA 上形成载孢体所需时间较短，一般6~7 d开始形成，而CMA 上则需要10~12d；在PDA 、PDYA 上菌丝生长快，但形成载孢体所需时间更长；V 8汁培养基上，载孢体的个体小，产生的数目也较少（见表5）。可见OMA 确实是一种较适合拟茎点霉等腔孢菌产生子实体的培养基。
表3 不同pH 值条件下拟茎点霉的载孢体形成情况 （25℃, OMA, 18d）
Table 3 Conidioma formation of Phomopsis in different pH value (25℃, OMA, 18d)
Isolate 1 2 3 4 5 6 7 8
4.4 ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
5.0 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋
5.6 ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋
6.2 ＋＋ － ＋＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋
6.8 ＋＋ － ＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋
7.4 ＋ － ＋＋ ＋ － ＋ ＋＋ ＋＋
8.0 － － － － － － － －
8.6 － － － － － － － －
9.2 － － － － － － － －
“－”、“+”、“++”、“+++” 和“++++”所表示的意义同表2。 “－”、“+”、“++”、“+++” and “++++” symbolized the same meaning as Table2.
222 菌 物 学 报
表4 不同光照时间拟茎点霉载孢体形成情况（25℃, OMA, 14d）
Table 4 Conidioma formation of Phomopsis under different lighting time (25℃, OMA, 14d)
载孢体数量 number of conidiomata + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
23卷
菌株 isolates
光照时间 lighting time
备 注 remarks
载孢体埋生 conidiomata immerse.
载孢体明显突出 conidiomata distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生conidiomata small, mostly immerse. 载孢体埋生 conidiomata immerse.
载孢体明显突出 conidiomata distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生 conidiomata small, mostly immerse. 载孢体较小, 多埋生conidiomata small, mostly immerse 载孢体较大, 明显突出conidiomata large, distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生 conidiomata small, mostly immerse. 载孢体很小, 埋生 conidiomata very small., immerse. 载孢体较大, 明显突出conidiomata large, distinctly protrudent. 载孢体较小, 埋生conidiomata small, immerse. 载孢体埋生 conidiomata immerse. 载孢体多突出 conidiomata mostly protrudent,
载孢体较小, 多埋生 conidiomata small, mostly immerse. 载孢体埋生 conidiomata immerse.
载孢体较大, 明显突出 conidiomata large, distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生 conidiomata small, mostly immerse. 载孢体埋生 conidiomata immerse.
载孢体较大, 明显突出conidiomata large, distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生conidiomata small, mostly immerse. 载孢体埋生 conidiomata immerse.
载孢体较大, 明显突出 conidiomata large, distinctly protrudent. 载孢体较小, 多埋生 conidiomata small, mostly immerse.
1 12 0 24
2 12 0 24
3 12 0 24
4 12 0 24
5 12 0 24
6 12 0 24
7 12 0 24
8 12 0
“－”、“+”、“++”、“+++” 和“++++”所表示的意义同表2. “－”、“+”、“++”、“+++” and “++++” symbolized the same meaning as Table 2.
2.4.2 合成培养基：与Czapek 培养基相比，添加了维生素和染料对拟茎点霉产生载孢体有一定促进作用，但菌株间有较大的差异，其中生物素、VB 1、V C 、刚果红对大多数菌株产孢的促进作用比较明显（图1），其对形成乙型分生孢子是否也有促进作用，值得进一步研究。
2.4.3 植物组织培养基：4种植物材料中以苜蓿杆+WA上形成载孢体数量最多，所需时间最短，一般在5 d左右开始形成小黑点，7~8 d后有的载孢体开始分泌孢子角。而在小麦秆、大豆杆和水稻杆上，产生载孢体和孢子所需时间至少需12 d，孢子数量也少（图2）。
2.4.4 混合培养基：与其他混合培养基相比较，苜蓿煎汁+Czapek培养基上产生载孢体的数量并无明显优势，但载孢体的显微观察可见：苜蓿煎汁+Czapek培养基上形成的分生孢子类型与苜蓿杆+OMA、苜蓿杆+Czapek培养基有所不同，对拟茎点霉的种类鉴定具有重要意义（另文讨论），为
2期 罗利娟等：纯培养拟茎点霉属真菌的产孢条件 223
拟茎点霉产孢的最佳培养基（表6）。
表5 几种常用培养基上拟茎点霉属真菌载孢体形成数量（个/皿）（14 d，25℃）
Table 5 The number of conidiomata of Phomopsis on several common culture media (14d, 25℃)
Isolate 1 2 3 4 5 6 7 8
PDA － 46 12 16 8 5 － 7
P D Y A － 9 11 8 35 3 － 8
OMA 138 145 165 98 148 167 182 176
CMA 145 130 134 147 86 147 177 156
V 8 12 67 25 11 77 34 35 44
－： 表示不产生载孢体 （No conidiomata formed）
表6 混合培养基上拟茎点霉属真菌载孢体形成数量（个/皿）（14d ，25℃）
Table 6 The number of conidiomata of Phomopsis on mixed culture media (14d, 25℃)
菌株 isolate 1 2 3 4 5 6 7 8
苜蓿煎汁+Czapek alfalfa extract+Czapek 167 154 197 145 123 154 189 170
苜蓿杆+Czapek alfalfa stem+ Czapek 118 126 156 89 32 127 104 86
苜蓿煎汁+OMA alfalfa extract+OMA 152 178 190 132 143 164 199 157
苜蓿杆+OMA alfalfa stem+ OMA 119 85 58 106 54 87 96 90
3 讨论
拟茎点霉纯培养产孢条件以22~25℃、每天12h 光照/d、pH 值5.6~6.8为佳。Kuropatwa （1995）在研究pH 值对Phomopsis viticola Sacc.产孢的影响时指出，Czapek 培养基的pH 值在3.18~7.19范围内该菌形成的甲型孢子数量比乙型孢子多，而在7.73~9.2之间则乙型孢子数量多；本研究的8种拟茎点霉未出现这一情况，当pH 值为8时供试的8种拟茎点霉均不形成载孢体，一种真菌产生子实体的合适pH 值能有如此大的变化范围也许只是个别现象。Coelho （1997）在对Phomopsis 和Phoma 在不同温度和光照时间条件下的产孢研究中指出，21~25℃下连续日光灯照射能够诱导产生孢子。本研究结果表明22~25℃的确有利于孢子的产生，但每天光照时间过长（16h 或以上）菌丝生长将会过于旺盛，载孢体被掩没在菌丝中，个体小且成熟慢。
224 菌 物 学 报 23卷
图1 不同维生素及染料对拟茎点霉载孢体形成的影响 （14d ，25℃）
Fig.1 Effect of different vitamin and dyestuff on conidioma formation of Phomopsis (14 d, 25℃ )
图2 不同植物材料上拟茎点霉的载孢体形成情况 （14d ，25℃）
Fig.2 Conidioma formation of Phomopsis on different plant material (14d, 25℃)
培养基是影响拟茎点霉产生载孢体很重要的因素。Gindrat & Moody（1973）和 Ushiyama（1995）的研究认为在水琼脂上加植物材料，如菜豆荚、植物叶片等可以诱导拟茎点霉产生载孢体；该观点为本研究结果所支持，本研究所采用的苜蓿杆、大豆杆等4种植物材料均能诱导产孢，尤以苜蓿杆为佳，不失为一种诱导拟茎点霉属产孢的良好材料，但其产生的孢子类型单一（多是甲型孢子），故对拟茎点霉种的鉴定意义不大。就OMA 而言，虽被认为是拟茎点霉属真菌产生孢子的最佳培养基（Sutton, 1980； Coelho, 1997）； 但从本研究14种培养基上8种拟茎点霉菌株载孢体产生的情况来看，苜蓿煎汁+Czapek培养基最有利于载孢体的产生。一般说来，拟茎点霉在PDA 上便可产生载孢体，但形成载孢体的数量比较少，所需的时间也较长；苜蓿煎汁+Czapek和OMA 培养基上产生载孢体和孢子数目相差不大，但形成的分生孢子类型有所不同，前者能诱导更多的菌株产生两种类型的孢子而有利于拟茎点霉的种类鉴定（将另文讨论）。可见，在纯培养下研究拟茎点霉的分生孢子类型及种鉴定，可采用苜蓿煎汁+Czapek培养基；若只是为获得载孢体和甲型分生孢子，则可采用OMA 或苜蓿杆+WA培养基。
2期 罗利娟等：纯培养拟茎点霉属真菌的产孢条件
[REFERENCES]
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Brayford D, 1990. Variation in Phomopsis isolates from Ulmus species in the British Isles and Italy. Mycol Res, 94: 691-697
Coelho R M S, 1997. Sporulation of Phomopsis and Phoma on different culture media, temperature and luminosity conditions. Summa
Phytopathologica , 23: 176-180
Fang ZD, 1998. Methods in plant disease research. 3ed. Beijing: China Agricultural Press. 1-427 (in Chinese)
Gambhir S P, Patil N N, 1983. Influence of vitamins on growth and sporulation of Pestalotiopsis species. India J Mycol Pl Pathol , 13: 113-114 Gindrat D, Moody A R, 1973. Rapid induction of sporulation of Phomopsis sclerotioides van Kesteren in pure culture. Ann Phytopathol ,
5 (2): 219-222
He X, 1987. Studies on the biological characteristics of Phomopsis vexans. Master dissertation in phytopathology. Shenyang Agricultural
University (in Chinese)
Kuropatwa E, 1995. The effect of pH of the culture media on the growth and sporulation of Phomopsis viticola Sacc. (Sphaeropsidales,
Deuteromycotina ). Materialy z sympozjum, Olsztyn, Biotyczne srodowisko uprawne a zagrozenie chorobowe roslin”Olsztyn, 7-9 wrzesnia 1993.
Morin L, 1990. Production of conidia by Phomopsis convolvulus. Can J Microb, 36: 86-91
Suryanarayanan T S, Muruganandam V, 1986. Effect of Congo red on hyphal morphogenesis and sporulation of Botryodiplodia theobromae.
Can J Bot , 65: 815-816
Sutton B C, 1980. The coelomycetes. Kew, Surrey : CMI, 1-696
Ushiyama K, 1995. Mass production of conidiophores of Phomopsis spp., Colletotrichum and Pestalotiopsis spp. by agar leaf disk method.
Proceeding of the Kanto-Tosan Plant Protection Society. No.42, 101-103
Zhu ZY, Huang XM, Lu YH, 1985. An efficient technique for inducing profuse sporulation of Alternaria solani in pure culture. Acta Mycol
Sinica , 4: 180-184 (in Chinese)
［附中文参考文献］
方中达, 1998. 植病研究方法. 第三版, 北京：中国农业出版社
何欣, 1987. 茄子褐纹病菌（Phomopsis vexans）的生物学特性研究. 沈阳农业大学硕士学位论文 朱宗源, 黄晓敏, 吕云华, 1985. 诱导茄链格孢菌分生孢子形成的新技术. 真菌学报, 4: 180-184
SPORULATION CONDITIONS OF PHOMOPSIS IN PURE CULTURE
LUO Li-Juan1, 2 XI Ping-Gen1 JIANG Zi-De1 QI Pei-Kun1
（1Department of Plant Pathology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642. 2Zhongshan Entry - Exit Inspection
and Quarantine Bureau, Zhongshan 528400）
ABSTRACT: The sporulation conditions of 8 species of Phomopsis in pure culture were compared. The optimum media for Phomopsis sporulation was alfalfa extract+Czapek medium, and were OMA and alfalfa stem+WA media. The optimum range of temperature was 22℃-25℃. The optimum illumination time was 12 hours each day (fluorescent light, 40W; interval: 30cm ). The befitting pH value was 5.6-6.8.
KEY WORDS: Culture conditions, optimum media, optimum temperature, optimum illumination, befitting pH value