无细胞百日咳疫苗生产用菌种CMCC58003
Fim2、Fim3抗原成分的血清学检测分析
罗勇, 赖军, 管红利, 严东珍，高慧, 王红, 潘海龙
【摘要】 目的 检测无细胞百日咳疫苗生产用菌种CMCC58003（简称CMCC58003）的 Fim2、Fim3抗原成分。 方法 运用玻片凝集试验法对5个批次CMCC58003 的Fim2、Fim3抗原成分进行血清学的检测分析。结果 现有5个批次CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分的玻片凝集试验均为阳性。结论 该5个批次CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分的血清学检测均为合格。
【关键词】 无细胞百日咳疫苗；CMCC58003；Fim2、Fim3抗原成分；玻片凝集试验法。
Serological analysis for Fim2 and Fim3 antigen components in bacterial seeds
CMCC58003 used for aP Vaccine production
Luo Yong Lai Jun Guan Hongli Yan Dongzhen Gao Hui Wang Hong Pan Hailong
[Abstract] Objective To analysis Fim2 and Fim3 antigen components in bacterial seed CMCC58003 which is used to produce aP Vaccine. Method Glass slide agglutination test is used to analysis. Result Glass slide agglutination test shows current 5 lots of CMCC58003 seeds are Fim2 and Fim3 antigen - positive .Conclusion Fim2 and Fim3 antigen component in 5 lots of bacterial seeds CMCC58003 are qualified in Serological analysis test.
[Key words] aP vaccine; CMCC58003；Fim2 and Fim3 antigen component; Glass slide agglutination test
CMCC58003是目前我国国家药品监督管理机构认可的无细胞百日咳疫苗的法定生产用菌种。以往没有将CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分的血清学检测列为菌种的法定检定项目，2010-10起实施的《中国药典》（2010年版 三部）首次规定需做Fim2、Fim3抗原的血清学检测，以确认CMCC58003菌种本身是否含有Fim2、Fim3 2种保护性抗原成分[1]。 __________________________
作者单位：成都生物制品研究所有限责任公司（四川 成都 610023）
作者简介：罗勇（1972-），男，生物医学工程师，硕士，疫苗生产管理
通讯作者：王红
现试验是运用玻片凝集试验法 对成都生物制品研究所有限责任公司现有共5个批次CMCC58003 的Fim2、Fim3抗原成分进行血清学的检测分析。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 CMCC58003批号 CS99-、BP-W-3-20101101、BP-W-3-20101102、BP-M-3-20100201、 [2]20071001。
1.1.2 Fim2、 Fim3抗体标准品 Fim2（批号：06/124）、 Fim3抗体标准品（批号：06/128）
由中国食品药品检定研究院提供（原始来源于英国国家生物制品检定所，NIBSC）。
1.1.3 主要设备 二级生物安全柜（型号：BHC-1600ⅡA/B3）。实验用仪器设备及试验用
耗材均在其验证、校验及有效期内使用。
1。2方法
1.2.1 CMCC58003菌液的制备、脱毒 将5个批次菌种分别启封接种到20%～25%羊血包姜 氏培养基，置35～37 ℃，连续传代培养3次。收集菌苔用适量0.9%无菌氯化钠溶液混匀， 经脱脂棉过滤收集菌种菌液各25 ml。加适量甲醛溶液和1%硫柳汞溶液，置于35～37 ℃ 70 h进行脱毒，贮存2～8 ℃备用。
1.2.2 Fim2、Fim3抗体标准品的稀释：分别用已标化的移液器吸取20 ul Fim2抗体标准品（批号：06/124）和Fim3抗体标准品（批号：06/128），再分别加入800 ul 0.9%无菌氯化钠溶液，混匀后，按50 ul/管（1:40）分装，贮存-20～-40 ℃备用。
1.2.3 玻片凝集试验 将已稀释（1:40）的Fim2、Fim3抗体标准品每次各取15 ul分别平均依次滴在5个干净玻片上，再向已加入Fim2、Fim3抗体标准品的玻片上分别加上5个菌种已脱毒菌液各15 ul，混匀后待3～5 min观察。
1.2.4 阴性对照 将已稀释（1:40）的Fim2、Fim3抗体标准品各取15 ul分别滴在1个干净玻片上再各加上15 ul 0.9%无菌氯化钠溶液，混匀后待3～5 min观察。
2 结果
2.1 检测结果 试验组玻片上有凝集块出现判为阳性、玻片上无凝集块出现，并显均匀浑浊 判为阴性（表1）。阴性对照组都没有出现凝集块现象。
表1 试验组玻片凝集试验的检测结果
菌种批次 Fim2抗体标准品
Fim3抗体标准品
CS99-1
BP-W-3-20101101
BP-W-3-20101102
BP-M-3-20100201
20071001 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 2.2 结论 5个批次的CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分的玻片凝集试验均为阳性，其血 清学检测结论为合格。
3 讨论
百日咳是一种由百日咳博德特氏菌引起的急性呼吸道传染病，全球每年约有1600万人因感染百日咳博德特氏菌而发病，约19.5万人因此死亡，其中，多数系发展中国家的婴幼儿。接种百日咳疫苗是预防和消灭百日咳的主要手段,无细胞百日咳疫苗较全细胞百日咳疫苗具有接种副反应轻微和良好的免疫效果，必将逐步取代全细胞百日咳疫苗广泛用于全程免疫和加强免疫。全细胞百白破疫苗和无细胞百白破疫苗主要区别在于所含抗原成分不同：前者抗原成分是百日咳博德特氏菌菌体，后者含有百日咳博德特氏菌的5种保护性抗原：百日咳毒素（PT）、丝状血凝素（FHA）、百日咳粘着素（PRN）、纤毛凝集原(Fim2、Fim3)，进而避免全细胞百白破疫苗可能产生严重的异常反应如脑炎等，就更加安全、同时提高了免疫效果。
[3-6]鉴于此，世界卫生组织（WHO）推荐发达国家和有经济能力的发展中国家应考虑使用五价无细胞百日咳疫苗。
玻片凝集试验能定性检测CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分，该方法原理：用已知的Fim2、Fim3抗体标准品作为诊断血清、与受检CMCC58003菌悬液各滴加在干净玻片上，混匀，数分钟后即可肉眼观察凝集结果，出现凝集现象的为阳性反应。此法具有灵敏、快速及操作简便等优点，常用于菌种鉴别等定性工作中。
在Fim2、Fim3抗原成分检测过程中，为了保证试验结果的可靠性，减小因试验操作原 因导致的误差，已设立阴性对照。考虑将引进明确含有Fim2、Fim3抗原的菌种CMCC58003，以此菌种菌悬液来设立阳性对照，从而可以进一步保障试验结果的可靠性。
CMCC58003的生物危害性为3类，就要求实验室必须已通过生物安全二级实验室备案登 记，菌液的制备、脱毒及玻片凝集试验等实验活动必须在二级生物安全柜内进行，实验人员需规范穿衣戴帽，并严格遵守标准操作程序操作，严防实验人员、试验样本及实验室环境被感染和污染/交叉污染，以保障生物安全、生产安全，同时减少假阳性产生风险[7,8]。
将近几年来共5个批次CMCC58003按照《中国药典》（2010年版 三部）规定进行了Fim2、
Fim3抗原成分的血清学检测，其玻片凝集反应都为阳性。本试验结果提示5个批次的CMCC58003都含有Fim2、Fim3保护性抗原。
4 参考文献
[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（2010年版 三部）[M].北京：中国医药科
技出版社，2010：63.
[2] 周德庆，胡宝龙，祖若夫，等.微生物学实验教程 [M]. 2版.北京：高等教育出版社，
2006：244-247.
[3] 世界卫生组织.WHO关于百日咳疫苗的立场文件[Z]. 瑞士: 日内瓦,2010-10:3.
[4] 迮文远，刁连东，苏万年，等.计划免疫学 [M].上海：上海科学技术文献出版社，
1997：311-329.
[5] 孙述学.无细胞百日咳疫苗的质量控制及其标准化[J].微生物学免疫学进展，2001，29
（1）：83-85.
[6] 谢广中.无细胞百日咳疫苗的发展及应用[J].上海预防医学杂志，2006，18（1）：6-8.
[7] 国务院.病原微生物实验室生物安全管理条例[S]. 北京：北京大学医学出版社，2006.
[8] 世界卫生组织.实验室生物安全手册 [M]. 3版.瑞士: 日内瓦,2004.
(收稿日期：2012-05-11)
无细胞百日咳疫苗生产用菌种CMCC58003
Fim2、Fim3抗原成分的血清学检测分析
罗勇, 赖军, 管红利, 严东珍，高慧, 王红, 潘海龙
【摘要】 目的 检测无细胞百日咳疫苗生产用菌种CMCC58003（简称CMCC58003）的 Fim2、Fim3抗原成分。 方法 运用玻片凝集试验法对5个批次CMCC58003 的Fim2、Fim3抗原成分进行血清学的检测分析。结果 现有5个批次CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分的玻片凝集试验均为阳性。结论 该5个批次CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分的血清学检测均为合格。
【关键词】 无细胞百日咳疫苗；CMCC58003；Fim2、Fim3抗原成分；玻片凝集试验法。
Serological analysis for Fim2 and Fim3 antigen components in bacterial seeds
CMCC58003 used for aP Vaccine production
Luo Yong Lai Jun Guan Hongli Yan Dongzhen Gao Hui Wang Hong Pan Hailong
[Abstract] Objective To analysis Fim2 and Fim3 antigen components in bacterial seed CMCC58003 which is used to produce aP Vaccine. Method Glass slide agglutination test is used to analysis. Result Glass slide agglutination test shows current 5 lots of CMCC58003 seeds are Fim2 and Fim3 antigen - positive .Conclusion Fim2 and Fim3 antigen component in 5 lots of bacterial seeds CMCC58003 are qualified in Serological analysis test.
[Key words] aP vaccine; CMCC58003；Fim2 and Fim3 antigen component; Glass slide agglutination test
CMCC58003是目前我国国家药品监督管理机构认可的无细胞百日咳疫苗的法定生产用菌种。以往没有将CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分的血清学检测列为菌种的法定检定项目，2010-10起实施的《中国药典》（2010年版 三部）首次规定需做Fim2、Fim3抗原的血清学检测，以确认CMCC58003菌种本身是否含有Fim2、Fim3 2种保护性抗原成分[1]。 __________________________
作者单位：成都生物制品研究所有限责任公司（四川 成都 610023）
作者简介：罗勇（1972-），男，生物医学工程师，硕士，疫苗生产管理
通讯作者：王红
现试验是运用玻片凝集试验法 对成都生物制品研究所有限责任公司现有共5个批次CMCC58003 的Fim2、Fim3抗原成分进行血清学的检测分析。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 CMCC58003批号 CS99-、BP-W-3-20101101、BP-W-3-20101102、BP-M-3-20100201、 [2]20071001。
1.1.2 Fim2、 Fim3抗体标准品 Fim2（批号：06/124）、 Fim3抗体标准品（批号：06/128）
由中国食品药品检定研究院提供（原始来源于英国国家生物制品检定所，NIBSC）。
1.1.3 主要设备 二级生物安全柜（型号：BHC-1600ⅡA/B3）。实验用仪器设备及试验用
耗材均在其验证、校验及有效期内使用。
1。2方法
1.2.1 CMCC58003菌液的制备、脱毒 将5个批次菌种分别启封接种到20%～25%羊血包姜 氏培养基，置35～37 ℃，连续传代培养3次。收集菌苔用适量0.9%无菌氯化钠溶液混匀， 经脱脂棉过滤收集菌种菌液各25 ml。加适量甲醛溶液和1%硫柳汞溶液，置于35～37 ℃ 70 h进行脱毒，贮存2～8 ℃备用。
1.2.2 Fim2、Fim3抗体标准品的稀释：分别用已标化的移液器吸取20 ul Fim2抗体标准品（批号：06/124）和Fim3抗体标准品（批号：06/128），再分别加入800 ul 0.9%无菌氯化钠溶液，混匀后，按50 ul/管（1:40）分装，贮存-20～-40 ℃备用。
1.2.3 玻片凝集试验 将已稀释（1:40）的Fim2、Fim3抗体标准品每次各取15 ul分别平均依次滴在5个干净玻片上，再向已加入Fim2、Fim3抗体标准品的玻片上分别加上5个菌种已脱毒菌液各15 ul，混匀后待3～5 min观察。
1.2.4 阴性对照 将已稀释（1:40）的Fim2、Fim3抗体标准品各取15 ul分别滴在1个干净玻片上再各加上15 ul 0.9%无菌氯化钠溶液，混匀后待3～5 min观察。
2 结果
2.1 检测结果 试验组玻片上有凝集块出现判为阳性、玻片上无凝集块出现，并显均匀浑浊 判为阴性（表1）。阴性对照组都没有出现凝集块现象。
表1 试验组玻片凝集试验的检测结果
菌种批次 Fim2抗体标准品
Fim3抗体标准品
CS99-1
BP-W-3-20101101
BP-W-3-20101102
BP-M-3-20100201
20071001 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 2.2 结论 5个批次的CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分的玻片凝集试验均为阳性，其血 清学检测结论为合格。
3 讨论
百日咳是一种由百日咳博德特氏菌引起的急性呼吸道传染病，全球每年约有1600万人因感染百日咳博德特氏菌而发病，约19.5万人因此死亡，其中，多数系发展中国家的婴幼儿。接种百日咳疫苗是预防和消灭百日咳的主要手段,无细胞百日咳疫苗较全细胞百日咳疫苗具有接种副反应轻微和良好的免疫效果，必将逐步取代全细胞百日咳疫苗广泛用于全程免疫和加强免疫。全细胞百白破疫苗和无细胞百白破疫苗主要区别在于所含抗原成分不同：前者抗原成分是百日咳博德特氏菌菌体，后者含有百日咳博德特氏菌的5种保护性抗原：百日咳毒素（PT）、丝状血凝素（FHA）、百日咳粘着素（PRN）、纤毛凝集原(Fim2、Fim3)，进而避免全细胞百白破疫苗可能产生严重的异常反应如脑炎等，就更加安全、同时提高了免疫效果。
[3-6]鉴于此，世界卫生组织（WHO）推荐发达国家和有经济能力的发展中国家应考虑使用五价无细胞百日咳疫苗。
玻片凝集试验能定性检测CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分，该方法原理：用已知的Fim2、Fim3抗体标准品作为诊断血清、与受检CMCC58003菌悬液各滴加在干净玻片上，混匀，数分钟后即可肉眼观察凝集结果，出现凝集现象的为阳性反应。此法具有灵敏、快速及操作简便等优点，常用于菌种鉴别等定性工作中。
在Fim2、Fim3抗原成分检测过程中，为了保证试验结果的可靠性，减小因试验操作原 因导致的误差，已设立阴性对照。考虑将引进明确含有Fim2、Fim3抗原的菌种CMCC58003，以此菌种菌悬液来设立阳性对照，从而可以进一步保障试验结果的可靠性。
CMCC58003的生物危害性为3类，就要求实验室必须已通过生物安全二级实验室备案登 记，菌液的制备、脱毒及玻片凝集试验等实验活动必须在二级生物安全柜内进行，实验人员需规范穿衣戴帽，并严格遵守标准操作程序操作，严防实验人员、试验样本及实验室环境被感染和污染/交叉污染，以保障生物安全、生产安全，同时减少假阳性产生风险[7,8]。
将近几年来共5个批次CMCC58003按照《中国药典》（2010年版 三部）规定进行了Fim2、
Fim3抗原成分的血清学检测，其玻片凝集反应都为阳性。本试验结果提示5个批次的CMCC58003都含有Fim2、Fim3保护性抗原。
4 参考文献
[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（2010年版 三部）[M].北京：中国医药科
技出版社，2010：63.
[2] 周德庆，胡宝龙，祖若夫，等.微生物学实验教程 [M]. 2版.北京：高等教育出版社，
2006：244-247.
[3] 世界卫生组织.WHO关于百日咳疫苗的立场文件[Z]. 瑞士: 日内瓦,2010-10:3.
[4] 迮文远，刁连东，苏万年，等.计划免疫学 [M].上海：上海科学技术文献出版社，
1997：311-329.
[5] 孙述学.无细胞百日咳疫苗的质量控制及其标准化[J].微生物学免疫学进展，2001，29
（1）：83-85.
[6] 谢广中.无细胞百日咳疫苗的发展及应用[J].上海预防医学杂志，2006，18（1）：6-8.
[7] 国务院.病原微生物实验室生物安全管理条例[S]. 北京：北京大学医学出版社，2006.
[8] 世界卫生组织.实验室生物安全手册 [M]. 3版.瑞士: 日内瓦,2004.
(收稿日期：2012-05-11)