21(2)109-112 中国生物防治 ChineseJournalofBiologicalControl 2005年5月
淡紫拟青霉诱变菌株的RAPD分析
张延新1,刘开启23,3,(1.山东农业大学植物保护学院,泰安 271018;2., 510225;
3.云南烟草科学研究所,653100)
摘要:选用615株突变菌株的全基因组DNA进行随机多态性扩增～的DNA片段,多态检测率为83.3%。利用UPG2,结果表明:供试菌株具有丰富的遗传多样性,应用RAPD;参照突变菌株表型特性上的改变,该方法。
关 键 词:淡紫拟青霉;遗传多样性;RAPD
中图分类号:S476.12 文献标识码:A 文章编号:100529261(2005)0220109204
RAPDAnalysisof16IsolatesofPaecilomyceslilacinusIPC
ZHANGYan2xin,LIUKai2qi,XIAZhen2yuan,LITian2fei
(CollegeofPlantProtection,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018,China)
Abstract:ThegenomicDNAofIPCandits15mutatedisolateswasputthroughRAPDwith6arbitraryprimers.114DNAfragmentsrangedfrom250to2500bpwasamplified.Polymorphismdetectionratewas83.3%.ClusteranalysisoftheRAPDprofilesbyusingUPGMAdisplayedthatthestudiedisolateshavegeneticpolymorphism.TheRAPDcandetectthemutationanditsdegreequicklyandaccurately.Italsoprovidedproofforthegeneticchangesofthemutatedisolateswhichshowchangesofphenotypiccharacter2istics.
Keywords:Paecilomyceslilacinus;geneticpolymorphism;RAPD
淡紫拟青霉[Paecilomyceslilacinus(Thom)Samson]是根结线虫卵寄生菌和多种昆虫及其他植物寄生线虫的一种重要天敌,具有极高的应用价值[1]。由云南省烟草科学研究所生物技术重点实验室筛选的淡紫拟青霉IPC菌株,大田试验对烟草根结线虫的防治效果达60%以上。采用紫外线照射和化学诱变剂处理孢子的方法诱变选育出7株卵寄生率得到提高的优良性状菌株。为了证明各突变菌株在遗传上是否发生了改变,本试验采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对其进行DNA片段遗传距离聚类分析,以揭示改良菌株寄生率变化与DNA突变
收稿日期:2004208227
基金项目:广东省自然基金(021923);云南省“十五”攻关项目(2001NG08);国家烟草专卖局科技项目([1**********]0)作者简介:张延新(19792),女,硕士研究生;3通讯作者,电话[1**********]9,E2mail:[email protected]。
109
中国生物防治 第21卷
位点之间的关系。
1 材料和方法
1.1 供试菌株
淡紫拟青霉IPC菌株由本室保藏,正突变菌株7个、负突变菌株4个1)表 编号
1234
菌株
UV23072寄生率提高
(%)17.16.87
编号
5678
2404HN2407IPC原始菌株
(2316.0515.230
9101112
UV2108SD2105HN2304DJ2107
寄生率提高
(%)-15.59-6.00-28.13-26.15
编号
13141516
菌株
UV2104SD2207HN2210DJ2207
寄生率提高
(%)2.943.218.475.08
注:UV为紫外线处理菌株,HN为亚硝酸处理菌株,SD为硫酸二乙酯处理菌株,DJ为氮芥处理菌株。
1.2 菌丝的培养收集
采用摇瓶法收集菌丝。将菌株接种于盛有100mlPD培养液的三角瓶中,150r/min、28℃振荡培养7d,抽滤机滤干。将菌丝体收集置于1.5ml离心管内,-20℃冰箱保存备用。1.3 DNA提取与检测
1.3.1 DNA提取 采用改良氯化苄方法[2]。
1.3.2 DNA检测 以0.5×TBE缓冲液制备0.8%～1.0%的琼脂糖凝胶,同时加入EB使终
μμμ浓度为0.5g/ml。取DNA样品3l和6×LoadingBuffer2l混合后点样,在5v/cm电压下进行电泳。约40min后关掉电源,将胶板放到紫外检测仪上直接观察。DNA浓度应用GeneQuant
pro仪器进行测定。
1.4 RAPD分析
1.4.1 RAPD引物 以IPC菌株和突变菌株UV2307、UV2309的基因组DNA为模板,对上海生
工生物工程技术有限公司生产的6组(A21～20、C21～20、D21～20、L21～20和M21～20)共120个10碱基寡核苷酸单链随机引物进行筛选。筛选出重复性好、扩增谱带清晰、不加模板均无任何谱带扩出的引物,用于淡紫拟青霉突变菌株全基因组DNA遗传标记和指纹图谱分析。μμμ1.4.2 RAPD2PCR扩增体系 反应体系总体积为25l,成分如下:16.4lddH2O,2.5l10×μμμμμBuffer,1.8lMgCl2(2.5mmol/L),2.0ldNTP(2.5mmol/L),1.0lPrimer(5mol/L),0.3lTaqE(5U),1.0μl模板DNA(约50ng)。按顺序分别加入PCR管充分混匀,短暂离心,进行PCR扩增。1.4.3 RAPD2PCR扩增程序 扩增程序按以下循环进行:94℃1min;94℃30s,37℃1min,72℃
μμ1min,进行45次循环;72℃10min。扩增后取5l样品和2l6×LoadingBuffer混合后点样,将胶板放到紫外检测仪上直接观察,然后用凝胶成像系统照相。
1.4.4 扩增产物的分析 电泳获得全基因组DNA指纹图谱中的每一条RAPD谱带的有无作
为统计参数,有记为1,无记为0;计算样品间的距离系数D∶D=1-2(Nxy)/(Nx+Ny)。其中Nxy是两样品间PCR扩增分子量相同的DNA片段总数;Nx,Ny分别是样本x和样本y的PCR扩增产物的DNA片段总数。根据遗传距离,采用UPGMA(UnweighedPairGroupMethodwithArithmeticMean)聚类分析法,利用Statistica软件自动生成UPGMA聚类图。110
第2期 张延新等:淡紫拟青霉诱变菌株的RAPD分析
2 结果与分析
2.1 引物的筛选
对各突变菌株的DNA进行RAPD扩增,从中筛选出62)。经统计,6个引物对16个菌株共标出114条特异性谱带,,多态性检测率为83.3%。
表2 引物Ⅰ.OPC211Ⅱ.OPL22碱基序列(5’)
-3’
GRAPD19
条101616
Ⅳ.OPA202Ⅴ.OPA220Ⅵ.OPD205总数
碱基序列(5’)-3’
TGCCGAGCTGACCCGGGTCATGAGCGGACA
RAPD标记
条带总数
201626114
多态性
条带
19142095
2.2 图谱分析
在本试验选用的扩增体系下,所筛选出的6个引物对16个菌株均有较好的扩增效果。扩增产物(DNA片段)经电泳,可分离出清晰的谱带(图1)。由RAPD2PCR扩增图谱可以看出,标记出的DNA片段分子量大部分集中在250～2500bp之间。同一引物对各菌株的扩增带型不相同,不同引物对16个菌株的扩增带型也都不相同。由此表明,供试菌株间表现出丰富的遗传多样性,说明15个突变菌株相对于原始菌株的遗传性状发生了明显分化。
点样顺序:从左向右依次为Marker和菌株1～16(M:GeneRulerTM1KbDNAladder)
图1 引物OPL202对16个供试菌株的RAPD图谱
2.3 RAPD聚类分析
从16个供试菌株遗传距离树状聚类图(图2)可以得出:以0.34的遗传距离为阈值,供试
菌株可以划分为10个RAPD组,其中寄生率变化不大的菌株13～16(UV2104、SD2207、HN2210、DJ2207)先聚为一组,正突变菌株4(UV221)和5(HN2402)聚为一组,负突变菌株9、10(UV2108、SD2105)和11、12(HN2304、DJ2107)分别聚为一组,其他菌株1～3和6～8(UV2307、UV2309、UV214和HN2404、HN2407、IPC原始菌株)各自为一组。由此可以看出按此划分与按照寄生性划分
的结果一致。若按照遗传距离0.64进行划分,可以划分为3个RAPD组,其中负突变率很高的菌株11和12单独为一组,表明正突变及突变率不高的菌株与负突变率很高的菌株在同源性上存在明显差异。但菌株3单独划分为一组,表明该菌株与其他正突变菌株存在差异。
111
中国生物防治 第21卷
结合寄生率测定结果,RAPD分析结果可以作为淡紫拟青霉诱变菌株鉴定的依据之一,该技术可以快速准确地鉴定各菌株是否发生了遗传突变。还发现不同诱变方法获得的菌株在遗传性上无明显的关系,由此说明各诱变方法对菌株的突变效果有很大随机性,同,寄生率提高的菌株之间也有很大差异。寄生特性是由多基因位点或基因簇控制的。
图2 6个引物对淡紫拟青霉16个供试菌株的RAPD平均UPGMA聚类图
3 讨论
在真菌的分类及系统进化研究中,RAPD用于种、属内不同种和属间的分类鉴定的报道较
多[4～9]。本试验通过16个菌株的扩增图谱和遗传距离的聚类分析,各诱变菌株与原始菌株比较,都在DNA水平上发生了突变,表现出了极高的遗传多样性。突变程度高和突变程度低的菌株可以被区分开,负突变程度很高的菌株与正突变菌株及突变率不高的菌株同源性差异显著,7株正突变菌株在遗传上发生了较大程度的突变,差异也较明显。初步证明RAPD技术作为一种快速准确的分子标记技术,可鉴定淡紫拟青霉菌株是否突变及突变程度,适用于鉴定淡紫拟青霉诱变菌株的遗传多样性。针对在生物学等表型特性上发生改变的诱变菌株,该方法为其在遗传性上是否发生分化提供了依据。但是控制该菌寄生性的基因还不清楚,还有待于继续筛选随机引物或合成特异性引物,从而为快速鉴定淡紫拟青霉突变菌株提供依据。
参考文献
[1] DomachKH,GernaW,AndersonTH.CompendiumofSoilFungi[M].LondonAcademicPress,1981.530-532.[2] 朱衡,瞿峰,朱立煌.利用氯化苄提取分子生物学分析的真菌DNA[J].真菌学报,1994,13(1):34-40.
[3] TommerupIC,BartonJE,O’BrienPA.ReliabilityofRAPDfinger2printingofthreebasidiomycetefungi,Laccaria,Hydnangium
andRhizoctonia[J].MycolRes,1995,99(2):179-186.
[4] SharmaTR,TewariJP.RAPDanalysisofthreeAlternariaspeciespathogenictocrucifers[J].MycolRes,1998,102(7):807-814.
[5] 阎培生,罗信昌,周启.利用RAPD技术对木耳属种进行分类鉴定的研究[J].菌物系统,2000,19(1):29-33.[6] 姜子德,梅曼彤,戚佩坤.广东果树上17种拟茎点霉的RAPD分析[J].植物病理学报,2003,33(1):35-39.[7] 黄春燕,刘开启.苹果轮纹病及其相关病害病原菌的RAPD分析[J].植物病理学报,2001,31(2):164-169.[8] 刘开启,郭泺.果树胶孢炭疽菌的RAPD分析[J].仲恺农业技术学院学报,2002,15(4):1-7.
[9] 刘开启,杨炜华,郭泺.杏果实黑斑病菌及近似链格孢种的RAPD分析[J].仲恺农业技术学院学报,2004,17(1):16.
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21(2)109-112 中国生物防治 ChineseJournalofBiologicalControl 2005年5月
淡紫拟青霉诱变菌株的RAPD分析
张延新1,刘开启23,3,(1.山东农业大学植物保护学院,泰安 271018;2., 510225;
3.云南烟草科学研究所,653100)
摘要:选用615株突变菌株的全基因组DNA进行随机多态性扩增～的DNA片段,多态检测率为83.3%。利用UPG2,结果表明:供试菌株具有丰富的遗传多样性,应用RAPD;参照突变菌株表型特性上的改变,该方法。
关 键 词:淡紫拟青霉;遗传多样性;RAPD
中图分类号:S476.12 文献标识码:A 文章编号:100529261(2005)0220109204
RAPDAnalysisof16IsolatesofPaecilomyceslilacinusIPC
ZHANGYan2xin,LIUKai2qi,XIAZhen2yuan,LITian2fei
(CollegeofPlantProtection,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018,China)
Abstract:ThegenomicDNAofIPCandits15mutatedisolateswasputthroughRAPDwith6arbitraryprimers.114DNAfragmentsrangedfrom250to2500bpwasamplified.Polymorphismdetectionratewas83.3%.ClusteranalysisoftheRAPDprofilesbyusingUPGMAdisplayedthatthestudiedisolateshavegeneticpolymorphism.TheRAPDcandetectthemutationanditsdegreequicklyandaccurately.Italsoprovidedproofforthegeneticchangesofthemutatedisolateswhichshowchangesofphenotypiccharacter2istics.
Keywords:Paecilomyceslilacinus;geneticpolymorphism;RAPD
淡紫拟青霉[Paecilomyceslilacinus(Thom)Samson]是根结线虫卵寄生菌和多种昆虫及其他植物寄生线虫的一种重要天敌,具有极高的应用价值[1]。由云南省烟草科学研究所生物技术重点实验室筛选的淡紫拟青霉IPC菌株,大田试验对烟草根结线虫的防治效果达60%以上。采用紫外线照射和化学诱变剂处理孢子的方法诱变选育出7株卵寄生率得到提高的优良性状菌株。为了证明各突变菌株在遗传上是否发生了改变,本试验采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对其进行DNA片段遗传距离聚类分析,以揭示改良菌株寄生率变化与DNA突变
收稿日期:2004208227
基金项目:广东省自然基金(021923);云南省“十五”攻关项目(2001NG08);国家烟草专卖局科技项目([1**********]0)作者简介:张延新(19792),女,硕士研究生;3通讯作者,电话[1**********]9,E2mail:[email protected]。
109
中国生物防治 第21卷
位点之间的关系。
1 材料和方法
1.1 供试菌株
淡紫拟青霉IPC菌株由本室保藏,正突变菌株7个、负突变菌株4个1)表 编号
1234
菌株
UV23072寄生率提高
(%)17.16.87
编号
5678
2404HN2407IPC原始菌株
(2316.0515.230
9101112
UV2108SD2105HN2304DJ2107
寄生率提高
(%)-15.59-6.00-28.13-26.15
编号
13141516
菌株
UV2104SD2207HN2210DJ2207
寄生率提高
(%)2.943.218.475.08
注:UV为紫外线处理菌株,HN为亚硝酸处理菌株,SD为硫酸二乙酯处理菌株,DJ为氮芥处理菌株。
1.2 菌丝的培养收集
采用摇瓶法收集菌丝。将菌株接种于盛有100mlPD培养液的三角瓶中,150r/min、28℃振荡培养7d,抽滤机滤干。将菌丝体收集置于1.5ml离心管内,-20℃冰箱保存备用。1.3 DNA提取与检测
1.3.1 DNA提取 采用改良氯化苄方法[2]。
1.3.2 DNA检测 以0.5×TBE缓冲液制备0.8%～1.0%的琼脂糖凝胶,同时加入EB使终
μμμ浓度为0.5g/ml。取DNA样品3l和6×LoadingBuffer2l混合后点样,在5v/cm电压下进行电泳。约40min后关掉电源,将胶板放到紫外检测仪上直接观察。DNA浓度应用GeneQuant
pro仪器进行测定。
1.4 RAPD分析
1.4.1 RAPD引物 以IPC菌株和突变菌株UV2307、UV2309的基因组DNA为模板,对上海生
工生物工程技术有限公司生产的6组(A21～20、C21～20、D21～20、L21～20和M21～20)共120个10碱基寡核苷酸单链随机引物进行筛选。筛选出重复性好、扩增谱带清晰、不加模板均无任何谱带扩出的引物,用于淡紫拟青霉突变菌株全基因组DNA遗传标记和指纹图谱分析。μμμ1.4.2 RAPD2PCR扩增体系 反应体系总体积为25l,成分如下:16.4lddH2O,2.5l10×μμμμμBuffer,1.8lMgCl2(2.5mmol/L),2.0ldNTP(2.5mmol/L),1.0lPrimer(5mol/L),0.3lTaqE(5U),1.0μl模板DNA(约50ng)。按顺序分别加入PCR管充分混匀,短暂离心,进行PCR扩增。1.4.3 RAPD2PCR扩增程序 扩增程序按以下循环进行:94℃1min;94℃30s,37℃1min,72℃
μμ1min,进行45次循环;72℃10min。扩增后取5l样品和2l6×LoadingBuffer混合后点样,将胶板放到紫外检测仪上直接观察,然后用凝胶成像系统照相。
1.4.4 扩增产物的分析 电泳获得全基因组DNA指纹图谱中的每一条RAPD谱带的有无作
为统计参数,有记为1,无记为0;计算样品间的距离系数D∶D=1-2(Nxy)/(Nx+Ny)。其中Nxy是两样品间PCR扩增分子量相同的DNA片段总数;Nx,Ny分别是样本x和样本y的PCR扩增产物的DNA片段总数。根据遗传距离,采用UPGMA(UnweighedPairGroupMethodwithArithmeticMean)聚类分析法,利用Statistica软件自动生成UPGMA聚类图。110
第2期 张延新等:淡紫拟青霉诱变菌株的RAPD分析
2 结果与分析
2.1 引物的筛选
对各突变菌株的DNA进行RAPD扩增,从中筛选出62)。经统计,6个引物对16个菌株共标出114条特异性谱带,,多态性检测率为83.3%。
表2 引物Ⅰ.OPC211Ⅱ.OPL22碱基序列(5’)
-3’
GRAPD19
条101616
Ⅳ.OPA202Ⅴ.OPA220Ⅵ.OPD205总数
碱基序列(5’)-3’
TGCCGAGCTGACCCGGGTCATGAGCGGACA
RAPD标记
条带总数
201626114
多态性
条带
19142095
2.2 图谱分析
在本试验选用的扩增体系下,所筛选出的6个引物对16个菌株均有较好的扩增效果。扩增产物(DNA片段)经电泳,可分离出清晰的谱带(图1)。由RAPD2PCR扩增图谱可以看出,标记出的DNA片段分子量大部分集中在250～2500bp之间。同一引物对各菌株的扩增带型不相同,不同引物对16个菌株的扩增带型也都不相同。由此表明,供试菌株间表现出丰富的遗传多样性,说明15个突变菌株相对于原始菌株的遗传性状发生了明显分化。
点样顺序:从左向右依次为Marker和菌株1～16(M:GeneRulerTM1KbDNAladder)
图1 引物OPL202对16个供试菌株的RAPD图谱
2.3 RAPD聚类分析
从16个供试菌株遗传距离树状聚类图(图2)可以得出:以0.34的遗传距离为阈值,供试
菌株可以划分为10个RAPD组,其中寄生率变化不大的菌株13～16(UV2104、SD2207、HN2210、DJ2207)先聚为一组,正突变菌株4(UV221)和5(HN2402)聚为一组,负突变菌株9、10(UV2108、SD2105)和11、12(HN2304、DJ2107)分别聚为一组,其他菌株1～3和6～8(UV2307、UV2309、UV214和HN2404、HN2407、IPC原始菌株)各自为一组。由此可以看出按此划分与按照寄生性划分
的结果一致。若按照遗传距离0.64进行划分,可以划分为3个RAPD组,其中负突变率很高的菌株11和12单独为一组,表明正突变及突变率不高的菌株与负突变率很高的菌株在同源性上存在明显差异。但菌株3单独划分为一组,表明该菌株与其他正突变菌株存在差异。
111
中国生物防治 第21卷
结合寄生率测定结果,RAPD分析结果可以作为淡紫拟青霉诱变菌株鉴定的依据之一,该技术可以快速准确地鉴定各菌株是否发生了遗传突变。还发现不同诱变方法获得的菌株在遗传性上无明显的关系,由此说明各诱变方法对菌株的突变效果有很大随机性,同,寄生率提高的菌株之间也有很大差异。寄生特性是由多基因位点或基因簇控制的。
图2 6个引物对淡紫拟青霉16个供试菌株的RAPD平均UPGMA聚类图
3 讨论
在真菌的分类及系统进化研究中,RAPD用于种、属内不同种和属间的分类鉴定的报道较
多[4～9]。本试验通过16个菌株的扩增图谱和遗传距离的聚类分析,各诱变菌株与原始菌株比较,都在DNA水平上发生了突变,表现出了极高的遗传多样性。突变程度高和突变程度低的菌株可以被区分开,负突变程度很高的菌株与正突变菌株及突变率不高的菌株同源性差异显著,7株正突变菌株在遗传上发生了较大程度的突变,差异也较明显。初步证明RAPD技术作为一种快速准确的分子标记技术,可鉴定淡紫拟青霉菌株是否突变及突变程度,适用于鉴定淡紫拟青霉诱变菌株的遗传多样性。针对在生物学等表型特性上发生改变的诱变菌株,该方法为其在遗传性上是否发生分化提供了依据。但是控制该菌寄生性的基因还不清楚,还有待于继续筛选随机引物或合成特异性引物,从而为快速鉴定淡紫拟青霉突变菌株提供依据。
参考文献
[1] DomachKH,GernaW,AndersonTH.CompendiumofSoilFungi[M].LondonAcademicPress,1981.530-532.[2] 朱衡,瞿峰,朱立煌.利用氯化苄提取分子生物学分析的真菌DNA[J].真菌学报,1994,13(1):34-40.
[3] TommerupIC,BartonJE,O’BrienPA.ReliabilityofRAPDfinger2printingofthreebasidiomycetefungi,Laccaria,Hydnangium
andRhizoctonia[J].MycolRes,1995,99(2):179-186.
[4] SharmaTR,TewariJP.RAPDanalysisofthreeAlternariaspeciespathogenictocrucifers[J].MycolRes,1998,102(7):807-814.
[5] 阎培生,罗信昌,周启.利用RAPD技术对木耳属种进行分类鉴定的研究[J].菌物系统,2000,19(1):29-33.[6] 姜子德,梅曼彤,戚佩坤.广东果树上17种拟茎点霉的RAPD分析[J].植物病理学报,2003,33(1):35-39.[7] 黄春燕,刘开启.苹果轮纹病及其相关病害病原菌的RAPD分析[J].植物病理学报,2001,31(2):164-169.[8] 刘开启,郭泺.果树胶孢炭疽菌的RAPD分析[J].仲恺农业技术学院学报,2002,15(4):1-7.
[9] 刘开启,杨炜华,郭泺.杏果实黑斑病菌及近似链格孢种的RAPD分析[J].仲恺农业技术学院学报,2004,17(1):16.
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