运动发酵单胞菌发酵产乙醇的中试研究

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运动发酵单胞菌发酵产乙醇的中试研究[注]

Ferm en tati on p roducti on of ethano l by z ym o m onas m obilis

genetic eng ineering strain Z 4on p ilo t scale

李宜海, 谢晓航, 熊　彬

B y L i Y iha i , X ie X iaohang and X iong B in

(广西轻工业科学技术研究院, 广西南宁　530031)

(Guangxi L igh t Industry Institute of Science and T echuo logy , N anning , Guangxi 530031, Ch ina )

摘　要:从6株Z ym o m onas . m obilis 基因工程菌中筛选出一株乙醇高产菌Z 4, 在500m l 摇瓶小试的基础上利用5L 全自动发酵罐进行了中试放大。结果表明Z 4菌株的最适初糖浓度为18%; pH 610, 35℃, 发酵48h 乙醇最高含量达6719g ・

-1

ethano l w ere 9311g ・L and 7716%.

Key W ords :Z ym o m onas m obilis , P ilo t test ,

Fer m en tati on conditi on s ; 2batch cu ltu re , E thano l p on , Genetic strain s of tho r :L i Y ihai , stry In stitu te of Science and logy , 8, Y ingkai Road , N ann ing , Guangx i 530031, Ch ina .

, 得率达7710%。补料分批培养实验结果表明, 补料时机

以发酵起始后24h 为佳, 发酵48h 后乙醇含量达最高值

9311g ・L -1, 得率为7716%。

关键词:运动发酵单胞菌; 中试研究; 养; 乙醇生产; 基因工程菌中图分类号:T Abstract :A h igh yield ethano l strain w as selected from 6Z ym o m onas m obilis genetic engineering strain s .

T h is strain w as nam ed Z 4and

its

fer m en tati on conditi on s in 5L au to 2fer m en to r w ere studied on the basis of 500m l agitati on flask . A cco rding to the experi m en t resu lts , the op ti m um in itial gluco se concen trati on w as 18%under 35℃, pH 610. Peak p roducti on of the ethano l w as at 48h after fer m en tati on w ith a m ax i m um yield of 6719g ・L -1(7710%p roductivity of alcoho l ) . T he ti m e of feeding in feeding 2batch cu ltu re w as exp lo red and the exp eri m en tal resu lts show ed that the op ti m um

ti m e

feeding

w as

24h

after

fer m en tati on . Peak p roducti on of the ethano l w as at 48h and the h ighest yield and p roductivity of

收稿日期:2005210214

作者简介:李宜海(1978-) , 男, 广东阳江人, 工学硕士, 助理工程师, 广西大学生命科学与技术学院发酵工程专业毕业, 目前从事发酵工程的研究工作。详细地址:南宁市经开区迎凯路8号广西轻工业科学技术研究院开发部, 530031, 电话:[1**********]1, E 2m ail :ai m 7@sina . com 注:本项目为桂科计字[2002]35、39号文件中的广西科学研究与技术开发计划项目(合同编号:桂科能0235027) 。

　　随着石油供应形势的日益严峻, 利用乙醇作为替代能源成为人们关注的焦点。运动发酵单胞菌

(Z ym o m onas . m obilis ) 为兼性厌氧的革兰氏阴性菌, 1928年由L indner 从墨西哥Pu lgue 酒中首先分离得到。Z . m obilis 通过ED 途径(En tner 2Doudo roff

果糖和蔗糖产生乙醇[1], 具Pathw ay ) 利用葡萄糖、

有乙醇产率高(可将98%的葡萄糖发酵生成乙醇) 、菌体生成少, 不需供氧以及易于基因操作等特点, 有可能成为替代酵母进行工业化酒精发酵的生物, 具

有应用于燃料乙醇生产的巨大潜力。但尽管具有这些优良的特性, Z . m obilis 仍没有取代酵母菌用于大规模的乙醇生产。其主要限制因素为:底物范围窄, 不能将纤维素、半纤维素和淀粉等复杂的碳水化合物多聚体转化为乙醇; 发酵时产生副产物如山梨醇、32羟基丁酮、甘油、乙醛及乙酸、胞外果糖等[2]。通过利用基因工程技术对Z . m obilis 进行遗传改造提高其性能, 并利用无载体固定化、连续发酵等先进工艺实现智能化和模式化控制以降低生产成本和能耗, 实现工业化生产, 对缓解我国能源短缺现状, 保护环境和实现可持续发展战略, 具有重要的意义。　　本文对Z . m obilis 基因工程菌进行了筛选, 并在500m l 摇瓶小试的基础上进行了以葡萄糖为原

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料的5L 全自动发酵罐中试实验。1　材料与方法111　菌种

Z ym o m onas . m obilis 基因工程菌Z 1～Z 6, 由清

取样测定乙醇含量。实验结果如表所示。

　　由表可见, 菌株Z 4生产性能最高, 发酵48h 乙醇得率与国内研究机构近年报导的水平接近[2, 5, 6, 7], 因此选取菌株Z 4作为中试的出发菌株。

表　不同菌株产乙醇能力的比较

菌株编号

Z 1Z 2Z 3Z 4Z 5Z 6

华大学生命科学院提供。112培养基

(1) 保存培养基(g L ) :葡萄糖10, 酵母膏15, 蛋白胨10, KH 2PO 41, (N H 4) 2SO 41, M gSO 417H 2O 1, N aC l 1, 琼脂10, pH 610, 011M Pa 灭菌20分钟;

(2) 种子培养基(g L ) :葡萄糖100, 酵母膏15,

乙醇含量(g ・L -1)

[***********]5610

乙醇得率(%)

[***********]176314

蛋白胨10, pH 610, 011M Pa 灭菌20分钟; (3) 发酵培养基(g L ) :葡萄糖180, 酵母膏15, 蛋白胨10, pH 610, 0107M Pa 灭菌30分钟; (4) 流加培养基(g L ) :葡萄糖360, 酵母膏15, 蛋白胨10, pH 610, 0107M Pa 灭菌30分钟。113　设备

B I O STA B I O S 2TA T 公司。114培养条件

m l 摇瓶发酵的

7412L -15L 发2Z . m obilis 基因工程菌发酵的影

响

　　将冰箱保藏的菌种接入一级种子培养基, 250m l 三角瓶装液量100m l , 静置培养24h ; 再以10%接种量接入二级种子培养基, 500m l 三角瓶装量200m l , 静置培养20h 后以10%接种量接入316L 不同葡萄糖浓度的发酵培养基中静置培养, 结果参见图1

。

冰箱保藏的菌种(高层琼脂穿刺培养物) 接入一级种子培养基中, 250m l 三角瓶装液量100m l ; 35℃静置培养16～24小时后, 以体积比10%接种二级培养基500m l 三角瓶装量200m l , 35℃静置培养20h ;

400m l 种子液接种入316L 发酵培养基, 35℃静置培养。培养时间按实验需要安排。115分析方法

(1) 葡萄糖以直接滴定法测定[3];

(2) 乙醇浓度测定[4]:以蒸馏法用酒精计进行测

定再校正为20℃时的酒精浓度。2　结果与讨论211　出发菌株的筛选

图1　初糖浓度对发酵的影响

冰箱保藏的基因工程菌Z 1～Z 6分别穿刺接入六个种子培养基中, 250m l 三角瓶装液量100m l ; 35℃培养16～24小时后, 以体积比10%接种发酵培养基, 500m l 三角瓶装量200m l , 35℃培养48h 后　　由上图可以看出, 对于Z 4菌株, 初糖浓度低于18%时, 乙醇产量随着初糖浓度的增加而增加; 当初糖浓度为18%时, 乙醇含量达最高值6719g ・L -1, 发酵周期为48h , 得率达7710%; 但如果葡萄糖浓度

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过高, 则产生的高渗透压不利于运动单胞菌的生长,

所以当初糖浓度为2215%时, 只产生少量的乙醇。213　补料的起始时间对Z . m obilis 基因工程菌发

48h 后乙醇含量达到最高值9311g ・L -1, 得率为7716%

。

酵的影响

　　由图1可见, 分批培养难以实现高产量、高得率和高生产强度的统一。因此, 有必要寻求其他培养方式来实现。另一方面, Z . m obilis 虽具有乙醇产率高的特点, 但其延迟期较长, 适合工业化连续发酵或菌体循环发酵[5]。因此, 利用全自动发酵罐的自动控制功能, 进行了葡萄糖总浓度2215%的补料分批培养实验。

补料的原则在于控制微生物的中间代谢, 使之向着有利于产物积累的方向发展。图2所示为初糖浓度为18%时分批发酵时乙醇和残糖变化曲线

。

图3　补料的起始时间对Z . m obilis 基因工程菌发酵的影响

3　结论

6Z . m , 得到5L 全自动发酵罐成功进行了以葡萄糖为原料的细菌发酵酒精中试实验, 研究了补料分批培养对乙醇产量的影响。实验结果表明, 在葡萄糖总浓度为2215%时, 补料时机以发酵起始后24h 为佳; 发酵48h 后, 乙醇含量达最高值9311g ・

图2　分批发酵时乙醇与残糖变化曲线

-1

, 得率达7716%。补料分批培养有利于提高乙醇

的产量和得率, 该结论对今后实现细菌发酵酒精的工业化生产具有指导意义。

参考文献

[1]　P . GUNA SEKA RAN , et , al . . Fer m entati on pattern of

Z ym o m onas m obilis strains on different substrates —a

　　由图2可知, 当葡萄糖浓度为18%时, 在18h

至30h 之间, 耗糖速率基本保持在6189g ・L -1・h

□

左右; 因此, 选取发酵起始培养基初糖浓度为18%, 体积为3L ; 种子液体积300m l ; 流加培养基初糖浓度为36%, 体积为1L ; 补料方式为恒速滴加, 速度为每小时67m l , 15h 内补完, 醪液最终体积为4L 。

-1

comparative study . J . B iosci , 1986. 10(2) :181～186.

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[3]　大连轻工业学院, 等1食品分析1北京:中国轻工业出

在确定补料的内容后, 选择适当的时机是相当

重要的。参考图2所示的耗糖曲线, 分别选取发酵起始20h , 24h , 28h 后进行补料, 在不同时间取样测定乙醇含量, 结果见图3。

　　由图3可见, 采用补料分批培养方式进行发酵, 可以在总葡萄糖浓度2215%的条件下进行乙醇发酵。开始补料时间以发酵起始24h 后为宜, 补料过早, 因菌体数量少不足以消耗培养液中的糖分, 造成葡萄糖浓度过高, 发酵缓慢; 补料过迟, 则菌种已老化, 也不利于发酵。接种后24h 开始补料, 在发酵

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