·10·化学通报2011年第74卷第1期http：//www.hxtb.org
蛋白质的单分子包埋
厉瑾
1
宋锡瑾
1*
徐佳音
1
王杰
杭州
2
（浙江大学1化学工程与生物工程系；2化学系310027）
摘要单分子包埋是一种高效的蛋白质包埋新方法。蛋白质的单分子包埋是利用蛋白质上的某些基
团可以与修饰剂反应的特点，将蛋白质先与修饰剂反应，再进行单个蛋白质分子的包埋。该方法获得的蛋白质单分子包埋颗粒粒径处于纳米尺寸范围，外壳的材料层薄至几到几十纳米。本文介绍了蛋白质的单分子包埋的原理及目前蛋白质单分子包埋的主要方法，包括共价结合包埋法、吸附包埋法。蛋白质的单分子包埋热稳定性及其在有机相中的稳定性等性能，从而扩大了蛋白质在药物制能有效地提高蛋白质的活性稳定性、生物燃料电池、微反应器等方面的应用。备、
关键词
蛋白质
酶
单分子
包埋
Theencapsulationofsingleprotein
LiJin1，SongXijin1*，XuJiayin1，WangJie2
（1DepartmentofChemicalandBiologicalEngineering，2DepartmentofChemistry，
ZhejiangUniversity，Hangzhou310027）
AbstractTheencapsulationofsingleproteinisaneweffectiveapproach.Theproteinreactswithmodifierto
Thisreviewdescribesthemechanismsandmethodsof
formsingleproteinbyencapsulation.Thesizesofthesesingleproteinparticlesrangeofnanometersandeachproteinmoleculeissurroundedwithananoscalenetwork.
encapsulation，includingcovalentbindingandadsorption.Theseapproachesimprovetheabilitiesoftheproteins，suchasstability，thermalstabilityandthestabilityinorganicsolvents，thusenhancetheapplicationsoftheproteins，suchasproteindrugs，biofuelcellsandmicroreactors.
Keywords
Protein，Enzyme，Singlemolecule，Encapsulation
蛋白质是生物体内最重要的生物大分子之一，它的生物活性是由其特定的化学结构和空间结构决定的，然而这些结构极易变形或被破坏，从而影响蛋白质的应用。自20世纪50年代以来，蛋白质结构和生物学功能关系研究的开展，使得蛋白质包埋研究逐渐成为热点机物进行蛋白质包埋的研究报道越来越多
［2，3］
［1］
。自70年代开始，有关用合成有
［4］
，蛋白质包埋能稳定蛋白质的结构甚至创造天然蛋白质
。
所不具备的某些优良特性，扩大蛋白质的应用领域，促进生物技术的发展料形成的网络中心只有单个蛋白分子
［5］
单分子包埋是一种新兴的蛋白质包埋方法，相对于传统包埋方法而言，由于每个有机/无机多孔材
，使得单个蛋白分子接触底物的机会达到最高，而且蛋白质分
子外层的网格结构往往制成纳米级厚度，这样大大克服了传质阻力，使单分子包埋的蛋白质的活性和稳定性得到极大的提高，从而使单分子包埋蛋白质的应用范围扩大到药物制备、生物燃料电池及微反应器等领域。
目前已经成功获得了一些单分子包埋的蛋白质，如α-胰凝乳蛋白酶、辣根过氧化物酶、脂肪酶、血葡萄糖氧化酶等（见表1）。红蛋白、
厉瑾24岁，E-mail：[email protected]女，硕士生。*联系人，
国家自然科学基金项目（20276067）资助2010-04-01收稿，2010-08-19接受
http：//www.hxtb.org化学通报
表1
Tab.1
2011年第74卷第1期·11·
一些蛋白质的单分子包埋
Theencapsulationofsomeproteinswithsinglemolecule
反应基团丙烯酰氯与氨基丙烯酰氯与氨基
N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与氨基N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与氨基N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与氨基
丙烯酰胺，N-（3-氨丙基）-甲基丙烯酰胺与氨基
丙烯酰胺，
甲基丙烯酸2-二甲氨基乙基酯与氨基
丙烯酰胺，甲基丙烯酸2-二甲氨基乙基酯与氨基
丙烯酰胺，甲基丙烯酸2-二甲氨基乙基酯与氨基
丙烯酰胺，甲基丙烯酸2-二甲氨基乙基酯与氨基
氨丙基与氨基氨丙基与氨基氨丙基与氨基
包埋材料
甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷N’-亚甲基二丙烯酰胺丙烯酰胺和N，
N’-亚甲基二丙烯酰胺丙烯酰胺和N，
丙烯酰胺e
二丙烯酰氧基化Val-Asp-Glu-Val-Asp-Thr-Lys
二甲基丙烯酸亚甲基二丙烯酰氨或甘油酯
二甲基丙烯酸亚甲基二丙烯酰氨或甘油酯
二甲基丙烯酸亚甲基二丙烯酰氨或甘油酯
二甲基丙烯酸亚甲基二丙烯酰氨
或甘油酯
氨丙基功能化的层状有机硅酸镁氨丙基功能化的层状有机硅酸镁氨丙基功能化的层状有机硅酸镁
参考文献［6］［6］［7］［8］［9，10］［11］［12］［12］［12］［12］［13］［13］［13］
蛋白质
α-胰凝乳蛋白酶（CT）
胰蛋白酶（TR）辣根过氧化物酶（HRP）牛碳酸酐酶（BCA）
脂肪酶
3（CP3）半胱氨酸蛋白酶-增强型绿色荧光蛋白
（EGFP）
辣根过氧化物酶（HRP）牛血清蛋白（BSA）超氧化物歧化酶（SOD）
肌红蛋白（Mb）血红蛋白（Hb）葡萄糖氧化酶（GOx）
方法共价结合共价结合共价结合共价结合共价结合吸附吸附吸附吸附吸附吸附吸附吸附
1蛋白质的单分子包埋
传统的蛋白质包埋法是将蛋白质包裹于各种材料的网络结构中
［14］
，这种方法一般不需要与蛋白质
的氨基酸残基结合，很少改变蛋白分子的空间构象，其特异性不强，故其应用范围广。但是，此法通常包传质阻力大，底物不易与蛋白分子接触，所以其活性都不高。蛋白质的单分子包埋是利用蛋埋层较厚，
白质上的某些基团可以与修饰剂反应的特点，将蛋白质先与修饰剂反应，再进行单个蛋白分子的包埋。该法获得的蛋白质单分子包埋颗粒粒径处于纳米尺寸范围，外壳的材料层薄至几到几十纳米，因此对蛋白质的底物传质无明显影响。根据蛋白质与修饰剂的作用方式不同，蛋白质的单分子包埋可以分为共价结合包埋、吸附包埋等方法。
1.1共价结合包埋法
由于氨基往往存在于蛋白质分子表面，加之较高的亲核反应活性，使之成为目前蛋白质修饰中最常
［15］
用的被修饰基团1.1.1
。不同的修饰剂可以使蛋白质的单分子包埋在不同的溶液体系中进行。
Kim等［6］采用丙烯酰氯与α-胰凝乳蛋白酶（CT）表面的氨基发生共价结合反
有机相中的包埋
应，引入乙烯基团，再通过聚合，在酶分子表面形成一层聚合物网络，从而获得单分子酶纳米颗粒（Single-enzymenanoparticles，SENs）。包埋过程由以下3步组成（如图1）：（a）酶的表面修饰：酶表面氨基与丙烯酰氯反应引入乙烯基团；（b）改性后的酶通过增溶作用可以从水相进入有机相溶剂中
［16］
，然
酶表面发生乙烯基聚合物的生长；（c）聚合物链聚合，使酶表面网络化，生成单分子酶纳米颗粒
。后，
图1
Fig.1
有机相中单分子蛋白质的包埋过程
Encapsulationofsingleproteininorganicphase
通过透射电镜（TEM）可以观察到纳米微粒表面的孔的中心孔径为4到8nm，这与CT的大小（4×3×8nm）、形状吻合，表明纳米微粒包埋的为单个酶分子。
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1.1.2水溶液中的包埋琥珀酰亚胺酯基与蛋白质分子上的氨基具有较高的反应活性，反应条件温
［22］、带有琥珀酰亚胺酯基的聚乙二醇（PEG）链以及含N-丙烯酰氧基琥珀酰
［17，18］
、反应速度快。常见的与蛋白质的氨基反应的物质有N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺带有琥珀酰亚和，
胺酯基的线性聚合物
刘铮等
［7］
［19～21］
［23］
亚胺聚合物微球P（S-NIPAM-NAS）等。
利用琥珀酰亚胺酯基的这一特性，对酶进行共价键合修饰。通过酶表面丙烯酰化和原位
［7～10］
水溶液聚合生成了单分子酶纳米凝胶，实现了水相中对酶分子的包埋。他们采用较为简单的两步
反应（如图2）：（a）酶的乙烯基化：N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与酶上的氨基通过丙烯酰化在蛋白质表面N，N′-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，N，N′，N′-四甲基生成乙烯基团；（b）采用丙烯酰胺为单体，以及N，通过原位水溶液聚合对丙烯酰化的酶实现包埋。此外，第二步中还可以重乙二胺/过硫酸铵为引发剂，
复添加单体和交联剂与初始纳米凝胶反应，以便得到预期大小和形状的单酶产品。这一含水纳米凝胶所得到的凝胶分别为的大小可以根据单体与酶的比例控制。当单体与HRP比例分别为400和800时，
尺寸11nm×9nm和直径17nm；HRP分子为6.5×5.4×4.3nm，因此凝胶中只含有一个HRP分子
。
图2Fig.2
水溶液中单分子蛋白质的包埋过程Encapsulationofsingleproteininaqueous
实验表明，得到的单分子酶纳米凝胶具有活性高、热稳定性好、耐有机溶剂能力好、粒径小、比表面积大、无传质扩散阻力等特点。
1.2吸附包埋法
蛋白质的氨基酸分子中既含有氨基，又含有羧基，是一种两性物质。当外界溶液的pH与蛋白质的
蛋白质会带有不同的电荷，从而对带有相反电荷的物质产生吸附作用。等电点不同时，1.2.1
蛋白质与单体的吸附
Zhen等［11］设计出了一种合成单分子蛋白质纳米微囊（NC）的方法。该
3（CP3）的表面修饰：以静电力、方法分成两步（如图3）：（a）半胱氨酸蛋白酶-范德华力等物理吸附方式N-（3-丙氨基）甲基丙烯酰胺）连接于蛋白质表面；（b）采用双丙烯酰化Val-Asp-Glu-将单体（丙烯酰胺，
Val-Asp-Thr-Lys（CL-VDEDTK）为交联剂，在溶液中进行原位自由基聚合反应形成聚合物包埋层
。
图3
Fig.3
单体在蛋白质表面的吸附和纳米微囊的合成
Theadsorptionofmonomeronsingleproteinandfabricationofnanocapsule
研究表明，用这种方法包埋的CP3，因过程中加入双丙烯酰化短链肽作为交联剂，而多肽链可通过蛋白酶水解，从而引起聚合物包埋层降解，使CP3以特定的功能形式释放。这种方法能够运用到蛋白药物、疫苗以及其它生物大分子药物的制备和给药过程。
Yan等［12］在上述研究的基础上，采用不同的单体与交联剂，包埋了一系列的蛋白质，包括增强型绿HRP、色荧光蛋白（EGFP）、牛血清蛋白（BSA）、超氧化物歧化酶（SOD）和CP3。实验表明，这些蛋白质的单分子微囊在细胞传递中有较高的传递效率，而且对细胞的毒性较低。1.2.2
蛋白质与包埋材料的吸附
Patil等［13］提出了一种核-壳结构模型，即单个的蛋白质或酶分子通
过与氨基功能化的层状有机硅酸镁的吸附作用将蛋白质包埋成有机粘土纳米颗粒。
实验将肌红蛋白（Mb）、血红蛋白（Hb）或葡萄糖氧化酶（GOx）的溶液与有机粘土低聚物的水溶液
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混合，带负电的蛋白质与有机粘土上带正电的氨丙基产生静电吸附力，就得到包埋有单个蛋白质或酶分子的有机粘土纳米颗粒（如图4）
。
图4
Fig.4
有机粘土包埋单分子蛋白质
Theencapsulationofsingleproteinwithorganoclay
实验表明，肌红蛋白（Mb）、血红蛋白（Hb）和葡萄糖氧化酶（GOx）3种蛋白质得到的纳米颗粒的平7.8nm（σ=0.8nm）和6.4nm（σ=0.9nm），均直径分别为4.0nm（σ=0.6nm）、这与它们本身的分子直径近似（Mb：4.5×3.5×2.5nm；Hb：6.5×5.4×5.3nm；GOx：6.0×5.2×3.7nm）。能量色散型X-射线这些纳米颗粒中不仅含有蛋白质，还含有有机粘土，而且有机粘土纳米颗粒中的光谱（EDX）分析显示，
酶分子的热稳定性和活性都得到了显著的提高。
2单分子包埋蛋白质的性能
检测表明，经过单分子包埋的蛋白质的活性稳定性、热稳定性、耐有机溶剂等性能都得到了较大的
提高。
2.1单分子包埋蛋白质的活性稳定性
蛋白质的包埋往往会造成蛋白质一定程度的变构，降低其活性，同时包埋的蛋白质或酶与底物之间
的接触概率降低，造成催化效率进一步降低。但是，单分子包埋的蛋白质可以较好克服这些问题。
刘铮等
［7］
制备了包埋单个酶分子的纳米凝胶，纳米凝胶内的微环境不仅限制了酶的变构，而且含
水凝胶的柔性微环境使酶在起催化作用时，能够发生柔性变化，从而和底物更好地结合，发挥较高的催化效果。同时，由于凝胶尺寸很小，为纳米级，底物很容易从外扩散到酶分子的表面，扩散阻力小，能较好体现酶的活性。碳酸酐酶凝胶和脂肪酶凝胶拥有约80%～95%游离酶的活力，经包埋的碳酸酐酶的半衰期由原来的3min延长到超过90min
［8，9］
。
Kim等［6］对CT等进行了单分子包埋，制备了包埋单个酶分子的纳米颗粒（SENs），纳米颗粒内的微环境使得酶无法自由变构，从而高度保持了酶的活性。实验发现，SEN-CT的半衰期可达143d，而游离的CT半衰期约为1d。同时，由于载体层厚度是纳米尺寸，底物很容易从外扩散到酶分子表面，扩散阻体现了高活性。力小，
［24］
。由于SENs的尺寸小，可以进一步将SEN-CT固定化到平均孔径为29nm含硅的介孔物质中
SENs可以与硅孔达到多点共价连接，这比直接将酶通过吸附或共价连接到相同的载体上更稳定，活性也更高
［25］
。
［7］
2.2单分子包埋蛋白质的热稳定性
刘铮等
比较了pH为7.0时，从30℃到85℃，游离和纳米凝胶中HRP的热稳定性。游离HRP在
而纳米凝胶HRP直到65℃都保持稳定。在65℃下放置90min后，纳米高于40℃后开始失去其活性，
凝胶HRP仍保持初始活性的80%，而游离酶则完全失活。纳米凝胶HRP热稳定性的显著增强，是由于从而表现了较好的热稳定性。凝胶中的聚合物阻碍了酶受温度影响的失活变构，
Patil等［13］将GOx等包埋成有机粘土纳米颗粒，在温度大于60℃情况下，有机粘土包埋的GOx较游离GOx活性高10%。
2.3单分子包埋蛋白质在有机相中的稳定性
一般来说，酶在有机溶剂中较易失活或活性降低。Zaks等
［26］
研究表明，水对维持酶的活性结构必
不可少，但只要保证酶分子表面的一小部分必需水，其它大部分水完全可以被有机溶剂取代而不影响酶
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的活性。
刘铮等
［7］
制备了单酶纳米凝胶后，比较了单分子酶纳米凝胶和游离酶的米氏常数，两者的米氏常
数相近，所以单酶纳米凝胶与游离酶具有相似的生物催化性能。但在研究酶在有机溶剂中的稳定性时，发现单酶纳米凝胶的稳定性大幅度提高。究其原因，一方面纳米凝胶可以限制酶的变构，因此其在有机溶剂中仍能保持较高的活性，另一方面纳米凝胶对水的微观保持作用，限制了有机溶剂对水的夺取，这种微环境保持了酶在有机溶剂中的催化活性
［10］
。
3单分子包埋蛋白质的应用
目前，单分子包埋蛋白质研究的主要对象是酶分子，酶作为一种生物催化剂，具有许多优点，但酶存
易变性失活、利用率低等缺陷，限制了它的广泛应用。上面提到的单分子包埋酶不仅提在的稳定性差、
高了酶的稳定性，还可以提高酶负载量、酶活性等，所以，我们可以预期，单分子包埋酶能在比如延长酶提高酶的重复利用性等方面带来更多的实际应用。下面介绍单分子包埋酶在如药物制反应器的寿命、
备、生物燃料电池和微反应器等方面的一些应用。
3.1在药物制备方面的应用
大多数蛋白质药物都有诸如热稳定性不好、易被血浆蛋白酶水解或无法穿过细胞膜等缺点
［27］
。为
［28］
此，人们一直力求提高蛋白质药物的稳定性及疗效。至今，已研究出了多种方法，包括利用脂质体多聚物
［29］
、
［30］［31］、中孔硅酸盐以及碳纳米管等形式。然而，这些方法大多需要对蛋白质表面进行共价
而这样会导致蛋白质不可逆的变性、失去作用，然而非共价方法如大分子自组装，则有形成的胶体修饰，
不稳定等缺点。
Zhen等［11］设计出了一种合成单分子蛋白质纳米微囊的方法，具有以下优点：（1）属于非共价包埋，既能防止蛋白质聚集又能防止蛋白质水解及变性；（2）当靶向蛋白到达目标细胞，外面的保护层能够分解掉；（3）能够提高含有靶向蛋白的靶向药物穿过细胞膜的效率。他们已成功包埋了CP3并实现了外包层的自我降解，这种蛋白酶调控型的设计可以进一步改进，使外部蛋白酶也能激发纳米微囊的降解过程，而且降解过程的时空控制可通过屏蔽蛋白酶的识别序列实现。
3.2在生物燃料电池方面的应用
酶生物燃料电池
［16，32］
是一项很有发展潜力的技术。生物燃料电池能量转化效率高、生物相容性
［33］
好、原料来源广泛、可以用多种天然有机物作为燃料，是一种真正意义上的绿色电池。我们可以利用
葡萄糖、果糖、乙醇以及油等生物燃料作为原料进行发电。酶燃料电池需要在几个月甚至更长的时间内连续稳定工作，而且要求酶必须适应其使用环境，以保持长期工作下酶的催化活性。但是，目前的酶燃pH、料电池连续工作时间较短，一般在几天至一个月左右。电池寿命主要与酶的特性有关，另外，温度、溶液中离子的组成与浓度等环境因素也会对电池性能产生很大影响载量，提高能量密度，有效延长生物燃料电池的寿命
［35］
［34，35］
。
被吸附于介孔物质中的单分子酶纳米颗粒以及其它的一些纳米级固定化酶的方法可以提高酶的负
。
3.3在微反应器中的应用
24］
Kim等［6，将由蛋白质的单分子包埋技术合成的SEN-CT与含硅的介孔物质结合，制备了微反应
器。单分子包埋的酶的尺寸属于纳米级，通过多尺度的材料设计思路，可以将其装载到微米级微反应器并且微反应器可以继续填充在宏观的反应床内，制成单分子包埋酶的微反应器，为实现纳米酶在工内，
业上的应用奠定了基础。
4结语
近年来，蛋白质包埋技术，尤其是酶的包埋技术已在食品工业、精细化学品工业等行业得到广泛的
应用。用酶技术生产产品，条件温和，无三废产生，酶的包埋及应用研究已得到长足发展。
通过单分子包埋所得到的蛋白质具有如活性高、热稳定性强、耐有机溶剂能力强、粒径小、比表面积无传质扩散阻力等优点。但是，它也仍然存在一些问题：（1）虽然目前已成功将几种蛋白质单分子大、
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包埋，但是有关这方面的机理研究还相对肤浅；（2）目前对单分子包埋蛋白质的分析检测手段主要集中而采用透射电镜的微观检测手段有待进一步完善；（3）聚合反应过程不易控制，导致于活力检测方面，
包埋后的蛋白质分散不均匀。
尽管存在以上问题，不过随着单分子包埋技术的不断发展，蛋白质的单分子包埋存在的问题会得到它将在越来越多的领域得到广泛的应用。最大程度的解决，
参
考
文
献
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蛋白质的单分子包埋
厉瑾
1
宋锡瑾
1*
徐佳音
1
王杰
杭州
2
（浙江大学1化学工程与生物工程系；2化学系310027）
摘要单分子包埋是一种高效的蛋白质包埋新方法。蛋白质的单分子包埋是利用蛋白质上的某些基
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关键词
蛋白质
酶
单分子
包埋
Theencapsulationofsingleprotein
LiJin1，SongXijin1*，XuJiayin1，WangJie2
（1DepartmentofChemicalandBiologicalEngineering，2DepartmentofChemistry，
ZhejiangUniversity，Hangzhou310027）
AbstractTheencapsulationofsingleproteinisaneweffectiveapproach.Theproteinreactswithmodifierto
Thisreviewdescribesthemechanismsandmethodsof
formsingleproteinbyencapsulation.Thesizesofthesesingleproteinparticlesrangeofnanometersandeachproteinmoleculeissurroundedwithananoscalenetwork.
encapsulation，includingcovalentbindingandadsorption.Theseapproachesimprovetheabilitiesoftheproteins，suchasstability，thermalstabilityandthestabilityinorganicsolvents，thusenhancetheapplicationsoftheproteins，suchasproteindrugs，biofuelcellsandmicroreactors.
Keywords
Protein，Enzyme，Singlemolecule，Encapsulation
蛋白质是生物体内最重要的生物大分子之一，它的生物活性是由其特定的化学结构和空间结构决定的，然而这些结构极易变形或被破坏，从而影响蛋白质的应用。自20世纪50年代以来，蛋白质结构和生物学功能关系研究的开展，使得蛋白质包埋研究逐渐成为热点机物进行蛋白质包埋的研究报道越来越多
［2，3］
［1］
。自70年代开始，有关用合成有
［4］
，蛋白质包埋能稳定蛋白质的结构甚至创造天然蛋白质
。
所不具备的某些优良特性，扩大蛋白质的应用领域，促进生物技术的发展料形成的网络中心只有单个蛋白分子
［5］
单分子包埋是一种新兴的蛋白质包埋方法，相对于传统包埋方法而言，由于每个有机/无机多孔材
，使得单个蛋白分子接触底物的机会达到最高，而且蛋白质分
子外层的网格结构往往制成纳米级厚度，这样大大克服了传质阻力，使单分子包埋的蛋白质的活性和稳定性得到极大的提高，从而使单分子包埋蛋白质的应用范围扩大到药物制备、生物燃料电池及微反应器等领域。
目前已经成功获得了一些单分子包埋的蛋白质，如α-胰凝乳蛋白酶、辣根过氧化物酶、脂肪酶、血葡萄糖氧化酶等（见表1）。红蛋白、
厉瑾24岁，E-mail：[email protected]女，硕士生。*联系人，
国家自然科学基金项目（20276067）资助2010-04-01收稿，2010-08-19接受
http：//www.hxtb.org化学通报
表1
Tab.1
2011年第74卷第1期·11·
一些蛋白质的单分子包埋
Theencapsulationofsomeproteinswithsinglemolecule
反应基团丙烯酰氯与氨基丙烯酰氯与氨基
N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与氨基N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与氨基N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与氨基
丙烯酰胺，N-（3-氨丙基）-甲基丙烯酰胺与氨基
丙烯酰胺，
甲基丙烯酸2-二甲氨基乙基酯与氨基
丙烯酰胺，甲基丙烯酸2-二甲氨基乙基酯与氨基
丙烯酰胺，甲基丙烯酸2-二甲氨基乙基酯与氨基
丙烯酰胺，甲基丙烯酸2-二甲氨基乙基酯与氨基
氨丙基与氨基氨丙基与氨基氨丙基与氨基
包埋材料
甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷N’-亚甲基二丙烯酰胺丙烯酰胺和N，
N’-亚甲基二丙烯酰胺丙烯酰胺和N，
丙烯酰胺e
二丙烯酰氧基化Val-Asp-Glu-Val-Asp-Thr-Lys
二甲基丙烯酸亚甲基二丙烯酰氨或甘油酯
二甲基丙烯酸亚甲基二丙烯酰氨或甘油酯
二甲基丙烯酸亚甲基二丙烯酰氨或甘油酯
二甲基丙烯酸亚甲基二丙烯酰氨
或甘油酯
氨丙基功能化的层状有机硅酸镁氨丙基功能化的层状有机硅酸镁氨丙基功能化的层状有机硅酸镁
参考文献［6］［6］［7］［8］［9，10］［11］［12］［12］［12］［12］［13］［13］［13］
蛋白质
α-胰凝乳蛋白酶（CT）
胰蛋白酶（TR）辣根过氧化物酶（HRP）牛碳酸酐酶（BCA）
脂肪酶
3（CP3）半胱氨酸蛋白酶-增强型绿色荧光蛋白
（EGFP）
辣根过氧化物酶（HRP）牛血清蛋白（BSA）超氧化物歧化酶（SOD）
肌红蛋白（Mb）血红蛋白（Hb）葡萄糖氧化酶（GOx）
方法共价结合共价结合共价结合共价结合共价结合吸附吸附吸附吸附吸附吸附吸附吸附
1蛋白质的单分子包埋
传统的蛋白质包埋法是将蛋白质包裹于各种材料的网络结构中
［14］
，这种方法一般不需要与蛋白质
的氨基酸残基结合，很少改变蛋白分子的空间构象，其特异性不强，故其应用范围广。但是，此法通常包传质阻力大，底物不易与蛋白分子接触，所以其活性都不高。蛋白质的单分子包埋是利用蛋埋层较厚，
白质上的某些基团可以与修饰剂反应的特点，将蛋白质先与修饰剂反应，再进行单个蛋白分子的包埋。该法获得的蛋白质单分子包埋颗粒粒径处于纳米尺寸范围，外壳的材料层薄至几到几十纳米，因此对蛋白质的底物传质无明显影响。根据蛋白质与修饰剂的作用方式不同，蛋白质的单分子包埋可以分为共价结合包埋、吸附包埋等方法。
1.1共价结合包埋法
由于氨基往往存在于蛋白质分子表面，加之较高的亲核反应活性，使之成为目前蛋白质修饰中最常
［15］
用的被修饰基团1.1.1
。不同的修饰剂可以使蛋白质的单分子包埋在不同的溶液体系中进行。
Kim等［6］采用丙烯酰氯与α-胰凝乳蛋白酶（CT）表面的氨基发生共价结合反
有机相中的包埋
应，引入乙烯基团，再通过聚合，在酶分子表面形成一层聚合物网络，从而获得单分子酶纳米颗粒（Single-enzymenanoparticles，SENs）。包埋过程由以下3步组成（如图1）：（a）酶的表面修饰：酶表面氨基与丙烯酰氯反应引入乙烯基团；（b）改性后的酶通过增溶作用可以从水相进入有机相溶剂中
［16］
，然
酶表面发生乙烯基聚合物的生长；（c）聚合物链聚合，使酶表面网络化，生成单分子酶纳米颗粒
。后，
图1
Fig.1
有机相中单分子蛋白质的包埋过程
Encapsulationofsingleproteininorganicphase
通过透射电镜（TEM）可以观察到纳米微粒表面的孔的中心孔径为4到8nm，这与CT的大小（4×3×8nm）、形状吻合，表明纳米微粒包埋的为单个酶分子。
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1.1.2水溶液中的包埋琥珀酰亚胺酯基与蛋白质分子上的氨基具有较高的反应活性，反应条件温
［22］、带有琥珀酰亚胺酯基的聚乙二醇（PEG）链以及含N-丙烯酰氧基琥珀酰
［17，18］
、反应速度快。常见的与蛋白质的氨基反应的物质有N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺带有琥珀酰亚和，
胺酯基的线性聚合物
刘铮等
［7］
［19～21］
［23］
亚胺聚合物微球P（S-NIPAM-NAS）等。
利用琥珀酰亚胺酯基的这一特性，对酶进行共价键合修饰。通过酶表面丙烯酰化和原位
［7～10］
水溶液聚合生成了单分子酶纳米凝胶，实现了水相中对酶分子的包埋。他们采用较为简单的两步
反应（如图2）：（a）酶的乙烯基化：N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与酶上的氨基通过丙烯酰化在蛋白质表面N，N′-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，N，N′，N′-四甲基生成乙烯基团；（b）采用丙烯酰胺为单体，以及N，通过原位水溶液聚合对丙烯酰化的酶实现包埋。此外，第二步中还可以重乙二胺/过硫酸铵为引发剂，
复添加单体和交联剂与初始纳米凝胶反应，以便得到预期大小和形状的单酶产品。这一含水纳米凝胶所得到的凝胶分别为的大小可以根据单体与酶的比例控制。当单体与HRP比例分别为400和800时，
尺寸11nm×9nm和直径17nm；HRP分子为6.5×5.4×4.3nm，因此凝胶中只含有一个HRP分子
。
图2Fig.2
水溶液中单分子蛋白质的包埋过程Encapsulationofsingleproteininaqueous
实验表明，得到的单分子酶纳米凝胶具有活性高、热稳定性好、耐有机溶剂能力好、粒径小、比表面积大、无传质扩散阻力等特点。
1.2吸附包埋法
蛋白质的氨基酸分子中既含有氨基，又含有羧基，是一种两性物质。当外界溶液的pH与蛋白质的
蛋白质会带有不同的电荷，从而对带有相反电荷的物质产生吸附作用。等电点不同时，1.2.1
蛋白质与单体的吸附
Zhen等［11］设计出了一种合成单分子蛋白质纳米微囊（NC）的方法。该
3（CP3）的表面修饰：以静电力、方法分成两步（如图3）：（a）半胱氨酸蛋白酶-范德华力等物理吸附方式N-（3-丙氨基）甲基丙烯酰胺）连接于蛋白质表面；（b）采用双丙烯酰化Val-Asp-Glu-将单体（丙烯酰胺，
Val-Asp-Thr-Lys（CL-VDEDTK）为交联剂，在溶液中进行原位自由基聚合反应形成聚合物包埋层
。
图3
Fig.3
单体在蛋白质表面的吸附和纳米微囊的合成
Theadsorptionofmonomeronsingleproteinandfabricationofnanocapsule
研究表明，用这种方法包埋的CP3，因过程中加入双丙烯酰化短链肽作为交联剂，而多肽链可通过蛋白酶水解，从而引起聚合物包埋层降解，使CP3以特定的功能形式释放。这种方法能够运用到蛋白药物、疫苗以及其它生物大分子药物的制备和给药过程。
Yan等［12］在上述研究的基础上，采用不同的单体与交联剂，包埋了一系列的蛋白质，包括增强型绿HRP、色荧光蛋白（EGFP）、牛血清蛋白（BSA）、超氧化物歧化酶（SOD）和CP3。实验表明，这些蛋白质的单分子微囊在细胞传递中有较高的传递效率，而且对细胞的毒性较低。1.2.2
蛋白质与包埋材料的吸附
Patil等［13］提出了一种核-壳结构模型，即单个的蛋白质或酶分子通
过与氨基功能化的层状有机硅酸镁的吸附作用将蛋白质包埋成有机粘土纳米颗粒。
实验将肌红蛋白（Mb）、血红蛋白（Hb）或葡萄糖氧化酶（GOx）的溶液与有机粘土低聚物的水溶液
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混合，带负电的蛋白质与有机粘土上带正电的氨丙基产生静电吸附力，就得到包埋有单个蛋白质或酶分子的有机粘土纳米颗粒（如图4）
。
图4
Fig.4
有机粘土包埋单分子蛋白质
Theencapsulationofsingleproteinwithorganoclay
实验表明，肌红蛋白（Mb）、血红蛋白（Hb）和葡萄糖氧化酶（GOx）3种蛋白质得到的纳米颗粒的平7.8nm（σ=0.8nm）和6.4nm（σ=0.9nm），均直径分别为4.0nm（σ=0.6nm）、这与它们本身的分子直径近似（Mb：4.5×3.5×2.5nm；Hb：6.5×5.4×5.3nm；GOx：6.0×5.2×3.7nm）。能量色散型X-射线这些纳米颗粒中不仅含有蛋白质，还含有有机粘土，而且有机粘土纳米颗粒中的光谱（EDX）分析显示，
酶分子的热稳定性和活性都得到了显著的提高。
2单分子包埋蛋白质的性能
检测表明，经过单分子包埋的蛋白质的活性稳定性、热稳定性、耐有机溶剂等性能都得到了较大的
提高。
2.1单分子包埋蛋白质的活性稳定性
蛋白质的包埋往往会造成蛋白质一定程度的变构，降低其活性，同时包埋的蛋白质或酶与底物之间
的接触概率降低，造成催化效率进一步降低。但是，单分子包埋的蛋白质可以较好克服这些问题。
刘铮等
［7］
制备了包埋单个酶分子的纳米凝胶，纳米凝胶内的微环境不仅限制了酶的变构，而且含
水凝胶的柔性微环境使酶在起催化作用时，能够发生柔性变化，从而和底物更好地结合，发挥较高的催化效果。同时，由于凝胶尺寸很小，为纳米级，底物很容易从外扩散到酶分子的表面，扩散阻力小，能较好体现酶的活性。碳酸酐酶凝胶和脂肪酶凝胶拥有约80%～95%游离酶的活力，经包埋的碳酸酐酶的半衰期由原来的3min延长到超过90min
［8，9］
。
Kim等［6］对CT等进行了单分子包埋，制备了包埋单个酶分子的纳米颗粒（SENs），纳米颗粒内的微环境使得酶无法自由变构，从而高度保持了酶的活性。实验发现，SEN-CT的半衰期可达143d，而游离的CT半衰期约为1d。同时，由于载体层厚度是纳米尺寸，底物很容易从外扩散到酶分子表面，扩散阻体现了高活性。力小，
［24］
。由于SENs的尺寸小，可以进一步将SEN-CT固定化到平均孔径为29nm含硅的介孔物质中
SENs可以与硅孔达到多点共价连接，这比直接将酶通过吸附或共价连接到相同的载体上更稳定，活性也更高
［25］
。
［7］
2.2单分子包埋蛋白质的热稳定性
刘铮等
比较了pH为7.0时，从30℃到85℃，游离和纳米凝胶中HRP的热稳定性。游离HRP在
而纳米凝胶HRP直到65℃都保持稳定。在65℃下放置90min后，纳米高于40℃后开始失去其活性，
凝胶HRP仍保持初始活性的80%，而游离酶则完全失活。纳米凝胶HRP热稳定性的显著增强，是由于从而表现了较好的热稳定性。凝胶中的聚合物阻碍了酶受温度影响的失活变构，
Patil等［13］将GOx等包埋成有机粘土纳米颗粒，在温度大于60℃情况下，有机粘土包埋的GOx较游离GOx活性高10%。
2.3单分子包埋蛋白质在有机相中的稳定性
一般来说，酶在有机溶剂中较易失活或活性降低。Zaks等
［26］
研究表明，水对维持酶的活性结构必
不可少，但只要保证酶分子表面的一小部分必需水，其它大部分水完全可以被有机溶剂取代而不影响酶
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的活性。
刘铮等
［7］
制备了单酶纳米凝胶后，比较了单分子酶纳米凝胶和游离酶的米氏常数，两者的米氏常
数相近，所以单酶纳米凝胶与游离酶具有相似的生物催化性能。但在研究酶在有机溶剂中的稳定性时，发现单酶纳米凝胶的稳定性大幅度提高。究其原因，一方面纳米凝胶可以限制酶的变构，因此其在有机溶剂中仍能保持较高的活性，另一方面纳米凝胶对水的微观保持作用，限制了有机溶剂对水的夺取，这种微环境保持了酶在有机溶剂中的催化活性
［10］
。
3单分子包埋蛋白质的应用
目前，单分子包埋蛋白质研究的主要对象是酶分子，酶作为一种生物催化剂，具有许多优点，但酶存
易变性失活、利用率低等缺陷，限制了它的广泛应用。上面提到的单分子包埋酶不仅提在的稳定性差、
高了酶的稳定性，还可以提高酶负载量、酶活性等，所以，我们可以预期，单分子包埋酶能在比如延长酶提高酶的重复利用性等方面带来更多的实际应用。下面介绍单分子包埋酶在如药物制反应器的寿命、
备、生物燃料电池和微反应器等方面的一些应用。
3.1在药物制备方面的应用
大多数蛋白质药物都有诸如热稳定性不好、易被血浆蛋白酶水解或无法穿过细胞膜等缺点
［27］
。为
［28］
此，人们一直力求提高蛋白质药物的稳定性及疗效。至今，已研究出了多种方法，包括利用脂质体多聚物
［29］
、
［30］［31］、中孔硅酸盐以及碳纳米管等形式。然而，这些方法大多需要对蛋白质表面进行共价
而这样会导致蛋白质不可逆的变性、失去作用，然而非共价方法如大分子自组装，则有形成的胶体修饰，
不稳定等缺点。
Zhen等［11］设计出了一种合成单分子蛋白质纳米微囊的方法，具有以下优点：（1）属于非共价包埋，既能防止蛋白质聚集又能防止蛋白质水解及变性；（2）当靶向蛋白到达目标细胞，外面的保护层能够分解掉；（3）能够提高含有靶向蛋白的靶向药物穿过细胞膜的效率。他们已成功包埋了CP3并实现了外包层的自我降解，这种蛋白酶调控型的设计可以进一步改进，使外部蛋白酶也能激发纳米微囊的降解过程，而且降解过程的时空控制可通过屏蔽蛋白酶的识别序列实现。
3.2在生物燃料电池方面的应用
酶生物燃料电池
［16，32］
是一项很有发展潜力的技术。生物燃料电池能量转化效率高、生物相容性
［33］
好、原料来源广泛、可以用多种天然有机物作为燃料，是一种真正意义上的绿色电池。我们可以利用
葡萄糖、果糖、乙醇以及油等生物燃料作为原料进行发电。酶燃料电池需要在几个月甚至更长的时间内连续稳定工作，而且要求酶必须适应其使用环境，以保持长期工作下酶的催化活性。但是，目前的酶燃pH、料电池连续工作时间较短，一般在几天至一个月左右。电池寿命主要与酶的特性有关，另外，温度、溶液中离子的组成与浓度等环境因素也会对电池性能产生很大影响载量，提高能量密度，有效延长生物燃料电池的寿命
［35］
［34，35］
。
被吸附于介孔物质中的单分子酶纳米颗粒以及其它的一些纳米级固定化酶的方法可以提高酶的负
。
3.3在微反应器中的应用
24］
Kim等［6，将由蛋白质的单分子包埋技术合成的SEN-CT与含硅的介孔物质结合，制备了微反应
器。单分子包埋的酶的尺寸属于纳米级，通过多尺度的材料设计思路，可以将其装载到微米级微反应器并且微反应器可以继续填充在宏观的反应床内，制成单分子包埋酶的微反应器，为实现纳米酶在工内，
业上的应用奠定了基础。
4结语
近年来，蛋白质包埋技术，尤其是酶的包埋技术已在食品工业、精细化学品工业等行业得到广泛的
应用。用酶技术生产产品，条件温和，无三废产生，酶的包埋及应用研究已得到长足发展。
通过单分子包埋所得到的蛋白质具有如活性高、热稳定性强、耐有机溶剂能力强、粒径小、比表面积无传质扩散阻力等优点。但是，它也仍然存在一些问题：（1）虽然目前已成功将几种蛋白质单分子大、
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包埋，但是有关这方面的机理研究还相对肤浅；（2）目前对单分子包埋蛋白质的分析检测手段主要集中而采用透射电镜的微观检测手段有待进一步完善；（3）聚合反应过程不易控制，导致于活力检测方面，
包埋后的蛋白质分散不均匀。
尽管存在以上问题，不过随着单分子包埋技术的不断发展，蛋白质的单分子包埋存在的问题会得到它将在越来越多的领域得到广泛的应用。最大程度的解决，
参
考
文
献
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