选择性五羟色胺在摄取抑制剂（SSRI）氟西汀的情况下是否
影响贝紫贻贝？
Maria Gonzalez-Rey, Maria João Bebianno*
CIMA，阿尔加维，法鲁， Gambelas大学理学院和技术学院，8000-135 Faro，葡萄牙
文章历史：写作于2012年5月23日，修改至2012年8月30日，发布于2012年10月10日
关键词：紫贻贝，氟西汀，抗氧化酶，神经毒性作用，内分泌干扰
摘要：氟西汀（FLX）在活性药物成分的作用下，与水生环境息息相关，在污水处理厂系统中，处方精神科药物被广泛使用，且去除率较差。API充当选择性血清素再吸收抑制剂（SSRI），经常被报道引起了非目标物种的破坏。这项研究的目标包括两周内暴露于75ng于贻贝紫贻贝多的生物标志物的反应评价中。以1 FLX评估抗氧化酶活性Ë超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST） ;过氧化脂质（LPO），通过不稳定磷酸盐（ALP）的卵黄蛋白原样蛋白间接测量乙酰胆碱酯酶（AChE）神经毒性反应和内分泌紊乱的过程。结果表明组织特异性酶促反应
和损害主要影响河蚌鳃。然而，在整个时间在两个性别分化的性腺明确ALP水平的抑制使证据FLX增强行动的内分泌干扰物，而不是氧化或神经诱导
1.简介。
关联到水生生态系统的活性药物成分（API）在生态毒性发生的风险中无处不在。随着检测技术的进步，正在对水生环境中检测到一个更大的API（参见评论：卡利斯托和埃斯特维斯，2009;Kümmerer，2009; Li和Randak，2009;阿隆索等人，2010年;帕尔等人，2010年; Kümmerer，2010; Santos等，2010; Brausch和Rand，2011）。污水处理厂仍然装备不良的api，其排负荷去除率差，因此这些生物活性物质最终会通过家庭和医院污水处理进入地表水（河流，河口和湖泊），并从那里回收到饮用水（恩斯，2001;恩斯等人，2002年;的Stackelberg等人，2004; Jones等人，2007; Kim等人，2007; Daughton，2010）构成对非目标水生生物的影响（2001年潜在的风险;布鲁克斯等人，2005年; FENT等，2006）。
氟西汀出现在抗抑郁药氟苯氧丙胺中被广泛使用（如西酞普兰，氟伏沙明，帕罗西汀，舍曲林和）通过增加血清素作为选择性血清素再摄取抑制剂（SSRI）在治疗抑郁症和其他情绪障碍（5-羟色胺ê5-HT）等方面的手段，提高神经元突触间隙的水平（Brosen，1993;德风向标，1999; Hiemke和Härtter，2000; FENT等，2006）虽然，FLX作为尿液的不变母体化合物百分之30排出体外，或代谢为去甲氟西汀（德风向标，1999; Hiemke和Härtter，2000;芳和莫尔纳，2008年）是有弹性的水解，光解和微生物降解过程（权和安布拉斯特，2006年）发生在1毫克的水生环境中（表1）。自从SSRIs改变神经递质5HT调节之后，关联到了脊椎动物和无脊椎动物（2001激素和神经机制重要功能调制; FENT等人，2006; Stanley等，2007。画家等，2009;Styrishaveet等人，对FLX曝光生态毒理学效应2011）大多数评审专注于急性毒性FLX和/或生理，行为变化（流动性，食性和侵略）和生殖健康的变化（表2）。尽管如此，FLX还涉及影响抗氧化系统中的小鼠（Djordjevic等，2011）。氧化的特征在于不平衡的生物外源性介入活性氧（ROS），（如超氧化物阴离子（OH），过氧化氢（H2O2）和羟基自由基）使其超过暴露需氧生物抗氧化防御机制。一这些机制涉及反作用于抗氧化酶，如反应
表1 氟西汀在水生环境浓度。
氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢（CAT）和还原型谷胱甘肽（过氧化物酶é谷胱甘肽过氧化物酶和还原酶ËGR）（利文斯通，2001; Regoli等，2002a，B; Valavanidis等，2006）。此外，二期谷胱甘肽S-转移酶还可以排毒，作为在结合反应谷胱甘肽与外源性的催化剂化合物电中心（Regoli和Principato，1995）。当抗氧化剂的系统响应由ROS过量破坏，过氧化脂质（LPO）产生，导致的磷脂膜的损伤（Valavanidis等人，2006）。抗氧化酶相似的脂质产生波动。由于污染物曝光已成功地用作氧化应激和损伤的生物标记物在贻贝物种（Regoli和Principato，1995; Regoli等，2002a; Santovito等人，2005; Bebianno等人，2005）.
据我们所知，这是第一次研究FLX现实环境浓度的电位变化状态（75纳克L 1）暴露在贻贝 地中海贻贝通过抗氧化酶活性的评价：SOD，CAT;贻贝“鳃和消化腺二期GST活性，LPO。SSRI FLX可能造成神经毒性效应响应通过评估一个基本神经传递调节剂的活性这一指标，乙酰胆碱酯酶测试胆碱酯酶（AChE）的贻贝鳃。 AChE活性已经报道在几种有机污染物的存在下（如杀虫剂，清洁剂和药品），以被抑制（Almeida等人，2010;鞋底等，2010）。最后，碱不稳定磷酸盐（ALP）方法用于性别分化贻贝性腺评估FLX作为一种内分泌干扰诱导剂，因为ALP水平与那些从卵黄蛋白原样蛋白这是在女性自然男性现象相关（布莱斯等人，1999;加涅等人，2002; Matozzo等人，2008）。
2.材料与方法
2.1。化学制品
R - （ - ）盐酸氟西汀（F1678，>98％，CAS：114247-09-5）; 1.1.3.3。四甲（MDA）（108383，CAS：102-52-3）;1-甲基-2-苯基吲哚（99％，CAS号：3558-24-5）; 5,50-二硫代双（2-硝基
苯甲酸）（DTNB）（D8130，？98％TLC，CAS：69-78-3）;乙酰基硫代胆碱碘化（ATC）（A5751，98％TLC，CAS：1866-15-5）;牛血清白蛋白（BSA）（A9418，>98％，CAS：9048-46-8）;丁基化羟基甲苯（BHT）（B1378，99.0％GC，CAS号：128-37-0）;从马心脏细胞色素C（C7752，> 95％，CAS：9007-43-6）;二乙烯三羧酸二酐（DTPA）（D6148，CAS：23911-26-4）;乙二胺四乙酸（EDTA）（ED，99％，CAS号：60-00-4）;菲斯克和Subbarow减速（F5428）;谷胱甘肽还原酶（G3664，CAS：9001-48-3）; HEPES（H3375，> 99.5％，CAS：7365-43-9）;过氧化氢溶液（H1009，30％w / w的，CAS：7722-84-1）;次黄嘌呤（H9377，> 99％，CAS：68-94-0）; L-谷胱甘肽氧化（GSSG）（G4501，> 98％，CAS：27025-41-8）; L-减少谷胱甘肽（GSH）（G4251，> 98％，CAS：70-18-8）;甲磺酸（> 99.5％，CAS：75-75-2）;的Triton X-100（X6878，CAS：9002-93-1）从牛奶黄嘌呤氧化酶（X1875，CAS：9002-17-9）; B烟酰胺腺嘌呤二核苷酸减少钠盐水合物（NADPH）（N8129，97％CAS号：606-68-8）购自Sigma Aldrich公司（德国）.Protein-测定染料试剂浓缩物（磷酸CAS购买：7664-38-2þ甲醇CAS号：67-56-1）从Bio-Rad实验室公司（USA）获得。1,4-二硫苏糖醇（DTT）（99％，CAS：3483-12-3）;乙腈（99.8％，CAS 75-05-8）;甲醇（99.9％，CAS 67-56-1）; natriumazide（叠氮化钠）（106688，？99％，CAS：26628-22-8）;氯化钾（氯化钾）（104936，99.5％，CAS号：7447-40-7）;三氯乙酸（TCA）（100807，CAS：76-03-9）;三 - （羟甲基）氨基甲烷（99％，CAS号：77-86-1）购自默克公司（德国）获得的。 1氯-2,4-，-dinitrobenzene（CDNB）（24440，98.0％GC，CAS：97-00-7）;钼酸试剂溶液（puriss PA）和磷酸二氢钾（60218，自Fluka收购7778-77-0）：99.5％，CAS。 D（TH）蔗糖额外纯（16104，99％，CAS：57-50-1）;氯化钠（盐）（puriss PA，CAS：7647-14-5）;钠氢氧化钠（NaOH）（纯化的，CAS：1310-73-2）自Riedel-脱HAEN得到（德国）。
2.2。氟西汀曝光法
贻贝地中海贻贝（N¼245，平均壳长尺寸：672毫米，宽度：371毫米），收集在2010年从河口Formosa湖中Portugal.These标本运送活到实验室，受到壳清洗最后放置在单独的关于控制和治疗接触〜75纳克L 1 FLX的水族箱（N¼35，1贻贝L 1）中。此前的75纳克L 1 FLX暴露所有贻贝都保留7天在的充气天然海水。在水族箱保持在恒定的温度（18.64 C1），盐度（33 0.4），pH值（8.1 0.2）和氧饱和度（>98％ 2）。贻贝未被医送，直到实验结束。水被改变使FLX浓度每48小时重新建立。
在每个设置的时间（0，3,7，和15天），贻贝（正¼20）从除去控制和曝光水族馆，个体壳生物数据测量（长度，宽度），并进行解剖，分离鳃，消化腺和性腺。每组织样品立即冷冻在液氮中并单独存储80C状态分析。对于条件指数（CI）估计，每15个贻贝水族馆，其中个别的加权有关的比例（式（1）。）：
2.3。组织准备抗氧化酶活性分析
采用抗氧化酶的分析进行解剖以前鳃（正¼5）和消化腺（正¼5）分开。每个单独的组织用20mM TRIS缓冲液（含有蔗糖þ0.15M氯化钾þ1mMof DTT EDTAþ0.5 M的1毫摩尔）在pH7.6。匀浆物离心15分钟，在500？在4克4 C和得到的上清液离心分离45分钟a在4C g。后胞浆部分体积测量，葡聚糖 G-25凝胶柱施加以进一步纯化样品中除去低分子量蛋白质。之前的100毫升的等分试样，将总的纯化使用如根据标准的牛血清白蛋白（BSA）蛋白质定量布拉德福德的方法（布拉德福德，1976年）。
鳃和消化腺的纯化等分单独一式三份的若干抗氧化酶通过分光光度分析应用以下方法进行定量分析。为了确定在贻贝组织的SOD活性，各100毫升纯化的等分试样进行评价，根据麦
科德和Fridovich（1969）的方法测定了50％的细胞色素c的吸收减少，在由黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤系统产生550nm的波长。 SOD活性是通过任意单位（U）占总蛋白质毫克1分钟表示。 CAT活性评估各100毫升纯化的组织等分试样用于测量吸光度降低，在240纳米（格林沃尔德，1985）相关的过氧化氢（H2O2）的消耗，并表示为米摩尔mg总蛋白浓度。进行GST活性分析定量为50毫升与CDNB每个纯化的样品的反应物在340纳米，以下的Habig等人（1974）的方法，并表示总的以所得CDNB共轭形成毫克。
2.4 。LPO分析
解剖鳃（正¼10）和消化腺（正¼10）匀浆冰。单独用20mM Tris HCl缓冲液和丁基化羟基甲苯（BHT）的溶液。100：1毫升比在pH8.6。以沉淀的细胞质部分，所述匀浆物离心30000。 g下在4分钟45℃。等分试样放置一边总蛋白定量根据Bradford的方法（布拉德福德，1976）。所得细胞质部分通过的量化用于LPO水平的测定的副产物丙二醛（MDA）和（2E）-4-羟基-2-壬烯醛（HNE）的形成的吸光度在586纳米以下Redelmeier等人的适应。 （1998）方法。 LPO水平表示为毫摩尔MDA克总蛋白。
2.5 。Ache分析
解剖腮在100mMTRISeHCl缓冲液和100：1毫升海卫在冰上的pH值为8.0。在12000离心的速度，30分钟，温度为4℃。所得培养上清中分离等份，一个用于总蛋白测定（布拉德福德，1976），并根据Ellman等适应其他为AChE活性分析。 （1961）。 AChE活性是通过测定增加黄色颜色的所得fromthe生产5-巯基-2-硝基苯甲酸酯在405nm（3¼13.6mm的α1-11）由基板硫代胆碱与DTNB的反应。AChE活性表示纳摩尔毫克。
2.6 ALP介绍
性别分化的性腺（正¼10）中匀在25毫摩尔的NaOH缓冲液（含有125 mM氯化钠DTT的þEDTA）中，pH值为7.4。匀浆物离心速度为12000。30分钟，所得的颗粒被丢弃。每个上清液的等分试样被保留，以确定总蛋白质含量（布拉德福德，1976）。剩余的胞质级分调整用35％的丙酮和离心在10000的速度，5分钟。所得沉淀溶解，用1M NaOH放置，用于在604
C加热浴30分钟。磷钼方法（斯坦顿，1968）被用来计算在660nm的无机磷酸盐（KH 2 PO 4）的浓度波长。 ALP浓度单位为mg[PO4]毫克。
2.7 统计分析
所有的生物标志物的结果是平均的。相应的标准偏差是每组的时间，是使用SIGMAPLOT进行的测试在每个组织和贻贝之间的差异与FLX治疗设定的时间。特设霍尔姆 - Sidak用于单生物标志物的区别。 Pearson相关用于验证生物标记物之间的依赖性。主成分分析（PCA）与XLSTAT进行， 2012年。评估在各组的时间对每个变异生物标志物和FLX食肉暴露。1）鳃2）消化腺 3）鳃与消化腺。 AChE活性被认为是在鳃，PCA。ALP没有考虑，因为它是在性腺。统计显着性限定为p
3.结果
3.1 C1
甲显著下降，观察控制贻贝从（26.0%到2.6％）至第3天（22.2%到3.3％）保持不变，直到实验（分19.5%到4.4％）的末端。另外，FLX暴露贻贝状况指标并没有受到影响。整个曝光（第3天：21.94.0;7天：22.03.3;15天：20.03.8％）的总量不显著，不服从各自的控制。
3.2 抗氧化酶
SOD活性是显著高于鳃和消化腺两个，而FLX却暴露贻贝整个实验。暴露鳃显示随着时间的推移的SOD活性的抑制趋势只有两个星期（图1A），而在暴露的贻贝消化腺无显著差异在（图1B）（P> 0.05）。相反，以SOD，CAT活性较高。尽管建立控制和FLX暴露鳃之间没有显著的差异，这是明显的CAT活性增加，这是随着时间的推移SOD活性会收到抑制
（P
3.3 LPO 等级
LPO水平（图1G和H）较高，鳃比在两个贻贝群消化腺。在鳃（图1G）中，对照显示没有差异（P> 0.05），暴露贻贝呈现更高LPO水平比。对照一周后回收。该实验结束时，以控制的水平（P> 0.05），在消化腺（图1H），控制保持后，显著下降的第3天，暴露蚌LPO水平升高，但只有在显著的
2周曝光（4倍高于对照）（P
3.4 Ache活性
乙酰胆碱酯酶（图2）的活性在整个实验中对照个体一致。相反地AChE活性在蚌腮中显著递增，FLX曝光的第3天之后，接着是渐进的抑制，通过达到对比。对照组一显著的活性较低（P
3.5 ALP浓度
ALP水平（图3）在第一周对照雌性下降0.05），而男性荷尔蒙保持在整个实验持续时间（第不变> 0.05）。然而，在暴露的性腺曝光后的3天，ALP水平显著在雌雄中男性更明显。在此之后，ALP水平被暴露于两种性别中。一周后显著递增，后再次降低到原来水平（P
3.6 鳃和消化腺的主要成分分析
PCA应用于在鳃测量中的所有参数。（图4A）揭示总变化的的72％。PC1代表变异的52％，在SOD活性与其余酶活性与LPO水平的阶乘重量分布反对突出非和FLX暴露鳃之间的距离。该第二个组成部分（解释只有19％的方差）显示CI在当天控制分离进一步的影响，与上述相反的关系确证
消化腺的PCA（图4B）表示TEVAR，其中两种组分对总的群体分布（PC1，46％和PC2，38％）类似影响的几乎84％。AChE活性没有考虑，因为它是处理仅在鳃。PC1显示控件（例外0天），特别是关联的，其余变量SOD活性反对派集群;与7天FLX分离暴露与其他曝光天消化腺。如观察鳃的PC2，CI，在这种情况下，第0天对照组的变异性最高的因子，天15 FLX暴露消化腺由LPO水平进一步影响。消化腺PCA也证实，在CAT和GST活动之间的直接关系。
PCA（图5）与具有氧化应激的生物标记物（SOD，CAT，GST和LPO）组织特异性整合，解释的TVar约85％（PC1，51％正PC2，34％）。第一部分明确分开非和FLX暴露鳃
消化腺治疗组，尤其是关于鳃LPO水平，GST和SOD活性，而消化腺更涉及到CAT的活性。第二部分重点介绍两种暴露鳃和控制组消化腺的分离，除天0控制和第7天露消化腺和每天15鳃关于向CAT水平控制，LPO和GST反对SOD。在整个PCA显示的聚集：1）腮与更高的SOD活性控制; 2）FLX暴露鳃与LPO水平的增加; 3）FLX暴露消化腺具有较高的CAT活动;最后4）消化腺反对所有的生物标志物的综合控制。
4 结论
4.1 氧化应激
我们所知，这是关于FLX作为一个潜在的氧化应激诱导采用抗氧化酶贻贝响应活动的效果的第一项研究。结果显示这两种蚌组织在一个短暂的抗氧化状态的改变。如结合污染物直接接触，所述显著SOD活性下调呈负状态，在消化腺SOD活性的伴随抑制倾向造成了显著增强的CAT3两周FLX曝光（后图1和图5）。鳟鱼（虹鳟）肝细胞以FLX已经显示出诱导ROS产生的增强（拉维尔等人，2004）。其在FLX的存在下抑制被关联到的ROS特别是在鳃和自消化腺对一般的氧化还原循环和生物转化过程（利文斯通等人，1992）在CAT的催化作用稍后在该触发组织（Regoli和Principato，1995年）。一个
抑制SOD的活性也是由乔尔杰维茨等人发现。 （2011）在暴露于5毫克/公斤FLX体重小鼠，虽然没有观察到增强的CAT活性。此外，较高的CAT活性报道消化腺。同样的贻贝品种暴露卡马西平（马丁·迪亚斯等人，2009年）。总体PCA集群（图5）提供了进一步的验证SOD的活性水平之间的鳃和消化腺的差异。
GST促进还原型谷胱甘肽（GSH）共轭与亲电子化合物使转型更提取亲水代谢物（Halling - 索伦森等人，1998年）。虽然，GST活性是治疗之间通常短暂两种组织中（图1E和F）。其他影响变量，而不是暴露自己的动作，这种酶是更敏感的FLX-暴露消化腺显示出比对照组同时更高的活性（一周后除外），并与CAT活性直接相关。 GST和CAT的增强M.中也观察之间的正相关关系贻贝暴露消化腺到250纳克L 1布洛芬为在同一时间（冈萨雷斯雷伊和
Bebianno，2012）都为苯扎贝特（Canesi联合。等，2007年），卡马西平（马丁-Diaz等人，2009）和普萘洛尔曝光（Franzellitti等。，2011）。最后，GST增强证实，通过Canesi联合等规定。
氧化酶的改变是无法阻止和反击行为FLX-曝光，因为是膜损伤明确的组织特异性反应，其中鳃表现出较高的vulnerably在FLX-曝光开始，直到第一个星期结束时LPO增强在暴露消化腺（7倍高）持续直到实验（图1G和H）的末端。即使暴露腮似乎恢复2周后，以控制的水平，PCA（图5）表明，FLX在这一组织中更高的影响比在消化腺随时间。更高水平的LPO后250纳克L者也观察到1布洛芬暴露在相同的贻贝，特别是在鳃（最大19毫摩尔MDA1毫克蛋白
质）。
4.2。神经毒性作用
乙酰胆碱酯酶是负责神经递质乙酰胆碱（ACh），以胆碱和乙酸的水解，并在胆碱能神经功能中起重要作用（Tsuchiya等人，2004），作为神经递质血清素（5-HT）具有血清素能神经传递的功能。这些神经递质在许多生理过程例如心脏调控类中起重要作用。桑泽和希尔，1997年）。其他一些研究表明，它受乙酰胆碱酯酶的诱导，即在放置最终的曝气泻湖贻贝（加涅等人，2010），没有明显的解释这一事实这超过污染物之间的拮抗作用。AChE活性的增强意味着乙酰胆碱的枯竭，我们假设几种可能的解释为AChE活性临时增强：神经递质5-羟色胺浓度的1）上所述的增强。在神经末梢动作已经竞相与乙酰胆碱互相攻击，因此导致它耗尽，尽管5-HT的贻贝的受体激活机制仍是未知的。由加涅和布莱斯（2003）说明的; 2）乙酰胆碱酯酶增加相关细胞凋亡（Zhang等人，2002），FLX存在可以促进腮细胞凋亡。 3）在小鼠大脑皮质细胞雌二醇水平和AChE活性调节之间的关系的报道指出的是，高水平的17b的雌二醇（E2）的乙酰胆碱酯酶的活性被抑制。
4.3 内分泌干扰
ALP水平由vitellogenins（VT）碱性水解后被释放，它是先于蛋黄蛋白卵黄蛋白（Vn的）的卵生物种（Matozzo等人，2008）。在双壳类，卵黄由雌二醇（E2）和神经肽诱导（Matozzo等人，2008）。 ALP水平增强是内分泌干扰（ED），是男性的标志（布莱斯等人，1999;加涅等人，2002; Matozzo等人，2008）。在FLX曝光的时候，ALP水平普遍较高（女性最大观察1600毫克[PO4]毫克）（加涅等，2008）。然而FLX曝光不诱导在两种性别分化的性腺的增强的是男性ALP水平，女性是在3天之后。ALP下调是女性性腺激素不足，通过多环芳香烃的抗雌激素效应（成人贻贝贻贝影响性腺发育也观察多环芳烃）和（蒂斯-Zarragoitia和Cajaraville，2006）。由这些作者指出，它考虑在性腺发育和繁殖双壳类5-HT的功能，由于这个原因FLX-暴露性腺，再变更数据是很重要的。此外，ALP下调在暴露的女性和男性性腺FLX可以被关联到的。E2反比关系与5-HT水平期间中所报告的淡水贻贝和性腺5-HT的浓度增加
产卵（加涅和Blaise，2003），因为和反对派卵黄蛋白原合成的诱导有关，性腺血清素水平下降（Matozzo等，2008）。另外，最近拉扎拉等（2012）报道的1.5倍E2的后6天暴露于200纳克L 1 FLX的贻贝体型的增大。然而，伴随着卵母细胞的减小，酯化E2水平在这种产卵间减少约38倍从而确认此SSRI是内分泌干扰。
5 结论
在鳃FLX接触蚌两周引起过性抗氧化酶活性的改变。然而，这些变化并没有想象中严重，整体ALP下调，而突出FLX较高的是内分泌干扰作用，而不是氧化应激诱导。此外，作为SSRI，对5-HT水平增加导致如前所述，乙酰胆碱酯酶活性明显改变整个实验和胆碱能神经传递的功能。在组织FLX浓度的测定，以及在这两个非并暴露贻贝的组织，血清素和雌二醇水平的改变应该清楚地弥补这些发现。最后，FLX存在，即使是在一个相关的环境浓度，显然有潜力来诱导在贻贝分枝生态理学效应贻贝特别影响其繁殖，所以5-HT受体的激活在蚌机制还是一个未知数。
致谢玛丽亚·冈萨雷斯 - 雷伊博士奖学金（SFRH/ BD/二千〇七分之四万一千六百零六）从科学技术的葡萄牙外交部葡萄牙科学技术基金会（FCT）。笔者想感谢子项目EMECORISK的支持：“新兴污染物的影响水生生态系统”的0432-I2TEP-5- E（I2TEP）项目，FP7-人-2009-IRSES GENERA项目。德博拉Legibre，玛蒂尔德·穆勒和圣卡塔琳娜佩雷拉在ALP法协议的技术援助。
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选择性五羟色胺在摄取抑制剂（SSRI）氟西汀的情况下是否
影响贝紫贻贝？
Maria Gonzalez-Rey, Maria João Bebianno*
CIMA，阿尔加维，法鲁， Gambelas大学理学院和技术学院，8000-135 Faro，葡萄牙
文章历史：写作于2012年5月23日，修改至2012年8月30日，发布于2012年10月10日
关键词：紫贻贝，氟西汀，抗氧化酶，神经毒性作用，内分泌干扰
摘要：氟西汀（FLX）在活性药物成分的作用下，与水生环境息息相关，在污水处理厂系统中，处方精神科药物被广泛使用，且去除率较差。API充当选择性血清素再吸收抑制剂（SSRI），经常被报道引起了非目标物种的破坏。这项研究的目标包括两周内暴露于75ng于贻贝紫贻贝多的生物标志物的反应评价中。以1 FLX评估抗氧化酶活性Ë超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST） ;过氧化脂质（LPO），通过不稳定磷酸盐（ALP）的卵黄蛋白原样蛋白间接测量乙酰胆碱酯酶（AChE）神经毒性反应和内分泌紊乱的过程。结果表明组织特异性酶促反应
和损害主要影响河蚌鳃。然而，在整个时间在两个性别分化的性腺明确ALP水平的抑制使证据FLX增强行动的内分泌干扰物，而不是氧化或神经诱导
1.简介。
关联到水生生态系统的活性药物成分（API）在生态毒性发生的风险中无处不在。随着检测技术的进步，正在对水生环境中检测到一个更大的API（参见评论：卡利斯托和埃斯特维斯，2009;Kümmerer，2009; Li和Randak，2009;阿隆索等人，2010年;帕尔等人，2010年; Kümmerer，2010; Santos等，2010; Brausch和Rand，2011）。污水处理厂仍然装备不良的api，其排负荷去除率差，因此这些生物活性物质最终会通过家庭和医院污水处理进入地表水（河流，河口和湖泊），并从那里回收到饮用水（恩斯，2001;恩斯等人，2002年;的Stackelberg等人，2004; Jones等人，2007; Kim等人，2007; Daughton，2010）构成对非目标水生生物的影响（2001年潜在的风险;布鲁克斯等人，2005年; FENT等，2006）。
氟西汀出现在抗抑郁药氟苯氧丙胺中被广泛使用（如西酞普兰，氟伏沙明，帕罗西汀，舍曲林和）通过增加血清素作为选择性血清素再摄取抑制剂（SSRI）在治疗抑郁症和其他情绪障碍（5-羟色胺ê5-HT）等方面的手段，提高神经元突触间隙的水平（Brosen，1993;德风向标，1999; Hiemke和Härtter，2000; FENT等，2006）虽然，FLX作为尿液的不变母体化合物百分之30排出体外，或代谢为去甲氟西汀（德风向标，1999; Hiemke和Härtter，2000;芳和莫尔纳，2008年）是有弹性的水解，光解和微生物降解过程（权和安布拉斯特，2006年）发生在1毫克的水生环境中（表1）。自从SSRIs改变神经递质5HT调节之后，关联到了脊椎动物和无脊椎动物（2001激素和神经机制重要功能调制; FENT等人，2006; Stanley等，2007。画家等，2009;Styrishaveet等人，对FLX曝光生态毒理学效应2011）大多数评审专注于急性毒性FLX和/或生理，行为变化（流动性，食性和侵略）和生殖健康的变化（表2）。尽管如此，FLX还涉及影响抗氧化系统中的小鼠（Djordjevic等，2011）。氧化的特征在于不平衡的生物外源性介入活性氧（ROS），（如超氧化物阴离子（OH），过氧化氢（H2O2）和羟基自由基）使其超过暴露需氧生物抗氧化防御机制。一这些机制涉及反作用于抗氧化酶，如反应
表1 氟西汀在水生环境浓度。
氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢（CAT）和还原型谷胱甘肽（过氧化物酶é谷胱甘肽过氧化物酶和还原酶ËGR）（利文斯通，2001; Regoli等，2002a，B; Valavanidis等，2006）。此外，二期谷胱甘肽S-转移酶还可以排毒，作为在结合反应谷胱甘肽与外源性的催化剂化合物电中心（Regoli和Principato，1995）。当抗氧化剂的系统响应由ROS过量破坏，过氧化脂质（LPO）产生，导致的磷脂膜的损伤（Valavanidis等人，2006）。抗氧化酶相似的脂质产生波动。由于污染物曝光已成功地用作氧化应激和损伤的生物标记物在贻贝物种（Regoli和Principato，1995; Regoli等，2002a; Santovito等人，2005; Bebianno等人，2005）.
据我们所知，这是第一次研究FLX现实环境浓度的电位变化状态（75纳克L 1）暴露在贻贝 地中海贻贝通过抗氧化酶活性的评价：SOD，CAT;贻贝“鳃和消化腺二期GST活性，LPO。SSRI FLX可能造成神经毒性效应响应通过评估一个基本神经传递调节剂的活性这一指标，乙酰胆碱酯酶测试胆碱酯酶（AChE）的贻贝鳃。 AChE活性已经报道在几种有机污染物的存在下（如杀虫剂，清洁剂和药品），以被抑制（Almeida等人，2010;鞋底等，2010）。最后，碱不稳定磷酸盐（ALP）方法用于性别分化贻贝性腺评估FLX作为一种内分泌干扰诱导剂，因为ALP水平与那些从卵黄蛋白原样蛋白这是在女性自然男性现象相关（布莱斯等人，1999;加涅等人，2002; Matozzo等人，2008）。
2.材料与方法
2.1。化学制品
R - （ - ）盐酸氟西汀（F1678，>98％，CAS：114247-09-5）; 1.1.3.3。四甲（MDA）（108383，CAS：102-52-3）;1-甲基-2-苯基吲哚（99％，CAS号：3558-24-5）; 5,50-二硫代双（2-硝基
苯甲酸）（DTNB）（D8130，？98％TLC，CAS：69-78-3）;乙酰基硫代胆碱碘化（ATC）（A5751，98％TLC，CAS：1866-15-5）;牛血清白蛋白（BSA）（A9418，>98％，CAS：9048-46-8）;丁基化羟基甲苯（BHT）（B1378，99.0％GC，CAS号：128-37-0）;从马心脏细胞色素C（C7752，> 95％，CAS：9007-43-6）;二乙烯三羧酸二酐（DTPA）（D6148，CAS：23911-26-4）;乙二胺四乙酸（EDTA）（ED，99％，CAS号：60-00-4）;菲斯克和Subbarow减速（F5428）;谷胱甘肽还原酶（G3664，CAS：9001-48-3）; HEPES（H3375，> 99.5％，CAS：7365-43-9）;过氧化氢溶液（H1009，30％w / w的，CAS：7722-84-1）;次黄嘌呤（H9377，> 99％，CAS：68-94-0）; L-谷胱甘肽氧化（GSSG）（G4501，> 98％，CAS：27025-41-8）; L-减少谷胱甘肽（GSH）（G4251，> 98％，CAS：70-18-8）;甲磺酸（> 99.5％，CAS：75-75-2）;的Triton X-100（X6878，CAS：9002-93-1）从牛奶黄嘌呤氧化酶（X1875，CAS：9002-17-9）; B烟酰胺腺嘌呤二核苷酸减少钠盐水合物（NADPH）（N8129，97％CAS号：606-68-8）购自Sigma Aldrich公司（德国）.Protein-测定染料试剂浓缩物（磷酸CAS购买：7664-38-2þ甲醇CAS号：67-56-1）从Bio-Rad实验室公司（USA）获得。1,4-二硫苏糖醇（DTT）（99％，CAS：3483-12-3）;乙腈（99.8％，CAS 75-05-8）;甲醇（99.9％，CAS 67-56-1）; natriumazide（叠氮化钠）（106688，？99％，CAS：26628-22-8）;氯化钾（氯化钾）（104936，99.5％，CAS号：7447-40-7）;三氯乙酸（TCA）（100807，CAS：76-03-9）;三 - （羟甲基）氨基甲烷（99％，CAS号：77-86-1）购自默克公司（德国）获得的。 1氯-2,4-，-dinitrobenzene（CDNB）（24440，98.0％GC，CAS：97-00-7）;钼酸试剂溶液（puriss PA）和磷酸二氢钾（60218，自Fluka收购7778-77-0）：99.5％，CAS。 D（TH）蔗糖额外纯（16104，99％，CAS：57-50-1）;氯化钠（盐）（puriss PA，CAS：7647-14-5）;钠氢氧化钠（NaOH）（纯化的，CAS：1310-73-2）自Riedel-脱HAEN得到（德国）。
2.2。氟西汀曝光法
贻贝地中海贻贝（N¼245，平均壳长尺寸：672毫米，宽度：371毫米），收集在2010年从河口Formosa湖中Portugal.These标本运送活到实验室，受到壳清洗最后放置在单独的关于控制和治疗接触〜75纳克L 1 FLX的水族箱（N¼35，1贻贝L 1）中。此前的75纳克L 1 FLX暴露所有贻贝都保留7天在的充气天然海水。在水族箱保持在恒定的温度（18.64 C1），盐度（33 0.4），pH值（8.1 0.2）和氧饱和度（>98％ 2）。贻贝未被医送，直到实验结束。水被改变使FLX浓度每48小时重新建立。
在每个设置的时间（0，3,7，和15天），贻贝（正¼20）从除去控制和曝光水族馆，个体壳生物数据测量（长度，宽度），并进行解剖，分离鳃，消化腺和性腺。每组织样品立即冷冻在液氮中并单独存储80C状态分析。对于条件指数（CI）估计，每15个贻贝水族馆，其中个别的加权有关的比例（式（1）。）：
2.3。组织准备抗氧化酶活性分析
采用抗氧化酶的分析进行解剖以前鳃（正¼5）和消化腺（正¼5）分开。每个单独的组织用20mM TRIS缓冲液（含有蔗糖þ0.15M氯化钾þ1mMof DTT EDTAþ0.5 M的1毫摩尔）在pH7.6。匀浆物离心15分钟，在500？在4克4 C和得到的上清液离心分离45分钟a在4C g。后胞浆部分体积测量，葡聚糖 G-25凝胶柱施加以进一步纯化样品中除去低分子量蛋白质。之前的100毫升的等分试样，将总的纯化使用如根据标准的牛血清白蛋白（BSA）蛋白质定量布拉德福德的方法（布拉德福德，1976年）。
鳃和消化腺的纯化等分单独一式三份的若干抗氧化酶通过分光光度分析应用以下方法进行定量分析。为了确定在贻贝组织的SOD活性，各100毫升纯化的等分试样进行评价，根据麦
科德和Fridovich（1969）的方法测定了50％的细胞色素c的吸收减少，在由黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤系统产生550nm的波长。 SOD活性是通过任意单位（U）占总蛋白质毫克1分钟表示。 CAT活性评估各100毫升纯化的组织等分试样用于测量吸光度降低，在240纳米（格林沃尔德，1985）相关的过氧化氢（H2O2）的消耗，并表示为米摩尔mg总蛋白浓度。进行GST活性分析定量为50毫升与CDNB每个纯化的样品的反应物在340纳米，以下的Habig等人（1974）的方法，并表示总的以所得CDNB共轭形成毫克。
2.4 。LPO分析
解剖鳃（正¼10）和消化腺（正¼10）匀浆冰。单独用20mM Tris HCl缓冲液和丁基化羟基甲苯（BHT）的溶液。100：1毫升比在pH8.6。以沉淀的细胞质部分，所述匀浆物离心30000。 g下在4分钟45℃。等分试样放置一边总蛋白定量根据Bradford的方法（布拉德福德，1976）。所得细胞质部分通过的量化用于LPO水平的测定的副产物丙二醛（MDA）和（2E）-4-羟基-2-壬烯醛（HNE）的形成的吸光度在586纳米以下Redelmeier等人的适应。 （1998）方法。 LPO水平表示为毫摩尔MDA克总蛋白。
2.5 。Ache分析
解剖腮在100mMTRISeHCl缓冲液和100：1毫升海卫在冰上的pH值为8.0。在12000离心的速度，30分钟，温度为4℃。所得培养上清中分离等份，一个用于总蛋白测定（布拉德福德，1976），并根据Ellman等适应其他为AChE活性分析。 （1961）。 AChE活性是通过测定增加黄色颜色的所得fromthe生产5-巯基-2-硝基苯甲酸酯在405nm（3¼13.6mm的α1-11）由基板硫代胆碱与DTNB的反应。AChE活性表示纳摩尔毫克。
2.6 ALP介绍
性别分化的性腺（正¼10）中匀在25毫摩尔的NaOH缓冲液（含有125 mM氯化钠DTT的þEDTA）中，pH值为7.4。匀浆物离心速度为12000。30分钟，所得的颗粒被丢弃。每个上清液的等分试样被保留，以确定总蛋白质含量（布拉德福德，1976）。剩余的胞质级分调整用35％的丙酮和离心在10000的速度，5分钟。所得沉淀溶解，用1M NaOH放置，用于在604
C加热浴30分钟。磷钼方法（斯坦顿，1968）被用来计算在660nm的无机磷酸盐（KH 2 PO 4）的浓度波长。 ALP浓度单位为mg[PO4]毫克。
2.7 统计分析
所有的生物标志物的结果是平均的。相应的标准偏差是每组的时间，是使用SIGMAPLOT进行的测试在每个组织和贻贝之间的差异与FLX治疗设定的时间。特设霍尔姆 - Sidak用于单生物标志物的区别。 Pearson相关用于验证生物标记物之间的依赖性。主成分分析（PCA）与XLSTAT进行， 2012年。评估在各组的时间对每个变异生物标志物和FLX食肉暴露。1）鳃2）消化腺 3）鳃与消化腺。 AChE活性被认为是在鳃，PCA。ALP没有考虑，因为它是在性腺。统计显着性限定为p
3.结果
3.1 C1
甲显著下降，观察控制贻贝从（26.0%到2.6％）至第3天（22.2%到3.3％）保持不变，直到实验（分19.5%到4.4％）的末端。另外，FLX暴露贻贝状况指标并没有受到影响。整个曝光（第3天：21.94.0;7天：22.03.3;15天：20.03.8％）的总量不显著，不服从各自的控制。
3.2 抗氧化酶
SOD活性是显著高于鳃和消化腺两个，而FLX却暴露贻贝整个实验。暴露鳃显示随着时间的推移的SOD活性的抑制趋势只有两个星期（图1A），而在暴露的贻贝消化腺无显著差异在（图1B）（P> 0.05）。相反，以SOD，CAT活性较高。尽管建立控制和FLX暴露鳃之间没有显著的差异，这是明显的CAT活性增加，这是随着时间的推移SOD活性会收到抑制
（P
3.3 LPO 等级
LPO水平（图1G和H）较高，鳃比在两个贻贝群消化腺。在鳃（图1G）中，对照显示没有差异（P> 0.05），暴露贻贝呈现更高LPO水平比。对照一周后回收。该实验结束时，以控制的水平（P> 0.05），在消化腺（图1H），控制保持后，显著下降的第3天，暴露蚌LPO水平升高，但只有在显著的
2周曝光（4倍高于对照）（P
3.4 Ache活性
乙酰胆碱酯酶（图2）的活性在整个实验中对照个体一致。相反地AChE活性在蚌腮中显著递增，FLX曝光的第3天之后，接着是渐进的抑制，通过达到对比。对照组一显著的活性较低（P
3.5 ALP浓度
ALP水平（图3）在第一周对照雌性下降0.05），而男性荷尔蒙保持在整个实验持续时间（第不变> 0.05）。然而，在暴露的性腺曝光后的3天，ALP水平显著在雌雄中男性更明显。在此之后，ALP水平被暴露于两种性别中。一周后显著递增，后再次降低到原来水平（P
3.6 鳃和消化腺的主要成分分析
PCA应用于在鳃测量中的所有参数。（图4A）揭示总变化的的72％。PC1代表变异的52％，在SOD活性与其余酶活性与LPO水平的阶乘重量分布反对突出非和FLX暴露鳃之间的距离。该第二个组成部分（解释只有19％的方差）显示CI在当天控制分离进一步的影响，与上述相反的关系确证
消化腺的PCA（图4B）表示TEVAR，其中两种组分对总的群体分布（PC1，46％和PC2，38％）类似影响的几乎84％。AChE活性没有考虑，因为它是处理仅在鳃。PC1显示控件（例外0天），特别是关联的，其余变量SOD活性反对派集群;与7天FLX分离暴露与其他曝光天消化腺。如观察鳃的PC2，CI，在这种情况下，第0天对照组的变异性最高的因子，天15 FLX暴露消化腺由LPO水平进一步影响。消化腺PCA也证实，在CAT和GST活动之间的直接关系。
PCA（图5）与具有氧化应激的生物标记物（SOD，CAT，GST和LPO）组织特异性整合，解释的TVar约85％（PC1，51％正PC2，34％）。第一部分明确分开非和FLX暴露鳃
消化腺治疗组，尤其是关于鳃LPO水平，GST和SOD活性，而消化腺更涉及到CAT的活性。第二部分重点介绍两种暴露鳃和控制组消化腺的分离，除天0控制和第7天露消化腺和每天15鳃关于向CAT水平控制，LPO和GST反对SOD。在整个PCA显示的聚集：1）腮与更高的SOD活性控制; 2）FLX暴露鳃与LPO水平的增加; 3）FLX暴露消化腺具有较高的CAT活动;最后4）消化腺反对所有的生物标志物的综合控制。
4 结论
4.1 氧化应激
我们所知，这是关于FLX作为一个潜在的氧化应激诱导采用抗氧化酶贻贝响应活动的效果的第一项研究。结果显示这两种蚌组织在一个短暂的抗氧化状态的改变。如结合污染物直接接触，所述显著SOD活性下调呈负状态，在消化腺SOD活性的伴随抑制倾向造成了显著增强的CAT3两周FLX曝光（后图1和图5）。鳟鱼（虹鳟）肝细胞以FLX已经显示出诱导ROS产生的增强（拉维尔等人，2004）。其在FLX的存在下抑制被关联到的ROS特别是在鳃和自消化腺对一般的氧化还原循环和生物转化过程（利文斯通等人，1992）在CAT的催化作用稍后在该触发组织（Regoli和Principato，1995年）。一个
抑制SOD的活性也是由乔尔杰维茨等人发现。 （2011）在暴露于5毫克/公斤FLX体重小鼠，虽然没有观察到增强的CAT活性。此外，较高的CAT活性报道消化腺。同样的贻贝品种暴露卡马西平（马丁·迪亚斯等人，2009年）。总体PCA集群（图5）提供了进一步的验证SOD的活性水平之间的鳃和消化腺的差异。
GST促进还原型谷胱甘肽（GSH）共轭与亲电子化合物使转型更提取亲水代谢物（Halling - 索伦森等人，1998年）。虽然，GST活性是治疗之间通常短暂两种组织中（图1E和F）。其他影响变量，而不是暴露自己的动作，这种酶是更敏感的FLX-暴露消化腺显示出比对照组同时更高的活性（一周后除外），并与CAT活性直接相关。 GST和CAT的增强M.中也观察之间的正相关关系贻贝暴露消化腺到250纳克L 1布洛芬为在同一时间（冈萨雷斯雷伊和
Bebianno，2012）都为苯扎贝特（Canesi联合。等，2007年），卡马西平（马丁-Diaz等人，2009）和普萘洛尔曝光（Franzellitti等。，2011）。最后，GST增强证实，通过Canesi联合等规定。
氧化酶的改变是无法阻止和反击行为FLX-曝光，因为是膜损伤明确的组织特异性反应，其中鳃表现出较高的vulnerably在FLX-曝光开始，直到第一个星期结束时LPO增强在暴露消化腺（7倍高）持续直到实验（图1G和H）的末端。即使暴露腮似乎恢复2周后，以控制的水平，PCA（图5）表明，FLX在这一组织中更高的影响比在消化腺随时间。更高水平的LPO后250纳克L者也观察到1布洛芬暴露在相同的贻贝，特别是在鳃（最大19毫摩尔MDA1毫克蛋白
质）。
4.2。神经毒性作用
乙酰胆碱酯酶是负责神经递质乙酰胆碱（ACh），以胆碱和乙酸的水解，并在胆碱能神经功能中起重要作用（Tsuchiya等人，2004），作为神经递质血清素（5-HT）具有血清素能神经传递的功能。这些神经递质在许多生理过程例如心脏调控类中起重要作用。桑泽和希尔，1997年）。其他一些研究表明，它受乙酰胆碱酯酶的诱导，即在放置最终的曝气泻湖贻贝（加涅等人，2010），没有明显的解释这一事实这超过污染物之间的拮抗作用。AChE活性的增强意味着乙酰胆碱的枯竭，我们假设几种可能的解释为AChE活性临时增强：神经递质5-羟色胺浓度的1）上所述的增强。在神经末梢动作已经竞相与乙酰胆碱互相攻击，因此导致它耗尽，尽管5-HT的贻贝的受体激活机制仍是未知的。由加涅和布莱斯（2003）说明的; 2）乙酰胆碱酯酶增加相关细胞凋亡（Zhang等人，2002），FLX存在可以促进腮细胞凋亡。 3）在小鼠大脑皮质细胞雌二醇水平和AChE活性调节之间的关系的报道指出的是，高水平的17b的雌二醇（E2）的乙酰胆碱酯酶的活性被抑制。
4.3 内分泌干扰
ALP水平由vitellogenins（VT）碱性水解后被释放，它是先于蛋黄蛋白卵黄蛋白（Vn的）的卵生物种（Matozzo等人，2008）。在双壳类，卵黄由雌二醇（E2）和神经肽诱导（Matozzo等人，2008）。 ALP水平增强是内分泌干扰（ED），是男性的标志（布莱斯等人，1999;加涅等人，2002; Matozzo等人，2008）。在FLX曝光的时候，ALP水平普遍较高（女性最大观察1600毫克[PO4]毫克）（加涅等，2008）。然而FLX曝光不诱导在两种性别分化的性腺的增强的是男性ALP水平，女性是在3天之后。ALP下调是女性性腺激素不足，通过多环芳香烃的抗雌激素效应（成人贻贝贻贝影响性腺发育也观察多环芳烃）和（蒂斯-Zarragoitia和Cajaraville，2006）。由这些作者指出，它考虑在性腺发育和繁殖双壳类5-HT的功能，由于这个原因FLX-暴露性腺，再变更数据是很重要的。此外，ALP下调在暴露的女性和男性性腺FLX可以被关联到的。E2反比关系与5-HT水平期间中所报告的淡水贻贝和性腺5-HT的浓度增加
产卵（加涅和Blaise，2003），因为和反对派卵黄蛋白原合成的诱导有关，性腺血清素水平下降（Matozzo等，2008）。另外，最近拉扎拉等（2012）报道的1.5倍E2的后6天暴露于200纳克L 1 FLX的贻贝体型的增大。然而，伴随着卵母细胞的减小，酯化E2水平在这种产卵间减少约38倍从而确认此SSRI是内分泌干扰。
5 结论
在鳃FLX接触蚌两周引起过性抗氧化酶活性的改变。然而，这些变化并没有想象中严重，整体ALP下调，而突出FLX较高的是内分泌干扰作用，而不是氧化应激诱导。此外，作为SSRI，对5-HT水平增加导致如前所述，乙酰胆碱酯酶活性明显改变整个实验和胆碱能神经传递的功能。在组织FLX浓度的测定，以及在这两个非并暴露贻贝的组织，血清素和雌二醇水平的改变应该清楚地弥补这些发现。最后，FLX存在，即使是在一个相关的环境浓度，显然有潜力来诱导在贻贝分枝生态理学效应贻贝特别影响其繁殖，所以5-HT受体的激活在蚌机制还是一个未知数。
致谢玛丽亚·冈萨雷斯 - 雷伊博士奖学金（SFRH/ BD/二千〇七分之四万一千六百零六）从科学技术的葡萄牙外交部葡萄牙科学技术基金会（FCT）。笔者想感谢子项目EMECORISK的支持：“新兴污染物的影响水生生态系统”的0432-I2TEP-5- E（I2TEP）项目，FP7-人-2009-IRSES GENERA项目。德博拉Legibre，玛蒂尔德·穆勒和圣卡塔琳娜佩雷拉在ALP法协议的技术援助。
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