实验九 薄 层 色 谱
一． 实验目的：
1. 学习薄层层析的基本原理和分离鉴别有机化合物的操作方法。
二． 实验重点和难点：
1. 学习薄层色谱法的原理及方法。
实验类型：基础性 实验学时：4学时
三． 实验装置和药品：
主要实验仪器：4块显微载玻片 50mL 烧杯 分液漏斗 布氏漏斗 研钵 烘箱 吸管 玻璃板点样毛细管、大头针、直尺、玻棒 无水硫酸钠
主要化学试剂：95%乙醇 石油醚（60-900C ） 丙酮 乙酸乙酯 菠菜叶 0.5%羧甲基纡维素钠(CMC)水溶液 硅胶G
实验类型：基础性 实验学时：4学时
四． 实验装置图：
五． 实验原理：
薄层色谱（thin layer chromatography，缩写TLC ）
薄层色谱又叫薄板层析，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。
薄层层析法是一种微量快速的分析分离方法。它具有灵敏、快速准确等优点。
薄层层析的原理和柱层析一样，属于固一液吸附层析的类型。通常是把吸附剂放在玻璃板上成为一个薄层，是为固定相，以有机溶剂作为流动相。实验时，把要分离的混合物滴在薄层析的一端，用适当的溶剂展开，当溶剂流经吸附剂时，由于各物质被吸附的强弱不同，就以不同的速率随着溶剂移动。展开一定时间后，让溶剂停止流动，混合物中各组分就停留在薄层析上显示出一个个色斑的色谱图。若各组分无色，可喷洒一定的显色剂使之显色。
它是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它
亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从
而将各组分分开。
它是近年来发展起来的一种微量快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。
最典型的薄层色谱法是在一块洗净干燥的玻璃片上均匀铺上一薄层吸附剂，制成薄层板。用毛细管将样品溶液点在起点处，把此薄层板置于盛有溶剂的容器中，待溶液到达前沿后取出，晾干，显色，测定色斑的位置。由于层析是在薄层板上进行，故称为薄层层析。
记录原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算此
移值（R f ）：
R f = 溶质的最高浓度中心至原点中心的距离 / 溶剂前沿 至原点中心的距离
混合物中各物质在薄析上随溶剂移动的相对距离称为比移值（R f 值）。
在一定条件下，各物质具有一定的R f 值。不同物质在相同条件下，具有不同的R f 值。因此，可利用R f 值对物质进行定性鉴定。但物质的R f 值常因吸附剂的种类和活性，薄层的厚度，展开剂及温度等的不同而异。所以在鉴定的样品时，常用已知成分作对照试验，在同一个薄层板上进行层析，然后通过R f 值的比较，对物质作定性鉴定。根据斑点的面积大小和颜色的深浅的标准物的对照下还可进行定量。
六． 实验內容及步骤：
1. 菠菜色素的提取： 称取20g 洗净后，用滤纸吸干的新鲜的菠菜叶，用剪刀剪碎并与20mL
乙醇拌匀，在研钵中研磨约5min ，然后用布氏漏斗抽滤菠菜叶，弃去滤液。将菠菜汁放回研钵，每次用20mL 3:2的石油醚—乙醇混合液萃取2次，每次需加以研磨并且抽滤，合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用10mL 水洗涤两次，弃去水—乙醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥水后，滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL 为止。
2. 薄层板的制备：
取7.5×2.5cm 左右的载玻片5块，洗净晾干。
在50mL 烧杯中放置3g 硅胶G ，逐渐加入0.5%羧甲基纡维素钠(CMC) 水溶液8mL ，调成均匀的糊状，用滴管吸取此糊状物，涂于上述洁净的载玻片上。用手将带浆的玻片在玻璃板或水平的桌面上做上下轻微的颠动，并不时转动方向，制成簿层均匀，表面光洁平整的簿层板。涂好硅胶G 的簿层板置于水平的玻璃板上，在室温放置0.5h 干燥后后，放入烘箱中，缓慢升温至110℃（目的是活化），恒温0.5h ，取出稍冷后置于干燥器中备用。
3. 点样：
取2块用上述方法制好的薄层板，分别在距一端1cm 处用铅笔轻轻划一横线作为起始
线。取管口平整的毛细管扦入样品溶液中，在一块板的起点线上点上述提取液样品。如果
样品的颜色较浅，可重复点样，重复点样前必须待前次样品干燥后进行，样点直径不应超过2mm 。
4. 展开：
展开剂：（a ）石油醚---丙酮=8:2（体积比） （b ）石油醚---乙酸乙酯=6:4（体积比） 待样点干燥后，小心放入巳加入展开剂的250ml 广口瓶(或小烧杯) 中进行展开。点样板一端应浸入展开剂0.5cm 。盖好瓶塞，观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm 处取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，在空气中晾干后观察分离的情况，分别用展开剂a 和b 展开，比较不同展开剂系统的展开效果。
5. 显色：（本次实验不显示）
展开完毕，取出薄层板，划出前沿线。如果化合物本身有顔色，就可直接观察它的斑点；如果本身无色，可先在紫外灯下观察有无荧光斑点，用小针在薄层上划出斑点的位置；也可在溶液蒸发前用显色剂喷雾显色。不同类型的化合物需选用不同的显色剂。凡可用于纸色谱的显色剂都可用于薄层色谱，薄层色谱还可使用腐蚀性的显色剂。如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。
七． 实验注意事项：
1. 本实验关键在于薄层板的制备要好。要求平滑均匀，即不应有纹路、带团粒，也不应有能看见玻璃的薄涂料点。
2. 点样用的毛细管必须专用，不得弄混，点样时，使毛细管液面刚好接触到薄层即可。
3. 点样时注意样点不能过大, 切勿点样过重而使薄层破坏。
4. 展开时注意观察样点的移动情况。
5. 仔细测量移动的距离，计算R f 值
八. 实验相关內容：
(一) 薄层色谱概念：
除了固定相的形状和展开剂的移动方向不同以外，薄层色谱和柱色谱在分离原理上基本相同。由于薄层色谱操作简单，试样和展开剂用量少，展开速度快，所以经常被用于探索柱色谱分离条件和监测柱色谱过程。
(二) 薄层色谱条件：
1.固定相选择：
柱色谱中提到的吸附剂都可以用作为薄层色谱的固定相，分离性能及使用选择同柱色谱的选择原则相同。
一般用于薄层色谱时，要求吸附剂的粒度更小。商品吸附剂区分为色谱级（用于柱色谱）和薄层色谱级（用于薄层色谱）。
2.展开剂选择：
薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。展开剂的极性越大，对化合物的洗脱力也越大。（各种溶剂极性见。
选择展开剂时，除参照表列溶剂极性来选择外，更多地采用试验的方法，在一块薄层板上进行试验：
①若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿，此溶剂的极性过强； ②若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在了原点上，此溶剂的极性过弱。
当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。合适的混合展开剂常需多次仔细选择才
能确定。
3.相对移动值：
在不同的展开条件下，各化合物的移动距离不会相同，而在同一条件下，相对于展开剂的移动距离，各化合物有可比较的展开数据，称为相对移动值，或比移值：
Rf = lI / lo
在相同条件下测得的比移值可以用于化合物的薄层色谱特征值进行比较对照。
4. 显色：
分离的化合物若有颜色，很容易识别出来各个样点。但多数情况下化合物没有颜色，要识别样点，必须使样点显色。通用的显色方法有碘蒸气显色和紫外线显色。
①碘蒸气显色：将展开的薄层板挥发干展开剂后，放在盛有碘晶体的封闭容器中，升华产生的碘蒸气能与有机物分子形成有色的缔合物，完成显色。
②紫外线显色：用掺有荧光剂的固定相材料（如硅胶F ，氧化铝F 等）制板，展开后在用紫外线照射展开的干燥薄层板，板上的有机物会吸收紫外线，在板上出现相应的色点，可以被观察到。
有时对于特殊有机物使用专用的显色剂显色。此时常用盛有显色剂溶液的喷雾器喷板显色。
(三) 薄层色谱操作：
1. 点样：
将试样用最少量展开剂溶解，用毛细管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量过多。
2.展开：
吹干样点，竖直放入盛有展开剂的有盖展开瓶中。展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。盖上盖子，展开。待展开剂上行到一定高度（由试验确定适当的展开高度），取出薄层板，再画出展开剂的前沿线。
3.显色，计算R f 值：
挥发干展开剂，选择合适的显色方法显色。量出展开剂和各组分的移动距离，计算各组分的相对移动值。
(四) 薄层色谱应用：
1.可用于判断两个化合物是否相同（同一展开条件下是否有相同的移动值）；
2.可用于确定混合物中含有的组分数；
3.可用于为柱色谱选择合适的展开剂，监视柱色谱分离状况和效果；
4.可用于检测反应过程。
九. 思考题：
1. 在一定的操作条件下为什么可利用R f 值来鉴定化合物?
2. 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置?
3. 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响?
4．样品斑点过大对分离效果会产生什么影响？
5．如何进行点样？
6．划点样线为什么用铅笔而不用圆珠笔？
7．为什么层析缸必须加盖密闭？
8. 影响R f 值大小的因素有哪些？
9. 展开前为什么需要一个饱和过程？
10. 层析缸中展开剂的高度超过薄层板点样线时，对薄层色谱有何影响？
11. 简述薄层色谱的基本原理和主要应用。
12. 如何制备薄层板？薄层板为什么要活化？
实验九 薄 层 色 谱
一． 实验目的：
1. 学习薄层层析的基本原理和分离鉴别有机化合物的操作方法。
二． 实验重点和难点：
1. 学习薄层色谱法的原理及方法。
实验类型：基础性 实验学时：4学时
三． 实验装置和药品：
主要实验仪器：4块显微载玻片 50mL 烧杯 分液漏斗 布氏漏斗 研钵 烘箱 吸管 玻璃板点样毛细管、大头针、直尺、玻棒 无水硫酸钠
主要化学试剂：95%乙醇 石油醚（60-900C ） 丙酮 乙酸乙酯 菠菜叶 0.5%羧甲基纡维素钠(CMC)水溶液 硅胶G
实验类型：基础性 实验学时：4学时
四． 实验装置图：
五． 实验原理：
薄层色谱（thin layer chromatography，缩写TLC ）
薄层色谱又叫薄板层析，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。
薄层层析法是一种微量快速的分析分离方法。它具有灵敏、快速准确等优点。
薄层层析的原理和柱层析一样，属于固一液吸附层析的类型。通常是把吸附剂放在玻璃板上成为一个薄层，是为固定相，以有机溶剂作为流动相。实验时，把要分离的混合物滴在薄层析的一端，用适当的溶剂展开，当溶剂流经吸附剂时，由于各物质被吸附的强弱不同，就以不同的速率随着溶剂移动。展开一定时间后，让溶剂停止流动，混合物中各组分就停留在薄层析上显示出一个个色斑的色谱图。若各组分无色，可喷洒一定的显色剂使之显色。
它是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它
亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从
而将各组分分开。
它是近年来发展起来的一种微量快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。
最典型的薄层色谱法是在一块洗净干燥的玻璃片上均匀铺上一薄层吸附剂，制成薄层板。用毛细管将样品溶液点在起点处，把此薄层板置于盛有溶剂的容器中，待溶液到达前沿后取出，晾干，显色，测定色斑的位置。由于层析是在薄层板上进行，故称为薄层层析。
记录原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算此
移值（R f ）：
R f = 溶质的最高浓度中心至原点中心的距离 / 溶剂前沿 至原点中心的距离
混合物中各物质在薄析上随溶剂移动的相对距离称为比移值（R f 值）。
在一定条件下，各物质具有一定的R f 值。不同物质在相同条件下，具有不同的R f 值。因此，可利用R f 值对物质进行定性鉴定。但物质的R f 值常因吸附剂的种类和活性，薄层的厚度，展开剂及温度等的不同而异。所以在鉴定的样品时，常用已知成分作对照试验，在同一个薄层板上进行层析，然后通过R f 值的比较，对物质作定性鉴定。根据斑点的面积大小和颜色的深浅的标准物的对照下还可进行定量。
六． 实验內容及步骤：
1. 菠菜色素的提取： 称取20g 洗净后，用滤纸吸干的新鲜的菠菜叶，用剪刀剪碎并与20mL
乙醇拌匀，在研钵中研磨约5min ，然后用布氏漏斗抽滤菠菜叶，弃去滤液。将菠菜汁放回研钵，每次用20mL 3:2的石油醚—乙醇混合液萃取2次，每次需加以研磨并且抽滤，合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用10mL 水洗涤两次，弃去水—乙醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥水后，滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL 为止。
2. 薄层板的制备：
取7.5×2.5cm 左右的载玻片5块，洗净晾干。
在50mL 烧杯中放置3g 硅胶G ，逐渐加入0.5%羧甲基纡维素钠(CMC) 水溶液8mL ，调成均匀的糊状，用滴管吸取此糊状物，涂于上述洁净的载玻片上。用手将带浆的玻片在玻璃板或水平的桌面上做上下轻微的颠动，并不时转动方向，制成簿层均匀，表面光洁平整的簿层板。涂好硅胶G 的簿层板置于水平的玻璃板上，在室温放置0.5h 干燥后后，放入烘箱中，缓慢升温至110℃（目的是活化），恒温0.5h ，取出稍冷后置于干燥器中备用。
3. 点样：
取2块用上述方法制好的薄层板，分别在距一端1cm 处用铅笔轻轻划一横线作为起始
线。取管口平整的毛细管扦入样品溶液中，在一块板的起点线上点上述提取液样品。如果
样品的颜色较浅，可重复点样，重复点样前必须待前次样品干燥后进行，样点直径不应超过2mm 。
4. 展开：
展开剂：（a ）石油醚---丙酮=8:2（体积比） （b ）石油醚---乙酸乙酯=6:4（体积比） 待样点干燥后，小心放入巳加入展开剂的250ml 广口瓶(或小烧杯) 中进行展开。点样板一端应浸入展开剂0.5cm 。盖好瓶塞，观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm 处取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，在空气中晾干后观察分离的情况，分别用展开剂a 和b 展开，比较不同展开剂系统的展开效果。
5. 显色：（本次实验不显示）
展开完毕，取出薄层板，划出前沿线。如果化合物本身有顔色，就可直接观察它的斑点；如果本身无色，可先在紫外灯下观察有无荧光斑点，用小针在薄层上划出斑点的位置；也可在溶液蒸发前用显色剂喷雾显色。不同类型的化合物需选用不同的显色剂。凡可用于纸色谱的显色剂都可用于薄层色谱，薄层色谱还可使用腐蚀性的显色剂。如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。
七． 实验注意事项：
1. 本实验关键在于薄层板的制备要好。要求平滑均匀，即不应有纹路、带团粒，也不应有能看见玻璃的薄涂料点。
2. 点样用的毛细管必须专用，不得弄混，点样时，使毛细管液面刚好接触到薄层即可。
3. 点样时注意样点不能过大, 切勿点样过重而使薄层破坏。
4. 展开时注意观察样点的移动情况。
5. 仔细测量移动的距离，计算R f 值
八. 实验相关內容：
(一) 薄层色谱概念：
除了固定相的形状和展开剂的移动方向不同以外，薄层色谱和柱色谱在分离原理上基本相同。由于薄层色谱操作简单，试样和展开剂用量少，展开速度快，所以经常被用于探索柱色谱分离条件和监测柱色谱过程。
(二) 薄层色谱条件：
1.固定相选择：
柱色谱中提到的吸附剂都可以用作为薄层色谱的固定相，分离性能及使用选择同柱色谱的选择原则相同。
一般用于薄层色谱时，要求吸附剂的粒度更小。商品吸附剂区分为色谱级（用于柱色谱）和薄层色谱级（用于薄层色谱）。
2.展开剂选择：
薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。展开剂的极性越大，对化合物的洗脱力也越大。（各种溶剂极性见。
选择展开剂时，除参照表列溶剂极性来选择外，更多地采用试验的方法，在一块薄层板上进行试验：
①若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿，此溶剂的极性过强； ②若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在了原点上，此溶剂的极性过弱。
当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。合适的混合展开剂常需多次仔细选择才
能确定。
3.相对移动值：
在不同的展开条件下，各化合物的移动距离不会相同，而在同一条件下，相对于展开剂的移动距离，各化合物有可比较的展开数据，称为相对移动值，或比移值：
Rf = lI / lo
在相同条件下测得的比移值可以用于化合物的薄层色谱特征值进行比较对照。
4. 显色：
分离的化合物若有颜色，很容易识别出来各个样点。但多数情况下化合物没有颜色，要识别样点，必须使样点显色。通用的显色方法有碘蒸气显色和紫外线显色。
①碘蒸气显色：将展开的薄层板挥发干展开剂后，放在盛有碘晶体的封闭容器中，升华产生的碘蒸气能与有机物分子形成有色的缔合物，完成显色。
②紫外线显色：用掺有荧光剂的固定相材料（如硅胶F ，氧化铝F 等）制板，展开后在用紫外线照射展开的干燥薄层板，板上的有机物会吸收紫外线，在板上出现相应的色点，可以被观察到。
有时对于特殊有机物使用专用的显色剂显色。此时常用盛有显色剂溶液的喷雾器喷板显色。
(三) 薄层色谱操作：
1. 点样：
将试样用最少量展开剂溶解，用毛细管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量过多。
2.展开：
吹干样点，竖直放入盛有展开剂的有盖展开瓶中。展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。盖上盖子，展开。待展开剂上行到一定高度（由试验确定适当的展开高度），取出薄层板，再画出展开剂的前沿线。
3.显色，计算R f 值：
挥发干展开剂，选择合适的显色方法显色。量出展开剂和各组分的移动距离，计算各组分的相对移动值。
(四) 薄层色谱应用：
1.可用于判断两个化合物是否相同（同一展开条件下是否有相同的移动值）；
2.可用于确定混合物中含有的组分数；
3.可用于为柱色谱选择合适的展开剂，监视柱色谱分离状况和效果；
4.可用于检测反应过程。
九. 思考题：
1. 在一定的操作条件下为什么可利用R f 值来鉴定化合物?
2. 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置?
3. 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响?
4．样品斑点过大对分离效果会产生什么影响？
5．如何进行点样？
6．划点样线为什么用铅笔而不用圆珠笔？
7．为什么层析缸必须加盖密闭？
8. 影响R f 值大小的因素有哪些？
9. 展开前为什么需要一个饱和过程？
10. 层析缸中展开剂的高度超过薄层板点样线时，对薄层色谱有何影响？
11. 简述薄层色谱的基本原理和主要应用。
12. 如何制备薄层板？薄层板为什么要活化？