土壤微生物的分离纯化与鉴定
姓名：胡雪芳
学号：[1**********]3
班级：泰山学堂2013级
组别：第4组
时间：2016.06.25
同组者：王钰珅
【实验目的】
1. 学习运用涂布和划线分离法获得细菌，掌握微生物的分离纯化方法和无菌操
作技术；
2. 学习测定土壤中细菌数目，种类的方法；
3. 掌握菌株筛选、分离纯化、菌种鉴定等操作的具体流程；
4. 初步掌握微生物的菌种保藏技术。
【实验原理】
土壤微生物是指生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌、藻类的总称。其个体微小，一般以微米或毫微米来计算，通常1克土壤中有106～109个，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株 不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。要研究某种微生物的特性或要确定某些微生物菌株的分类地位，首先须使该微生物为纯培养。也就是说培养物中所有的细胞只是微生物的某一个或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。
从复杂的微生物群体中获得只含有一种或一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。单细胞挑取法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法和平板划线法是分离纯化微生物的常规方法。通过稀释涂布平板法可以在平板上获得单菌落，再通过挑取单菌落进行平板划线分离可获得纯培养。在稀释涂布平板法中还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。
对微生物分类的主要依据有形态特征、生理生化特征性等。形态特征包括个体形态和培养形态。细胞形状、大小、排列，革兰氏染色反应，运动性，鞭毛位置、数目，芽孢有无、形状和部位都是个体形态的特点。培养形态指微生物在培养基（包括固体和液体培养）中生长的形态特征。通过细菌的形态特征可以对微生物进行分类鉴定。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的终产物的不同，反应出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。
下面介绍实验中涉及技术的原理：
1. 平板分离技术与活菌计数
固平板菌落计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中的细胞密度。由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自2个或者多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落数来表示样品中活菌含量的原因。
2. 微生物的分离和纯化
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混
杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等
条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
3. 革兰氏染色
革兰氏染色法可以将细菌分成革兰氏阳性和革兰氏阴性两种类型，这是由于两种细菌的细胞壁的组成结构不同。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为酶染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物。增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%的乙醇作为脱色剂进行处理时，两种菌的脱色效果不同。革兰氏阳性菌细胞壁中的肽聚糖的含量高，壁厚切脂质含量低，其网孔结构可以滞留复合物。但是在革兰氏阴性菌中，肽聚糖的含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时则会溶解，细胞壁的透性就会增加，从而讲复合物洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂染色后又变为复染剂颜色。
4.芽孢染色
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段后形成的一种抗逆性很强
的休眠体结构。也成为内生孢子，通常为圆形或者椭圆形。与正常细胞或者菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。所以利用着色能力强的染料在加热条件下染色，使染料即可以进入菌体也可以进入芽孢，然后水洗脱色菌体中的染料被洗脱，但是芽孢中的染料仍然存在，从而对芽孢进行了染色。
5.微生物的生理生化反应
在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶
促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，
或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
5.1淀粉的水解
由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。
5.2糖发酵试验
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
5.3IMViC实验
IMViC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
5.3.1吲哚试验
吲哚实验是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
5.3.2甲基红试验（MR）
某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由
橙黄色转变为红色，即甲基红反应。大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
5. 阿莫西林
阿莫西林又名安莫西林或安默西林，是一种最常用的半合成青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，为一种白色粉末，半衰期约为61.3分钟。在酸性条件下稳定，胃肠道吸收率达90%。阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞膜的能力也强。是目前应用较为广泛的口服半合成青霉素之一，也是在自然界中微生物产生了巨大抗药性的一种普遍抗生素种类。
阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞壁的能力也强。口服后药物分子中的内酰胺基立即水解生成肽键，迅速和菌体内的转肽酶结合使之失活，切断了菌体依靠转肽酶合成糖肽用来建造细胞壁的唯一途径，使细菌细胞迅速成为球形体而破裂溶解，菌体最终因细胞壁损失，水份不断渗透而胀裂死亡。对大多数致病的G+菌和G-菌(包括球菌和杆菌)均有强大的抑菌和杀菌作用。其中对肺炎链球菌、溶血性链球菌等链球菌属、不产青霉素酶葡萄球菌、粪肠球菌等需氧革兰阳性球菌，大肠埃希菌、奇异变形菌、沙门菌属、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需氧革兰阴性菌的不产β内酰胺酶菌株及幽门螺杆菌具有良好的抗菌活性。血液透析能清除部分药物，但腹膜透析无清除本品的作用。
实验中，运用以上技术，操作原理如下：
1. 在确定土样环境之后，对土壤溶液样品进行稀释，在选择培养基上进行涂布
分离。在进行微生物的菌落计数后再进行进一步的纯化分离。
2. 经过划线分离、复筛等步骤的纯化，得到特定的六种纯化细菌。
3. 对得到的纯种细菌进行染色和穿刺实验，观察细菌形态以及运动性，再对所
筛菌种进行生理生化试验。通过查阅《伯杰氏手册》对微生物的分类进行定
位（定位到菌种的属别）。
【实验材料】
1. 菌株
分离所得菌种（山东大学化学老楼后，世纪林等）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。
2. 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（固体、半固体、液体）、淀粉培养基（固体）、油脂培养
基（固体）、葡萄糖发酵培养基（液体）、乳糖发酵培养基（液体）、蛋白胨水培养基（液体）、葡萄糖蛋白胨水培养基（液体）
3. 实验试剂
结晶紫染液、碘液、95﹪乙醇、番红复染液、孔雀绿水溶液、吕氏碱性美篮染液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、溴甲酚紫乙醇溶液、蒸馏水、中性红试剂、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、酵母粉、NaCl、稀盐酸、NaOH溶液、可溶性淀粉、花生油、葡萄糖、乳糖、K2HPO4。
4. 实验仪器和其他用品
试管架、试管、小试管、滴管、锥形瓶、棉塞、记号笔、解剖刀、涂布棒、移液枪、枪尖、50% 乙醇、20% 的甘油、酒精灯、接种环、烧杯、培养皿、镊子、载玻片、盖玻片、载玻片夹子、显微镜、双层瓶（香柏油和二甲苯）、擦镜纸、灭菌锅、滤纸圆片、恒温培养箱、无菌水。
【实验步骤】
1. 微生物的筛选、分离纯化及保种
1.1微生物的筛选
1.1.1配制牛肉膏蛋白胨培养基
按照附表配方配制牛肉膏蛋白胨培养基，调节pH，包好灭菌。
1.1.2土样处理
将采集的土壤样本平铺在滤纸上，放在37℃培养箱内过夜烘干。烘干后用纱布过滤除去较大土壤颗粒，保留较细土壤颗粒。
1.1.3划线
将300ml牛肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至不烫手时，按照10μg/ml的量加入已过滤除菌的阿莫西林，待其溶解混匀后倒平板，在培养皿盖周边用记号笔做好标记。
取土壤10g，加入5ml的蒸馏水和1g达克宁将其混合均匀，用接种环划线。每个土壤样本进行3次重复。并留一没有加阿莫西林的平板进行划线，作为对照。
1.1.4培养
将平板倒置于37℃恒温箱中培养1天。
1.2微生物的分离纯化
取加阿莫西林的牛肉膏蛋白胨培养基，在培养皿盖周边用记号笔做好标记并划分区域，挑取前一天平板上的菌落进行划线分离，然后将平板倒置于37℃恒温箱中培养1天。
该步骤重复三次，即进行3层筛选。
划线分离具体步骤：
（1）先在平皿上划定区域（一般分为3区），然后在超净工作台中，将接种针在
火焰上灼烧灭菌。
（2）取含菌种的培养皿，在火焰上方，打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划
线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好。
（3）再取空白培养基，在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭
菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，划完后引线到3区，划线完毕后盖盖平放，将平板倒置于37℃恒温箱中培养1天。1天后再划线一次直到出现单菌落。
1.3保种
用接种环挑取单菌落，将细菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基。将试管置于37℃恒温箱中培养。培养1天后的试管可以置于4℃冰箱中继续保种。
2. 细菌的染色及镜检
2.1细菌单染色
（1）洗片干燥
（2）涂片
（3）加热固定干燥（在火上固定时，用手背试涂片反面的热度，以不烫手为宜）
（4）滴加结晶紫染液覆盖于涂菌处，染色1.5min
（5）水洗、干燥
（6）镜检
2.2细菌革兰氏染色
（1）洗片、干燥
（2）涂片
（3）加热固定干燥 （在火上固定时，用手背试涂片反面的热度，以不烫手为宜）
（4）初染：滴加结晶紫染液覆盖l.5min，水洗
（5）媒染：用碘液冲洗载玻片正面，碘液覆盖lmin，水洗。
（6）脱色：用95%乙醇冲洗载玻片正面，覆盖脱色30s，水洗。
（7）复染：滴加番红复染液，覆盖l.5min，水洗，干燥。
（8）镜检：革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色
2.3细菌芽孢染色
（1）涂片、干燥、固定。
（2）用5%孔雀绿染液覆盖两个菌种，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至
染料冒蒸汽并开始计时。维持5min（加热过程中注意及时补充染液，切勿
持续加热，让涂片干涸）。
（3）冷却后，用自来水缓慢冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。
（4）用0.5%番红染液冲洗，复染2min。
（5）用自来水缓慢冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。
（6）干燥，用油镜镜检。
3. 细菌的穿刺实验及运动性观察
3.1培养基试管的制备
将半固体培养基倒入试管中灭菌后，垂直放置待凝。
3.2接种
将菌种分别用接种针穿刺接种于半固体培养基中，37℃恒温箱中培养1-2天。
3.3观察
观察细菌生长范围并记录，判断细菌是否有运动性。
4. 微生物生理生化实验
3.1培养基的配制及灭菌
按配方配制各个培养基（注意：在配置油脂培养基时不能使用变质油，油和琼脂及水先加热，调好PH后最后加入中性红；在配置糖发酵培养基时将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（PH7.6）以及糖溶液分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管，使之充满培养基）。配制分装包扎完成后放入灭菌锅中121℃灭菌20min。
3.2倒平板，接种及培养
3.2.1淀粉水解试验
（1）倒平板
无菌条件下将冷却至50℃下的淀粉培养基倒平板并冷却至室温；
（2）接种及培养
用记号笔在平板底部划成四部分，并标记各分区所接种的名称。将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在所标定对应的不同的区域点种（注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同，为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠，宜采用点种的方式，如下图1所示。接种完成贴好标签后在37℃条件下培养两天。
图1.淀粉水解试验接种示意图 图2.油脂水解试验接种示意图
3.2.2油脂水解试验
（1）倒平板
无菌条件下将冷却至50℃下的油脂培养基倒平板并冷却至室温（注：倒平板时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中）；
（2）接种及培养
用记号笔在平板底部划成四部分，并标记各分区所接种的名称。将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在所标定对应的不同的区域划十字线接种，如上图2所示。接种完成贴好标签后在37℃条件下培养两天。
3.2.3糖酵解试验
（1）葡萄糖酵解的接种及培养
用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名（大肠杆菌，
普通变形杆菌）。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管5支，按编号2支接种大肠杆菌，2支接种普通变形杆菌，剩余的1支作为空白对照不接种。接种完成后在37℃条件下培养两天；
（2）乳糖酵解的接种及培养
用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名（大肠杆菌，普通变形杆菌）。取盛有乳糖发酵培养基的试管5支，按编号2支接种大肠杆菌， 2支接种普通变形杆菌，剩余的1支作为空白对照不接种。接种完成后在37℃条件下培养两天。
3.2.4 IMViC试验
（1）吲哚实验的接种及培养
用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有蛋白胨水培养基的试管4支，按编号2支接种大肠杆菌，另2支接种产气肠杆菌。接种完成后在37℃条件下培养两天。
（2）甲基红实验的接种及培养
用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管4支，按编号2支接种大肠杆菌，另2支接种产气肠杆菌。接种完成后在37℃条件下培养两天。
3.3结果的检验
3.3.1大分子水解试验的检验
（1）淀粉水解试验的检验
观察各种细菌的生长情况，打开平板的盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察水解圈，出现水解圈的为阳性，记录试验结果。
（2）油脂水解试验的检验
取出平板，观察各种细菌产生的菌苔颜色，出现红色菌苔的为阳性，记录试验结果。
3.3.2糖发酵试验的检验
取出各试管，与空白对照组对照观察培养基的颜色以及倒立的小管中气泡的有无，若培养基变成黄色则说明细菌分解糖类并产酸；若倒立的小管中有气泡存在，则说明细菌分解糖类并产气。产酸产气的为阳性。
3.3.3 IMViC试验的检验
（1）吲哚试验的检验
取出各试管，向培养基中加入3～4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性。
（2）吲哚试验的检验
取出各试管，向培养基的培养物内加甲基红试剂2滴。培养基变黄为阴性，红为阳性。
【实验结果】
1. 实验结果记录
表1.各个实验的结果记录如下。
2. 实验结果图示
2.1初级筛选划线平板图
a b c
图3.初级筛选结果图
图3中，a是第一个地点的划线培养结果；b是第二个地点的划线培养结果；c是第三个地点的划线培养结果。
2.2细菌的革兰氏染色结果及形态观察
a b c
d e f
图4.革兰氏染色结果（10*100）
图4中，图a为b菌革兰氏染色结果，图b为c菌革兰氏染色结果，图c为h菌革兰氏染色结果，图d为k菌革兰氏染色结果，图e为s菌革兰氏染色结果，图f为v菌革兰氏染色结果。 2.3细菌芽孢染色结果观察
a b c
d e f
图5.芽孢染色结果（10*100）
图5中，图a为b菌芽孢氏染色结果，图b为c菌芽孢氏染色结果，图c为h菌芽孢氏染色结果，图d为k菌芽孢氏染色结果，图e为s菌芽孢氏染色结果，图f为v菌芽孢氏染色结果。
2.4运动性的观察
a b c
d e f
图6. 半固体穿刺观察结果
图6中，图a是b菌的半固体穿刺结果，图b是c菌的半固体穿刺结果，图c是h菌的半固体穿刺结果，图d是k菌的半固体穿刺结果，图e是s菌的半固体穿刺结果，图f是v菌的半固体穿刺结果。
2.5细菌生理生化实验观察结果
a b c
d e f
图7.b菌生理生化实验结果
图7中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。 a b c
d e f
图8.c菌生理生化实验结果
图8中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。
a b c
d e f
图9.h菌生理生化实验结果
图9中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。
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d e f
图10.k菌生理生化实验结果
图10中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。
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图11.s菌生理生化实验结果
图11中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。
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图12.v菌生理生化实验结果
图12中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。
图13.甲基红实验结果
图13中，图a为b菌、h菌甲基红实验结果，图b为c菌、v菌甲基红实验结果，图c为s菌、k菌甲基红实验结果。
【注意事项 】
1. 要认真按照实验步骤进行操作，如在淀粉水解实验中，观察哥哥细菌的生长情况时，滴入少量的卢戈氏碘液于平板，应该轻轻旋转平板，使碘液覆盖整个平板；在油脂水解实验中，制备固体油脂培养基时，应充分要当，使油脂均匀分布等。
2. 注意在接种之前用记号笔做好记号，接种时一定要认真检查标记，对号接种，一面接错菌种，造成混乱。 附表：培养基配方
土壤微生物的分离纯化与鉴定
姓名：胡雪芳
学号：[1**********]3
班级：泰山学堂2013级
组别：第4组
时间：2016.06.25
同组者：王钰珅
【实验目的】
1. 学习运用涂布和划线分离法获得细菌，掌握微生物的分离纯化方法和无菌操
作技术；
2. 学习测定土壤中细菌数目，种类的方法；
3. 掌握菌株筛选、分离纯化、菌种鉴定等操作的具体流程；
4. 初步掌握微生物的菌种保藏技术。
【实验原理】
土壤微生物是指生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌、藻类的总称。其个体微小，一般以微米或毫微米来计算，通常1克土壤中有106～109个，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株 不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。要研究某种微生物的特性或要确定某些微生物菌株的分类地位，首先须使该微生物为纯培养。也就是说培养物中所有的细胞只是微生物的某一个或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。
从复杂的微生物群体中获得只含有一种或一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。单细胞挑取法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法和平板划线法是分离纯化微生物的常规方法。通过稀释涂布平板法可以在平板上获得单菌落，再通过挑取单菌落进行平板划线分离可获得纯培养。在稀释涂布平板法中还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。
对微生物分类的主要依据有形态特征、生理生化特征性等。形态特征包括个体形态和培养形态。细胞形状、大小、排列，革兰氏染色反应，运动性，鞭毛位置、数目，芽孢有无、形状和部位都是个体形态的特点。培养形态指微生物在培养基（包括固体和液体培养）中生长的形态特征。通过细菌的形态特征可以对微生物进行分类鉴定。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的终产物的不同，反应出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。
下面介绍实验中涉及技术的原理：
1. 平板分离技术与活菌计数
固平板菌落计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中的细胞密度。由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自2个或者多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落数来表示样品中活菌含量的原因。
2. 微生物的分离和纯化
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混
杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等
条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
3. 革兰氏染色
革兰氏染色法可以将细菌分成革兰氏阳性和革兰氏阴性两种类型，这是由于两种细菌的细胞壁的组成结构不同。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为酶染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物。增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%的乙醇作为脱色剂进行处理时，两种菌的脱色效果不同。革兰氏阳性菌细胞壁中的肽聚糖的含量高，壁厚切脂质含量低，其网孔结构可以滞留复合物。但是在革兰氏阴性菌中，肽聚糖的含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时则会溶解，细胞壁的透性就会增加，从而讲复合物洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂染色后又变为复染剂颜色。
4.芽孢染色
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段后形成的一种抗逆性很强
的休眠体结构。也成为内生孢子，通常为圆形或者椭圆形。与正常细胞或者菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。所以利用着色能力强的染料在加热条件下染色，使染料即可以进入菌体也可以进入芽孢，然后水洗脱色菌体中的染料被洗脱，但是芽孢中的染料仍然存在，从而对芽孢进行了染色。
5.微生物的生理生化反应
在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶
促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，
或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
5.1淀粉的水解
由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。
5.2糖发酵试验
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
5.3IMViC实验
IMViC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
5.3.1吲哚试验
吲哚实验是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
5.3.2甲基红试验（MR）
某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由
橙黄色转变为红色，即甲基红反应。大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
5. 阿莫西林
阿莫西林又名安莫西林或安默西林，是一种最常用的半合成青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，为一种白色粉末，半衰期约为61.3分钟。在酸性条件下稳定，胃肠道吸收率达90%。阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞膜的能力也强。是目前应用较为广泛的口服半合成青霉素之一，也是在自然界中微生物产生了巨大抗药性的一种普遍抗生素种类。
阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞壁的能力也强。口服后药物分子中的内酰胺基立即水解生成肽键，迅速和菌体内的转肽酶结合使之失活，切断了菌体依靠转肽酶合成糖肽用来建造细胞壁的唯一途径，使细菌细胞迅速成为球形体而破裂溶解，菌体最终因细胞壁损失，水份不断渗透而胀裂死亡。对大多数致病的G+菌和G-菌(包括球菌和杆菌)均有强大的抑菌和杀菌作用。其中对肺炎链球菌、溶血性链球菌等链球菌属、不产青霉素酶葡萄球菌、粪肠球菌等需氧革兰阳性球菌，大肠埃希菌、奇异变形菌、沙门菌属、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需氧革兰阴性菌的不产β内酰胺酶菌株及幽门螺杆菌具有良好的抗菌活性。血液透析能清除部分药物，但腹膜透析无清除本品的作用。
实验中，运用以上技术，操作原理如下：
1. 在确定土样环境之后，对土壤溶液样品进行稀释，在选择培养基上进行涂布
分离。在进行微生物的菌落计数后再进行进一步的纯化分离。
2. 经过划线分离、复筛等步骤的纯化，得到特定的六种纯化细菌。
3. 对得到的纯种细菌进行染色和穿刺实验，观察细菌形态以及运动性，再对所
筛菌种进行生理生化试验。通过查阅《伯杰氏手册》对微生物的分类进行定
位（定位到菌种的属别）。
【实验材料】
1. 菌株
分离所得菌种（山东大学化学老楼后，世纪林等）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。
2. 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（固体、半固体、液体）、淀粉培养基（固体）、油脂培养
基（固体）、葡萄糖发酵培养基（液体）、乳糖发酵培养基（液体）、蛋白胨水培养基（液体）、葡萄糖蛋白胨水培养基（液体）
3. 实验试剂
结晶紫染液、碘液、95﹪乙醇、番红复染液、孔雀绿水溶液、吕氏碱性美篮染液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、溴甲酚紫乙醇溶液、蒸馏水、中性红试剂、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、酵母粉、NaCl、稀盐酸、NaOH溶液、可溶性淀粉、花生油、葡萄糖、乳糖、K2HPO4。
4. 实验仪器和其他用品
试管架、试管、小试管、滴管、锥形瓶、棉塞、记号笔、解剖刀、涂布棒、移液枪、枪尖、50% 乙醇、20% 的甘油、酒精灯、接种环、烧杯、培养皿、镊子、载玻片、盖玻片、载玻片夹子、显微镜、双层瓶（香柏油和二甲苯）、擦镜纸、灭菌锅、滤纸圆片、恒温培养箱、无菌水。
【实验步骤】
1. 微生物的筛选、分离纯化及保种
1.1微生物的筛选
1.1.1配制牛肉膏蛋白胨培养基
按照附表配方配制牛肉膏蛋白胨培养基，调节pH，包好灭菌。
1.1.2土样处理
将采集的土壤样本平铺在滤纸上，放在37℃培养箱内过夜烘干。烘干后用纱布过滤除去较大土壤颗粒，保留较细土壤颗粒。
1.1.3划线
将300ml牛肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至不烫手时，按照10μg/ml的量加入已过滤除菌的阿莫西林，待其溶解混匀后倒平板，在培养皿盖周边用记号笔做好标记。
取土壤10g，加入5ml的蒸馏水和1g达克宁将其混合均匀，用接种环划线。每个土壤样本进行3次重复。并留一没有加阿莫西林的平板进行划线，作为对照。
1.1.4培养
将平板倒置于37℃恒温箱中培养1天。
1.2微生物的分离纯化
取加阿莫西林的牛肉膏蛋白胨培养基，在培养皿盖周边用记号笔做好标记并划分区域，挑取前一天平板上的菌落进行划线分离，然后将平板倒置于37℃恒温箱中培养1天。
该步骤重复三次，即进行3层筛选。
划线分离具体步骤：
（1）先在平皿上划定区域（一般分为3区），然后在超净工作台中，将接种针在
火焰上灼烧灭菌。
（2）取含菌种的培养皿，在火焰上方，打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划
线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好。
（3）再取空白培养基，在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭
菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，划完后引线到3区，划线完毕后盖盖平放，将平板倒置于37℃恒温箱中培养1天。1天后再划线一次直到出现单菌落。
1.3保种
用接种环挑取单菌落，将细菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基。将试管置于37℃恒温箱中培养。培养1天后的试管可以置于4℃冰箱中继续保种。
2. 细菌的染色及镜检
2.1细菌单染色
（1）洗片干燥
（2）涂片
（3）加热固定干燥（在火上固定时，用手背试涂片反面的热度，以不烫手为宜）
（4）滴加结晶紫染液覆盖于涂菌处，染色1.5min
（5）水洗、干燥
（6）镜检
2.2细菌革兰氏染色
（1）洗片、干燥
（2）涂片
（3）加热固定干燥 （在火上固定时，用手背试涂片反面的热度，以不烫手为宜）
（4）初染：滴加结晶紫染液覆盖l.5min，水洗
（5）媒染：用碘液冲洗载玻片正面，碘液覆盖lmin，水洗。
（6）脱色：用95%乙醇冲洗载玻片正面，覆盖脱色30s，水洗。
（7）复染：滴加番红复染液，覆盖l.5min，水洗，干燥。
（8）镜检：革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色
2.3细菌芽孢染色
（1）涂片、干燥、固定。
（2）用5%孔雀绿染液覆盖两个菌种，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至
染料冒蒸汽并开始计时。维持5min（加热过程中注意及时补充染液，切勿
持续加热，让涂片干涸）。
（3）冷却后，用自来水缓慢冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。
（4）用0.5%番红染液冲洗，复染2min。
（5）用自来水缓慢冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。
（6）干燥，用油镜镜检。
3. 细菌的穿刺实验及运动性观察
3.1培养基试管的制备
将半固体培养基倒入试管中灭菌后，垂直放置待凝。
3.2接种
将菌种分别用接种针穿刺接种于半固体培养基中，37℃恒温箱中培养1-2天。
3.3观察
观察细菌生长范围并记录，判断细菌是否有运动性。
4. 微生物生理生化实验
3.1培养基的配制及灭菌
按配方配制各个培养基（注意：在配置油脂培养基时不能使用变质油，油和琼脂及水先加热，调好PH后最后加入中性红；在配置糖发酵培养基时将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（PH7.6）以及糖溶液分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管，使之充满培养基）。配制分装包扎完成后放入灭菌锅中121℃灭菌20min。
3.2倒平板，接种及培养
3.2.1淀粉水解试验
（1）倒平板
无菌条件下将冷却至50℃下的淀粉培养基倒平板并冷却至室温；
（2）接种及培养
用记号笔在平板底部划成四部分，并标记各分区所接种的名称。将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在所标定对应的不同的区域点种（注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同，为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠，宜采用点种的方式，如下图1所示。接种完成贴好标签后在37℃条件下培养两天。
图1.淀粉水解试验接种示意图 图2.油脂水解试验接种示意图
3.2.2油脂水解试验
（1）倒平板
无菌条件下将冷却至50℃下的油脂培养基倒平板并冷却至室温（注：倒平板时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中）；
（2）接种及培养
用记号笔在平板底部划成四部分，并标记各分区所接种的名称。将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在所标定对应的不同的区域划十字线接种，如上图2所示。接种完成贴好标签后在37℃条件下培养两天。
3.2.3糖酵解试验
（1）葡萄糖酵解的接种及培养
用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名（大肠杆菌，
普通变形杆菌）。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管5支，按编号2支接种大肠杆菌，2支接种普通变形杆菌，剩余的1支作为空白对照不接种。接种完成后在37℃条件下培养两天；
（2）乳糖酵解的接种及培养
用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名（大肠杆菌，普通变形杆菌）。取盛有乳糖发酵培养基的试管5支，按编号2支接种大肠杆菌， 2支接种普通变形杆菌，剩余的1支作为空白对照不接种。接种完成后在37℃条件下培养两天。
3.2.4 IMViC试验
（1）吲哚实验的接种及培养
用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有蛋白胨水培养基的试管4支，按编号2支接种大肠杆菌，另2支接种产气肠杆菌。接种完成后在37℃条件下培养两天。
（2）甲基红实验的接种及培养
用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管4支，按编号2支接种大肠杆菌，另2支接种产气肠杆菌。接种完成后在37℃条件下培养两天。
3.3结果的检验
3.3.1大分子水解试验的检验
（1）淀粉水解试验的检验
观察各种细菌的生长情况，打开平板的盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察水解圈，出现水解圈的为阳性，记录试验结果。
（2）油脂水解试验的检验
取出平板，观察各种细菌产生的菌苔颜色，出现红色菌苔的为阳性，记录试验结果。
3.3.2糖发酵试验的检验
取出各试管，与空白对照组对照观察培养基的颜色以及倒立的小管中气泡的有无，若培养基变成黄色则说明细菌分解糖类并产酸；若倒立的小管中有气泡存在，则说明细菌分解糖类并产气。产酸产气的为阳性。
3.3.3 IMViC试验的检验
（1）吲哚试验的检验
取出各试管，向培养基中加入3～4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性。
（2）吲哚试验的检验
取出各试管，向培养基的培养物内加甲基红试剂2滴。培养基变黄为阴性，红为阳性。
【实验结果】
1. 实验结果记录
表1.各个实验的结果记录如下。
2. 实验结果图示
2.1初级筛选划线平板图
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图3.初级筛选结果图
图3中，a是第一个地点的划线培养结果；b是第二个地点的划线培养结果；c是第三个地点的划线培养结果。
2.2细菌的革兰氏染色结果及形态观察
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图4.革兰氏染色结果（10*100）
图4中，图a为b菌革兰氏染色结果，图b为c菌革兰氏染色结果，图c为h菌革兰氏染色结果，图d为k菌革兰氏染色结果，图e为s菌革兰氏染色结果，图f为v菌革兰氏染色结果。 2.3细菌芽孢染色结果观察
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图5.芽孢染色结果（10*100）
图5中，图a为b菌芽孢氏染色结果，图b为c菌芽孢氏染色结果，图c为h菌芽孢氏染色结果，图d为k菌芽孢氏染色结果，图e为s菌芽孢氏染色结果，图f为v菌芽孢氏染色结果。
2.4运动性的观察
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图6. 半固体穿刺观察结果
图6中，图a是b菌的半固体穿刺结果，图b是c菌的半固体穿刺结果，图c是h菌的半固体穿刺结果，图d是k菌的半固体穿刺结果，图e是s菌的半固体穿刺结果，图f是v菌的半固体穿刺结果。
2.5细菌生理生化实验观察结果
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图7.b菌生理生化实验结果
图7中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。 a b c
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图8.c菌生理生化实验结果
图8中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。
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图9.h菌生理生化实验结果
图9中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。
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图10.k菌生理生化实验结果
图10中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。
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图11.s菌生理生化实验结果
图11中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。
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图12.v菌生理生化实验结果
图12中，图a是葡萄糖发酵结果，图b是乳糖发酵结果，图c是淀粉培养基培养结果，图d是耐药性检验结果，图e是吲哚实验，图f是油脂培养基培养结果。
图13.甲基红实验结果
图13中，图a为b菌、h菌甲基红实验结果，图b为c菌、v菌甲基红实验结果，图c为s菌、k菌甲基红实验结果。
【注意事项 】
1. 要认真按照实验步骤进行操作，如在淀粉水解实验中，观察哥哥细菌的生长情况时，滴入少量的卢戈氏碘液于平板，应该轻轻旋转平板，使碘液覆盖整个平板；在油脂水解实验中，制备固体油脂培养基时，应充分要当，使油脂均匀分布等。
2. 注意在接种之前用记号笔做好记号，接种时一定要认真检查标记，对号接种，一面接错菌种，造成混乱。 附表：培养基配方