粗壮女贞RAPD_PCR实验体系优化的研究

第25卷第2期

2007年6月

贵州科学

GU IZ HOU SC I ENCE

V o. l 25, N o . 2

Jun . 2007

粗壮女贞RAPD-PCR 实验体系优化的研究

鄢东海, 郑道君, 梁远发, 令狐昌弟, 刘国民, 田永辉

(1. 贵州省茶叶科学研究所, 贵州湄潭 564100; 2. 海南大学苦丁茶研究所, 海南海口 570228)

摘要以粗壮女贞嫩芽为材料, 对粗壮女贞RA PD 分析中一些重要影响因素, 包括模板DNA 浓度、d NT Ps 浓度、M g 2+浓度、T aq 酶用量、退火温度、延伸时间以及循环次数等因子进行了比较系统的摸索和优化. 建立了适合粗壮女贞RA P -PCRD 分析的优化反应体系:即25 l 反应体系中M g 2+浓度为2. 5mM, d NT Ps 浓度为200 M, T aq 酶用量为2. 0U, 引物浓度为10p mo , l 模板浓度为80ng . PCR 扩增程序为:94 预变性4m in , 然后按94 变性30s , 37 退火45s , 72 延伸120s , 进行40个循环, 最后于72 延伸10m i n . 以该优化的RA PD 条件进行重复实验, 其实验结果重现性良好.

关键词:苦丁茶; 粗壮女贞; RAPD ; 反应体系

中图分类号 S571. 1 文献标识码 A 文章编号 1003-6563(2007) 02-0056-09

S TUDY ON THE OPT I M IZAT I ON OF RAPD -PCR EXPER I MEN TAL S YSTEM I N LIGUSTRU M ROBUSTU M (ROXB) BL

Y AN D on g -hai 1, Z H E NG D ao -jun 2, LIANG Yuan -fa 1, LI N G H U Chang -di 1, LIU Guo -min 2, TIAN Yong -hui 1

(1. T he T ea R esearch Institute of G uizhou P rov i nce , Gu iz hou , M e itan 564100; 2. T he kudingcha R esea rch Instit ute o fH a i nan U niversity , H a i nan , H aikou 570228)

AB STRACT U si ng t he young buds as the test ma teria, l several i m po rtant factors in RA PD ana l y si s of L i gustru m ro bustu m (R oxb) B l w ere syste m aticall y st udied and opti m ized , wh ich i nc l ude the concen tra ti on of DNA te m plate , d N TPs , M g 2+and T aq po ly m erase , as we ll as the anneali ng temperate , t he e l ong ati on ti m e and the number o f ther m a l cyc le . An opti m al RAPD -PCR experi m ental syste m for L. robust u m was estab lished . The opti m a l exper i m enta l cond i ti ons we re set as the fo llo w s :i n 25 l reacti on syste m, buffer 2. 5 l 10 PCR, M g2+2. 5mM, d NT Ps 200 m, T aq po l y m e rase 2. 0U, rando m pr i m e rs 10p m ol and DNA te m plate 80ng . The a m plificati on prog ram o f the opti m ized PCR w as :A t fi rst pre-denaturing a t 94 45s ; extensi on at 72

for 4m i n , t hen 40cyc l es of denaturing a t 94

for 30s ; annea li ng at 37

f o r

f o r 120s ; at last extensi on a t 72

for 10m i n . T he a m plifi cation producti ons w ere stored at

4 . A h i gh reproduc i b ilit y w as obta i ned unde r t he opti m i zed exper i m enta l conditi ons . K EY WORDS kudi ngcha ; L i gustrum robustu m (R ox ) B. l ; RA PD; reacti on syste m

粗壮女贞〔L i g ustrum robust u m (Roxb) B. l 〕是我国! 苦丁茶∀的主要种类之一. 事实上! 苦丁茶∀

收稿日期:2006-09-11

是我国民间一大类代茶饮料的统称, 其原植物涉及12科13属, 至少有30余种(包括变种、变型)

〔1~3〕

基金项目:贵州省自然科学基金资助项目, 批准文号:黔科合J 字〔2005〕2033号.

作者简介:鄢东海(1968~) 男. 贵州遵义县人, 高级农艺师, 主要从事茶叶种质资源及育种研究, 已获省级科技进步奖2项, 省农业厅科研奖3项; 发表研究论文10余篇, 参编专著1部. 郑道君(1979~) 海南海口人, 在读硕士研究生, 主要从事苦丁茶种质资源研究. 通讯作者:刘国民, 教授.

2期鄢东海, 等:粗壮女贞RAPD -PCR 实验体系优化的研究按照栽培面积、产量以及在民间流行程度等情况, ! 苦丁茶∀的主要种类又大致可以分为2类, 一类是以苦丁茶冬青(Ilex kud ingcha C . J . Tseng ) 为代表的冬青科苦丁茶(不是本文所讨论的对象), 另一类则是以粗壮女贞代表的木犀科苦丁茶. 木犀科苦丁茶主要包括女贞属的粗壮女贞、丽叶女贞(又名兴山蜡树, L i g ustrum. henry i H e m s. l ) 、日本女贞(L. ja p onicu m Thunb . ) 、日本毛女贞(L. japonicum Thunb. var . pubescen s Ko idz) 、女贞(L. luci d u m A i. t ) 、序梗女贞(L. pricei H ayata ) 、粗壮女贞〔L. robust u m (Roxb) B. l 〕、光萼小蜡(L. sinense Lour . var . myri anthus (D ie ls) H ook . . f ) 和宜昌女贞(L. strongy lo phy ll u m H e m s. l ) 以及木犀属的牛矢果(Os m anthus m ats am uranus H ayata ). 近年还有报道, 李氏女贞(L. lianum H a m . ) 和川滇蜡树(L. delavayanm H ar l o t) 在贵州省务川、余庆等局部地区作为苦丁茶使用

〔4, 5〕

作, 此前基本上还是一片空白.

在植物分类学研究领域, 与木犀科苦丁茶相关的某些学术问题至今也还存在争议. 例如关于木犀科苦丁茶的主要种类紫茎女贞(L. pur purascens Y. C . Yang) 的分类地位问题, 《云南植物志》(第四卷) 将粗壮女贞与紫茎女贞作为两个不同的分种分别予以描述

〔6〕

, 而《中国植物志》(第六十一卷) 则将紫茎

〔7〕

女贞归并于粗壮女贞条目之下种与粗壮女贞分别加以介绍

; 众多学者在介绍.

木犀科苦丁茶时, 仍将紫茎女贞作为一个独立的物

〔4, 5; 8~11〕

近年来兴起的分子标记技术, 可以为木犀科苦丁茶的基础研究工作(包括物种鉴定、种间关系的确定、种质资源的遗传多样性检测, 遗传图谱的构建等方面) 以及种苗质量管理提供一种便捷而可靠的技术手段. 分子标记目前已发展出多种成熟的方

法, 其中RAPD 分析因其具有快速简便, 实验成本低廉以及准确性较高等优点而被许多学者作为优选的方法加以采用. 事实上, RAPD 分析在其他多种植物中已被广泛地应用于上述各个研究领域的焦点

〔12, 20, 21〕

〔12~21〕

. 我国木犀科苦丁茶不仅种类繁多, 而且其同

物异名(Ho m ony m ) 和异物同名(Synony m ) 现象非常

普遍. 由于各地所推崇的木犀科苦丁茶不尽相同, 上述现象已在种子、种苗或代茶产品的流通过程中造成诸多不便, 而且在文献引用、原植物认定、种植规划以及新产品研发等方面给人们带来不少麻烦, 有时甚至导致了法律纠纷.

与生产形势(主要是种植业与产品初加工) 快速发展的局面相比较, 木犀科苦丁茶的基础研究则明显滞后. 以粗壮女贞为例:粗壮女贞在云南(主要是滇东北地区), 贵州(主要是余庆、台江、石阡以及赫章等县) 以及四川(主要是宜宾地区, 特别是筠连县) 等省各有上千公顷种植面积. 然而, 这种作物至今为止在各省(区) 均还没有一个经过省级农作物品种审定机构审定的定型品种, 大田栽种所用的种苗, 大都是直接从野生植株上采集果实, 利用其中的种子繁育成实生苗, 进而在生产上推广种植; 或用这种实生苗经多次扦插繁育成扦插苗, 进而在生产上推广种植. 因此, 我国木犀科苦丁茶产区, 生产上所栽种的种苗实际上都是遗传背景相当杂乱的混合群体, 从而致使大田植株的性状五花八门, 苦丁茶产品的产量和品质无法做到稳定和一致. 可以说, 加速培育出高产优良性状一致的粗壮女贞(苦丁茶) 品种, 已成为木犀科苦丁茶育种工作者的当务之急. 而要提高选择效率, 加速育种进程, 充分了解育种材料的遗传背景以及不同育种材料之间的亲缘关系则.

RAPD 分析结果的可重复性, 一直是人们关注

. 由于RAPD 引物的随机性、序列较

短及退火温度低等特点, 对反应条件变化反应非常灵敏. 不同的物种, 不同的仪器设备, 不同的DNA 提取方法, 以及不同的反应体系、反应条件, 均有可能对RAPD 反应结果产生较大的影响. 系统地研究RPAD 分析中的各种影响因子, 摸索其最佳反应条件并优化反应体系, 是获得可重复研究结果的关键. 为此, 我们以粗壮女贞为实验材料对其RAPD 分析中的模板浓度、dNTPS 浓度、M g 浓度、Taq 酶用量以及反应程序等影响因素进行了比较系统的研究, 建立一了套稳定的反应参数, 为后续大量粗壮女贞

种质材料的RAPD 分析创建了一套标准化的实验程序.

1 材料与方法

1. 1 材料

以一份编号为CZ-064的粗壮女贞嫩叶为材料, 采自海南大学苦丁茶研究所的苦丁茶种质资源圃.

1. 2 试剂与仪器

1. 2. 1 试剂:CTAB (十六烷基三甲基溴化铵) 、T ris () )

贵州科学 25卷

100, 150, 200, 300, 400, 500和600 m o l/L.1. 4. 2 Taq 酶的用量

Taq 酶的用量对扩增结果产生影响. 其用量受模板的质量、反应体积、酶活性、酶的耐热性等多种因素的制约

〔13, 28〕

州威佳科技有限公司, Operon 系列引物购自北京鼎国生物技术有限责任公司, La m bda DNA /Hi n d Ⅲ+Eco R ⅠM ar kers 和DL M -3000分别购自华美生物工程公司和杭州吉诺生物医药技术有限公司, Taq DNA po l y m erase 和4Xd NTP m i x 购自上海申能博彩生物科技有限公司等.

1. 2. 2 仪器:离心机, 电热衡温水浴锅, 电冰箱, 移液枪, 752型紫外分光光度计, icycler 像系统等.

1. 3 方法1. 3. 1 总DNA 的提取采用改良的CTAB 法, 具体步骤详见另文报道. 1. 3. 2 RAPD 扩增反应

反应在icycler

T M

. 一般在25 l 的反应体系中Taq

〔23〕

酶的用量为1. 0~2. 5U . 若酶用量过少, 可能扩

增不出条带, 相反, 酶用量过大, 会造成不必要的浪费, 还可能出现非特异性条带和弥散现象. 本实验所设置了的6个Taq 酶用量梯度, 即0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5和3. 0U. 1. 4. 3 M g 用量

M g 可以影响酶的活性、扩增的真实性及产物的特异性. TaqDNA 聚合酶需要镁离子, 同时引物和模板的双链杂交体的解链和退火温度、产物的特异性、引物二聚体的形成也受镁离子的影响

〔23, 25, 28~31〕

Ther m al Cy

cler 型PCR 仪, 水平电泳仪, Ge l Doc XR 型凝胶成

Ther m al Cyc ler 型PCR 仪上进

行. RAPD 基本反应体系组成为:10 反应buffer2 5 , l 3. 0mm ol/LM gC l m o l/LdNTPs, Taq 2, 200 酶2 0U, 引物10pm o, l DNA 模板(CZ-064) 50ng , 最后用无菌超纯水补足至25 . l 循环反应体系的优化按单因子梯度设置进行(见表1~4). 在保持其他因子一致不变的条件下, 变化单一因子, 筛选最优浓度.

PC R 基本扩增程序为:94 预变性4m i n , 然后按94 变性30s , 36 退火45s , 72 延伸120s , 进行45个循环, 最后72 延伸10m i n . 优化程序梯度设置(见表5):退火温度设置5个梯度, 伸延时间与循环数各设置4个梯度, 其余条件则同基本程序. 1. 3. 3 扩增产物的检测

取扩增产物10 l 和2 l 上样缓冲液(含40%蔗糖、0. 25%溴酚蓝) 混匀, 点样于1. 4%琼脂糖凝胶(含0. 5 g /ml EB) 的上样孔中, 以La m bda DNA /H ind Ⅲ+E coR ⅠM arkers 和DL M -3000作为对照分子量标准, 在1 TAE 缓冲液中电压5V /c m 电泳1 5~2. 0h , 然后在Ge l Doc XR 型凝胶成像分析系统下照相并记录, 检验优化结果.

1. 4 各反应因子含量的梯度组合及反应程序各条件的组合1. 4. 1 dNTPs 的用量

d NTPs 是反应中磷酸根的主要来源, 另外其浓度的任何变化都会影响到M g 的有效浓度. W il lia m s 等(1990) 的RAPD 实验中每种dNTP 浓度为100 m o l/L

〔22〕

. 此外, 也有报道说过高的镁离子浓度

〔23, 32〕

对酶会抑制作用. 因此镁离子浓度是影响扩增

特异性主要的因子之一, 确定扩增反应的最佳镁离子的浓度非常重要. 用于RAPD 反应的镁离子的浓度一般选择1~5mm o l/L

〔31, 33〕

. 本实验设置了8个

M g 浓度梯度以确定合适的M g 浓度, 即1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0, 3. 5, 4. 0和4. 5mm ol/L. 1. 4. 4 模板的用量

模板DNA 的用量是影响RAPD 扩增产物的一个重要因素, 它的改变可能导致扩增带型的变化, 而这

种变化在不同的物种中有所不同, 因此有必要通过试验来确定合适的模板浓度. 从已发表的文献看

〔13, 17, 22, 28〕

, RAPD 实验的模板浓度范围较大, 一般为

每反应20ng ~160ng .. 本实验在5. 0ng ~320. 0ng 之间设置8个模板DNA 用量梯度, 即5. 0, 10. 0, 20. 0, 40. 0, 80. 0, 160. 0, 240. 0和320. 0ng /25 . l 1. 4. 5 PCR 热循环的反应参数

除上述反应混合物中各组份会对RAPD 扩增效果产生影响外, 热循环参数的设定也至关重要. 因此, 本实验还针对退火温度、延伸时间、循环次数等条件进行了试验, 其程序设计见表1. 试验条件为:10 反应buffer 2. 5 L , 2. 5m M MgC l M d NTPs , Taq 2, 200 酶2. 0U , 引物(OPG-18) 10p mo, l te m pl a te DNA 80ng .

2 结果与分析

2. 1 dNTPs 浓度对PCR 结果的影响

, ; 在以后的研究中常使用100~d NTPs

〔23~27〕

400 m o l/L的. 本实验在50~

2期鄢东海, 等:粗壮女贞RAPD -PCR 实验体系优化的研究

表1 试验反应程序T ab . 1 T esti ng progra m s

混合液中的Taq 酶竞争M g , 对M g 产生拮抗作用, 从而抑制聚合酶的活性, 导致扩增谱带的改变甚至产物消失; dNTPs 浓度偏低, 会影响合成效率, 使

dNTPs 过早消耗完, 而导致产物单链化, 影响扩增效果

〔23, 34, 35〕

. 本研究在对设置的8个dNTPs 浓度的扩

增结果进行比较发现(表2; 图1):在浓度为50~500 m ol/L之间均能扩增出条带, 但只有200、300 m ol/L两个浓度扩增出的带型一致, 条带多而清晰(图1中4, 5泳道), 其他5个处理的增产物较少, 条带少且不清晰; 当浓度达到600 m o l/L时, 无扩增产物(图1中8泳道). 因此, 我们认为, 粗壮女贞RAPD 扩增的适宜dNTPs 浓度范围为200~300 m ol/L. 张恒庆等(1999) 报道指出使用较低的dNTPs 浓度比使用高浓度dNTPs 会减少聚合酶在非靶位置的启动和延伸时核苷酸的错误码掺入, 可提高特异性与精确性

〔28〕

. 因此为了降低扩增过程中

的错误掺入率, 且200 m o l/L浓度时的扩增条带较

亮, 最后选择200 m ol/L作为最佳反应浓度. 这与

接影响产物的产量、特异性及合成的忠实性. d NTP 浓度过高会导致聚合酶错误掺入, 而且还会与反应

一般文献报道的dNTPs 浓度以0. 2mm o l/L为宜是一致的

图1 dNTPs 浓度试验:1号泳道为M arkers (La m bda DNA /

H i nd Ⅲ+E coR ⅠM ar k ers+DL M -3000); 2~8号泳道的浓度分别为:50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 m ol/L

F i g . 1 Testi ng of dNTPs concentrati on:, dNTPs con cen trati ons w ere 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 mo l/L,res pecti vel y 图2 Taq 酶浓度试验:1号泳道为M arkers(La mbda DNA /

H i nd Ⅲ+E coR ⅠM arkers+DL M -3000); 2~6号泳道的浓度分别为:0. 5, 1. 0, 15, 2. 0, 2. 5, 3. 0U Fig . 2 Testi ng ofT aq concen tration :, Taq concentrati on s w ere 0. 5, 1. 0, 15, 2. 0, 2. 5, 3. 0U , res p ecti vel y

表2 dNTP s 浓度对PCR 的影响

T ab . 2 E ffect o f d NTP s concentration to PCR reacti on

d NTP s 含量( m o l/L)

d NT Ps content 结果R esu lts

50+/-100+/-150+/-200++

300++

400+/-500+/-600#

注:试验条件为:10 反应buffer2. 5 , l 3. 0mMM gC l . 0U, 引物(O PB -8) 10p mo , l T e m plate 50ng . ! #∀表示无2, T aq 酶2

扩增产物; ! +/-∀表示扩增产物不稳定; ! ++∀表示扩增产物效率高且稳定、效果好

2. 2 Taq 酶的用量对RAPD 的影响

贵州科学 25卷

一些文献

〔36~38〕

报道相符:酶量过高, 反而引起

对所设置的6个Taq 酶用量梯度的实验结果表明:Taq 酶单位的变化对RAPD 带的数量和强弱影响较大. 当Taq 酶用量在1. 0U 及其以下用量时无扩增产物(图2中1, 2泳道); 当达到1. 5U 时有扩增产物, 但扩增条带少且不清晰(图2中3泳道); 当用量为2. 0~2. 5U 时, 带型基本一致, 条数丰富且清晰, 但在2. 5U 时新扩增出1条带(图2中4, 5泳道); 当用量为3. 0U 时, 对扩增结果有很大的影响, 小片段扩增量增加而使背景加深呈现弥散状, 而分子量较大的条带反而丢失(图2中6泳道). 这与

RAPD 扩增效果的降低. 从以上结果可见, 用于粗壮女贞RAPD 扩增的适宜Taq 酶用量为2. 0U ~2. 5U, 但在2. 5U 时新扩增出1条带, 分析原因可能是由于酶量过高导致的非特异性扩增

〔39〕

. 因此从实

验的特异性和实验成本的角度综合考虑, 在实际分析过程中应采用2U 的Taq 酶量. 另外, 作者还发现不同批次购买的Tag 酶活性有差异, 导致扩增结果不一致, 因此建议购买大剂量分装的Tag 酶, 以获得较好的重复效果.

表3 T aq 酶用量对PCR 的影响T ab . 3 E ffect o f T oq to PCR reacti on

T aq 酶用量(U ) T aq con tent 结果R esults

0. 5#

1. 0#

1. 5+/-2. 0++

2. 5++

3. 0+/-

注:试验条件为:10 反应buff e r2. 5 L , 3. 0mMM gC l 2, 200 M d NTP s , 引物(OPF -9) 10p m o , l T e mp late 50ng . ! #∀表示无

扩增产物; ∀+/-∀表示扩增产物不稳定; ∀++∀表示扩增产物效率高且稳定、效果好

2. 3 M g 浓度对PCR 结果的影响

M g 浓度的变化对RAPD 带的数量和强弱影响较大. 实验结果表明, 当1. 5mmo l/L及其以下浓度的M g 时均不能扩增出条带(图3中1, 2泳道), 说明1. 5mm ol/L及其以下浓度的M g 不能有效激活Taq 酶活性, 这可能是模板、引物、d NTPs 都与M g 结合, 导致激活Taq 酶的自由M g 不足, 造成酶活力显著降低, 扩增反应失败; 随着M g 浓度的提高, 扩增条带数及条带的亮度也在增加, 当浓度为2. 0mm o l/L时, 有扩增产物, 但条带少且模湖不清(图3中3泳道), 说明M g 浓度仍低, 当浓度为2 5~3. 0mm o l/L时, 扩增条型一致, 条带丰富且清

表4

2+2+

晰(图3中4, 5泳道), 当浓度提高到3. 5mm o l/L及其以上浓度时, 主带亮度明显增强, 但有2条弱带缺失, 同时扩增出了条新带, 背景加深并呈现有拖尾现象(图3中6~8泳道), 可见高浓度M g 会使反应出现非特异性扩增. 综上所述, 用于粗壮女贞RAPD 分析的适宜M g 浓度为2. 5~3. 0mm o l/L. 此外, 减少镁离子浓度可以提高扩增的严谨性, 而增加镁离子的浓度则使扩增的严谨性下降

〔31〕

. 有研究指

〔40〕

出增加镁离子的浓度会使引物的错配频率增加.

因此实验过程中考虑到M g 浓度高容易引起产物非特异性扩增, 故选定2. 5mm o l/L为实际反应浓度.

M g 2+浓度对PCR 的影响

T ab . 4 E ff ec t ofM g 2+concentration t o PCR reacti on

M g 2+含量(mm ol/L) M g

content

1. 0#

1. 5#

2. 0+/-

2. 5++

3. 0++

3. 5+

4. 0+

4. 5+

结果R esults

注:试验条件为:10 反应buffe r2. 5 l, 200 M d NT Ps , T aq 酶2. 0U, 引物(O PF-9) 10pmo , l T e m plate 50ng . ! #∀表示无

扩增产物; ! +/-∀表示扩增产物不稳定; ! +∀表示扩增产物效率高, 但效果差; ! ++∀表示扩增产物效率高且稳定、效果好

2期鄢东海, 等:粗壮女贞RAPD -PCR 实验体系优化的研究

图M g 2+浓度试验:1号泳道为M arkers (Lambda DNA /H i nd Ⅲ+EcoR ⅠM arkers+DLM -3000); 2~8号泳道的浓度分别为:1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0, 3. 5, 4. 0, 4. 5m M

F ig . 3

图4 模板浓度试验:1号泳道为M arke rs(L a m bda DNA /H i nd Ⅲ+E coR ⅠM a rke rs+DLM -3000); 2~8号泳道的浓度分别为:5, 10, 20, 40, 80, 160, 240, 320ng F i g. 4 T esti ng o f te mp late concen trati on :lane 1w as

, lanes 2to 8w ere 5, 10, 20, 40, 80, 160, 240, T esti ng of M g 2+concentrati on :lane 1w as m arker

320ng , respectively m arke , r l anes 2t o 8w ere 1. 0, 1. 5, 2 0, 2 5, 3 0, 3 5, 4 0, 4 5mM, respecti v ely

2. 4 模板DAN 用量的适宜范围

本实验结果表明, 模板浓度在5ng~20ng 范围内, 扩增强度及带数随着浓度的增加而增加, 达到20ng 时扩增多态性丰富, 但某些扩增片段尤其是大片段不稳定(图4中3泳道), 当浓度为40ng 时, 带

数减少(图4中4泳道). 这可解释为模板浓度过低, 分子碰撞的机率低, 偶然性高, 扩增产物无或不稳定. 当浓度在80ng ~160ng 时, 扩增出的条带丰富且清晰, 带型一致且稳定(图4中5, 6泳道). 超过160ng 以后扩增大片段消失, 扩增带数减少(图4中7, 8泳道). 从以上结果可见, 在本实验中模板浓度的变化对RAPD 条带和扩增量的影响显著. 汪小全等(1996) 曾提出模板DNA 的量对RAPD 的条带影响不大, 但对扩增产物的量可有不同程度的影〔41〕

响. 但本实验结果证实模板DNA 的浓度对RAPD 条带也有不同程度的影响, 当模板浓度超过160ng 以后, 扩增带数明显减少. 这一结果与李钧敏等(2002) (2003) (2000)

〔44〕

〔39〕

加, 从而导致Taq 酶活性减弱所致. 而张子学等(2005)

〔45〕

则有不同的看法, 他们分析认为反应体系

中模板、引物和dNTPs 都可与M g 结合, M g 为Taq 酶活性不可缺少的辅助因子, 由于模板浓度的过量提高, 使自由M g2+的浓度下降, 因而阻碍了RAPD 反应. 李钧敏等(2002) 还认为这也有可能是

由于随机引物与不同浓度的模板DNA 结合有所不同

〔39〕

. 在本实验中, 为了有效去除多糖多次用到

〔41〕

CTAB . 汪小全等(1996) 的研究发现, 在提取

DNA 时, 样品中的SDS 、C TAB 等去垢剂及蛋白质沉淀剂如氯仿、乙醇或异丙醇等小分子物质未被除尽而直接影响了Taq 聚合酶活性, 从而影响PCR 扩增. 因此, 我们认为, 模板浓度过高而使扩增带数减少的原因可能是模板浓度过高使CTAB 过多而降低了Taq 聚合酶活性导致RAPD 扩增带数减少. 根据以上分析结果, 我们认为在粗壮女贞的RAPD 实验中模板DNA 浓度的适宜范围为80ng ~160ng . 同时, 在DNA 模板可能不纯的情况下, 宁可使用有效浓度范围内的最低极限, 使抑制TaqDNA 聚合酶活性的因子的影响降到最小, 因此最后确定80ng 为优化后的反应浓度.

2. 5 PCR 热循环的反应参数

退火温度是影响扩增特异性的主要因子之一. 退火温度高特异性强, 但过高则引物不能与模板牢, , 郭安平等(2001)

〔42〕

, 周章乐等

〔43〕

, 李雪雁等(2003)

〔29〕

, 张今今等

的研究结果相似, 即模板浓度增加超过某

一值后扩增带数有明显减少的趋势, 但对此现象的

〔39〕

解释却不一. 李钧敏等(2002) , 郭安平等(2001)

〔42〕

, 周章乐等(2003)

〔43〕

认为, 随着模板浓

度的增加, 扩增强度和带数均减少, 这是由于模板用

贵州科学 25卷

度较其他温度明显变淡, 且模湖难辨(图5中1泳道), 36 、37 时扩增的重复性好, 条带清晰(图5中3, 4泳道), 当温度为38 时, 随着温度的升高, 大片段条带有变模湖的趋势, 达到39 时有1条带基本扩增不出(图5中4, 5泳道). 考虑到既要尽量避免出现阴性结果, 又要增强结果的特异性, 我们认为退火温度为37 较适宜.

可造成引物与模板错配, 非特异性产物增加, 使扩增产物的特异性降低. 对于RAPD 分析, 10个碱基的引物退火温度一般低于40 . W illia m s(1990) 曾

指出, 40 以上的复性温度会使10个碱基的随机引物PCR 反应受到抑制

〔22〕

〔13〕

. 本实验分别在35 、

36 、37 、38 、39 5种复性温度条件下进行PC R 扩增, 结果表明, 在这种5种复性温度条件下所扩增出的主带型基本一致, 35 时有一条带的亮

表5 模板浓度对PCR 的影响

T ab . 5 E ffect o f temp l a te concentra ti on to PCR reaction

模板含量(ng /25 l) te m plate content 结果R esults

5. 0+/-10. 0+/-20. 0+/-40. 0+/-80. 0++

160. 0++

240. 0+/-320. 0+/-

注:试验条件为:10 反应buffer2. 5 , l 2. 5mMM gC l NTP s , T aq 酶2. 0U, 引物(OPF -9) 10p mo. l ! +/-∀表示2, 200 M d

扩增产物不稳定; ! +∀表示扩增产物效率高, 但效果差; ! ++∀表示扩增产物效率高且稳定、效果好

图5 退火温度的影响:1号泳道为m arkers(Lambda DNA /H i nd Ⅲ+EcoR ⅠM arkers+DLM -3000), 2~5泳道分别为程序P35, P36, P37, P38, P39 F ig . 5

Effce t of anneali ng te m pera t ure :lane 1w as

m arke r , l anes 2to 5w ere P35, P36, P37, respecti ve l y .

图6 延伸时间和循环次数的影响:1号泳道为m arkers(L a m bda DNA /Hi nd Ⅲ+EcoR ⅠM a rkers+DL M -3000), 2~8泳道分别为程序E30, E60, E90, E120, C35, C40, C45, C50

F i g . 6 E ffect o f e l onga tion ti m e and nu mbers o f cyc l e :lane 1w as ma rker , l anes 2to 8w ere E30, E120, C35, C40, C45, C50, respectively .

E60, E90,

通常所采用的Taq 酶的最适延伸温度为70~75 , 一般采用72 作为RAPD 反应的延伸温度. 延伸时间主要是根据欲扩增片段的长度来确定的, 一般来讲, 72 延伸1m in 对于2kb 的片段是足够的. 我们在本实验中设置了30s 、60s 、90s 、120s 4种的延伸时间, 结果表明, 当延伸时间为30s 时只扩增出2条带(图6中1泳道), 随着延伸时间的加长, 扩增产物最大片段的大小和强度均明显增加, 达到道), 这与陈宏等

〔46〕

(2003) 、B iela w sk 等(1995)

〔47〕

所述一致. 陈宏等认为扩增产物最大片段的大小和强度随延伸时间的加长而增加; B i e la w sk i 等的试验证明, 不同的延伸时间(30、60、120s) 会导致带谱的差异. 最后确定在我们的实验条件下粗壮女贞的RAPD 实验其最佳延伸时间应为120s .

RAPD -PCR 的循环次数直接影响扩增产物的量及扩增结果的特异性, 在一定范围内, 每一循环都

2期鄢东海, 等:粗壮女贞RAPD -PCR 实验体系优化的研究中模板DNA 的部分区段以几何级数扩增. 但在事实上, 经过一定的循环次数, 随着引物或dNTPs 被耗尽、Taq 酶失活, 扩增会进入线性的平台期, 以后的循环不会使产物明显增加, 反而可能引起非特异的扩增. 本实验通过对比35、40、45、50个循环的扩增效果, 结果在40、45、50个循环条件下的带谱和强度并无显著区别(图6中6~8泳道), 而35个循环的扩增量略显不足(图6中5泳道). 可见, 在本实验条件下40个循环已经可以达到要求了.

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李明云, 钟爱华. 3 结语

由以上实验结果可知, 扩增条件的变化会对

RAPD 图谱产生较大的影响, 从而影响RAPD 分析的准确性. 而RAPD 带谱的准确性与稳定性是利用RAPD 进行遗传多样性分析的前提条件, 因此为了获得准确性与稳定性较高的RAPD 带谱, 在进行不同物种甚至某一物种间不种质材料的RAPD 分析前, 有必要花适当的时间与精力筛选最适宜的RAPD 条件. 从以上分析可看出粗壮女贞的RAPD 分析较适宜的扩增条件如下:RAPD 反应体系组成为:10 反应buffer 2 5 , l 2 5mm o l/LM gC l 2, 200 m o l/Ld NTPs , Taq 酶2. 0U, 引物10pm o, l DNA 模板80ng , 最后用无菌超纯水补足至25 . l PCR 扩增程序为:94 预变性4m in , 然后按94 变性30s , 37 退火45s , 72 延伸120s , 进行40个循环, 最后72 延伸10m i n . 在此扩增条件下所扩增出粗壮女贞RAPD 图谱稳定、可靠.

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第25卷第2期

2007年6月

贵州科学

GU IZ HOU SC I ENCE

V o. l 25, N o . 2

Jun . 2007

粗壮女贞RAPD-PCR 实验体系优化的研究

鄢东海, 郑道君, 梁远发, 令狐昌弟, 刘国民, 田永辉

(1. 贵州省茶叶科学研究所, 贵州湄潭 564100; 2. 海南大学苦丁茶研究所, 海南海口 570228)

关键词:苦丁茶; 粗壮女贞; RAPD ; 反应体系

中图分类号 S571. 1 文献标识码 A 文章编号 1003-6563(2007) 02-0056-09

S TUDY ON THE OPT I M IZAT I ON OF RAPD -PCR EXPER I MEN TAL S YSTEM I N LIGUSTRU M ROBUSTU M (ROXB) BL

Y AN D on g -hai 1, Z H E NG D ao -jun 2, LIANG Yuan -fa 1, LI N G H U Chang -di 1, LIU Guo -min 2, TIAN Yong -hui 1

(1. T he T ea R esearch Institute of G uizhou P rov i nce , Gu iz hou , M e itan 564100; 2. T he kudingcha R esea rch Instit ute o fH a i nan U niversity , H a i nan , H aikou 570228)

for 4m i n , t hen 40cyc l es of denaturing a t 94

for 30s ; annea li ng at 37

f o r

f o r 120s ; at last extensi on a t 72

for 10m i n . T he a m plifi cation producti ons w ere stored at

4 . A h i gh reproduc i b ilit y w as obta i ned unde r t he opti m i zed exper i m enta l conditi ons . K EY WORDS kudi ngcha ; L i gustrum robustu m (R ox ) B. l ; RA PD; reacti on syste m

粗壮女贞〔L i g ustrum robust u m (Roxb) B. l 〕是我国! 苦丁茶∀的主要种类之一. 事实上! 苦丁茶∀

收稿日期:2006-09-11

是我国民间一大类代茶饮料的统称, 其原植物涉及12科13属, 至少有30余种(包括变种、变型)

〔1~3〕

基金项目:贵州省自然科学基金资助项目, 批准文号:黔科合J 字〔2005〕2033号.

〔4, 5〕

作, 此前基本上还是一片空白.

〔6〕

, 而《中国植物志》(第六十一卷) 则将紫茎

〔7〕

女贞归并于粗壮女贞条目之下种与粗壮女贞分别加以介绍

; 众多学者在介绍.

木犀科苦丁茶时, 仍将紫茎女贞作为一个独立的物

〔4, 5; 8~11〕

〔12, 20, 21〕

〔12~21〕

. 我国木犀科苦丁茶不仅种类繁多, 而且其同

物异名(Ho m ony m ) 和异物同名(Synony m ) 现象非常

RAPD 分析结果的可重复性, 一直是人们关注

. 由于RAPD 引物的随机性、序列较

种质材料的RAPD 分析创建了一套标准化的实验程序.

1 材料与方法

1. 1 材料

以一份编号为CZ-064的粗壮女贞嫩叶为材料, 采自海南大学苦丁茶研究所的苦丁茶种质资源圃.

1. 2 试剂与仪器

1. 2. 1 试剂:CTAB (十六烷基三甲基溴化铵) 、T ris () )

贵州科学 25卷

100, 150, 200, 300, 400, 500和600 m o l/L.1. 4. 2 Taq 酶的用量

Taq 酶的用量对扩增结果产生影响. 其用量受模板的质量、反应体积、酶活性、酶的耐热性等多种因素的制约

〔13, 28〕

1. 2. 2 仪器:离心机, 电热衡温水浴锅, 电冰箱, 移液枪, 752型紫外分光光度计, icycler 像系统等.

1. 3 方法1. 3. 1 总DNA 的提取采用改良的CTAB 法, 具体步骤详见另文报道. 1. 3. 2 RAPD 扩增反应

反应在icycler

T M

. 一般在25 l 的反应体系中Taq

〔23〕

酶的用量为1. 0~2. 5U . 若酶用量过少, 可能扩

〔23, 25, 28~31〕

Ther m al Cy

cler 型PCR 仪, 水平电泳仪, Ge l Doc XR 型凝胶成

Ther m al Cyc ler 型PCR 仪上进

1. 4 各反应因子含量的梯度组合及反应程序各条件的组合1. 4. 1 dNTPs 的用量

d NTPs 是反应中磷酸根的主要来源, 另外其浓度的任何变化都会影响到M g 的有效浓度. W il lia m s 等(1990) 的RAPD 实验中每种dNTP 浓度为100 m o l/L

〔22〕

. 此外, 也有报道说过高的镁离子浓度

〔23, 32〕

对酶会抑制作用. 因此镁离子浓度是影响扩增

特异性主要的因子之一, 确定扩增反应的最佳镁离子的浓度非常重要. 用于RAPD 反应的镁离子的浓度一般选择1~5mm o l/L

〔31, 33〕

. 本实验设置了8个

M g 浓度梯度以确定合适的M g 浓度, 即1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0, 3. 5, 4. 0和4. 5mm ol/L. 1. 4. 4 模板的用量

模板DNA 的用量是影响RAPD 扩增产物的一个重要因素, 它的改变可能导致扩增带型的变化, 而这

种变化在不同的物种中有所不同, 因此有必要通过试验来确定合适的模板浓度. 从已发表的文献看

〔13, 17, 22, 28〕

, RAPD 实验的模板浓度范围较大, 一般为

2 结果与分析

2. 1 dNTPs 浓度对PCR 结果的影响

, ; 在以后的研究中常使用100~d NTPs

〔23~27〕

400 m o l/L的. 本实验在50~

2期鄢东海, 等:粗壮女贞RAPD -PCR 实验体系优化的研究

表1 试验反应程序T ab . 1 T esti ng progra m s

混合液中的Taq 酶竞争M g , 对M g 产生拮抗作用, 从而抑制聚合酶的活性, 导致扩增谱带的改变甚至产物消失; dNTPs 浓度偏低, 会影响合成效率, 使

dNTPs 过早消耗完, 而导致产物单链化, 影响扩增效果

〔23, 34, 35〕

. 本研究在对设置的8个dNTPs 浓度的扩

〔28〕

. 因此为了降低扩增过程中

的错误掺入率, 且200 m o l/L浓度时的扩增条带较

亮, 最后选择200 m ol/L作为最佳反应浓度. 这与

接影响产物的产量、特异性及合成的忠实性. d NTP 浓度过高会导致聚合酶错误掺入, 而且还会与反应

一般文献报道的dNTPs 浓度以0. 2mm o l/L为宜是一致的

图1 dNTPs 浓度试验:1号泳道为M arkers (La m bda DNA /

H i nd Ⅲ+E coR ⅠM ar k ers+DL M -3000); 2~8号泳道的浓度分别为:50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 m ol/L

F i g . 1 Testi ng of dNTPs concentrati on:, dNTPs con cen trati ons w ere 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 mo l/L,res pecti vel y 图2 Taq 酶浓度试验:1号泳道为M arkers(La mbda DNA /

表2 dNTP s 浓度对PCR 的影响

T ab . 2 E ffect o f d NTP s concentration to PCR reacti on

d NTP s 含量( m o l/L)

d NT Ps content 结果R esu lts

50+/-100+/-150+/-200++

300++

400+/-500+/-600#

注:试验条件为:10 反应buffer2. 5 , l 3. 0mMM gC l . 0U, 引物(O PB -8) 10p mo , l T e m plate 50ng . ! #∀表示无2, T aq 酶2

扩增产物; ! +/-∀表示扩增产物不稳定; ! ++∀表示扩增产物效率高且稳定、效果好

2. 2 Taq 酶的用量对RAPD 的影响

贵州科学 25卷

一些文献

〔36~38〕

报道相符:酶量过高, 反而引起

〔39〕

. 因此从实

表3 T aq 酶用量对PCR 的影响T ab . 3 E ffect o f T oq to PCR reacti on

T aq 酶用量(U ) T aq con tent 结果R esults

0. 5#

1. 0#

1. 5+/-2. 0++

2. 5++

3. 0+/-

注:试验条件为:10 反应buff e r2. 5 L , 3. 0mMM gC l 2, 200 M d NTP s , 引物(OPF -9) 10p m o , l T e mp late 50ng . ! #∀表示无

扩增产物; ∀+/-∀表示扩增产物不稳定; ∀++∀表示扩增产物效率高且稳定、效果好

2. 3 M g 浓度对PCR 结果的影响

表4

2+2+

〔31〕

. 有研究指

〔40〕

出增加镁离子的浓度会使引物的错配频率增加.

因此实验过程中考虑到M g 浓度高容易引起产物非特异性扩增, 故选定2. 5mm o l/L为实际反应浓度.

M g 2+浓度对PCR 的影响

T ab . 4 E ff ec t ofM g 2+concentration t o PCR reacti on

M g 2+含量(mm ol/L) M g

content

1. 0#

1. 5#

2. 0+/-

2. 5++

3. 0++

3. 5+

4. 0+

4. 5+

结果R esults

注:试验条件为:10 反应buffe r2. 5 l, 200 M d NT Ps , T aq 酶2. 0U, 引物(O PF-9) 10pmo , l T e m plate 50ng . ! #∀表示无

扩增产物; ! +/-∀表示扩增产物不稳定; ! +∀表示扩增产物效率高, 但效果差; ! ++∀表示扩增产物效率高且稳定、效果好

2期鄢东海, 等:粗壮女贞RAPD -PCR 实验体系优化的研究

图M g 2+浓度试验:1号泳道为M arkers (Lambda DNA /H i nd Ⅲ+EcoR ⅠM arkers+DLM -3000); 2~8号泳道的浓度分别为:1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0, 3. 5, 4. 0, 4. 5m M

F ig . 3

, lanes 2to 8w ere 5, 10, 20, 40, 80, 160, 240, T esti ng of M g 2+concentrati on :lane 1w as m arker

320ng , respectively m arke , r l anes 2t o 8w ere 1. 0, 1. 5, 2 0, 2 5, 3 0, 3 5, 4 0, 4 5mM, respecti v ely

2. 4 模板DAN 用量的适宜范围

响. 但本实验结果证实模板DNA 的浓度对RAPD 条带也有不同程度的影响, 当模板浓度超过160ng 以后, 扩增带数明显减少. 这一结果与李钧敏等(2002) (2003) (2000)

〔44〕

〔39〕

加, 从而导致Taq 酶活性减弱所致. 而张子学等(2005)

〔45〕

则有不同的看法, 他们分析认为反应体系

由于随机引物与不同浓度的模板DNA 结合有所不同

〔39〕

. 在本实验中, 为了有效去除多糖多次用到

〔41〕

CTAB . 汪小全等(1996) 的研究发现, 在提取

2. 5 PCR 热循环的反应参数

退火温度是影响扩增特异性的主要因子之一. 退火温度高特异性强, 但过高则引物不能与模板牢, , 郭安平等(2001)

〔42〕

, 周章乐等

〔43〕

, 李雪雁等(2003)

〔29〕

, 张今今等

的研究结果相似, 即模板浓度增加超过某

一值后扩增带数有明显减少的趋势, 但对此现象的

〔39〕

解释却不一. 李钧敏等(2002) , 郭安平等(2001)

〔42〕

, 周章乐等(2003)

〔43〕

认为, 随着模板浓

度的增加, 扩增强度和带数均减少, 这是由于模板用

贵州科学 25卷

可造成引物与模板错配, 非特异性产物增加, 使扩增产物的特异性降低. 对于RAPD 分析, 10个碱基的引物退火温度一般低于40 . W illia m s(1990) 曾

指出, 40 以上的复性温度会使10个碱基的随机引物PCR 反应受到抑制

〔22〕

〔13〕

. 本实验分别在35 、

36 、37 、38 、39 5种复性温度条件下进行PC R 扩增, 结果表明, 在这种5种复性温度条件下所扩增出的主带型基本一致, 35 时有一条带的亮

表5 模板浓度对PCR 的影响

T ab . 5 E ffect o f temp l a te concentra ti on to PCR reaction

模板含量(ng /25 l) te m plate content 结果R esults

5. 0+/-10. 0+/-20. 0+/-40. 0+/-80. 0++

160. 0++

240. 0+/-320. 0+/-

注:试验条件为:10 反应buffer2. 5 , l 2. 5mMM gC l NTP s , T aq 酶2. 0U, 引物(OPF -9) 10p mo. l ! +/-∀表示2, 200 M d

扩增产物不稳定; ! +∀表示扩增产物效率高, 但效果差; ! ++∀表示扩增产物效率高且稳定、效果好

图5 退火温度的影响:1号泳道为m arkers(Lambda DNA /H i nd Ⅲ+EcoR ⅠM arkers+DLM -3000), 2~5泳道分别为程序P35, P36, P37, P38, P39 F ig . 5

Effce t of anneali ng te m pera t ure :lane 1w as

m arke r , l anes 2to 5w ere P35, P36, P37, respecti ve l y .

图6 延伸时间和循环次数的影响:1号泳道为m arkers(L a m bda DNA /Hi nd Ⅲ+EcoR ⅠM a rkers+DL M -3000), 2~8泳道分别为程序E30, E60, E90, E120, C35, C40, C45, C50

F i g . 6 E ffect o f e l onga tion ti m e and nu mbers o f cyc l e :lane 1w as ma rker , l anes 2to 8w ere E30, E120, C35, C40, C45, C50, respectively .

E60, E90,

〔46〕

(2003) 、B iela w sk 等(1995)

〔47〕

RAPD -PCR 的循环次数直接影响扩增产物的量及扩增结果的特异性, 在一定范围内, 每一循环都

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李明云, 钟爱华. 3 结语

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