第38卷
2010年12月分析化学(FE N X I H U A X U E ) 研究简报C h i n ese 第12期1793—1796Jour nal of A nal yti cal C h em i s t r y
酶促电化学发光法测定血清总胆汁酸
丁敏’王箭张晓清邓文平
(重庆医科大学医学检验系，临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆400016)
摘要利用胆汁酸在氧化型辅酶I (N A D +)共存下被3a ．类固醇脱氢酶(3a ．H SD ) 催化脱氢，同时N A D +被
还原为还原型辅酶I (N A D H ) 可增强三联吡啶钌(R u(bpy ) ；+)的电化学发光(EC L) 信号，实现电化学发光法
间接检测胆汁酸。检测池中含2．5m m oV L Ru(bpy) ；+，833U ／L 3a —H S D o i ／L N ，70nm A D +，50m m ol ／L 磷酸
盐缓冲液(p H8．0) 。EC L 强度与胆汁酸的浓度在1．0—100f m oV L 范围内呈良好的线性关系，线性方程，，=
0．7707x+12．04(r =0．9975) ；检出限为0．02f m ol ／L ；平均回收率为97．5％。本方法与临床采用的酶循环放
大法有较好的相关性。
关键词胆汁酸；电化学发光；酶；血清
1引言
胆汁酸(B i l e ac i d ，B A ) 是内源性胆同醇在肝脏内的主要代谢产物，目前认为血清总胆汁酸水平是唯一可同时反映肝脏分泌、合成与代谢及肝细胞损伤三方面的血清学指标…。检测总胆汁酸的常用方法有高效液相色谱(H PL C) 法【2j 、高效液相色谱一质谱(H PL C ．M S) 法【31和酶法M J 。色谱法需要衍生和水解，测定过程较为繁琐；而质谱法价格昂贵，都不适合临床检测。临床使用的酶循环放大法”1测定总胆汁酸成本较高，且灵敏度有待进一步提高。
电化学发光(El ect r ochem i l um i nesc ence ，E C L) 分析法具有可控性好、灵敏度高、选择性好、仪器简单等优点。EC L 法中采用较多的是在水溶液中具有良好电化学可逆性和稳定性的三联吡啶钌反应体系一，8J 。还原型辅酶I(N A D H ) 是许多酶反应的辅酶且能够与Ru(bpy) ；+发生电化学发光，经酶反应可将不能与Ru(bpy) ；+反应产生EC L 的物质(如葡萄糖、乙醇和二氧化碳等) 与可以发光的N A D H 相关联，实现其酶促间接EC L 检测【9．10l 。本实验采用3a 一羟类固醇脱氢酶(3a-H SD ) 对胆汁酸(3a-羟类固醇) 进行催化脱氢，伴随氧化型辅酶I (NA D +)被还原为N A D H ，建立了酶促电化学发光检测血清总胆汁酸的方法。本方法不需对标本进行前处理，灵敏度高，快速，且与现临床采用的酶循环放大法有较好的相关性。2实验部分
M PI —B 型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈分析仪器有限公司) 。电化学发光检测采用三电极2．1仪器与试剂体系：Pt 圆盘电极(咖500t un) 为工作电极、P ￡丝(1r ai n) 为对电极、A g ／A gC l (饱和K C l ) 为参比电极。
Ru(bpy)；+和胆汁酸标准品(Si gm a-A l dri ch 公司) ；3a —H SD (酶活力为6．09
司) 纯化。
2．2实验方法U ／m g ，迈克公司) ；N A D +和N A D H (R oche 公司) ；其它试剂均为国产分析纯。实验用水经M i l l i —O 系统(美国M i l l i pore 公
将电化学发光检测池放人发光检测仪的暗盒中，使透光窗正对光电倍增管入射窗，检测池中含
2．5m m oV L R u(bpy) ；+，833U ／L 3a-H ol ／L N SD ，70nm A D +，50m m ol ／L 磷酸盐缓冲液(P B S ，pH 8．0) ，光电倍增管高压为一700V 。每次实验开始时，一般在0．2—1．25V (佻．A g ／A gCl ) 内进行循环伏安扫描，若可得到重复可逆的循环伏安谱图，则认为电极体系运行正常。恒电位设置为1．17V ，待发光信号2010-04-20收稿；20104) 7-06接受
}Em ai l ：di n gm i n@cqm u ．edu ．c n
第38卷
2010年12月分析化学(FE N X I H U A X U E ) 研究简报C h i n ese 第12期1793—1796Jour nal of A nal yti cal C h em i s t r y
酶促电化学发光法测定血清总胆汁酸
丁敏’王箭张晓清邓文平
(重庆医科大学医学检验系，临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆400016)
摘要利用胆汁酸在氧化型辅酶I (N A D +)共存下被3a ．类固醇脱氢酶(3a ．H SD ) 催化脱氢，同时N A D +被
还原为还原型辅酶I (N A D H ) 可增强三联吡啶钌(R u(bpy ) ；+)的电化学发光(EC L) 信号，实现电化学发光法
间接检测胆汁酸。检测池中含2．5m m oV L Ru(bpy) ；+，833U ／L 3a —H S D o i ／L N ，70nm A D +，50m m ol ／L 磷酸
盐缓冲液(p H8．0) 。EC L 强度与胆汁酸的浓度在1．0—100f m oV L 范围内呈良好的线性关系，线性方程，，=
0．7707x+12．04(r =0．9975) ；检出限为0．02f m ol ／L ；平均回收率为97．5％。本方法与临床采用的酶循环放
大法有较好的相关性。
关键词胆汁酸；电化学发光；酶；血清
1引言
胆汁酸(B i l e ac i d ，B A ) 是内源性胆同醇在肝脏内的主要代谢产物，目前认为血清总胆汁酸水平是唯一可同时反映肝脏分泌、合成与代谢及肝细胞损伤三方面的血清学指标…。检测总胆汁酸的常用方法有高效液相色谱(H PL C) 法【2j 、高效液相色谱一质谱(H PL C ．M S) 法【31和酶法M J 。色谱法需要衍生和水解，测定过程较为繁琐；而质谱法价格昂贵，都不适合临床检测。临床使用的酶循环放大法”1测定总胆汁酸成本较高，且灵敏度有待进一步提高。
电化学发光(El ect r ochem i l um i nesc ence ，E C L) 分析法具有可控性好、灵敏度高、选择性好、仪器简单等优点。EC L 法中采用较多的是在水溶液中具有良好电化学可逆性和稳定性的三联吡啶钌反应体系一，8J 。还原型辅酶I(N A D H ) 是许多酶反应的辅酶且能够与Ru(bpy) ；+发生电化学发光，经酶反应可将不能与Ru(bpy) ；+反应产生EC L 的物质(如葡萄糖、乙醇和二氧化碳等) 与可以发光的N A D H 相关联，实现其酶促间接EC L 检测【9．10l 。本实验采用3a 一羟类固醇脱氢酶(3a-H SD ) 对胆汁酸(3a-羟类固醇) 进行催化脱氢，伴随氧化型辅酶I (NA D +)被还原为N A D H ，建立了酶促电化学发光检测血清总胆汁酸的方法。本方法不需对标本进行前处理，灵敏度高，快速，且与现临床采用的酶循环放大法有较好的相关性。2实验部分
M PI —B 型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈分析仪器有限公司) 。电化学发光检测采用三电极2．1仪器与试剂体系：Pt 圆盘电极(咖500t un) 为工作电极、P ￡丝(1r ai n) 为对电极、A g ／A gC l (饱和K C l ) 为参比电极。
Ru(bpy)；+和胆汁酸标准品(Si gm a-A l dri ch 公司) ；3a —H SD (酶活力为6．09
司) 纯化。
2．2实验方法U ／m g ，迈克公司) ；N A D +和N A D H (R oche 公司) ；其它试剂均为国产分析纯。实验用水经M i l l i —O 系统(美国M i l l i pore 公
将电化学发光检测池放人发光检测仪的暗盒中，使透光窗正对光电倍增管入射窗，检测池中含
2．5m m oV L R u(bpy) ；+，833U ／L 3a-H ol ／L N SD ，70nm A D +，50m m ol ／L 磷酸盐缓冲液(P B S ，pH 8．0) ，光电倍增管高压为一700V 。每次实验开始时，一般在0．2—1．25V (佻．A g ／A gCl ) 内进行循环伏安扫描，若可得到重复可逆的循环伏安谱图，则认为电极体系运行正常。恒电位设置为1．17V ，待发光信号2010-04-20收稿；20104) 7-06接受
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