冰冻切片的制作方法
一、概述
所谓冰冻法（Freezing method），就是先将组织块进行冰冻，水分成为包埋介质，组织块在一定温度和时间内变硬，然后使用切片机进行薄片切割的一种方法。
(一) 冰冻切片法分类
一般冰冻切片机：用Co2气、液氮等，通过制冷的气体或液体冰冻组织块与切片刀，因受周围环境的影响，夏季不易操作。半导体制冷切片机，通过半导体材料的制冷原理，使组织块和刀冷冻，并需要循环水降除半导体材料的高热，夏季不易操作。恒冷箱式切片机，不受外界温度的影响，不需要循环水，四季都能切成非薄的切片，操作方便用时间短，用途广泛是目前最为理想的切片机。
（二）恒冷箱式切片机及切片法
机器构造：（1）制冷室：有轮转式切片机，切片机的手轮在室的右外侧壁；组织托台放组织托用；速冰冷锤，是铸铁圆块，能迅速吸取组织中热量，起速冻作用。（2）开关：电源开关；温度设定调节键；时钟键；除霜时间设定键；半导体速冻键；（按此健在十分钟里提高温度-4摄氏度）。（3）切片机调节系统：有快慢进或退键，修整组织块时可快或慢进退机头。组织接近刀刃时要慢进键，并不停的旋转手轮，组织修平后，松开进机头键开始切片。
恒冷箱式切片机最大的优点不受外界温度变化的影响，操作很方便，5¡ª10分钟内可切出满意的薄片，是外科病理快速诊断；酶化学的新鲜组织切片；组织化学脂质染色；免疫组化，特别是免疫荧光等技术开展必备的仪器。
（三）冷冻切片需要温度及时间
在零下15——20摄氏度之间，大部分组织均能切出良好的切片。各器官组织切片的最适温度及时间见下表：
各器官组织冷冻切片的最适温度及时间表
组 织 温 度 时 间 新鲜 固定后
皮肤及脂肪 -26摄氏度 -28摄氏度 3~5min 5~8min 胃肠、食管、膀胱 -18摄氏度 -20摄氏度 3~5min 5~6min 子宫、卵巢 -20摄氏度 -22摄氏度 3~4min 4~5min 腮腺、肌肉 -17摄氏度 -19摄氏度 3~4min 4~5min 脾、淋巴结、甲状腺 -16摄氏度 -18摄氏度 2~3min 4~5min 脑组织 -15摄氏度 -17摄氏度 2~3min 4~5min
注：表中温度及时间指组织厚度0.3-0.4 cm
（四）冷冻温度及时间的关系
制冷温度数越大对组织冰硬的时间越短，但往往是欲速越不达，组织冻过切片呈碎屑状，得不到完整切片；并出现冰晶，改变组织应有的形态，细胞呈现脂肪样细胞状态，特别是脑组织肾透明细胞癌组织最明显。如果按表中所示的制冷温度操作时间稍长一点也不会影响切片质量。但冷冻时间太长尽管冷度不是很高，也会使一些器官的组织坚硬似骨，如子宫平滑肌瘤，卵巢纤维瘤韧带纤维瘤等良性肿瘤组织的新鲜标本难以制成切片。处理方法：掌握好制冷的温度和时间，一但组织冰过，可用手指温一温组织块，如果还不行，就拿到冷室外暖后再切。
（五）持刀器的倾斜度
持刀器是用来夹持切刀片的夹子，并能调节刀的倾斜度，一般从4-6度最适当。切片刀的倾斜度是指刀刃面和水平面所形成的角度，角度不足或过大时，均不能取切片。
在倾斜度不足时，切片呈现锯齿状，横行的波纹的切片，也不能成切片带，严重时砍坏组织。
在倾斜度过大时，切片带发生纵走裂痕，严重时不能切取切片甚至砍坏组织块。因切片机旋转，丝杠向外推出组织块，组织块和清角度的刀相碰造成破坏组织块。
二．冷冻切片
将组织块置于金属组织托上面，（常规外科快速病理切片组织与托之间用化学胶水粘附即可，如免疫荧光，酶化学染色用OCT包埋剂，防止异荧光或影响酶染色。）组织块冰硬后，将连组织的金属托固定于机头上，按快进或退键使组织块接近于切片刀，按慢进键，右手旋转手轮至修平组织面，左手松开按键，右手旋转手轮即可切片。切片时可用
防卷板，防卷板与刀片平行放置，应略低于刀刃，与刀刃平行不能切片，低于刀刃太多不能防卷，通过调节防卷板螺丝使切片平展于防卷板下面为好。不用防卷板直接切削至组织上极留蒂，将切片用毛笔轻轻扫平与组织块面上。将切削片从防卷板或组织块上面粘附于切片上即可。 切片的厚度按需而定，一般外科快速病理切片，免疫组化荧光法染色4-5um都能切破细胞膜，不会影响抗体与抗原的接触。组织化学的脂肪染色，要求10-15 um；神经鞘染色8-10 um。另外还有一些病毒的免疫荧光或免疫组化染色2 um，在切薄片时可用OCT包埋剂将组织包埋于中心，这样更容易切成
三、组织切片固定液
为使组织细胞保持接近于它生前的正常状态，在标本制作的过程中，要经过各种方法的处理，截止组织成分的融化消失，特别防止抗原弥散、丢失和终止分解酶的活性，以免抗原破坏而丧失抗原性，并转变为不溶性物质从而有利于保存。这些就是固定的意义。
常用的固定液有三大类：丙酮醇类；醛类及碳化二亚胺，固定原理有二个方面：一类是使蛋白质沉淀，另一类是使蛋白质交联而起固定作用。下面分类介绍。
（一）丙酮和醇类
对蛋白质沉淀起固定作用，对抗原的抗原性影响小，对组织结构上的抗原及微生物抗原的固定效果好，但对胞质的蛋白及低分子多肽较差。
丙酮：优点对抗原的抗原性影响小，对组织的通透性较好，缺点对组织的一般染色性较差。
乙醇：优点同丙酮但对组织的一般染色性较丙酮好，缺点对组织的通透性较差。为了增加固定效果常配成卡若氏混合固定液，除能增加对组织穿透性，还能祛除细胞膜的脂质成分，有利于抗体的穿透和减少非特异性染色。
（二）醛类
对蛋白质发生交联而起固定作用，能很好的保持组织结构，也能固定低分子多肽，是免疫酶电镜观察，对多肽免疫酶染色时首选醛类固定液。醛类最大的缺点也正是其交联作用，造成细胞膜的通透性减少，并使大多数抗原尤其是大分子抗原丧失其抗原性。这也许是由于交联作用使抗原分子形态结构发生变化，出现空间障碍使抗体不能与抗原决定簇
接触，或者是抗原与其他分子发生分子间交联，遮盖了抗原决定簇。戊二醛弊病更加严重，故很少单独使用。目前一般用新鲜解聚的多聚甲醛，它的弊病比戊二醛小的多。如果控制浓度可以降低它对抗原的影响，但必须在四度下的冰箱内进行。4%多聚甲醛对HBSAg免疫球蛋白等影响不大，但对许多组织的抗原，病毒抗原有明显的损害，宜用1~1.5％浓度，为了保存微细结构，可加至0.2%苦味酸，或加至2%醋酸，或用多聚甲醛配成BOUIN氏液，都能增加固定效果。
此外：过碘酸、赖氨酸和多聚甲醛（PLP法）对富于糖分子的组织有很好固定作用，对病毒的抗原性影响较小。其原理是：过碘酸氧化抗原的糖分子,形成新的醛基通过赖氨酸的作用进行分子内及分子间交联，蛋白分子的固定有多聚甲醛来完成。故多聚甲醛可增加至2%浓度。
（三）碳化二亚胺（carbodiimide）：又称卡比马钙。
是常用来将半抗原结合到载体蛋白上的一种水溶性物质，它作用于羟基使之形成酰基异尿素,然后通过酰胺键与附近的氨基交联起来.如果羟基与氨基的位置接近，碳化二亚胺对蛋白质的固定作用与醛类同样有效，对抗原的遮盖作用及降低细胞的通透性的作用比醛类小，是一种有前途的新的固定剂。
四、固定的方法
常规HE染色，以甲醇、丙酮、乙醇或卡诺氏固定液均可，固定切片1-2min。免疫组化染色时先用上述固定剂4℃15min，预实验，如果所要标记的抗原不理想时，再选择其他的固定剂。醛类的交联作用具有高度的pH依赖性，pH高时交联作用强，表面组织先被固定，就妨碍固定液的进一步穿透，造成固定不均。造成固定不充分的抗原则可能发生弥散，特别在科研保存组织块待冰冻切片时，最好用二级固定剂，第一级先用pH6-6.5多聚甲醛固定4-6小时，第二级用pH9-11同样的固定液保存组织块。
组织块保存，因长期保存于多聚甲醛固定液中，对多数的抗原是不稳定的，可考虑用以下的保存法：
①快速冷冻，选放在液氮中，然后放在-８0℃低温冰箱保存。
②固定后的切片低温保存，如腺病毒抗原的冰冻切片或涂片在4℃.可保存2周，-5℃可保存2-3个月，-20℃ 可保存一年以上。
③甲醛固定的冰冻切片，在5-15%蔗糖磷酸缓冲液中，在4℃可保存1-2
周。
五、染色
（一）常规苏术素伊红染色（HE）
将固定后的切片水洗片刻浸染苏术素1 min；水洗后盐酸酒精分化；充分水洗（或用PH7.8-80氨水浸泡片刻水洗）至显蓝，伊红染30秒；水洗切片；常规脱水、透明、封固切片。
（二）组织化学染色
糖、蛋白质和脂肪，按组织化学染色法要求进行。
（三）酶染色
按酶化学技术要求进行。
（四）免疫组化、含免疫荧光染色
按免疫组化技术进行。
冰冻切片的注意事项
１．速冻：是冰冻切片的关键，因为只有速冻才能减少组织内的冰晶，最好的办法是将速冻头迅速压在组织上，冻好后就可以切片特别适用于较脆的组织；而含有脂肪组织较多的组织，最好放在液氮里处理，在液氮里冷冻要注意不要冻过头，2-3秒钟就要拿出来看一下，只要4/5的组织已经冻住就可以了，否则会引起组织发脆或冷冻头与组织分离。 ． ２、固定：切片后应立即放入甲醇中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成细胞退变。固定液有很多种我们实践认为甲醇作用快，收缩小，染色较清晰，是冰冻切片最理想的固定液，如加5%的冰醋酸效果更好。
3. 包埋剂：可用普通胶水代替，但要加入适量的水（胶水与水的比例约2：1左右）太稀了容易损伤切片刀，太稠了粘在切片上不容易洗掉，影响切片质量。
4. 冰冻用切片刀：不仅要磨的快，而且要磨的直，否则切出的片子就不会平整，不能进入抗卷板，最好能使用一次性刀片。
5. 如果组织发脆，可等几分钟后再切，也可用手在组织上稍稍加温，如果用手摸组织块，最好戴手套，或用玻片间的纸夹在手与组织之间，以防感染。
6. 冷冻室的温度，冬天一般设在-19℃左右，夏天设在-22℃左右。不同的组织有不同的温度要求，肝脏、甲状腺组织温度控制在-15℃左右，脂肪组织一般在-35℃以下。
7. 冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态，经常的开关机器电源容易造成压缩机损伤
冰冻切片的制作方法
一、概述
所谓冰冻法（Freezing method），就是先将组织块进行冰冻，水分成为包埋介质，组织块在一定温度和时间内变硬，然后使用切片机进行薄片切割的一种方法。
(一) 冰冻切片法分类
一般冰冻切片机：用Co2气、液氮等，通过制冷的气体或液体冰冻组织块与切片刀，因受周围环境的影响，夏季不易操作。半导体制冷切片机，通过半导体材料的制冷原理，使组织块和刀冷冻，并需要循环水降除半导体材料的高热，夏季不易操作。恒冷箱式切片机，不受外界温度的影响，不需要循环水，四季都能切成非薄的切片，操作方便用时间短，用途广泛是目前最为理想的切片机。
（二）恒冷箱式切片机及切片法
机器构造：（1）制冷室：有轮转式切片机，切片机的手轮在室的右外侧壁；组织托台放组织托用；速冰冷锤，是铸铁圆块，能迅速吸取组织中热量，起速冻作用。（2）开关：电源开关；温度设定调节键；时钟键；除霜时间设定键；半导体速冻键；（按此健在十分钟里提高温度-4摄氏度）。（3）切片机调节系统：有快慢进或退键，修整组织块时可快或慢进退机头。组织接近刀刃时要慢进键，并不停的旋转手轮，组织修平后，松开进机头键开始切片。
恒冷箱式切片机最大的优点不受外界温度变化的影响，操作很方便，5¡ª10分钟内可切出满意的薄片，是外科病理快速诊断；酶化学的新鲜组织切片；组织化学脂质染色；免疫组化，特别是免疫荧光等技术开展必备的仪器。
（三）冷冻切片需要温度及时间
在零下15——20摄氏度之间，大部分组织均能切出良好的切片。各器官组织切片的最适温度及时间见下表：
各器官组织冷冻切片的最适温度及时间表
组 织 温 度 时 间 新鲜 固定后
皮肤及脂肪 -26摄氏度 -28摄氏度 3~5min 5~8min 胃肠、食管、膀胱 -18摄氏度 -20摄氏度 3~5min 5~6min 子宫、卵巢 -20摄氏度 -22摄氏度 3~4min 4~5min 腮腺、肌肉 -17摄氏度 -19摄氏度 3~4min 4~5min 脾、淋巴结、甲状腺 -16摄氏度 -18摄氏度 2~3min 4~5min 脑组织 -15摄氏度 -17摄氏度 2~3min 4~5min
注：表中温度及时间指组织厚度0.3-0.4 cm
（四）冷冻温度及时间的关系
制冷温度数越大对组织冰硬的时间越短，但往往是欲速越不达，组织冻过切片呈碎屑状，得不到完整切片；并出现冰晶，改变组织应有的形态，细胞呈现脂肪样细胞状态，特别是脑组织肾透明细胞癌组织最明显。如果按表中所示的制冷温度操作时间稍长一点也不会影响切片质量。但冷冻时间太长尽管冷度不是很高，也会使一些器官的组织坚硬似骨，如子宫平滑肌瘤，卵巢纤维瘤韧带纤维瘤等良性肿瘤组织的新鲜标本难以制成切片。处理方法：掌握好制冷的温度和时间，一但组织冰过，可用手指温一温组织块，如果还不行，就拿到冷室外暖后再切。
（五）持刀器的倾斜度
持刀器是用来夹持切刀片的夹子，并能调节刀的倾斜度，一般从4-6度最适当。切片刀的倾斜度是指刀刃面和水平面所形成的角度，角度不足或过大时，均不能取切片。
在倾斜度不足时，切片呈现锯齿状，横行的波纹的切片，也不能成切片带，严重时砍坏组织。
在倾斜度过大时，切片带发生纵走裂痕，严重时不能切取切片甚至砍坏组织块。因切片机旋转，丝杠向外推出组织块，组织块和清角度的刀相碰造成破坏组织块。
二．冷冻切片
将组织块置于金属组织托上面，（常规外科快速病理切片组织与托之间用化学胶水粘附即可，如免疫荧光，酶化学染色用OCT包埋剂，防止异荧光或影响酶染色。）组织块冰硬后，将连组织的金属托固定于机头上，按快进或退键使组织块接近于切片刀，按慢进键，右手旋转手轮至修平组织面，左手松开按键，右手旋转手轮即可切片。切片时可用
防卷板，防卷板与刀片平行放置，应略低于刀刃，与刀刃平行不能切片，低于刀刃太多不能防卷，通过调节防卷板螺丝使切片平展于防卷板下面为好。不用防卷板直接切削至组织上极留蒂，将切片用毛笔轻轻扫平与组织块面上。将切削片从防卷板或组织块上面粘附于切片上即可。 切片的厚度按需而定，一般外科快速病理切片，免疫组化荧光法染色4-5um都能切破细胞膜，不会影响抗体与抗原的接触。组织化学的脂肪染色，要求10-15 um；神经鞘染色8-10 um。另外还有一些病毒的免疫荧光或免疫组化染色2 um，在切薄片时可用OCT包埋剂将组织包埋于中心，这样更容易切成
三、组织切片固定液
为使组织细胞保持接近于它生前的正常状态，在标本制作的过程中，要经过各种方法的处理，截止组织成分的融化消失，特别防止抗原弥散、丢失和终止分解酶的活性，以免抗原破坏而丧失抗原性，并转变为不溶性物质从而有利于保存。这些就是固定的意义。
常用的固定液有三大类：丙酮醇类；醛类及碳化二亚胺，固定原理有二个方面：一类是使蛋白质沉淀，另一类是使蛋白质交联而起固定作用。下面分类介绍。
（一）丙酮和醇类
对蛋白质沉淀起固定作用，对抗原的抗原性影响小，对组织结构上的抗原及微生物抗原的固定效果好，但对胞质的蛋白及低分子多肽较差。
丙酮：优点对抗原的抗原性影响小，对组织的通透性较好，缺点对组织的一般染色性较差。
乙醇：优点同丙酮但对组织的一般染色性较丙酮好，缺点对组织的通透性较差。为了增加固定效果常配成卡若氏混合固定液，除能增加对组织穿透性，还能祛除细胞膜的脂质成分，有利于抗体的穿透和减少非特异性染色。
（二）醛类
对蛋白质发生交联而起固定作用，能很好的保持组织结构，也能固定低分子多肽，是免疫酶电镜观察，对多肽免疫酶染色时首选醛类固定液。醛类最大的缺点也正是其交联作用，造成细胞膜的通透性减少，并使大多数抗原尤其是大分子抗原丧失其抗原性。这也许是由于交联作用使抗原分子形态结构发生变化，出现空间障碍使抗体不能与抗原决定簇
接触，或者是抗原与其他分子发生分子间交联，遮盖了抗原决定簇。戊二醛弊病更加严重，故很少单独使用。目前一般用新鲜解聚的多聚甲醛，它的弊病比戊二醛小的多。如果控制浓度可以降低它对抗原的影响，但必须在四度下的冰箱内进行。4%多聚甲醛对HBSAg免疫球蛋白等影响不大，但对许多组织的抗原，病毒抗原有明显的损害，宜用1~1.5％浓度，为了保存微细结构，可加至0.2%苦味酸，或加至2%醋酸，或用多聚甲醛配成BOUIN氏液，都能增加固定效果。
此外：过碘酸、赖氨酸和多聚甲醛（PLP法）对富于糖分子的组织有很好固定作用，对病毒的抗原性影响较小。其原理是：过碘酸氧化抗原的糖分子,形成新的醛基通过赖氨酸的作用进行分子内及分子间交联，蛋白分子的固定有多聚甲醛来完成。故多聚甲醛可增加至2%浓度。
（三）碳化二亚胺（carbodiimide）：又称卡比马钙。
是常用来将半抗原结合到载体蛋白上的一种水溶性物质，它作用于羟基使之形成酰基异尿素,然后通过酰胺键与附近的氨基交联起来.如果羟基与氨基的位置接近，碳化二亚胺对蛋白质的固定作用与醛类同样有效，对抗原的遮盖作用及降低细胞的通透性的作用比醛类小，是一种有前途的新的固定剂。
四、固定的方法
常规HE染色，以甲醇、丙酮、乙醇或卡诺氏固定液均可，固定切片1-2min。免疫组化染色时先用上述固定剂4℃15min，预实验，如果所要标记的抗原不理想时，再选择其他的固定剂。醛类的交联作用具有高度的pH依赖性，pH高时交联作用强，表面组织先被固定，就妨碍固定液的进一步穿透，造成固定不均。造成固定不充分的抗原则可能发生弥散，特别在科研保存组织块待冰冻切片时，最好用二级固定剂，第一级先用pH6-6.5多聚甲醛固定4-6小时，第二级用pH9-11同样的固定液保存组织块。
组织块保存，因长期保存于多聚甲醛固定液中，对多数的抗原是不稳定的，可考虑用以下的保存法：
①快速冷冻，选放在液氮中，然后放在-８0℃低温冰箱保存。
②固定后的切片低温保存，如腺病毒抗原的冰冻切片或涂片在4℃.可保存2周，-5℃可保存2-3个月，-20℃ 可保存一年以上。
③甲醛固定的冰冻切片，在5-15%蔗糖磷酸缓冲液中，在4℃可保存1-2
周。
五、染色
（一）常规苏术素伊红染色（HE）
将固定后的切片水洗片刻浸染苏术素1 min；水洗后盐酸酒精分化；充分水洗（或用PH7.8-80氨水浸泡片刻水洗）至显蓝，伊红染30秒；水洗切片；常规脱水、透明、封固切片。
（二）组织化学染色
糖、蛋白质和脂肪，按组织化学染色法要求进行。
（三）酶染色
按酶化学技术要求进行。
（四）免疫组化、含免疫荧光染色
按免疫组化技术进行。
冰冻切片的注意事项
１．速冻：是冰冻切片的关键，因为只有速冻才能减少组织内的冰晶，最好的办法是将速冻头迅速压在组织上，冻好后就可以切片特别适用于较脆的组织；而含有脂肪组织较多的组织，最好放在液氮里处理，在液氮里冷冻要注意不要冻过头，2-3秒钟就要拿出来看一下，只要4/5的组织已经冻住就可以了，否则会引起组织发脆或冷冻头与组织分离。 ． ２、固定：切片后应立即放入甲醇中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成细胞退变。固定液有很多种我们实践认为甲醇作用快，收缩小，染色较清晰，是冰冻切片最理想的固定液，如加5%的冰醋酸效果更好。
3. 包埋剂：可用普通胶水代替，但要加入适量的水（胶水与水的比例约2：1左右）太稀了容易损伤切片刀，太稠了粘在切片上不容易洗掉，影响切片质量。
4. 冰冻用切片刀：不仅要磨的快，而且要磨的直，否则切出的片子就不会平整，不能进入抗卷板，最好能使用一次性刀片。
5. 如果组织发脆，可等几分钟后再切，也可用手在组织上稍稍加温，如果用手摸组织块，最好戴手套，或用玻片间的纸夹在手与组织之间，以防感染。
6. 冷冻室的温度，冬天一般设在-19℃左右，夏天设在-22℃左右。不同的组织有不同的温度要求，肝脏、甲状腺组织温度控制在-15℃左右，脂肪组织一般在-35℃以下。
7. 冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态，经常的开关机器电源容易造成压缩机损伤