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基因打靶技术在构建基因敲除或敲入细胞系中的应用
时文涛，邵荣光
（中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京100050）
摘要：同源重组介导的基因打靶技术是一项判定哺乳动物基因功能的强有力工具。在过去的十几年中，应用于转基因小鼠的基因敲除∕敲入技术经过必要的完善后进一步被应用于人源细胞。本文介绍了在人源细胞系中基因打靶技术应用的优势与局限性、可应用细胞系的选择、基因打靶的基本方法，并比较系统地讲解了重组腺相关病毒介导的基因打靶的实验设计，以使读者对这项技术的应用有一个基本的了解。
关键词：基因打靶；基因敲除∕敲入；重组腺相关病毒
ngGeneTheApplicationofGeneTargetingTechnologyinConstructionstructing
KnockoutandKnockinCellLines
Wen-taoShi，Rong-guangShao
（InstituteofMedicinalBiotechnology,ChineseAcademyofMedicalSciences&
PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China）
Abstract：Homologousrecombination-mediatedgenetargetingtechnologyisthemostpowerfultechniqueavailableforanalysisofmammaliangenefunction.Overthepastdecadeyears,themethodsusedtogenerateknockoutandknockinmicehavebeenmodifiedforuseinculturedhumancells.Inthispaper,theadvantagesandlimitationsofgenetargetingtechnology,suitablecelllinesforgenetargetingandthebasicmethodforgeneratingknockout/knockincelllinesareintroduced.Moreover,wealsosystematicallydescribetheexperimentaldesignofrAAV-mediatedgenetargetingtoenablereaderstobasicallyunderstandtheapplicationofthistechnology.Keywords：Genetargeting；Knockout；Knockin；rAAV
基金项目：教育部博士点基金（No:[1**********]）
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同源重组介导的基因敲除（knockout）∕敲入（knockin）技术是一项判定基因功能的强有力工具，这种基因打靶技术已经帮助人们在一定程度上认识了某些细胞或动物个体异常表型的遗传基础。应用这种技术产生的模式生物（例如基因敲除小鼠）对人类基因进行研究已经广泛开展[1]，早在1999年就有超过800个小鼠种系被报道[2]。比较基因敲除小鼠而言，对人类体细胞基因敲除或基因敲入细胞系构建的报道相对较少，但这项技术对于在细胞水平上分析某些人源基因参与的生化或生理途径是不可替代的。基因打靶技术最常见的应用是通过连续使所有等位基因失活，建立基因敲除细胞系。另外，这种技术还可以用于将外源序列引入内源基因，建立基因敲入等位基因，小到引入单碱基替换，大到引入报告基因[3]。本文主要介绍了基因打靶技术的基本原理以及最近发展起来的腺相关病毒介导的基因打靶技术的基本应用。
1基因打靶技术应用的优势与局限性
迄今为止，在所有使细胞系中特定基因失活的技术中，应用最多的是引起基因表达下调的RNA干扰（RNAi）技术。与同源重组介导的基因打靶技术相比，RNAi技术应用起来更方便、快捷，成本较低，且适合于高通量筛选[4]。但是，RNAi结果在不同的实验室及不同的实验之间会有一定差别，而且RNAi只能用于下调而不能彻底消除基因的表达，故其不能用于不同遗传变异体之间的比较，无法彻底取代基因敲除∕敲入技术。其他的一些基因操作技术，例如过表达显性失活突变，也取得了相当的成功，但其明显不能精确地重演自然发生的遗传改变。由此可见，基因敲除∕敲入技术有其独特性，可以用于帮助解决许多用其他实验方法无法解决的问题。
像所有实验系统一样，针对人体细胞的基因敲除∕敲入技术既有其独特的贡献，也有明显的局限性，最主要的局限性是这项技术大多应用于培养的人肿瘤细胞。在肿瘤细胞形成时会产生很多获得性或选择性遗传改变，从而使肿瘤细胞与正常细胞有很明显的差别[5,6]，所以当我们应用一种遗传背景不完全清楚的细胞系时，就应该非常小心。另外，这种遗传不稳定性在细胞培养过程中还可能产生获得额外的、无法预期突变的亚克隆，在理论上会混淆对表型的分析[7]。在实际操作中，细胞基因组中自发的改变会随机发生，但是其发生的频率较低，在可接
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受的范围内。例如，错配修复缺陷细胞发生突变的频率比正常细胞高三个数量级，但突变主要发生在重复序列元件中，每代每个碱基的突变频率大约为10-8。经过认真的设计和适当的对照实验，可以将遗传不稳定性造成的干扰降到最小。例如，通过比较亲代细胞、独立的靶向基因敲除∕敲入细胞以及非靶向细胞，我们对目的基因功能分析的结果就会具有较高的可信度。
2基因打靶细胞系的选择与基因打靶的基本方法
用于基因打靶细胞系的选择是很重要的。由于产生纯合的基因敲除∕敲入等位基因需要反复打靶，所以选择二倍体或近二倍体细胞对实验最为便捷，大多数具有稳定染色体组的二倍体肿瘤细胞系是具有错配修复缺陷的[7]。迄今为止，在基因打靶中应用最广泛的是错配修复缺陷的结肠癌细胞系HCT116和DLD1。当然还有一些细胞系也曾被用于基因打靶，包括其他肿瘤细胞系以及正常组织细胞系，但也有很多未经验证的细胞系很可能不适合基因打靶，所以我们应该尽量选择经过验证的细胞系。
人们设计了多种方法用于基因的改造，其成功率和效率差别很大，而最直接的方法就是利用构建好的含外源基因的载体转入细胞与内源基因进行同源重组。用于体细胞打靶的方法与构建基因敲除小鼠的方法相似，在两种方法中，都包括四个基本的步骤：（1）设计并构建打靶载体，载体中包括两段同源区及在两段同源区之间的筛选标记，（2）将打靶载体高效转入目的细胞，（3）在一定的筛选条件下，使稳定整合筛选标记的克隆扩增，（4）鉴定并大量扩增发生同源重组而非随机重组的细胞克隆。除了上述基本的步骤外，对人源细胞的打靶又有独特的要求，需要对用于小鼠的标准方法进行修改。首先，外源DNA整合进人类细胞基因组的效率比整合进小鼠基因组的效率低，这就使大量转基因克隆的产生变得相对困难。其次，人类基因组大小约为小鼠基因组的三倍，有证据显示培养的人源细胞中同源重组效率较低[8]。最后，人源细胞与小鼠细胞相同，一般为二倍体，在小鼠中杂合子可以通过回交（backcrossing）变为纯合子，这在人源细胞中显然不能实现，所以多个等位基因需要逐个敲除∕敲入才能获得纯合克隆。在以上四个步骤中，打靶载体的构建是后续实验的基础，决定了同源重组的位点及重组效率，所以打靶载体的选择与构建就显得尤为关键。
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3重组腺相关病毒介导的基因打靶
在基因打靶技术应用的早期，一般以质粒为骨架构建打靶载体，再通过电转化的方法将载体转入目的细胞系。例如，Brown等[9]成功在人正常二倍体成纤维细胞中敲除p21基因，揭示了p21与细胞衰老间的关系。Chan等[10]在HCT116细胞系中成功敲除14-3-3σ基因，证明这个基因在DNA发生损伤后参与维持G2期检验点并阻止细胞死亡。Ku86在哺乳动物中的非同源末端连接中起非常关键的作用，敲除Ku86产生的杂合子HCT116细胞，其增殖速度减慢，p53表达水平增高，而敲除的纯合子细胞在经过几次分裂后就发生凋亡[11]。以上实验取得了很大的成功，但是在上述实验中，载体转入细胞及整合进特异位点的效率较低，增加了实验的成本和操作的复杂性。重组腺相关病毒（rAAV）载体的出现在一定程度上克服了上述缺点。Russell等[12]发现rAAV载体中的外源DNA序列整合进染色体同源位点的效率较高，有证据证明其效率比质粒载体高25倍[13]。由于细胞表面的腺相关病毒受体广泛分布于各种人体组织中，所以包装好的rAAV病毒颗粒可以高效转染各种人源细胞。
另外一个对基因打靶技术的改进是启动子捕获载体（promotertrapvector）的应用。典型的例子是应用于小鼠胚胎干细胞的打靶载体，包含一个由强启动子驱动的筛选标记基因，这种筛选元件在染色体上发生随机重组时也会稳定表达筛选标记，产生非目的打靶克隆，增加了筛选的工作量。Sedivy等[8]发现，当筛选标记基因的表达依赖于内源目的基因的启动子，就可以使所有转基因克隆中产生同源重组克隆的比例大大增加，这项技术就叫做启动子捕获技术。Bunz等[13]设计了一个通用的筛选元件，从元件的上游到下游包含剪接受体（Spliceacceptor,SA）、IRES序列（internalribosomalentrysequence），筛选标记基因以及多聚腺苷酸尾，将这个元件命名为SEPT（syntheticexonpromotertrap），用于构建启动子捕获载体。在SEPT的两侧，还包括loxP位点，从而可以通过Cre重组酶将筛选基因切除（见图1a）。需要说明的是，这项技术需要一个有活性的内源启动子，所以被打靶的基因必须是在正常生长条件下持续表达的基因[14]。
rAAV打靶载体和启动子捕获技术的应用在很大程度上提高了产生同源重组细胞克隆的效率，优化了转基因克隆产生的条件，缩小了克隆筛选的范围，使阳性克隆的产生率达到1%以上[3]。应用上述改进的基因打靶方法，研究人员在细
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胞水平上对肿瘤的凋亡、生长、转移等许多方面有了进一步的认识，有很多的基因敲除∕敲入细胞系还被用于新药研发及对药物靶点的验证[3]
。
图1：同源重组介导的基因敲除/敲入。(a)基因打靶载体中的功能元件，主要是两条同源臂及中间的筛选标记；SEPT通用筛选元件，包括一个剪接位点、一个IRES序列、新霉素转移酶编码序列（neo）以及一个多聚腺苷酸尾；这个筛选元件两端还含有Cre重组酶的识别位点（即loxP位点）。(b)同源臂的位置决定打靶载体的功能。在knockout打靶载体中，同源臂的位置选在目的外显子的两侧，这样通过同源重组使目的外显子被敲除；但要产生knockin等位基因，选取的同源臂应跨越目的外显子，同源重组后，由经过修饰的同源臂代替野生型同源区。
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4体细胞基因打靶的实验设计
基因打靶的第一步是设计打靶载体，打靶载体由两个重要的部分组成：一部分是同源臂（homologyarm,HA），另一部分是位于两个同源臂之间的筛选标记元件。同源臂决定了被打靶的区域，也就是将插入筛选标记元件的区域（图1a,图2）。Knockout细胞被打靶的区域一般选择5′末端的多个外显子，但如果目的基因具有较明确的结构域，也可以选择敲除其保守区或催化区；在构建knockin
载体时要选择内含子作为敲除区域，从而不对目的基因结构产生影响。
图2：rAAV打靶载体的装配。(a)SEPT元件及其两侧的酶切位点；(b)打靶载体由4部分连接而成：两段同源臂（HA1和HA2），SEPT/lxoP元件以及pAAV穿梭载体（其中包括AAV的反向末端重复ITRs）。SEPT元件通过选定的RE1和RE2内切酶与两段同源臂连接。
同源臂可以从基因组DNA文库中扩增，但更简便的方法是以被打靶细胞系基因组DNA为模板直接扩增（图3）。虽然现在不清楚rAAV介导基因打靶可以敲除的最大长度，但敲除1kb左右的片段应该足以使绝大多数基因失活，而且有证据显示敲除片段长度越小，敲除效率越高[3]。同源臂的位置选择决定被敲除或被改变的区域，所以同源臂的选择非常重要。
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图3：同源臂的合成。第一步是同源区的扩增，应用引物1和引物2扩增同源模板；第二步是同源臂的扩增，将设计好的酶切位点引入引物3-6，扩增两段同源臂，进一步酶切后即可以用于构建打靶载体。
构建knockin打靶载体时，还有另外一些需要注意的问题。一些较小的遗传改变被加到同源臂中（图1b），这是通过对同源臂的定点诱变产生[15]。在整合过程中由于加入的遗传改变可能与选择标记基因分离，所以同源臂中引入的遗传改变与筛选标记基因之间的距离越近越好。一些较大的遗传改变，例如报告基因，应该直接将其插入选择性标记旁边（即loxP位点的外面）。
rAAV的包装能力限制了打靶载体的长度，外源DNA长度为4.1~4.9kb时其包装效率最高。用于筛选的SEPT元件长约2kb，所以用于两侧同源臂的长度只有2.6kb左右。同源臂的长度越长，同源重组的效率越高，所以在应用时每个同源臂的长度应该在0.9~1.3kb之间[16]。用于转染目的细胞的病毒颗粒，不需要很高的纯度和滴度，原始的病毒溶胞产物直接用于转染目的细胞就可以产生很多转基因克隆，足以用于进一步的筛选[16]。
要筛选发生同源重组而非随机重组的阳性克隆，需要提取基因组DNA，通过PCR及Southernblot进行验证。最简单的PCR检测方法是将一对引物中的一个设计在筛选标记中，另一个设计在同源臂的外面（图4a），这对引物可以跨越某一个同源臂，由此我们可以预先知道产物的长度。但这种设计的缺点是没有阳性对照，改进的方法是在用于扩增某个同源臂引物的5′端加上额外的20bp，这
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20bp来自被敲除位点内；引物E可与这20bp内源序列结合，引物B与同源臂外序列结合，这样无论野生型克隆还是发生同源重组的克隆都可得到扩增产物，但重组克隆的扩增产物要比野生型的短；在构建打靶载体之前，最好先以野生型基因组DNA为模板，测试引物E和引物B的扩增效果（图4b）[10,17]。以野生型等位基因为模板扩增得到的PCR产物与被打靶等位基因产生的产物长度不同，可以作为阳性对照。Southernblot作为另一种筛选方法，其操作复杂程度高于PCR，但其结果更具说服力。Southernblot所需的探针应根据基因组上及筛选标记基因中的酶切位点的位置来设计，具体基因具体分析[18]。
在得到正确打靶的细胞克隆后，应用Cre重组酶将筛选标记基因切除。Cre可以通过哺乳动物质粒表达载体或逆转录病毒表达载体转入细胞表达，成功切除标记基因的克隆由PCR（及Southernblot）鉴定：用引物F与引物B扩增，野生型等位基因与被Cre切除SEPT的等位基因都会产生扩增产物，后者的产物比前者短，二者相差的长度就是被敲除的长度。SEPT元件没有被切除的等位基因扩增产物比被切除的等位基因扩增产物长约2kb（即SEPT元件的长度，但这种扩增产物的信号一般很弱，在胶图上很难看到）（图4c）。应用逆转录病毒载体，约有三分之一的细胞克隆中位于两个loxP位点间的标记基因会被成功切除[3]。
成功的第一轮基因打靶的结果会产生含有杂合性遗传改变的细胞系，由于筛选标记基因被切除，这个细胞系会对前面应用的筛选药物非常敏感。对于二倍体，我们为了得到含有纯合遗传改变的细胞，还需要第二轮的rAAV转染、细胞克隆药物筛选、PCR验证及Cre重组的过程。需要说明的是，第二轮打靶的同源重组可能发生在第一轮成功打靶的那个等位基因上，所以第二轮打靶的效率约为第一轮打靶效率的一半。
5结语
综上所述，构建基因敲除∕敲入细胞系的基因打靶技术在对基因功能的研究中是一项不可替代的技术。rAAV载体和启动子捕获技术的应用使基因打靶技术操作复杂、同源重组率低等缺点在一定程度上得到了改善。随着这项技术的不断成熟，其在基因型与表型关系的研究中一定会得到更广泛的应用。
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图4：同源重组克隆的筛选。(a)最简单且应用最广泛的方法就是使一个引物（引物A）与SEPT元件结合，另一个引物（引物B）与同源区外的序列结合。这样只有发生同源重组的克隆能扩增出条带，而野生型克隆则检测不到扩增产物；也可以用引物C和引物D以上游同源臂为模板进行PCR。(b)这个设计对上面的方法进行了改进，在扩增同源臂的引物上引入了20bp的序列（黄色片段）。(c)可以用PCR来鉴定Cre重组酶能否成功切除SEPT元件。
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参考文献
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基因打靶技术在构建基因敲除或敲入细胞系中的应用
时文涛，邵荣光
（中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京100050）
摘要：同源重组介导的基因打靶技术是一项判定哺乳动物基因功能的强有力工具。在过去的十几年中，应用于转基因小鼠的基因敲除∕敲入技术经过必要的完善后进一步被应用于人源细胞。本文介绍了在人源细胞系中基因打靶技术应用的优势与局限性、可应用细胞系的选择、基因打靶的基本方法，并比较系统地讲解了重组腺相关病毒介导的基因打靶的实验设计，以使读者对这项技术的应用有一个基本的了解。
关键词：基因打靶；基因敲除∕敲入；重组腺相关病毒
ngGeneTheApplicationofGeneTargetingTechnologyinConstructionstructing
KnockoutandKnockinCellLines
Wen-taoShi，Rong-guangShao
（InstituteofMedicinalBiotechnology,ChineseAcademyofMedicalSciences&
PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China）
Abstract：Homologousrecombination-mediatedgenetargetingtechnologyisthemostpowerfultechniqueavailableforanalysisofmammaliangenefunction.Overthepastdecadeyears,themethodsusedtogenerateknockoutandknockinmicehavebeenmodifiedforuseinculturedhumancells.Inthispaper,theadvantagesandlimitationsofgenetargetingtechnology,suitablecelllinesforgenetargetingandthebasicmethodforgeneratingknockout/knockincelllinesareintroduced.Moreover,wealsosystematicallydescribetheexperimentaldesignofrAAV-mediatedgenetargetingtoenablereaderstobasicallyunderstandtheapplicationofthistechnology.Keywords：Genetargeting；Knockout；Knockin；rAAV
基金项目：教育部博士点基金（No:[1**********]）
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同源重组介导的基因敲除（knockout）∕敲入（knockin）技术是一项判定基因功能的强有力工具，这种基因打靶技术已经帮助人们在一定程度上认识了某些细胞或动物个体异常表型的遗传基础。应用这种技术产生的模式生物（例如基因敲除小鼠）对人类基因进行研究已经广泛开展[1]，早在1999年就有超过800个小鼠种系被报道[2]。比较基因敲除小鼠而言，对人类体细胞基因敲除或基因敲入细胞系构建的报道相对较少，但这项技术对于在细胞水平上分析某些人源基因参与的生化或生理途径是不可替代的。基因打靶技术最常见的应用是通过连续使所有等位基因失活，建立基因敲除细胞系。另外，这种技术还可以用于将外源序列引入内源基因，建立基因敲入等位基因，小到引入单碱基替换，大到引入报告基因[3]。本文主要介绍了基因打靶技术的基本原理以及最近发展起来的腺相关病毒介导的基因打靶技术的基本应用。
1基因打靶技术应用的优势与局限性
迄今为止，在所有使细胞系中特定基因失活的技术中，应用最多的是引起基因表达下调的RNA干扰（RNAi）技术。与同源重组介导的基因打靶技术相比，RNAi技术应用起来更方便、快捷，成本较低，且适合于高通量筛选[4]。但是，RNAi结果在不同的实验室及不同的实验之间会有一定差别，而且RNAi只能用于下调而不能彻底消除基因的表达，故其不能用于不同遗传变异体之间的比较，无法彻底取代基因敲除∕敲入技术。其他的一些基因操作技术，例如过表达显性失活突变，也取得了相当的成功，但其明显不能精确地重演自然发生的遗传改变。由此可见，基因敲除∕敲入技术有其独特性，可以用于帮助解决许多用其他实验方法无法解决的问题。
像所有实验系统一样，针对人体细胞的基因敲除∕敲入技术既有其独特的贡献，也有明显的局限性，最主要的局限性是这项技术大多应用于培养的人肿瘤细胞。在肿瘤细胞形成时会产生很多获得性或选择性遗传改变，从而使肿瘤细胞与正常细胞有很明显的差别[5,6]，所以当我们应用一种遗传背景不完全清楚的细胞系时，就应该非常小心。另外，这种遗传不稳定性在细胞培养过程中还可能产生获得额外的、无法预期突变的亚克隆，在理论上会混淆对表型的分析[7]。在实际操作中，细胞基因组中自发的改变会随机发生，但是其发生的频率较低，在可接
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受的范围内。例如，错配修复缺陷细胞发生突变的频率比正常细胞高三个数量级，但突变主要发生在重复序列元件中，每代每个碱基的突变频率大约为10-8。经过认真的设计和适当的对照实验，可以将遗传不稳定性造成的干扰降到最小。例如，通过比较亲代细胞、独立的靶向基因敲除∕敲入细胞以及非靶向细胞，我们对目的基因功能分析的结果就会具有较高的可信度。
2基因打靶细胞系的选择与基因打靶的基本方法
用于基因打靶细胞系的选择是很重要的。由于产生纯合的基因敲除∕敲入等位基因需要反复打靶，所以选择二倍体或近二倍体细胞对实验最为便捷，大多数具有稳定染色体组的二倍体肿瘤细胞系是具有错配修复缺陷的[7]。迄今为止，在基因打靶中应用最广泛的是错配修复缺陷的结肠癌细胞系HCT116和DLD1。当然还有一些细胞系也曾被用于基因打靶，包括其他肿瘤细胞系以及正常组织细胞系，但也有很多未经验证的细胞系很可能不适合基因打靶，所以我们应该尽量选择经过验证的细胞系。
人们设计了多种方法用于基因的改造，其成功率和效率差别很大，而最直接的方法就是利用构建好的含外源基因的载体转入细胞与内源基因进行同源重组。用于体细胞打靶的方法与构建基因敲除小鼠的方法相似，在两种方法中，都包括四个基本的步骤：（1）设计并构建打靶载体，载体中包括两段同源区及在两段同源区之间的筛选标记，（2）将打靶载体高效转入目的细胞，（3）在一定的筛选条件下，使稳定整合筛选标记的克隆扩增，（4）鉴定并大量扩增发生同源重组而非随机重组的细胞克隆。除了上述基本的步骤外，对人源细胞的打靶又有独特的要求，需要对用于小鼠的标准方法进行修改。首先，外源DNA整合进人类细胞基因组的效率比整合进小鼠基因组的效率低，这就使大量转基因克隆的产生变得相对困难。其次，人类基因组大小约为小鼠基因组的三倍，有证据显示培养的人源细胞中同源重组效率较低[8]。最后，人源细胞与小鼠细胞相同，一般为二倍体，在小鼠中杂合子可以通过回交（backcrossing）变为纯合子，这在人源细胞中显然不能实现，所以多个等位基因需要逐个敲除∕敲入才能获得纯合克隆。在以上四个步骤中，打靶载体的构建是后续实验的基础，决定了同源重组的位点及重组效率，所以打靶载体的选择与构建就显得尤为关键。
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3重组腺相关病毒介导的基因打靶
在基因打靶技术应用的早期，一般以质粒为骨架构建打靶载体，再通过电转化的方法将载体转入目的细胞系。例如，Brown等[9]成功在人正常二倍体成纤维细胞中敲除p21基因，揭示了p21与细胞衰老间的关系。Chan等[10]在HCT116细胞系中成功敲除14-3-3σ基因，证明这个基因在DNA发生损伤后参与维持G2期检验点并阻止细胞死亡。Ku86在哺乳动物中的非同源末端连接中起非常关键的作用，敲除Ku86产生的杂合子HCT116细胞，其增殖速度减慢，p53表达水平增高，而敲除的纯合子细胞在经过几次分裂后就发生凋亡[11]。以上实验取得了很大的成功，但是在上述实验中，载体转入细胞及整合进特异位点的效率较低，增加了实验的成本和操作的复杂性。重组腺相关病毒（rAAV）载体的出现在一定程度上克服了上述缺点。Russell等[12]发现rAAV载体中的外源DNA序列整合进染色体同源位点的效率较高，有证据证明其效率比质粒载体高25倍[13]。由于细胞表面的腺相关病毒受体广泛分布于各种人体组织中，所以包装好的rAAV病毒颗粒可以高效转染各种人源细胞。
另外一个对基因打靶技术的改进是启动子捕获载体（promotertrapvector）的应用。典型的例子是应用于小鼠胚胎干细胞的打靶载体，包含一个由强启动子驱动的筛选标记基因，这种筛选元件在染色体上发生随机重组时也会稳定表达筛选标记，产生非目的打靶克隆，增加了筛选的工作量。Sedivy等[8]发现，当筛选标记基因的表达依赖于内源目的基因的启动子，就可以使所有转基因克隆中产生同源重组克隆的比例大大增加，这项技术就叫做启动子捕获技术。Bunz等[13]设计了一个通用的筛选元件，从元件的上游到下游包含剪接受体（Spliceacceptor,SA）、IRES序列（internalribosomalentrysequence），筛选标记基因以及多聚腺苷酸尾，将这个元件命名为SEPT（syntheticexonpromotertrap），用于构建启动子捕获载体。在SEPT的两侧，还包括loxP位点，从而可以通过Cre重组酶将筛选基因切除（见图1a）。需要说明的是，这项技术需要一个有活性的内源启动子，所以被打靶的基因必须是在正常生长条件下持续表达的基因[14]。
rAAV打靶载体和启动子捕获技术的应用在很大程度上提高了产生同源重组细胞克隆的效率，优化了转基因克隆产生的条件，缩小了克隆筛选的范围，使阳性克隆的产生率达到1%以上[3]。应用上述改进的基因打靶方法，研究人员在细
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胞水平上对肿瘤的凋亡、生长、转移等许多方面有了进一步的认识，有很多的基因敲除∕敲入细胞系还被用于新药研发及对药物靶点的验证[3]
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图1：同源重组介导的基因敲除/敲入。(a)基因打靶载体中的功能元件，主要是两条同源臂及中间的筛选标记；SEPT通用筛选元件，包括一个剪接位点、一个IRES序列、新霉素转移酶编码序列（neo）以及一个多聚腺苷酸尾；这个筛选元件两端还含有Cre重组酶的识别位点（即loxP位点）。(b)同源臂的位置决定打靶载体的功能。在knockout打靶载体中，同源臂的位置选在目的外显子的两侧，这样通过同源重组使目的外显子被敲除；但要产生knockin等位基因，选取的同源臂应跨越目的外显子，同源重组后，由经过修饰的同源臂代替野生型同源区。
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4体细胞基因打靶的实验设计
基因打靶的第一步是设计打靶载体，打靶载体由两个重要的部分组成：一部分是同源臂（homologyarm,HA），另一部分是位于两个同源臂之间的筛选标记元件。同源臂决定了被打靶的区域，也就是将插入筛选标记元件的区域（图1a,图2）。Knockout细胞被打靶的区域一般选择5′末端的多个外显子，但如果目的基因具有较明确的结构域，也可以选择敲除其保守区或催化区；在构建knockin
载体时要选择内含子作为敲除区域，从而不对目的基因结构产生影响。
图2：rAAV打靶载体的装配。(a)SEPT元件及其两侧的酶切位点；(b)打靶载体由4部分连接而成：两段同源臂（HA1和HA2），SEPT/lxoP元件以及pAAV穿梭载体（其中包括AAV的反向末端重复ITRs）。SEPT元件通过选定的RE1和RE2内切酶与两段同源臂连接。
同源臂可以从基因组DNA文库中扩增，但更简便的方法是以被打靶细胞系基因组DNA为模板直接扩增（图3）。虽然现在不清楚rAAV介导基因打靶可以敲除的最大长度，但敲除1kb左右的片段应该足以使绝大多数基因失活，而且有证据显示敲除片段长度越小，敲除效率越高[3]。同源臂的位置选择决定被敲除或被改变的区域，所以同源臂的选择非常重要。
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图3：同源臂的合成。第一步是同源区的扩增，应用引物1和引物2扩增同源模板；第二步是同源臂的扩增，将设计好的酶切位点引入引物3-6，扩增两段同源臂，进一步酶切后即可以用于构建打靶载体。
构建knockin打靶载体时，还有另外一些需要注意的问题。一些较小的遗传改变被加到同源臂中（图1b），这是通过对同源臂的定点诱变产生[15]。在整合过程中由于加入的遗传改变可能与选择标记基因分离，所以同源臂中引入的遗传改变与筛选标记基因之间的距离越近越好。一些较大的遗传改变，例如报告基因，应该直接将其插入选择性标记旁边（即loxP位点的外面）。
rAAV的包装能力限制了打靶载体的长度，外源DNA长度为4.1~4.9kb时其包装效率最高。用于筛选的SEPT元件长约2kb，所以用于两侧同源臂的长度只有2.6kb左右。同源臂的长度越长，同源重组的效率越高，所以在应用时每个同源臂的长度应该在0.9~1.3kb之间[16]。用于转染目的细胞的病毒颗粒，不需要很高的纯度和滴度，原始的病毒溶胞产物直接用于转染目的细胞就可以产生很多转基因克隆，足以用于进一步的筛选[16]。
要筛选发生同源重组而非随机重组的阳性克隆，需要提取基因组DNA，通过PCR及Southernblot进行验证。最简单的PCR检测方法是将一对引物中的一个设计在筛选标记中，另一个设计在同源臂的外面（图4a），这对引物可以跨越某一个同源臂，由此我们可以预先知道产物的长度。但这种设计的缺点是没有阳性对照，改进的方法是在用于扩增某个同源臂引物的5′端加上额外的20bp，这
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20bp来自被敲除位点内；引物E可与这20bp内源序列结合，引物B与同源臂外序列结合，这样无论野生型克隆还是发生同源重组的克隆都可得到扩增产物，但重组克隆的扩增产物要比野生型的短；在构建打靶载体之前，最好先以野生型基因组DNA为模板，测试引物E和引物B的扩增效果（图4b）[10,17]。以野生型等位基因为模板扩增得到的PCR产物与被打靶等位基因产生的产物长度不同，可以作为阳性对照。Southernblot作为另一种筛选方法，其操作复杂程度高于PCR，但其结果更具说服力。Southernblot所需的探针应根据基因组上及筛选标记基因中的酶切位点的位置来设计，具体基因具体分析[18]。
在得到正确打靶的细胞克隆后，应用Cre重组酶将筛选标记基因切除。Cre可以通过哺乳动物质粒表达载体或逆转录病毒表达载体转入细胞表达，成功切除标记基因的克隆由PCR（及Southernblot）鉴定：用引物F与引物B扩增，野生型等位基因与被Cre切除SEPT的等位基因都会产生扩增产物，后者的产物比前者短，二者相差的长度就是被敲除的长度。SEPT元件没有被切除的等位基因扩增产物比被切除的等位基因扩增产物长约2kb（即SEPT元件的长度，但这种扩增产物的信号一般很弱，在胶图上很难看到）（图4c）。应用逆转录病毒载体，约有三分之一的细胞克隆中位于两个loxP位点间的标记基因会被成功切除[3]。
成功的第一轮基因打靶的结果会产生含有杂合性遗传改变的细胞系，由于筛选标记基因被切除，这个细胞系会对前面应用的筛选药物非常敏感。对于二倍体，我们为了得到含有纯合遗传改变的细胞，还需要第二轮的rAAV转染、细胞克隆药物筛选、PCR验证及Cre重组的过程。需要说明的是，第二轮打靶的同源重组可能发生在第一轮成功打靶的那个等位基因上，所以第二轮打靶的效率约为第一轮打靶效率的一半。
5结语
综上所述，构建基因敲除∕敲入细胞系的基因打靶技术在对基因功能的研究中是一项不可替代的技术。rAAV载体和启动子捕获技术的应用使基因打靶技术操作复杂、同源重组率低等缺点在一定程度上得到了改善。随着这项技术的不断成熟，其在基因型与表型关系的研究中一定会得到更广泛的应用。
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图4：同源重组克隆的筛选。(a)最简单且应用最广泛的方法就是使一个引物（引物A）与SEPT元件结合，另一个引物（引物B）与同源区外的序列结合。这样只有发生同源重组的克隆能扩增出条带，而野生型克隆则检测不到扩增产物；也可以用引物C和引物D以上游同源臂为模板进行PCR。(b)这个设计对上面的方法进行了改进，在扩增同源臂的引物上引入了20bp的序列（黄色片段）。(c)可以用PCR来鉴定Cre重组酶能否成功切除SEPT元件。
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