第55卷 第10期 化 工 学 报 Vol155 №10 2004年10月 Journal of Chemical Industry and Engineering (China) October 2004
综述与专论
微生物代谢工程:绘制细胞工厂的蓝图
李 寅1 曹竹安2
(1江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214036;2清华大学化学工程系,北京100084)
摘 要 代谢工程是一种理解并利用代谢过程的方法,其目的是优化或改变生物细胞中的代谢网络和表达调控网络,提高其代谢产物的产量或合成新的化合物.后基因组时代系统生物学和功能基因组学技术的发展,为构建能够实现特定目标的微生物细胞工厂提供了空前机遇.本文回顾代谢工程在技术和应用上的最新进展,讨论代谢工程中的关键问题和发展趋势,并提出中国在该领域的发展策略.关键词 代谢工程 微生物 细胞工厂 系统生物学中图分类号 Q93 文献标识码 A 1573-08
MICROBIALMGATEWAYTO
FORCELLFACTORIES
LIYin1andCAOZhu’an2
(1KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi214036,Jiangsu,China;
2
DepartmentofChemicalEngineering,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)
Abstract Metabolicengineeringisanapproachtounderstandingandutilizingmetabolicprocesses,bywhichmetabolicnetworksandgeneregulatorynetworkscanbeoptimizedordirectlymodifiedtoenhancemetabolitesproductionorsynthesizenovelcompounds.Developmentofsystemsbiologyandfunctionalgenomicsinpost2genomiceraprovidessignificantopportunitiestoconstructmicrobialcellfactoriesformetabolicengineering.Therecentdevelopmentofmetabolicengineeringintechnologyandapplicationwasreviewed,basedonwhichseveralkeyissueswereaddressedandfutureperspectiveswerediscussed.Finally,thestrategytodevelopmetabolicengineeringinChinawasproposed.
Keywords metabolicengineering,microorganism,cellfactory,systemsbiology
引 言
微生物是地球上最古老、分布最广的物种之一,其种属多样性和遗传多样性决定了其代谢多样性.与植物和动物的代谢途径相比,微生物所具有的代谢途径虽然相对简单,但可能是最强大、最高效、与人类日常生产生活关系最密切的生物化学途径.除了参与传统的酿酒、制醋、酸乳和发酵食品生产过
程,微生物或其一部分(酶)可以生产包括燃料、医
2004-08-20收到初稿.
联系人:曹竹安.第一作者:李寅,男,30岁,副教授.
基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(No12003CB716007)资助.
药、纤维、塑料在内的几乎所有重要的工业原材料.不仅如此,微生物还能够降解毒害性化合物,修复被石油或辐射污染的场地,恢复生态.如果说工业生物技术是21世纪社会可持续发展的重要技术保障,微生物就是其灵魂所在[1].
为了实现某种工业目的(生产工业原料或降解
有毒物质),从自然界中筛选微生物并通过化学或物理诱变改善其工业性能,是发酵工程的基本思路.传统的育种手段虽然在工业应用上是有效的,但由于
Receiveddate:2004-08-20.
Correspondingauthor:Prof.CAOZhu’an.E-mail:cza2dce@tsinghua1edu1cn
Foundationitem:supportedbytheStateKeyDevelopmentProgramforBasicResearchofChina(No12003CB716007).
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突变的非定向性和设计的非理性,越来越暴露出其
难以认识微生物生理本质的缺陷;而对微生物代谢特性的认识不足,又进一步妨碍了对其代谢能力的改造及工业应用.重组DNA技术的发展提供了定向操纵遗传变化的可能性,代谢工程应运而生.
代谢工程自1991年诞生以来已有10余年历史,其定义已从最初的“采用重组DNA技术,操纵细胞的酶、运输及调节功能,达到提高或改善细胞活
[2]
性的目的”发展到目前的“一种理解并利用代谢
[3]
过程的方法”.具体而言,代谢工程是利用重组DNA技术或其他技术,有目的地改变生物中已有的
于微生物代谢网络的全局调控,不一定能获得预期
的代谢通量增大/降低的效果.功能基因组学和系统生物学的发展,从整体规模上提供了深刻认识微生物代谢特性的工具,毫无疑问为代谢工程的发展创造了前所未有的机遇.
代谢工程诞生以来虽有大量论文发表,但是真正在工业上应用的例子还很少.本文拟在评论代谢工程最新进展的基础上,讨论代谢工程中要解决的关键问题和发展趋势,并提出我国在代谢工程领域应采取的发展策略.
代谢网络和表达调控网络,以更好地理解细胞的代谢途径,并用于化学转化、程.虽然在植物、工程研究,对象.
微生物代谢工程在过去10余年中取得了飞速发展,其主要原因可归于社会需求和技术推动两个方面.
(1)社会可持续发展的需求.石油等不可再生化石资源严重短缺并日渐枯竭的现状,使得可再生的碳水化合物将有可能逐步替代不可再生的碳氢化合物,成为能源和原材料的主要来源.理论上,基于碳水化合物的微生物(酶)反应可以替代所有基于碳氢化合物的化学合成反应.但在实际中,有些基于石油原料的化工过程,还没有找到合适的生物加工过程可以替代;或者生物加工过程的效率还不够高.整个社会经济结构能否成功转向生物经济,取决于对微生物代谢过程的理解、开发和利用是否能达到或者超过化学加工的水平.因此,迫切需要通过微生物代谢工程的研究,推动工业生物技术的发展,进而提高整个社会可持续发展的程度.
(2)基因组科学和相关技术的推动.如果要对一株遗传和生化背景不清楚的微生物进行代谢工程研究,首先要确定其合成某种产物的代谢途径,克隆途径中各个酶的编码基因,然后根据对酶特性的分析,对某个特定的基因进行过量表达/基因敲除.可以想像,在遗传学方面的工作是极其复杂和耗时的.随着微生物基因组测序计划的快速发展,几乎所有重要工业微生物模式种的基因组全序列和相应的代谢途径都已经或即将公布,极大地提高了代谢工程的研究效率.此外,以往有些代谢工程研究中,过量表达或敲除微生物代谢途径中的某一个或几个基因,由
11所示.其中设,遗传修饰是关键,代谢分析则决定是否需要进行新一轮的代谢工程循环.最初的代谢工程设计策略主要针对单基因进行遗传修饰,往往不能显著改变整个代谢途径的通量.这表明由于代谢网络的复杂性,在代谢工程中简单地应用重组DNA技术,难以取得酶工程那样的快速突破.换言之,将细胞中的酶作为蛋白机器,虽然可以实现简单的催化反应,但却难以在复杂的代谢工程中有所作为.微生物代谢工程的目标是将微生物发展成单细胞或多细胞工厂,而工厂的复杂程度显然远远高于单一机器.
为了理解这一复杂体系并能够将其成功用于工业生产,近年来围绕设计策略、遗传修饰和代谢分析方面发展了许多新方法.以下分别简单阐述.
图1 代谢工程循环
111 设计策略
传统的代谢工程是根据已知的遗传学和生化学研究,选择特定的基因(簇)进行过量表达或沉默表达/基因敲除.但是除了大肠杆菌、酿酒酵母等少数几种微生物外,大多数工业微生物的遗传和生化背景都不是非常清楚.基因组学和功能基因组学的发展,推动了一种新的代谢工程设计策略———反向代谢工程(inversemetabolicengineering)[4].反向代谢工程的基本研究思想是:首先,通过对实验室菌株(或野生型)的突变、定向进化和定向筛选,获得预期的表型,并确定其基因型;然后,选择工业菌株并对
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其相应基因进行遗传操作,以期获得同样的表型.
反向代谢工程要回答两个关键问题:(1)如何运用突变或重组技术获得预期的表型?(2)如何快速找到突变表型所对应的基因型?相比较而言,第二个问题更困难一些.因为无论是利用传统诱变、恒化器培养还是利用基因组重排(genomeshuffling),都可以通过定向筛选获得预期的表型.但获得这种表型的突变,可能随机发生在基因组的一个或多个位点,传统手段很难快速找到突变表型所对应的基因型.目前主要有两个新的手段可以快速找到突变表型所对应的基因型.一是利用全基因组测序来发现突变基因.日本学者对两株谷氨酸棒杆菌(一株是生长较差但能高产赖氨酸的突变株,好的野生型),然后,3g・L-1・h-1[4].二是利用DNA芯片对基因组序列已知的微生物进行转录组分
将此线性基因片段转化酵母即可实现插入突变[7].类似策略在大肠杆菌等革兰阴性菌中也有报道.
为了过量表达某个基因(簇),另一个必不可少的工具是强启动子[5].酵解途径中酶的表达通常都是由组成型的强启动子控制的,这些启动子(如编码32磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子)可以上千倍地
提高某一个或一系列酶的活性,因而在代谢工程中具有广泛用途.大肠杆菌的lac启动子经IPTG(异β 丙基硫代22D2半乳糖苷)诱导后,可用于生产异源蛋白.但IPTG价格较贵,(如磷酸),].若要将某种酶,可以使用可控表达的强启动子.应用于乳酸乳球菌的nisA启动子是一个很好的例子:当培养基中nisin(乳酸链球菌素)的加入量为0～10ng・L-1时,相应的基因表达可以在0～100倍之间变化[8].113 代谢分析
析.通过提取微生物的mRNA,反转录为带有红色或绿色荧光标记的cDNA,然后和DNA芯片杂交,不仅可以分析野生型或突变株在不同时空下的基因表达谱,也可以容易地鉴别出野生型和突变株之间基因表达谱的差异,进而能够分析是哪些基因及其表达发生变化带来了表型的变化.112 遗传修饰
代谢分析是决定是否需要进行新一轮代谢工程循环的重要因素.微生物基因组测序计划的发展确定了大多数重要工业微生物的主要代谢途径.但是,微生物胞内的实际代谢通量分布并不清楚.20世纪90年代发展的代谢通量分析(metabolicfluxanalysis,MFA)是获得胞内通量分布的一种简单方
宿主细胞的遗传可操作程度是进行遗传修饰的先决条件.遗传可操作程度主要包括:是否有合适的载体可以转化?转化效率及同源重组的频率是否足够高?载体是否带有强启动子以实现高效表达?等等问题.目前,除了酿酒酵母和大肠杆菌外,其他一
些工业上重要的微生物,如天蓝色链霉菌(抗生素)、产黄青霉(抗生素)、黑曲霉(有机酸)、谷氨酸棒杆菌(氨基酸)和乳酸乳球菌(发酵乳制品),均已开发出
法.其基本原理是假设胞内代谢物浓度都处于拟稳态,根据物质平衡得到一系列关于通量的数学方程,然后通过测定其中一些通量的变化,来获得整个代谢网络的通量分布[5].MFA虽然已在许多微生物中得到验证,但是由于胞内代谢物的实际状态与假设有一定距离,因此有时候准确性不是很高.
为了了解胞内代谢的真实情况,还需要测定胞内代谢物的实际浓度.测定胞内代谢物的实际浓度不仅有助于获取代谢途径中有关酶对底物亲和性的信息,也有助于指导下一轮代谢工程策略的合理设计.利用-80
℃甲醇瞬时停止细胞代谢后,用核磁
共振(NMR)或GC2MS研究13C或31P标记代谢物在胞内的分布,仍是研究胞内代谢物实际浓度的较好方法[9].较NMR而言,GC2MS灵敏度更高、更快速且费用相对更低:样品量只需015～1样品的分析时间5～20
mg;每个
min;每天每台仪器最多可
合适的表达或整合载体[5,6].
质粒介导的单交换或双交换同源重组策略,已经成功地用于多种原核或真核微生物的基因敲除.前者通过在目标基因中插入一个质粒破坏读框;后者则通过在目标基因两侧进行两次重组将其删除或替换为其他基因.新的高效重组技术仍在不断开发.例如,利用PCR(聚合酶链式反应)在选择性标记基因两侧接上与目标基因同源的寡核苷酸片段,然后
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分析300个样品[10].新发展的基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI2TOF2MS)的分析速度和灵敏度更高,完全可以满足高通量代谢组分析的需要.
由于代谢网络的实际执行者是蛋白质组,故而在转录和翻译水平上也可以间接控制代谢通量.因此,在下一轮代谢工程开始之前,除了代谢组和流量组,所有的mRNA(转录组)、所有的蛋白质(蛋白质组)、所有的蛋白质2蛋白质之间以及蛋白质2DNA之间的作用(交互组)也都可以用高通量的分析技术予以研究,并通过生物信息学分析获得改进细胞功能的新知识,用于指导代谢工程设计[9].
进化和途径工程的发展将有助于解决这些问题,推进乙醇代谢工程.
1,32丙二醇(简称1,32PD)是一种重要的溶剂
和化工原料,主要用于生产多醇聚酯(PTT),在纤维和纺织品工业有重要用途.野生型的克氏肺炎杆菌、弗氏柠檬酸菌和丁酸梭状杆菌在厌氧状态下发酵甘油可以产生1,32PD.经过发酵优化,最高产量可以达到60～75
g・L-1,但由于使用了价格相对较贵
的甘油作为底物,仍不足以实现工业化.杰能科和杜邦公司报道,2,1合成途径的两个1,32PD氧化还原酶同时转,以葡萄糖为原料发酵42产量可达到140能.
212 乳酸菌发酵产品
以乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)为模式种的
h,1,32PD
g・L-1[14],使工业化生产成为可
2 代谢工程应用最新进展
分为2类:(良;(2)[2].Nielsen将其分为7类:(1)合成异源代谢产物;(2)扩大底物利用范围;(3)
生产非天然的新物质如新型药物;(4)降解环境有害物质;(5)改善提高微生物的某种性能;(6)阻断或降低副产物的合成;(7)提高代谢产物产率[5].本文简单介绍几种工业中重要的代谢工程.211 重要工业原料
2002年美国燃料乙醇的产量已经超过22亿加
乳酸菌代谢工程是近年来食品生物技术中发展最快的领域之一.这一方面比较有特点的工作包括:
(1)重建丙酮酸节点的代谢网络:正常生长条件下,L1lactis的代谢以同型乳酸发酵为主.若敲除乳酸脱氢酶的编码基因ldh,细胞不能产生乳酸.由于失去了氧化NADH的能力,生长也受到明显抑制.若在ldh-突变株中表达来源于Bacillus
sphaericus的丙氨酸脱氢酶编码基因alaD,并补充
仑.乙醇代谢工程的主要目标是以更快的速度、更高的产量和更低的成本生产乙醇.目前限制乙醇作为燃料使用的主要障碍还是成本问题,故而构建能够利用可再生物质生产乙醇的工程菌是主要努力方向[11].一种思路是利用木质纤维素水解物为原料生产乙醇,但由于木质纤维素水解物是木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖和鼠李糖等的混合物,能够快速产生乙醇的酿酒酵母和运动发酵单胞菌只能利用其中的一部分糖;而能够利用这些糖的大肠杆菌、肺炎杆菌、欧文氏菌、乳杆菌、芽孢杆菌和梭状杆菌又由于伴随混合酸发酵,乙醇产率很低.因此,提高酿酒酵母和运动发酵单胞菌对五碳糖的利用能力[12,13],或者将细菌的混合酸发酵转向乙醇生产[14],都有可能提高乙醇的生产效率.实际研究中,还要考虑底物的运输,底物、产物或副产物对途径中关键酶活性的抑制程度,代谢旁路的竞争以及乙醇向胞外的运输等问题.功能基因组学、分子定向
适量的铵离子,L1lactis可将丙酮酸100%转化为L2丙氨酸[15],后者在食品工业中可用作生产甜味剂
的原料.
(2)辅因子代谢工程:主要目标是利用L1
lactis生产B族维生素(如叶酸).叶酸是人类膳食
的必需成分,每日的摄入量应在200μg,对孕妇尤其重要.L1lactis能够生物合成叶酸,产量大约为100μg・L-1,其中90%为胞内产物,且主要为不易被人吸收的多聚谷氨酰叶酸.在L1lactis中表达来源于人的γ2谷氨酰水解酶的cDNA可提高叶酸的生物可利用性.HPLC分析结果证实,随着γ2谷氨酰水解酶表达量的不断提高,叶酸的多聚谷氨酰链的聚合度明显降低,分泌到胞外的叶酸产量较对照提高6倍[8].这使得人们将来有可能仅通过食用发酵乳
制品就可以满足对叶酸的需求.由于乳酸菌是一类
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非常重要的工业微生物,在食品发酵中应用的历史非常悠久(全世界每年用于奶酪和酸乳发酵工业的乳酸乳球菌细胞有1023之多,相当于50万吨),可以预期,乳酸菌代谢工程的发展将为发酵食品和功能食品工业创造新的发展机遇.213 微生物代谢工程药物
这一问题的根源在于:把微生物视作简单的蛋白机器而不是立体的细胞工厂.工厂中的主要生产线,由于和产品直接相关,最容易受到人们注意.但是生产线是受到生产计划调控的,以免造成过量生产.对于微生物,虽然已经发现了在蛋白水平上的产物反馈抑制或阻遏以及在RNA水平上的转录控制,但从总体上说,目前人们对微生物代谢调控的认识还很有限.因此,未来的代谢工程设计除了重构代谢网络外,还应当在认识微生物代谢调控机理的基础上,,不仅要定,还要定向改,900万欧元、为期五“EngineeringofMicrobialFunctionality”的项目,主要目标是用功能基因组学技术研究突变株的功能变化,对乳酸菌代谢及调控产生新的理解以指导新的代谢工程设计.2004年,为保持荷兰发酵工业在全球的领先地位,荷兰政府投资5000万欧元成立了“KluyverCentreforGenomicsofIndustrialMicroorganisms”,通过功能基因组学的研究指导4
对微生物次级代谢途径进行代谢工程设计可以产生新的药物.这一技术首先在聚酮类和肽类化合物的生物合成研究中取得重要进展[16,17].这类化合物的生物合成存在共同特点,即都通过聚酮体合酶(polyketidesynthase,PKS)或非核糖体肽合酶(non2ribosomalpeptidesynthase)催化形成.这些合同时,、阻断、,,从.此外,参与这类分子生物合成的基因通常是位于一个基因簇上,为基因的克隆和操作提供了方便.这一策略已经在类胡萝卜素和类异戊二烯物质的代谢工程中取得一定成功[16].
除此之外,近年来代谢工程在有机酸(琥珀酸、乳酸)、维生素C、甘油[14]、氨基酸(谷氨酸[18]和赖氨酸[19])和抗生素[20]等重要发酵产品、新药开发[21]以及环境生物技术方面[22]都取得了重要进展,并建立了一些能够预测代谢变化的代谢模型[23].限于篇幅不能一一详细介绍.
种重要的工业微生物:酿酒酵母、黑曲霉、乳酸乳球菌、恶臭假单胞菌的代谢工程设计,并发展新的生物信息学技术构建虚拟细胞,以期能模拟和预测细胞代谢.德国、法国、丹麦等国家也都设立了相似的研究计划.由此分析,功能基因组学技术在未来代谢工程设计中将扮演极其重要的角色.
312 如何在整体规模上获得对微生物新的理解?
3 待解决的关键问题和发展前景
311 如何设计代谢工程?
美国能源部在2002年底启动的“GenomestoLife”计划,旨在从(1)负责细胞大部分生命活动的
代谢工程的设计策略过去是、将来仍然是代谢工程迫切需要解决的问题.对一个基因组序列和生化途径已知的微生物进行代谢工程研究可以降低盲目性,但并不是从途径中任意选择某个基因进行过量表达或基因敲除就能够实现代谢工程的目标.举例来说,提高酵解速度是所有以糖质原料为底物的工业发酵过程共同关心的问题.但是怎样设计代谢工程才能提高酵解速度?酵解是研究最为透彻的生化途径之一,己糖激酶、1,62二磷酸果糖激酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶已被证实是多种微生物酵解途径中的限速酶.即便如此,分别或共同过量表达这3种酶,并不能显著提高酵解速度.
蛋白质及蛋白质机器;(2)控制蛋白质机器的基因调
控网络;(3)自然界中共生的微生物群体这3个水平,解析微生物基因组信息与代谢途径、基因表达、分子机器、代谢网络调控以及细胞及其相互作用之间的关系,以解决人类所面临的能源安全、环境恶化和全球气候变化问题.完成这一计划不仅要用到功能基因组学技术,还需要系统生物学技术的支撑.如果说功能基因组学是研究如何确定基因组中开放阅读框(ORFs)的功能,系统生物学则是通过对系统(如细胞)所有单元(如基因转录、翻译、蛋白与蛋白、
代谢途径、酶与胞内代谢物)之间关系的定量研究来描述细胞的整体功能[24].显然,系统生物学的发展
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将促进人们对微生物生理、代谢和功能的理解,进而推动微生物功能的工业应用.
高通量测序、分析和各种组学技术的发展,必将推动系统生物学的快速发展.目前,一个2～3Mb的细菌基因组如果要达到4～5倍的测序覆盖度,费用不过30万～40万元人民币.随着基因组数据库容的不断增大,比较基因组学将能够快速揭示酶和代谢途径的进化特征.为了研究基因调控网络对代谢途径的控制作用,需要利用DNA芯片进行转录组分析.一张2000个基因的DNA芯片价格已经下降到3000元人民币左右,在不久的将来,DNA微阵列分析将可能成为分子生物学研究中与印迹分析同样普通的技术.在蛋白质水平上,分离全部蛋白质,然后在2MS饰).质之间、之间的相互关系,但现在也已经有相应的技术可以使用.科学家已经利用酵母双杂交系统从酿酒酵母6000个蛋白中发现192种蛋白可能有相互关联[24],这有助于理解代谢途径的调控信号是如何传导的,进而有可能设计出解除某种信号对代谢途径控制的工程策略.此外,DNA的转录(激活或关闭)是由特定的能与DNA结合的转录因子控制的.利用DNA芯片可以研究蛋白质2DNA之间的相关关系,发现新的转录因子[24],从而
高效表达载体、新的选择标记(如在食品中应用)、新的报告基因.表达外源合成途径的基因(簇)时可能还要考虑把该基因(簇)的转录激活元件(或其他功能)一同导入宿主微生物,真正按照人们的设计建造一个细胞工厂.此外,由于外源基因在宿主中的密码子使用偏好性、宿主细胞中的DNA修饰系统都会影响基因表达效率,未来的研究要考虑解决这一问题.
分子定向进化技术在代谢工程中具有重要应用潜力.基因重排(geneshuffling),,如提高稳、.前两个性.但是分子定向进,采用这种方法,有可能将更多的碳流导向感兴趣的分支代谢物,这是代谢工程的目标之一.此外,通过改变代谢途径中特定酶的结构,还有可能生产出结构变化的代谢物质,如将D2氨基酸转变为L2氨基酸[16].这样可以扩大氨基酸生产菌种的选择范围.
微生物代谢途径的控制机理和决定代谢通量的关键因素目前仍不是很清楚.为此需要开发在生理状态下定量分析酶和调控元件活性以及代谢物浓度变化的设备和技术,以及将基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和流量组数据关联起来的计算方法.314 如何更好地将代谢工程与产业化关联起来?
加深对基因表达调控网络的理解.
313 如何改进对宿主微生物的遗传操作和代谢
无论是以生产有用物质还是以降解有害物质为目标的代谢工程,都有着很强的应用导向性.发展代谢工程的战略目标是促进工业生物技术的发展,最终实现人类社会的可持续发展.为了实现这一战略目标,需要通过深入的基础研究来理解微生物的功能和行为,随后将这些理解转化为潜在的或现实的生产力,用于解决制约人类社会可持续发展的资源、能源和环境问题.在代谢工程从实验室走向产业化的过程中,需要考虑的问题是:对底物的利用范围是否足够宽?培养基组成是否足够简单?发酵速度是否足够快?产物浓度是否足够高?与传统发酵工程相比在经济性方面是否有显著提高?等等.研究并解决这些问题有助于推进代谢工程的产业化进程,发展以高产、高效、环境友好为特征的现代工业生物技术产业,并将促进一批包括生物能源、生物材料、生物化工、生物医药及环境生物技术产业在内的新兴产业的发展.
分析?
多种重要工业微生物基因组序列的公布只是为代谢工程研究提供了可能性.要对宿主微生物进行代谢工程设计,宿主必须是遗传可操作的,且有相应的表达或整合载体.乳酸菌代谢工程的成功得益于一个高效的乳链菌肽控制表达系统的开发:荷兰Wageningen食品科学中心有一个小组专门研究乳
酸菌的分子遗传学,开发新的遗传工具;而另一个研究小组则专门利用这些遗传工具在代谢工程中进行遗传修饰.德国国家生物技术中心(GBF)、芬兰国家生物技术中心(VTT)和丹麦技术大学(DTU)也有相应的研究机制,这种模式值得在我国开展代谢工程研究时借鉴.
为了提高对宿主微生物的遗传可操作程度,需要开发新的通用型(能广泛使用于不同宿主细胞)的
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4 我国代谢工程研究的发展战略和对策
411 我国的代谢工程研究目前处于什么水平?
目前我国发酵行业生产企业有5000多家,主要发酵产品的年产值高达1300亿元人民币,在国民经济中已经占有较高的比重,其中抗生素的总产值已占到我国医药行业总产值的18%左右.我国具有国际上发酵工程相关产业中的所有主要产业,就其规模而言,某些产业(如谷氨酸、柠檬酸、维生素C等)在国际上占有举足轻重的位置.但就技术水平而言,与发达国家有较大差距.例如,氨基酸和有机酸发酵的整体水平,国外比我国高30%～50%.由于总体技术水平与国外的差距较大,生产成本明显高于国外,竞争,.,进入中试生产.由于国外在非食品工业用酶领域中80%的产品已经采用基因工程菌生产,随着实验室代谢工程研究的快速突破,未来五年内预期将会有一批产品至少在中试规模用代谢工程菌生产.我国各相关大学、研究所的生物化工、发酵工程、应用微生物学专业的研究人员已经开展了一些代谢工程研究,但由于资金和人员投入不足,总体水平较低,大多数研究仍停留在10年前代谢工程刚发展起来时的单基因操作阶段.因此,如果不加大投入、加快发展,我国在代谢工程方面与国际先进水平的差距将进一步拉大.从另一个角度说,国外这方面的工作启动时间不长,我国在有些方面也有一定积累,如能抓紧安排,赶上国际先进水平是很有希望的.412 我国发展代谢工程的目标是什么?
高点和产业交叉点.
目前,微生物代谢工程已进入一个借助于系统生物学、基因组学和功能基因组学技术平台、系统开展微生物代谢途径和基因表达调控网络研究的新阶段.我国发展微生物代谢工程的目标,将以改造我国传统生物技术产业为技术切入点,解决制约传统产业生产水平低下的关键技术问题,促进传统产业的升级和结构调整;将以系统生物学和功能基因组学为技术依托,选择具有重要工业应用价值的生物能源、生物材料、体,,在发展;将以,开发功能强、农药、辐射污染场地的环保微生物制剂,推动环境生物技术产业的发展,为我国实施可持续发展战略提供重要的技术支撑.413 我国发展代谢工程应采取什么策略?
(1)代谢工程是涉及工业、环境、能源等国民经济各领域的公共基础,对于医药和农业的发展具有长远的意义,需要国家投入;在国家投入的过程中,需协调各部委的经费投入渠道,在国家各级科技项目计划中设立代谢工程专题;加强宏观计划,减少低水平的重复;鼓励企业参与,并与研究单位实现互动;
(2)代谢工程是一个多学科的综合技术,需要多个学科的协同努力,在工作部署和实施措施上需要鼓励和强调学科之间的密切合作,产业、大学和研究院所的协调工作,发挥集成的优势;
(3)制定和完善代谢工程菌(基因工程菌)相关的安全性法规;
(4)充分重视系统生物学研究为发展代谢工程带来的机遇,加强代谢工程领域的基础研究,构筑具有共性的创新技术平台;
(5)重点选择对国民经济有重大影响、对解决三农问题有重大贡献或对缓解环境恶化有重要作用的产品或制剂为研究对象,有所为有所不为.
微生物代谢工程是工业生物技术的核心技术之
一.后基因组时代的代谢工程,是在系统生物学和功能基因组学的强力支撑下,通过对微生物代谢与调控网络的全面理解,将微生物作为细胞工厂生产有用物质或服务于人类社会的重要技术.代谢工程的应用遍及医药、化工、轻工、食品、农业、能源、环保等国民经济诸多领域,是生物技术产业化和规模化发展壮大的基础,关系到一个国家的国计民生和经济竞争力、食品安全以及传统产业升级改造.加强微生物代谢工程的研究与应用,符合我国国民经济发展、生态环境保护、能源战略替代的重大需求,将成为推动新兴生物产业发展和现代工业体系形成的技术制
5 结束语
后基因组时代的代谢工程是一个庞大的系统工程(见图2),需要由系统生物学家领衔,微生物学家、分析化学家、工程师和分子生物学家等多学科背景的人员共同参与,从基础研究和应用开发方面共同努力.生命科学和信息技术的快速发展,正为工业
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11 ZaldivarJ,NielsenJ,OlssonL1FuelEthanolProductionfrom
Lignocellulose:aChallengeforMetabolicEngineeringandProcessIntegration.Appl.Microbiol.Biotechnol1,2001,56:17—3412 JeffriesTW,JinYS1MetabolicEngineeringforImproved
Fermentation
of
Pentoses
by
Yeasts.
Appl.
Microbiol.
Biotechnol1,2004,63:495—509
生物技术学者理解并利用微生物创造着前所未有的
机遇.有理由相信,根据微生物代谢工程技术绘制的细胞工厂的蓝图,人类将创造多样化的细胞工厂,这些微米级的细胞工厂在社会的可持续发展中将扮演极其重要的角色
.
13 Hahn2HagerdalB,WahlbomCF,GardonyiM,vanZylWH,
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第55卷 第10期 化 工 学 报 Vol155 №10 2004年10月 Journal of Chemical Industry and Engineering (China) October 2004
综述与专论
微生物代谢工程:绘制细胞工厂的蓝图
李 寅1 曹竹安2
(1江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214036;2清华大学化学工程系,北京100084)
摘 要 代谢工程是一种理解并利用代谢过程的方法,其目的是优化或改变生物细胞中的代谢网络和表达调控网络,提高其代谢产物的产量或合成新的化合物.后基因组时代系统生物学和功能基因组学技术的发展,为构建能够实现特定目标的微生物细胞工厂提供了空前机遇.本文回顾代谢工程在技术和应用上的最新进展,讨论代谢工程中的关键问题和发展趋势,并提出中国在该领域的发展策略.关键词 代谢工程 微生物 细胞工厂 系统生物学中图分类号 Q93 文献标识码 A 1573-08
MICROBIALMGATEWAYTO
FORCELLFACTORIES
LIYin1andCAOZhu’an2
(1KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi214036,Jiangsu,China;
2
DepartmentofChemicalEngineering,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)
Abstract Metabolicengineeringisanapproachtounderstandingandutilizingmetabolicprocesses,bywhichmetabolicnetworksandgeneregulatorynetworkscanbeoptimizedordirectlymodifiedtoenhancemetabolitesproductionorsynthesizenovelcompounds.Developmentofsystemsbiologyandfunctionalgenomicsinpost2genomiceraprovidessignificantopportunitiestoconstructmicrobialcellfactoriesformetabolicengineering.Therecentdevelopmentofmetabolicengineeringintechnologyandapplicationwasreviewed,basedonwhichseveralkeyissueswereaddressedandfutureperspectiveswerediscussed.Finally,thestrategytodevelopmetabolicengineeringinChinawasproposed.
Keywords metabolicengineering,microorganism,cellfactory,systemsbiology
引 言
微生物是地球上最古老、分布最广的物种之一,其种属多样性和遗传多样性决定了其代谢多样性.与植物和动物的代谢途径相比,微生物所具有的代谢途径虽然相对简单,但可能是最强大、最高效、与人类日常生产生活关系最密切的生物化学途径.除了参与传统的酿酒、制醋、酸乳和发酵食品生产过
程,微生物或其一部分(酶)可以生产包括燃料、医
2004-08-20收到初稿.
联系人:曹竹安.第一作者:李寅,男,30岁,副教授.
基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(No12003CB716007)资助.
药、纤维、塑料在内的几乎所有重要的工业原材料.不仅如此,微生物还能够降解毒害性化合物,修复被石油或辐射污染的场地,恢复生态.如果说工业生物技术是21世纪社会可持续发展的重要技术保障,微生物就是其灵魂所在[1].
为了实现某种工业目的(生产工业原料或降解
有毒物质),从自然界中筛选微生物并通过化学或物理诱变改善其工业性能,是发酵工程的基本思路.传统的育种手段虽然在工业应用上是有效的,但由于
Receiveddate:2004-08-20.
Correspondingauthor:Prof.CAOZhu’an.E-mail:cza2dce@tsinghua1edu1cn
Foundationitem:supportedbytheStateKeyDevelopmentProgramforBasicResearchofChina(No12003CB716007).
・1574・化 工 学 报 2004年10月
突变的非定向性和设计的非理性,越来越暴露出其
难以认识微生物生理本质的缺陷;而对微生物代谢特性的认识不足,又进一步妨碍了对其代谢能力的改造及工业应用.重组DNA技术的发展提供了定向操纵遗传变化的可能性,代谢工程应运而生.
代谢工程自1991年诞生以来已有10余年历史,其定义已从最初的“采用重组DNA技术,操纵细胞的酶、运输及调节功能,达到提高或改善细胞活
[2]
性的目的”发展到目前的“一种理解并利用代谢
[3]
过程的方法”.具体而言,代谢工程是利用重组DNA技术或其他技术,有目的地改变生物中已有的
于微生物代谢网络的全局调控,不一定能获得预期
的代谢通量增大/降低的效果.功能基因组学和系统生物学的发展,从整体规模上提供了深刻认识微生物代谢特性的工具,毫无疑问为代谢工程的发展创造了前所未有的机遇.
代谢工程诞生以来虽有大量论文发表,但是真正在工业上应用的例子还很少.本文拟在评论代谢工程最新进展的基础上,讨论代谢工程中要解决的关键问题和发展趋势,并提出我国在代谢工程领域应采取的发展策略.
代谢网络和表达调控网络,以更好地理解细胞的代谢途径,并用于化学转化、程.虽然在植物、工程研究,对象.
微生物代谢工程在过去10余年中取得了飞速发展,其主要原因可归于社会需求和技术推动两个方面.
(1)社会可持续发展的需求.石油等不可再生化石资源严重短缺并日渐枯竭的现状,使得可再生的碳水化合物将有可能逐步替代不可再生的碳氢化合物,成为能源和原材料的主要来源.理论上,基于碳水化合物的微生物(酶)反应可以替代所有基于碳氢化合物的化学合成反应.但在实际中,有些基于石油原料的化工过程,还没有找到合适的生物加工过程可以替代;或者生物加工过程的效率还不够高.整个社会经济结构能否成功转向生物经济,取决于对微生物代谢过程的理解、开发和利用是否能达到或者超过化学加工的水平.因此,迫切需要通过微生物代谢工程的研究,推动工业生物技术的发展,进而提高整个社会可持续发展的程度.
(2)基因组科学和相关技术的推动.如果要对一株遗传和生化背景不清楚的微生物进行代谢工程研究,首先要确定其合成某种产物的代谢途径,克隆途径中各个酶的编码基因,然后根据对酶特性的分析,对某个特定的基因进行过量表达/基因敲除.可以想像,在遗传学方面的工作是极其复杂和耗时的.随着微生物基因组测序计划的快速发展,几乎所有重要工业微生物模式种的基因组全序列和相应的代谢途径都已经或即将公布,极大地提高了代谢工程的研究效率.此外,以往有些代谢工程研究中,过量表达或敲除微生物代谢途径中的某一个或几个基因,由
11所示.其中设,遗传修饰是关键,代谢分析则决定是否需要进行新一轮的代谢工程循环.最初的代谢工程设计策略主要针对单基因进行遗传修饰,往往不能显著改变整个代谢途径的通量.这表明由于代谢网络的复杂性,在代谢工程中简单地应用重组DNA技术,难以取得酶工程那样的快速突破.换言之,将细胞中的酶作为蛋白机器,虽然可以实现简单的催化反应,但却难以在复杂的代谢工程中有所作为.微生物代谢工程的目标是将微生物发展成单细胞或多细胞工厂,而工厂的复杂程度显然远远高于单一机器.
为了理解这一复杂体系并能够将其成功用于工业生产,近年来围绕设计策略、遗传修饰和代谢分析方面发展了许多新方法.以下分别简单阐述.
图1 代谢工程循环
111 设计策略
传统的代谢工程是根据已知的遗传学和生化学研究,选择特定的基因(簇)进行过量表达或沉默表达/基因敲除.但是除了大肠杆菌、酿酒酵母等少数几种微生物外,大多数工业微生物的遗传和生化背景都不是非常清楚.基因组学和功能基因组学的发展,推动了一种新的代谢工程设计策略———反向代谢工程(inversemetabolicengineering)[4].反向代谢工程的基本研究思想是:首先,通过对实验室菌株(或野生型)的突变、定向进化和定向筛选,获得预期的表型,并确定其基因型;然后,选择工业菌株并对
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其相应基因进行遗传操作,以期获得同样的表型.
反向代谢工程要回答两个关键问题:(1)如何运用突变或重组技术获得预期的表型?(2)如何快速找到突变表型所对应的基因型?相比较而言,第二个问题更困难一些.因为无论是利用传统诱变、恒化器培养还是利用基因组重排(genomeshuffling),都可以通过定向筛选获得预期的表型.但获得这种表型的突变,可能随机发生在基因组的一个或多个位点,传统手段很难快速找到突变表型所对应的基因型.目前主要有两个新的手段可以快速找到突变表型所对应的基因型.一是利用全基因组测序来发现突变基因.日本学者对两株谷氨酸棒杆菌(一株是生长较差但能高产赖氨酸的突变株,好的野生型),然后,3g・L-1・h-1[4].二是利用DNA芯片对基因组序列已知的微生物进行转录组分
将此线性基因片段转化酵母即可实现插入突变[7].类似策略在大肠杆菌等革兰阴性菌中也有报道.
为了过量表达某个基因(簇),另一个必不可少的工具是强启动子[5].酵解途径中酶的表达通常都是由组成型的强启动子控制的,这些启动子(如编码32磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子)可以上千倍地
提高某一个或一系列酶的活性,因而在代谢工程中具有广泛用途.大肠杆菌的lac启动子经IPTG(异β 丙基硫代22D2半乳糖苷)诱导后,可用于生产异源蛋白.但IPTG价格较贵,(如磷酸),].若要将某种酶,可以使用可控表达的强启动子.应用于乳酸乳球菌的nisA启动子是一个很好的例子:当培养基中nisin(乳酸链球菌素)的加入量为0～10ng・L-1时,相应的基因表达可以在0～100倍之间变化[8].113 代谢分析
析.通过提取微生物的mRNA,反转录为带有红色或绿色荧光标记的cDNA,然后和DNA芯片杂交,不仅可以分析野生型或突变株在不同时空下的基因表达谱,也可以容易地鉴别出野生型和突变株之间基因表达谱的差异,进而能够分析是哪些基因及其表达发生变化带来了表型的变化.112 遗传修饰
代谢分析是决定是否需要进行新一轮代谢工程循环的重要因素.微生物基因组测序计划的发展确定了大多数重要工业微生物的主要代谢途径.但是,微生物胞内的实际代谢通量分布并不清楚.20世纪90年代发展的代谢通量分析(metabolicfluxanalysis,MFA)是获得胞内通量分布的一种简单方
宿主细胞的遗传可操作程度是进行遗传修饰的先决条件.遗传可操作程度主要包括:是否有合适的载体可以转化?转化效率及同源重组的频率是否足够高?载体是否带有强启动子以实现高效表达?等等问题.目前,除了酿酒酵母和大肠杆菌外,其他一
些工业上重要的微生物,如天蓝色链霉菌(抗生素)、产黄青霉(抗生素)、黑曲霉(有机酸)、谷氨酸棒杆菌(氨基酸)和乳酸乳球菌(发酵乳制品),均已开发出
法.其基本原理是假设胞内代谢物浓度都处于拟稳态,根据物质平衡得到一系列关于通量的数学方程,然后通过测定其中一些通量的变化,来获得整个代谢网络的通量分布[5].MFA虽然已在许多微生物中得到验证,但是由于胞内代谢物的实际状态与假设有一定距离,因此有时候准确性不是很高.
为了了解胞内代谢的真实情况,还需要测定胞内代谢物的实际浓度.测定胞内代谢物的实际浓度不仅有助于获取代谢途径中有关酶对底物亲和性的信息,也有助于指导下一轮代谢工程策略的合理设计.利用-80
℃甲醇瞬时停止细胞代谢后,用核磁
共振(NMR)或GC2MS研究13C或31P标记代谢物在胞内的分布,仍是研究胞内代谢物实际浓度的较好方法[9].较NMR而言,GC2MS灵敏度更高、更快速且费用相对更低:样品量只需015～1样品的分析时间5～20
mg;每个
min;每天每台仪器最多可
合适的表达或整合载体[5,6].
质粒介导的单交换或双交换同源重组策略,已经成功地用于多种原核或真核微生物的基因敲除.前者通过在目标基因中插入一个质粒破坏读框;后者则通过在目标基因两侧进行两次重组将其删除或替换为其他基因.新的高效重组技术仍在不断开发.例如,利用PCR(聚合酶链式反应)在选择性标记基因两侧接上与目标基因同源的寡核苷酸片段,然后
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分析300个样品[10].新发展的基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI2TOF2MS)的分析速度和灵敏度更高,完全可以满足高通量代谢组分析的需要.
由于代谢网络的实际执行者是蛋白质组,故而在转录和翻译水平上也可以间接控制代谢通量.因此,在下一轮代谢工程开始之前,除了代谢组和流量组,所有的mRNA(转录组)、所有的蛋白质(蛋白质组)、所有的蛋白质2蛋白质之间以及蛋白质2DNA之间的作用(交互组)也都可以用高通量的分析技术予以研究,并通过生物信息学分析获得改进细胞功能的新知识,用于指导代谢工程设计[9].
进化和途径工程的发展将有助于解决这些问题,推进乙醇代谢工程.
1,32丙二醇(简称1,32PD)是一种重要的溶剂
和化工原料,主要用于生产多醇聚酯(PTT),在纤维和纺织品工业有重要用途.野生型的克氏肺炎杆菌、弗氏柠檬酸菌和丁酸梭状杆菌在厌氧状态下发酵甘油可以产生1,32PD.经过发酵优化,最高产量可以达到60～75
g・L-1,但由于使用了价格相对较贵
的甘油作为底物,仍不足以实现工业化.杰能科和杜邦公司报道,2,1合成途径的两个1,32PD氧化还原酶同时转,以葡萄糖为原料发酵42产量可达到140能.
212 乳酸菌发酵产品
以乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)为模式种的
h,1,32PD
g・L-1[14],使工业化生产成为可
2 代谢工程应用最新进展
分为2类:(良;(2)[2].Nielsen将其分为7类:(1)合成异源代谢产物;(2)扩大底物利用范围;(3)
生产非天然的新物质如新型药物;(4)降解环境有害物质;(5)改善提高微生物的某种性能;(6)阻断或降低副产物的合成;(7)提高代谢产物产率[5].本文简单介绍几种工业中重要的代谢工程.211 重要工业原料
2002年美国燃料乙醇的产量已经超过22亿加
乳酸菌代谢工程是近年来食品生物技术中发展最快的领域之一.这一方面比较有特点的工作包括:
(1)重建丙酮酸节点的代谢网络:正常生长条件下,L1lactis的代谢以同型乳酸发酵为主.若敲除乳酸脱氢酶的编码基因ldh,细胞不能产生乳酸.由于失去了氧化NADH的能力,生长也受到明显抑制.若在ldh-突变株中表达来源于Bacillus
sphaericus的丙氨酸脱氢酶编码基因alaD,并补充
仑.乙醇代谢工程的主要目标是以更快的速度、更高的产量和更低的成本生产乙醇.目前限制乙醇作为燃料使用的主要障碍还是成本问题,故而构建能够利用可再生物质生产乙醇的工程菌是主要努力方向[11].一种思路是利用木质纤维素水解物为原料生产乙醇,但由于木质纤维素水解物是木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖和鼠李糖等的混合物,能够快速产生乙醇的酿酒酵母和运动发酵单胞菌只能利用其中的一部分糖;而能够利用这些糖的大肠杆菌、肺炎杆菌、欧文氏菌、乳杆菌、芽孢杆菌和梭状杆菌又由于伴随混合酸发酵,乙醇产率很低.因此,提高酿酒酵母和运动发酵单胞菌对五碳糖的利用能力[12,13],或者将细菌的混合酸发酵转向乙醇生产[14],都有可能提高乙醇的生产效率.实际研究中,还要考虑底物的运输,底物、产物或副产物对途径中关键酶活性的抑制程度,代谢旁路的竞争以及乙醇向胞外的运输等问题.功能基因组学、分子定向
适量的铵离子,L1lactis可将丙酮酸100%转化为L2丙氨酸[15],后者在食品工业中可用作生产甜味剂
的原料.
(2)辅因子代谢工程:主要目标是利用L1
lactis生产B族维生素(如叶酸).叶酸是人类膳食
的必需成分,每日的摄入量应在200μg,对孕妇尤其重要.L1lactis能够生物合成叶酸,产量大约为100μg・L-1,其中90%为胞内产物,且主要为不易被人吸收的多聚谷氨酰叶酸.在L1lactis中表达来源于人的γ2谷氨酰水解酶的cDNA可提高叶酸的生物可利用性.HPLC分析结果证实,随着γ2谷氨酰水解酶表达量的不断提高,叶酸的多聚谷氨酰链的聚合度明显降低,分泌到胞外的叶酸产量较对照提高6倍[8].这使得人们将来有可能仅通过食用发酵乳
制品就可以满足对叶酸的需求.由于乳酸菌是一类
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非常重要的工业微生物,在食品发酵中应用的历史非常悠久(全世界每年用于奶酪和酸乳发酵工业的乳酸乳球菌细胞有1023之多,相当于50万吨),可以预期,乳酸菌代谢工程的发展将为发酵食品和功能食品工业创造新的发展机遇.213 微生物代谢工程药物
这一问题的根源在于:把微生物视作简单的蛋白机器而不是立体的细胞工厂.工厂中的主要生产线,由于和产品直接相关,最容易受到人们注意.但是生产线是受到生产计划调控的,以免造成过量生产.对于微生物,虽然已经发现了在蛋白水平上的产物反馈抑制或阻遏以及在RNA水平上的转录控制,但从总体上说,目前人们对微生物代谢调控的认识还很有限.因此,未来的代谢工程设计除了重构代谢网络外,还应当在认识微生物代谢调控机理的基础上,,不仅要定,还要定向改,900万欧元、为期五“EngineeringofMicrobialFunctionality”的项目,主要目标是用功能基因组学技术研究突变株的功能变化,对乳酸菌代谢及调控产生新的理解以指导新的代谢工程设计.2004年,为保持荷兰发酵工业在全球的领先地位,荷兰政府投资5000万欧元成立了“KluyverCentreforGenomicsofIndustrialMicroorganisms”,通过功能基因组学的研究指导4
对微生物次级代谢途径进行代谢工程设计可以产生新的药物.这一技术首先在聚酮类和肽类化合物的生物合成研究中取得重要进展[16,17].这类化合物的生物合成存在共同特点,即都通过聚酮体合酶(polyketidesynthase,PKS)或非核糖体肽合酶(non2ribosomalpeptidesynthase)催化形成.这些合同时,、阻断、,,从.此外,参与这类分子生物合成的基因通常是位于一个基因簇上,为基因的克隆和操作提供了方便.这一策略已经在类胡萝卜素和类异戊二烯物质的代谢工程中取得一定成功[16].
除此之外,近年来代谢工程在有机酸(琥珀酸、乳酸)、维生素C、甘油[14]、氨基酸(谷氨酸[18]和赖氨酸[19])和抗生素[20]等重要发酵产品、新药开发[21]以及环境生物技术方面[22]都取得了重要进展,并建立了一些能够预测代谢变化的代谢模型[23].限于篇幅不能一一详细介绍.
种重要的工业微生物:酿酒酵母、黑曲霉、乳酸乳球菌、恶臭假单胞菌的代谢工程设计,并发展新的生物信息学技术构建虚拟细胞,以期能模拟和预测细胞代谢.德国、法国、丹麦等国家也都设立了相似的研究计划.由此分析,功能基因组学技术在未来代谢工程设计中将扮演极其重要的角色.
312 如何在整体规模上获得对微生物新的理解?
3 待解决的关键问题和发展前景
311 如何设计代谢工程?
美国能源部在2002年底启动的“GenomestoLife”计划,旨在从(1)负责细胞大部分生命活动的
代谢工程的设计策略过去是、将来仍然是代谢工程迫切需要解决的问题.对一个基因组序列和生化途径已知的微生物进行代谢工程研究可以降低盲目性,但并不是从途径中任意选择某个基因进行过量表达或基因敲除就能够实现代谢工程的目标.举例来说,提高酵解速度是所有以糖质原料为底物的工业发酵过程共同关心的问题.但是怎样设计代谢工程才能提高酵解速度?酵解是研究最为透彻的生化途径之一,己糖激酶、1,62二磷酸果糖激酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶已被证实是多种微生物酵解途径中的限速酶.即便如此,分别或共同过量表达这3种酶,并不能显著提高酵解速度.
蛋白质及蛋白质机器;(2)控制蛋白质机器的基因调
控网络;(3)自然界中共生的微生物群体这3个水平,解析微生物基因组信息与代谢途径、基因表达、分子机器、代谢网络调控以及细胞及其相互作用之间的关系,以解决人类所面临的能源安全、环境恶化和全球气候变化问题.完成这一计划不仅要用到功能基因组学技术,还需要系统生物学技术的支撑.如果说功能基因组学是研究如何确定基因组中开放阅读框(ORFs)的功能,系统生物学则是通过对系统(如细胞)所有单元(如基因转录、翻译、蛋白与蛋白、
代谢途径、酶与胞内代谢物)之间关系的定量研究来描述细胞的整体功能[24].显然,系统生物学的发展
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将促进人们对微生物生理、代谢和功能的理解,进而推动微生物功能的工业应用.
高通量测序、分析和各种组学技术的发展,必将推动系统生物学的快速发展.目前,一个2～3Mb的细菌基因组如果要达到4～5倍的测序覆盖度,费用不过30万～40万元人民币.随着基因组数据库容的不断增大,比较基因组学将能够快速揭示酶和代谢途径的进化特征.为了研究基因调控网络对代谢途径的控制作用,需要利用DNA芯片进行转录组分析.一张2000个基因的DNA芯片价格已经下降到3000元人民币左右,在不久的将来,DNA微阵列分析将可能成为分子生物学研究中与印迹分析同样普通的技术.在蛋白质水平上,分离全部蛋白质,然后在2MS饰).质之间、之间的相互关系,但现在也已经有相应的技术可以使用.科学家已经利用酵母双杂交系统从酿酒酵母6000个蛋白中发现192种蛋白可能有相互关联[24],这有助于理解代谢途径的调控信号是如何传导的,进而有可能设计出解除某种信号对代谢途径控制的工程策略.此外,DNA的转录(激活或关闭)是由特定的能与DNA结合的转录因子控制的.利用DNA芯片可以研究蛋白质2DNA之间的相关关系,发现新的转录因子[24],从而
高效表达载体、新的选择标记(如在食品中应用)、新的报告基因.表达外源合成途径的基因(簇)时可能还要考虑把该基因(簇)的转录激活元件(或其他功能)一同导入宿主微生物,真正按照人们的设计建造一个细胞工厂.此外,由于外源基因在宿主中的密码子使用偏好性、宿主细胞中的DNA修饰系统都会影响基因表达效率,未来的研究要考虑解决这一问题.
分子定向进化技术在代谢工程中具有重要应用潜力.基因重排(geneshuffling),,如提高稳、.前两个性.但是分子定向进,采用这种方法,有可能将更多的碳流导向感兴趣的分支代谢物,这是代谢工程的目标之一.此外,通过改变代谢途径中特定酶的结构,还有可能生产出结构变化的代谢物质,如将D2氨基酸转变为L2氨基酸[16].这样可以扩大氨基酸生产菌种的选择范围.
微生物代谢途径的控制机理和决定代谢通量的关键因素目前仍不是很清楚.为此需要开发在生理状态下定量分析酶和调控元件活性以及代谢物浓度变化的设备和技术,以及将基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和流量组数据关联起来的计算方法.314 如何更好地将代谢工程与产业化关联起来?
加深对基因表达调控网络的理解.
313 如何改进对宿主微生物的遗传操作和代谢
无论是以生产有用物质还是以降解有害物质为目标的代谢工程,都有着很强的应用导向性.发展代谢工程的战略目标是促进工业生物技术的发展,最终实现人类社会的可持续发展.为了实现这一战略目标,需要通过深入的基础研究来理解微生物的功能和行为,随后将这些理解转化为潜在的或现实的生产力,用于解决制约人类社会可持续发展的资源、能源和环境问题.在代谢工程从实验室走向产业化的过程中,需要考虑的问题是:对底物的利用范围是否足够宽?培养基组成是否足够简单?发酵速度是否足够快?产物浓度是否足够高?与传统发酵工程相比在经济性方面是否有显著提高?等等.研究并解决这些问题有助于推进代谢工程的产业化进程,发展以高产、高效、环境友好为特征的现代工业生物技术产业,并将促进一批包括生物能源、生物材料、生物化工、生物医药及环境生物技术产业在内的新兴产业的发展.
分析?
多种重要工业微生物基因组序列的公布只是为代谢工程研究提供了可能性.要对宿主微生物进行代谢工程设计,宿主必须是遗传可操作的,且有相应的表达或整合载体.乳酸菌代谢工程的成功得益于一个高效的乳链菌肽控制表达系统的开发:荷兰Wageningen食品科学中心有一个小组专门研究乳
酸菌的分子遗传学,开发新的遗传工具;而另一个研究小组则专门利用这些遗传工具在代谢工程中进行遗传修饰.德国国家生物技术中心(GBF)、芬兰国家生物技术中心(VTT)和丹麦技术大学(DTU)也有相应的研究机制,这种模式值得在我国开展代谢工程研究时借鉴.
为了提高对宿主微生物的遗传可操作程度,需要开发新的通用型(能广泛使用于不同宿主细胞)的
第55卷第10期 李寅等:微生物代谢工程:绘制细胞工厂的蓝图・1579・
4 我国代谢工程研究的发展战略和对策
411 我国的代谢工程研究目前处于什么水平?
目前我国发酵行业生产企业有5000多家,主要发酵产品的年产值高达1300亿元人民币,在国民经济中已经占有较高的比重,其中抗生素的总产值已占到我国医药行业总产值的18%左右.我国具有国际上发酵工程相关产业中的所有主要产业,就其规模而言,某些产业(如谷氨酸、柠檬酸、维生素C等)在国际上占有举足轻重的位置.但就技术水平而言,与发达国家有较大差距.例如,氨基酸和有机酸发酵的整体水平,国外比我国高30%～50%.由于总体技术水平与国外的差距较大,生产成本明显高于国外,竞争,.,进入中试生产.由于国外在非食品工业用酶领域中80%的产品已经采用基因工程菌生产,随着实验室代谢工程研究的快速突破,未来五年内预期将会有一批产品至少在中试规模用代谢工程菌生产.我国各相关大学、研究所的生物化工、发酵工程、应用微生物学专业的研究人员已经开展了一些代谢工程研究,但由于资金和人员投入不足,总体水平较低,大多数研究仍停留在10年前代谢工程刚发展起来时的单基因操作阶段.因此,如果不加大投入、加快发展,我国在代谢工程方面与国际先进水平的差距将进一步拉大.从另一个角度说,国外这方面的工作启动时间不长,我国在有些方面也有一定积累,如能抓紧安排,赶上国际先进水平是很有希望的.412 我国发展代谢工程的目标是什么?
高点和产业交叉点.
目前,微生物代谢工程已进入一个借助于系统生物学、基因组学和功能基因组学技术平台、系统开展微生物代谢途径和基因表达调控网络研究的新阶段.我国发展微生物代谢工程的目标,将以改造我国传统生物技术产业为技术切入点,解决制约传统产业生产水平低下的关键技术问题,促进传统产业的升级和结构调整;将以系统生物学和功能基因组学为技术依托,选择具有重要工业应用价值的生物能源、生物材料、体,,在发展;将以,开发功能强、农药、辐射污染场地的环保微生物制剂,推动环境生物技术产业的发展,为我国实施可持续发展战略提供重要的技术支撑.413 我国发展代谢工程应采取什么策略?
(1)代谢工程是涉及工业、环境、能源等国民经济各领域的公共基础,对于医药和农业的发展具有长远的意义,需要国家投入;在国家投入的过程中,需协调各部委的经费投入渠道,在国家各级科技项目计划中设立代谢工程专题;加强宏观计划,减少低水平的重复;鼓励企业参与,并与研究单位实现互动;
(2)代谢工程是一个多学科的综合技术,需要多个学科的协同努力,在工作部署和实施措施上需要鼓励和强调学科之间的密切合作,产业、大学和研究院所的协调工作,发挥集成的优势;
(3)制定和完善代谢工程菌(基因工程菌)相关的安全性法规;
(4)充分重视系统生物学研究为发展代谢工程带来的机遇,加强代谢工程领域的基础研究,构筑具有共性的创新技术平台;
(5)重点选择对国民经济有重大影响、对解决三农问题有重大贡献或对缓解环境恶化有重要作用的产品或制剂为研究对象,有所为有所不为.
微生物代谢工程是工业生物技术的核心技术之
一.后基因组时代的代谢工程,是在系统生物学和功能基因组学的强力支撑下,通过对微生物代谢与调控网络的全面理解,将微生物作为细胞工厂生产有用物质或服务于人类社会的重要技术.代谢工程的应用遍及医药、化工、轻工、食品、农业、能源、环保等国民经济诸多领域,是生物技术产业化和规模化发展壮大的基础,关系到一个国家的国计民生和经济竞争力、食品安全以及传统产业升级改造.加强微生物代谢工程的研究与应用,符合我国国民经济发展、生态环境保护、能源战略替代的重大需求,将成为推动新兴生物产业发展和现代工业体系形成的技术制
5 结束语
后基因组时代的代谢工程是一个庞大的系统工程(见图2),需要由系统生物学家领衔,微生物学家、分析化学家、工程师和分子生物学家等多学科背景的人员共同参与,从基础研究和应用开发方面共同努力.生命科学和信息技术的快速发展,正为工业
・1580・化 工 学 报 2004年10月
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生物技术学者理解并利用微生物创造着前所未有的
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