第40卷第11期2009年11月
东北农业大学学报40(11):11~13
Nov. 2009
Journal of Northeast Agricultural University
不同地区大豆根瘤菌培养条件的优化
李郑军，许修宏*
（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨
150030）
摘要：土壤环境是影响根瘤菌结瘤固氮的首要因素，其类型、pH 以及其他理化性质都能影响根瘤菌的接
种效果。因此有必要对不同地区大豆根瘤菌的培养条件进行优化，使大豆接种根瘤菌，能够在植物根部产生大量有效根瘤，达到增产目的。研究通过单因素试验分析得到海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化的大豆根瘤菌的最佳培养条件。培养时间分别为48、48、48、96和48h ；pH 分别为6.0、7.5、6.5、8.0、6.5；转速分别为180、180、160、180、180r ·min -1；培养温度均为28℃。
关键词：大豆根瘤菌；培养时间；pH ；转速；温度中图分类号：S144.3
文献标识码：A
文章编号：1005-9369（2009）11－0011－03
Optimization on culture conditions of Rhizobia in different areas/LI Zheng-jun, XU Xiuhong (Collegeof Resources and Environmental Sciences , Northeast Agricultural Uni-versity, Harbin 150030, China )
Abstract:Environment of soil is the primary factor affected nodulation of Rhizobia , and its type, pH
as well as other physical and chemical properties can influence the effect of Rhizobia inoculation. Therefore, it is necessary for Rhizobia from different regions to optimize culture conditions in order to ensure that the inoculation of Rhizobia can produce a large number of effective nodules, reach high production purposes. Rhizobia from Hailun, Suiling, Beian, Hulan and Suihua were investigated for obtaining the optimal culture conditions by single factor. The results showed that the optimal culture conditions were as below:culture time was, 48, 48, 48, 96and 48h, respectively; initial pH was 6.0, 7.5, 6.5, 8.0, 6.5, respectively; rotate speed was 180,180, 160, 180, 180r ·min -1, respectively; culture temperature of all the Rhizobia was 28℃.
Key words:Rhizobia ; culture time; pH; rotate speed; temperature 生物固氮在提高土壤肥力、改变土壤的物理性状和生物学性状方面具有比较明显的效果[1]，不仅具有良好的经济效益和社会效益，而且还能在可持续农业中维持良好的生态环境，具有明显的生态效益[2]。可以说豆科固氮的意义不仅能够为作物提供营养元素，而且在改善作物生态环境方面为土壤微生物研究者提供了新的视角[3]。应用大豆根瘤菌接种技术，使植物根部产生大量有效根瘤，不但能够提高籽粒中蛋白质
收稿日期：2009-03-20
基金项目：中国科学院知识创新工程重大项目（KSCX1-YW-09-09-03）；黑龙江省科技计划项目（KT05A400-1）；哈尔滨市科技攻关计划项目（2007AA6CN105）；东北农业大学创新团队发展计划项目（CXT003-2-1）
作者简介：李郑军（1983-），女，硕士研究生，研究方向为微生物学。
*通讯作者：许修宏，教授，博士生导师，研究方向为食用菌、微生物肥料、微生物除草剂。E-mail:[email protected]
的含量，且增产效果在10％以上[4]。然而土壤环境是影响根瘤菌结瘤固氮的首要因素，其类型、pH 以及其他理化性质都能影响根瘤菌的接种效果。针对不同土壤的理化特性筛选出抗逆性强的优良根瘤菌菌株作为接种剂是仍需研究的一个问题[5]。因此有必要对不同地区大豆根瘤菌的培养条件进行优化，针对不同地区的土壤和大豆品种选择最适宜的根瘤菌作为接种剂，才能获得最佳的增产效果[6]。
·12·东北农业大学学报第40卷
1
1.1
材料与方法
菌种
本实验室分离纯化得到的海伦、绥棱、北安、
种到新鲜培养基中后，为了适应新的环境，菌株自身进行代谢的适应性调整；24~48h 内除呼兰地区的大豆根瘤菌外其余均处于对数生长期，而呼兰地区的大豆根瘤菌在24~96h 内处于对数生长期。这是由于细胞的代谢活性急剧增强，生成大量组成新细胞的物质，因而菌株的繁殖速度加快；随后则出现较明显的差异性，海伦地区的大豆根瘤菌在48~96h 内处于稳定期；绥棱地区的大豆根瘤菌在48~120h 内处于稳定期；北安和绥化地区的大豆根瘤菌在48~144h 内处于稳定期；呼兰地区的大豆根瘤菌在96~144h 内处于稳定期；在此之后，不同地区的大豆根瘤菌均处于衰亡期，菌体开始自溶。可能是由于液体培养基中的某些变化引起的，比如液体培养基中营养物质的减少、甚至是有害代谢产物的积累等。因此确定海伦、绥棱、北安、呼兰、绥化的最佳培养时间分别为48、48、48、96和48h 。
O D 值V a l u e s o f o p t i c a l d e n s i t y
2.52.01.51.00.5
0◆
▲×
■
呼兰和绥化地区的大豆根瘤菌。1.2
培养基
除有特殊说明之外，以下培养基、试剂和营养液在配制时均用蒸馏水定容至1000mL ，121℃灭（W/V）琼菌30min ，若是固体培养基则再加入2%脂粉。
斜面固体培养基：甘露醇10.0g ，酵母膏3.0g ，Na 2SO 40.2g ，K 2HPO 40.5g ，NaCl 0.1g ，CaCl ·26H 2O 0.1g ，1%干果红。种子液体、发酵液体培养基：甘露醇10.0g ，酵母膏3.0g ，Na 2SO 40.2g ，K 2HPO 40.5g ，NaCl 0.1g ，CaCl 2·6H 2O 0.1g 。1.31.3.1
方法培养方法
菌种活化：取1环菌种接入斜面培养基，28℃培养48~72h ，用作活化菌种。
种子培养：取1环斜面菌体接种于种子培养基），28℃、180r ·min -1（250mL 三角瓶装液量为40mL 恒温振荡培养24~48h 。
发酵培养：按2%的接种量吸取种子培养基接种于发酵培养基（250mL 三角瓶装液量为40mL ）恒温振荡培养。1.3.2
大豆根瘤菌培养条件的优化
取分离纯化后的大豆根瘤菌菌株，对培养时间、pH 、转速和培养温度进行单因素条件优化。培养时间分别选取：24、48、72、96、120、144、168、192h ；pH 分别选取：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；转速分别选取：140、160、180、200、220r ·min -1；培养温度分别选取：22、25、28、31、34℃。将不同培养条件下的大豆根瘤菌培养液在紫外分光光度计上测定OD 600值，确定不同地区大豆根瘤菌的最佳培养条件。
◆
▲
■
▲*
■×
×*
×*
×海伦H ailun
绥棱Suiling
北安Bei ′an ×呼兰Hulan ■绥化Suihua
[***********]192
培养时间（h ）
Culture time
图1培养时间对大豆根瘤菌生长的影响Fig. 1
Effect of cultural time on Rhizobia growth
2.2pH 值对大豆根瘤菌生长的影响
海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根
瘤菌分别在最佳培养时间，培养温度28℃，转速180r ·min -1时，pH 值对其生长的影响见图2。
O D 值
V a l u e s o f o p t i c a l d e n s i t y
2.051.881.55
■
◆■
◆
■
◆
■
◆
■
■
1.301.05×
0.80
6.0
×
*▲▲*
▲*×
2结果与分析
2.1
培养时间对大豆根瘤菌生长的影响
·min -1当pH 7.0、培养温度28℃，转速180r 时，培养时间对不同地区大豆根瘤菌生长的影响见图1。在0~24h 内，不同地区的大豆根瘤菌均处于延滞期，生长较为缓慢。此时大豆根瘤菌接
×
海伦H ailun
绥棱Suiling ▲北安Beian 呼兰Hulan 绥化Suihua
6.57.0pH
7.58.0
图2pH 对大豆根瘤菌生长的影响Fig. 2Effect of pH on Rhizobia growth
海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根瘤菌最适pH 分别为6.0、7.5、6.5、8.0、6.5。其
第11期李郑军等：不同地区大豆根瘤菌培养条件的优化·13·
对pH 的适应能力表现出不同的趋势。海伦地区的大豆根瘤菌对pH 值的变化趋势不大；而绥棱地区和呼兰地区的大豆根瘤菌对弱碱性的适应能力较强；北安和绥化地区的大豆根瘤菌在pH 6.0~7.5的变化趋势大体一致，而在pH 7.5~8.0的变化趋势却不同，北安地区的大豆根瘤菌OD 值随着pH 值的增加而上升，而绥化地区的大豆根瘤菌OD 值则随着pH 值的减少而下降。培养基的初始pH 值是影响微生物生长的主要因素，太高或太低均不利于菌体生长。这是由于一方面不适合的pH 值会引起微生物表面电荷的改变，从而不利于细胞对营养物质的吸收；另一方面pH 的改变会让有机化合物离子化，不利于有机化合物渗入细胞，继而影响微生物细胞的运输机制，促进或妨碍一些营养物质的吸收。2.3
转速对大豆根瘤菌生长的影响
海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根瘤菌分别在最佳培养时间，最佳pH 值，培养温度28℃时，转速对其生长的影响见图3。
O D 值V a l u e s o f o p t i c a l d e n s i t y
2.52.01.5*1.00.50140
160
180
200
220
■
豆根瘤菌分别在最佳培养时间，最佳pH 值，最佳转速条件下，培养温度对其生长的影响结果见图4。
O D 值V a l u e s o f o p t i c a l d e n s i t y
2.52.01.5
◆▲
◆▲×■
◆▲
▲◆
*
1.0*
×*
■
0.5022
25
28
31
海伦H ailun
绥棱Suiling ◆▲
北安Bei ′an 呼兰Hulan ■×*
*绥化Suihua
34
培养温度（℃）Temperature
图4Fig. 4
培养温度对大豆根瘤菌生长的影响
Effect of temperature on Rhizobia growth
由图4可知，不同地区的大豆根瘤菌对温度表现出相同的变化趋势，最适温度为28℃。在22~28℃，其OD 值随着温度的升高而升高，但在28~34℃时，其OD 值随着温度的升高而下降。
3结
▲◆*■×
◆
×
▲◆
*
■
论
◆▲■*×
×
海伦H ailun 绥棱Suiling 北安Bei ′an 呼兰Hulan 绥化Suihua
采用单因素试验得到海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化的大豆根瘤菌生长的最适培养条件。培养时间分别为48、48、48、96和48h ；pH 分别为6.0、7.5、6.5、8.0、6.5；转速分别为180、180、160、180和180r ·min -1；培养温度均为28℃。
[
参考文
献
]
转速（r ·min -1）
Rotate speed
图3转速对大豆根瘤菌生长的影响Fig. 3Effect of rotate speed on Rhizobia growth
[1]
张学江. 广谱、高效的大豆根瘤菌[M]．武汉:武汉作物油料科研所出版, 1979:60-62.
由图3可知，海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根瘤菌最适转速分别为180、180、160、180和180r ·min -1。除北安地区的大豆根瘤菌外，其他地区的转速对其生长影响的变化趋势大体一致，OD 值随着转速的增加而增加，在180r ·min -1达到最大值，随后随着转速的增加，OD 值有所下降。而北安地区在160r ·min -1时达到最大值。摇床转速的快慢控制了通入培养基中的通气量，适量通气有利于微生物的生长，但通气量不应太大或太小，否则都会对其产生影响。2.4
培养温度对大豆根瘤菌生长的影响
海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大
[6][5]
[2]曾昭海, 隋新华, 胡跃高, 等. 紫花苜蓿-根瘤菌高效共生体筛选
及田间作用效果[J].草业学报, 2004, 13(5):95-100.
[3]朱奇, 陈彦. 生物固氮在我国农业生产中的研究现状及发展
对策[J].微生物学杂志, 2003, 23(5):40-43.
[4]李奇真, 孙克用, 卢增辉, 等. 夏大豆施肥生理基础及高产栽培
技术研究[J].中国农业科学, 1989, 22(4):41-48.
戴小密, 刘彦杰, 叶小梅, 等. 接种大豆根瘤菌（Sinorhizobium fredii ）遗传工程菌株LMG101对大豆的增产效应[J].中国农业科学, 2003, 36(1):66-70.
窦新田, 李晓明, 林海, 等. 大豆根瘤菌不同菌系与大豆品种和土壤类型的适应性[J].黑龙江省农业科学, 1986(1):27-31.
第40卷第11期2009年11月
东北农业大学学报40(11):11~13
Nov. 2009
Journal of Northeast Agricultural University
不同地区大豆根瘤菌培养条件的优化
李郑军，许修宏*
（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨
150030）
摘要：土壤环境是影响根瘤菌结瘤固氮的首要因素，其类型、pH 以及其他理化性质都能影响根瘤菌的接
种效果。因此有必要对不同地区大豆根瘤菌的培养条件进行优化，使大豆接种根瘤菌，能够在植物根部产生大量有效根瘤，达到增产目的。研究通过单因素试验分析得到海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化的大豆根瘤菌的最佳培养条件。培养时间分别为48、48、48、96和48h ；pH 分别为6.0、7.5、6.5、8.0、6.5；转速分别为180、180、160、180、180r ·min -1；培养温度均为28℃。
关键词：大豆根瘤菌；培养时间；pH ；转速；温度中图分类号：S144.3
文献标识码：A
文章编号：1005-9369（2009）11－0011－03
Optimization on culture conditions of Rhizobia in different areas/LI Zheng-jun, XU Xiuhong (Collegeof Resources and Environmental Sciences , Northeast Agricultural Uni-versity, Harbin 150030, China )
Abstract:Environment of soil is the primary factor affected nodulation of Rhizobia , and its type, pH
as well as other physical and chemical properties can influence the effect of Rhizobia inoculation. Therefore, it is necessary for Rhizobia from different regions to optimize culture conditions in order to ensure that the inoculation of Rhizobia can produce a large number of effective nodules, reach high production purposes. Rhizobia from Hailun, Suiling, Beian, Hulan and Suihua were investigated for obtaining the optimal culture conditions by single factor. The results showed that the optimal culture conditions were as below:culture time was, 48, 48, 48, 96and 48h, respectively; initial pH was 6.0, 7.5, 6.5, 8.0, 6.5, respectively; rotate speed was 180,180, 160, 180, 180r ·min -1, respectively; culture temperature of all the Rhizobia was 28℃.
Key words:Rhizobia ; culture time; pH; rotate speed; temperature 生物固氮在提高土壤肥力、改变土壤的物理性状和生物学性状方面具有比较明显的效果[1]，不仅具有良好的经济效益和社会效益，而且还能在可持续农业中维持良好的生态环境，具有明显的生态效益[2]。可以说豆科固氮的意义不仅能够为作物提供营养元素，而且在改善作物生态环境方面为土壤微生物研究者提供了新的视角[3]。应用大豆根瘤菌接种技术，使植物根部产生大量有效根瘤，不但能够提高籽粒中蛋白质
收稿日期：2009-03-20
基金项目：中国科学院知识创新工程重大项目（KSCX1-YW-09-09-03）；黑龙江省科技计划项目（KT05A400-1）；哈尔滨市科技攻关计划项目（2007AA6CN105）；东北农业大学创新团队发展计划项目（CXT003-2-1）
作者简介：李郑军（1983-），女，硕士研究生，研究方向为微生物学。
*通讯作者：许修宏，教授，博士生导师，研究方向为食用菌、微生物肥料、微生物除草剂。E-mail:[email protected]
的含量，且增产效果在10％以上[4]。然而土壤环境是影响根瘤菌结瘤固氮的首要因素，其类型、pH 以及其他理化性质都能影响根瘤菌的接种效果。针对不同土壤的理化特性筛选出抗逆性强的优良根瘤菌菌株作为接种剂是仍需研究的一个问题[5]。因此有必要对不同地区大豆根瘤菌的培养条件进行优化，针对不同地区的土壤和大豆品种选择最适宜的根瘤菌作为接种剂，才能获得最佳的增产效果[6]。
·12·东北农业大学学报第40卷
1
1.1
材料与方法
菌种
本实验室分离纯化得到的海伦、绥棱、北安、
种到新鲜培养基中后，为了适应新的环境，菌株自身进行代谢的适应性调整；24~48h 内除呼兰地区的大豆根瘤菌外其余均处于对数生长期，而呼兰地区的大豆根瘤菌在24~96h 内处于对数生长期。这是由于细胞的代谢活性急剧增强，生成大量组成新细胞的物质，因而菌株的繁殖速度加快；随后则出现较明显的差异性，海伦地区的大豆根瘤菌在48~96h 内处于稳定期；绥棱地区的大豆根瘤菌在48~120h 内处于稳定期；北安和绥化地区的大豆根瘤菌在48~144h 内处于稳定期；呼兰地区的大豆根瘤菌在96~144h 内处于稳定期；在此之后，不同地区的大豆根瘤菌均处于衰亡期，菌体开始自溶。可能是由于液体培养基中的某些变化引起的，比如液体培养基中营养物质的减少、甚至是有害代谢产物的积累等。因此确定海伦、绥棱、北安、呼兰、绥化的最佳培养时间分别为48、48、48、96和48h 。
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■
呼兰和绥化地区的大豆根瘤菌。1.2
培养基
除有特殊说明之外，以下培养基、试剂和营养液在配制时均用蒸馏水定容至1000mL ，121℃灭（W/V）琼菌30min ，若是固体培养基则再加入2%脂粉。
斜面固体培养基：甘露醇10.0g ，酵母膏3.0g ，Na 2SO 40.2g ，K 2HPO 40.5g ，NaCl 0.1g ，CaCl ·26H 2O 0.1g ，1%干果红。种子液体、发酵液体培养基：甘露醇10.0g ，酵母膏3.0g ，Na 2SO 40.2g ，K 2HPO 40.5g ，NaCl 0.1g ，CaCl 2·6H 2O 0.1g 。1.31.3.1
方法培养方法
菌种活化：取1环菌种接入斜面培养基，28℃培养48~72h ，用作活化菌种。
种子培养：取1环斜面菌体接种于种子培养基），28℃、180r ·min -1（250mL 三角瓶装液量为40mL 恒温振荡培养24~48h 。
发酵培养：按2%的接种量吸取种子培养基接种于发酵培养基（250mL 三角瓶装液量为40mL ）恒温振荡培养。1.3.2
大豆根瘤菌培养条件的优化
取分离纯化后的大豆根瘤菌菌株，对培养时间、pH 、转速和培养温度进行单因素条件优化。培养时间分别选取：24、48、72、96、120、144、168、192h ；pH 分别选取：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；转速分别选取：140、160、180、200、220r ·min -1；培养温度分别选取：22、25、28、31、34℃。将不同培养条件下的大豆根瘤菌培养液在紫外分光光度计上测定OD 600值，确定不同地区大豆根瘤菌的最佳培养条件。
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×海伦H ailun
绥棱Suiling
北安Bei ′an ×呼兰Hulan ■绥化Suihua
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培养时间（h ）
Culture time
图1培养时间对大豆根瘤菌生长的影响Fig. 1
Effect of cultural time on Rhizobia growth
2.2pH 值对大豆根瘤菌生长的影响
海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根
瘤菌分别在最佳培养时间，培养温度28℃，转速180r ·min -1时，pH 值对其生长的影响见图2。
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2结果与分析
2.1
培养时间对大豆根瘤菌生长的影响
·min -1当pH 7.0、培养温度28℃，转速180r 时，培养时间对不同地区大豆根瘤菌生长的影响见图1。在0~24h 内，不同地区的大豆根瘤菌均处于延滞期，生长较为缓慢。此时大豆根瘤菌接
×
海伦H ailun
绥棱Suiling ▲北安Beian 呼兰Hulan 绥化Suihua
6.57.0pH
7.58.0
图2pH 对大豆根瘤菌生长的影响Fig. 2Effect of pH on Rhizobia growth
海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根瘤菌最适pH 分别为6.0、7.5、6.5、8.0、6.5。其
第11期李郑军等：不同地区大豆根瘤菌培养条件的优化·13·
对pH 的适应能力表现出不同的趋势。海伦地区的大豆根瘤菌对pH 值的变化趋势不大；而绥棱地区和呼兰地区的大豆根瘤菌对弱碱性的适应能力较强；北安和绥化地区的大豆根瘤菌在pH 6.0~7.5的变化趋势大体一致，而在pH 7.5~8.0的变化趋势却不同，北安地区的大豆根瘤菌OD 值随着pH 值的增加而上升，而绥化地区的大豆根瘤菌OD 值则随着pH 值的减少而下降。培养基的初始pH 值是影响微生物生长的主要因素，太高或太低均不利于菌体生长。这是由于一方面不适合的pH 值会引起微生物表面电荷的改变，从而不利于细胞对营养物质的吸收；另一方面pH 的改变会让有机化合物离子化，不利于有机化合物渗入细胞，继而影响微生物细胞的运输机制，促进或妨碍一些营养物质的吸收。2.3
转速对大豆根瘤菌生长的影响
海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根瘤菌分别在最佳培养时间，最佳pH 值，培养温度28℃时，转速对其生长的影响见图3。
O D 值V a l u e s o f o p t i c a l d e n s i t y
2.52.01.5*1.00.50140
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豆根瘤菌分别在最佳培养时间，最佳pH 值，最佳转速条件下，培养温度对其生长的影响结果见图4。
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海伦H ailun
绥棱Suiling ◆▲
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34
培养温度（℃）Temperature
图4Fig. 4
培养温度对大豆根瘤菌生长的影响
Effect of temperature on Rhizobia growth
由图4可知，不同地区的大豆根瘤菌对温度表现出相同的变化趋势，最适温度为28℃。在22~28℃，其OD 值随着温度的升高而升高，但在28~34℃时，其OD 值随着温度的升高而下降。
3结
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论
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海伦H ailun 绥棱Suiling 北安Bei ′an 呼兰Hulan 绥化Suihua
采用单因素试验得到海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化的大豆根瘤菌生长的最适培养条件。培养时间分别为48、48、48、96和48h ；pH 分别为6.0、7.5、6.5、8.0、6.5；转速分别为180、180、160、180和180r ·min -1；培养温度均为28℃。
[
参考文
献
]
转速（r ·min -1）
Rotate speed
图3转速对大豆根瘤菌生长的影响Fig. 3Effect of rotate speed on Rhizobia growth
[1]
张学江. 广谱、高效的大豆根瘤菌[M]．武汉:武汉作物油料科研所出版, 1979:60-62.
由图3可知，海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大豆根瘤菌最适转速分别为180、180、160、180和180r ·min -1。除北安地区的大豆根瘤菌外，其他地区的转速对其生长影响的变化趋势大体一致，OD 值随着转速的增加而增加，在180r ·min -1达到最大值，随后随着转速的增加，OD 值有所下降。而北安地区在160r ·min -1时达到最大值。摇床转速的快慢控制了通入培养基中的通气量，适量通气有利于微生物的生长，但通气量不应太大或太小，否则都会对其产生影响。2.4
培养温度对大豆根瘤菌生长的影响
海伦、绥棱、北安、呼兰和绥化地区的大
[6][5]
[2]曾昭海, 隋新华, 胡跃高, 等. 紫花苜蓿-根瘤菌高效共生体筛选
及田间作用效果[J].草业学报, 2004, 13(5):95-100.
[3]朱奇, 陈彦. 生物固氮在我国农业生产中的研究现状及发展
对策[J].微生物学杂志, 2003, 23(5):40-43.
[4]李奇真, 孙克用, 卢增辉, 等. 夏大豆施肥生理基础及高产栽培
技术研究[J].中国农业科学, 1989, 22(4):41-48.
戴小密, 刘彦杰, 叶小梅, 等. 接种大豆根瘤菌（Sinorhizobium fredii ）遗传工程菌株LMG101对大豆的增产效应[J].中国农业科学, 2003, 36(1):66-70.
窦新田, 李晓明, 林海, 等. 大豆根瘤菌不同菌系与大豆品种和土壤类型的适应性[J].黑龙江省农业科学, 1986(1):27-31.