2009年第44卷第12期生物学通报3
基因敲除小鼠在疾病研究中的应用
桑景荭
刘
欣
北京
（首都医科大学基础医学院
100069）
摘要人类疾病动物模型在揭示人类疾病的发生机制或建立治疗方法中具有极重要的作
用。然而，许多疾病难以用人工诱发的方法制造动物模型, 还有许多疾病在实验动物身上不发生, 而难以通过自发或人工定向培育的方法获得动物模型。基因敲除技术的出现, 为人类精确地研究基因与疾病的直接关系提供了可能, 而且可以在个体发生的每个阶段中进行遗传功能的分析。综述了基因敲除小鼠模型在几种疾病研究中的研究与应用及其发展前景。
关键词
基因敲除小鼠
动物模型
动脉粥样硬化
2型糖尿病帕金森病
中国图书分类号：R332Q31文献标识码：A
疾病都与基因有关，基因敲除动物模型的建立, 为研究人类疾病提供了一个崭新方法, 尤其是遗传性疾病。通过基因敲除动物，能够通过表型变化，生理指标检测等直接分析被敲除基因的功能。
基因敲除又称基因打靶(genetargeting) ，是通过外源DNA 与染色体DNA 之间的同源重组，精细地定点修饰和改造基因DNA 片段的技术。它是于20世纪80年代后半期在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的，具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA 共同稳定遗传的特点，目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。阔的应用前景。
综上所述，杜氏藻是一种优越的经济藻类，具有独特的生理特性。随着科技的发展以及消费者对天然产品的需求日益增加，杜氏藻的效能和应用价值将越来越广泛地被开发出来，进而在医药、食品、养殖业、化妆品等领域发挥越来越重要的作用。
主要参考文献
1
Leon R., Vila M., Hernanz D. et al . Production of phytoene by herbicide-treated microalgae Dunaliella bardawil in two-phase systems. Biotechnol Bioeng ,2005,92:695—701. 234
尹鸿萍, 盛玉青. 盐藻多糖体内抑菌及抗炎作用的研究. 中国生化药物杂志，2006,27(6):361—363.
朱红红, 尹鸿萍. 盐藻多糖抗病毒实验研究. 南京中医药大学学报,2007,23(5):310—312.
黄小娟, 沈洛夫, 姜建国等. 卤代物对盐藻生长抑制实验的联合效应的观察. 癌变·畸变·突变,2005,17(1):27—28.
基因敲除（gene knock-out ）是指借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法，通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将模式生物正常的功能基因的编码区破坏，使特定基因失活，以研究该基因的功能，或者通过外源基因来替换宿主基因组中的相应部分，以便测定它们是否具有相同的功能，或者将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。
1基因敲除小鼠技术的建立
目前，比较广泛应用的基因敲除动物主要是
基因敲除小鼠，因为基因敲除技术基于完善的胚胎干细胞系统和胚胎重建技术。人类几乎所有的芳香物、卤化物和杀虫剂等，因此在污水的三级处理过程中也具有潜在应用价值。研究显示，特氏杜氏藻中的金属结合肽和植物螯合肽可将无机砷代谢成砷聚合物，从而达到去除环境中重金属的目的。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
6环境指示
相对其他测试生物(如动物) 而言，藻类对生活
污水或工业废水有更高的敏感性。利用藻类来指示环境毒性的研究，最近有很多报道。Santin-
Montanya 等报道了7种微藻对海洋环境杀虫剂的
测试方法，指出普氏杜氏藻是禾草灭、稀禾定、苯嗪草酮、二氯吡啶酸等杀虫剂的最佳指示剂。黄小娟等
［4］
利用杜氏藻生长阻碍实验，测定排放到环
境中特别是饮用水中的有机毒物，从而得知被测化合物的生物毒性。这种行之有效的测试饮用水污染的方法，在水质污染监测和控制方面有着广
（E-mail:[email protected]）
4生物学通报2009年第44卷第12期
2007年诺贝尔生理学或医学奖授予了来自美
国的Mario R ．Capecchi 、Oliver Smithies 和来自英国的Martin J ．Evans 。他们因利用基因靶向技术使小鼠体内的特定基因失去活性，培育出研究价值极高的“基因敲除小鼠”而获此殊荣。诺贝尔奖评审委员会在新闻公报中说到：“今年的奖项所涉及的发现引领人们掌握了一个无比强大的研究武器”。
在生物、医学等各方面的研究中，模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。其中最具代表性的应用就是在人类疾病动物模型方面的应用，人类的很多疾病，都是由基因决定的，构建相应的基因敲除动物模型，对人类疾病的研究来说不失为一个好方法。
迄今为止，基因敲除技术已经帮助人们构建了数百个人类疾病的小鼠模型，包括心血管疾病、神经退化性疾病、糖尿病、癌症等小鼠模型。通过对这些模型的研究，可以找到相关疾病的潜在治疗靶点。预计在不久的将来，有可能完成小鼠所有基因的敲除实验，来研究不同基因在生命活动中所扮演的具体角色。
性疾病，它会随着年龄的增加而逐渐的发展。目前对于动脉粥样硬化的发生机制存在着许多假说，但是这些假说最终都汇集到动脉内皮受损导致的炎症，而不同的假说只是内皮受损的机制不同。在这些假说中，脂浸润导致内皮损伤的机制由于实验证据颇多，被广泛的认同。脂浸润假说认为，血液中过多的脂类物质（包括甘油三酯，胆固醇等）与载脂蛋白结合而成的低密度脂蛋白（LDL ）可以浸润渗透入血管内皮，从而被内皮细胞吸收导致细胞死亡，进而引发炎症。另外，进入内皮的脂类分子经过超氧化作用形成至炎作用极强的致炎因子，诱导炎性细胞侵入血管内皮。经典动脉粥样硬化动物模型同样是利用脂代谢紊乱诱发动脉硬化来造模的。而目前常用的基因敲除小鼠模型通常有2种，一种是敲除了低密度脂蛋白受体（LdlR ）的基因工程小鼠，另一种是敲除了载脂蛋白E （ApoE ）的基因工程小鼠。
事实上，这2种敲除方式所利用的原理十分相似。敲除了LdlR 的小鼠由于其细胞几乎无法吸收低密度脂蛋白，而造成内环境（血液）中低密度脂蛋白的含量维持在很高的水平，促进了脂浸润的过程，从而诱发动脉粥样硬化。而载脂蛋白E 是脂蛋白的成分之一，同时它又是低密度脂蛋白受体的配体，也就是说，低密度脂蛋白是通过
2
究
基因敲除小鼠疾病模型的建立与相关疾病研在动脉粥样硬化(artherosclerosis)研究中的应据统计，全球每年死于心血管疾病的人数达
ApoE 与LdlR 的相互识别才可以进入细胞的。因
此，敲除了ApoE 的小鼠由于LDL 无法与受体相识别从而滞留在血液当中。这2种基因敲除小鼠作为动脉粥样硬化模型的质量相当高，一般8周龄的小鼠就可以发现明显的硬化斑块。有研究者就利用Ldlr -/-的小鼠研究发现动脉粥炎硬化形成的炎症反应过程中，肥大细胞的浸润是非常关键的一步，去除肥大细胞或是一只肥大细胞脱颗粒作用可以很显著的减少动脉粥样硬化的形成，这个成果对于动脉粥样硬化的预防与治疗中有很重要的意义。
由于动脉粥样硬化是绝大多数心血管疾病的诱因，包括最常见的高血压症，以及常诱发紧急事件的冠心病、急性心肌梗塞、主动脉瘤和主动脉夹层、硬膜下出血和蛛网膜下出血等。基因敲除
2.1
用
到1700万~1900万，约占总死亡人数的30%。因此，很长时间以来，对于心血管疾病的研究都是医学和生命科学关注的焦点。用于心血管疾病研究的经典实验动物模型通常是采用手术、饲喂或是药物处理的方法制作，譬如动脉粥样硬化的模型通常以饲喂高胆固醇配合维生素D 的方法，或是手术破坏血管内膜获得；心肌缺血和心肌缺血再灌注损伤模型通常采用手术结扎冠脉。然而，随着科学技术的发展以及人类对心血管疾病发生机理的深入了解，基因工程技术也逐步应用到了心血管疾病研究领域，为研究提供了更加便利，快速和真实的动物模型。通过基因靶向技术得到的小鼠在心血管疾病的研究中发挥了重要作用，其中比较突出的是动脉粥样硬化模型。
动脉粥样硬化是一种与炎症反应相关的进行
LdlR 或ApoE 的小鼠为攻克这些疾病，提供了强
有力的实验工具。
2.2在2型糖尿病（diabetes mellitus ）研究中的应
2009年第44卷第12期生物学通报5
用2型糖尿病人存在着明显的胰岛素抵抗，产Glut-4蛋白的表达异常足以改变体内的糖平衡。
另外，这种小鼠还出现与2型糖尿病病人相似的糖尿病性心肌病和脂肪肝。因此，Glut-4+/-小鼠是研究非肥胖性2型糖尿病发病的良好模型。
过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ属于核受体超家族，参与脂肪生成。在人类PPAR-γ突变与某一类型的肥胖和严重的胰岛素抵抗相关。
生胰岛素抵抗的主要原因是胰岛素信号转导出现缺陷，同时也影响胰岛素的分泌。胰岛素的形成是一个复杂的、多基因参与的过程。利用基因敲除技术可以探究单个基因在产生胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷中的作用。现在通过基因敲除模型，已经发现了多种与2型糖尿病有关的基因，如IR 基因、Glu-4基因、PPAR γ等。
通过实验发现：胰岛素受体(IR)基因缺失杂合子小鼠无明显的代谢异常，仅10％在成年时出现糖尿病。IR 缺失纯合子(IR)小鼠出生时表型与野生型小鼠相似，但哺乳不久即出现代谢异常，生长迟缓等症状，最后发生糖尿病酮症酸中毒，在出生后1周内死亡。胰岛素受体底物1(IRS-1)是IR 和胰岛素样生长因子1(IGF-1)受体酪氨酸激酶的重要底物。利用基因敲除产生的IRS-1-/-小鼠出现生长迟缓和外周胰岛素抵抗，并有高甘油三脂血症，胰岛素代偿性分泌增加，空腹血糖保持正常。
PPAR-γ是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮(TZD)类药物
的主要功能受体。PPAR-γ-/-小鼠于胚胎期死亡。
PPAR-γ+/-小鼠体重正常，血糖、胰岛素浓度和游
离脂肪酸(FFA)浓度亦无明显改变，但PPAR-γ抑制瘦素表达作用的部分丧失，瘦素表达升高；口服葡萄糖实验后糖耐量正常，但血胰岛素浓度较低，这表明胰岛索敏感性升高。
PPAR-γ在胰岛素敏感性的调控中起双重角
色，噻唑烷二酮类激活的PPAR-γ增强了脂肪细胞的分化，产生小而对胰岛素敏感的脂肪细胞。相反，在PPAR γ2个等位基因存在时，PPAR γ的高表达却促进高脂饮食下的脂肪细胞肥大，形成大的脂肪细胞，产生胰岛素抵抗。
IRS-1-/-小鼠保留部分胰岛素作用促使了另一胰
岛素受体底物IRs-2的发现。在ZRS 小鼠肌肉中，胰岛素诱导的磷脂酰肌醇3激酶（PJ 3k ）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK ）活化水平下降，而在肝脏中显示正常，这是由于酪氨酸磷酸化的IRS-
2.3
应用
在帕金森病（Parkinson disease PD ）研究中的帕金森病是一种严重危害中老年健康的中
枢神经系统退行性疾病。随着社会老龄化，其患病率逐步升高。因此，对PD 的研究越来越受到关注。
2在IRS-1-/-小鼠肝脏中增加，代偿了IRS-1的缺
失，介导胰岛素的信号转导。在肌肉中，这种代偿作用并不存在。IRS-2-/-小鼠存在着外周胰岛素抵抗和B 细胞功能的障碍，在早期即出现明显的糖耐量异常，10周时发展成糖尿病。组织病理学显示IRS-2-/-小鼠的胰岛B 细胞体积明显减小，以致不能代偿外周胰岛素抵抗。这是第一个胰岛素信号蛋白单基因突变影响胰岛素分泌和功能的2型糖尿病动物模型，然而至今还未发现2型糖尿病病人的IRS-2的突变，IRS-1的突变却出现在
PD 动物模型的制作是研究的基础和关键，无
论研究其发病机制，还是探索新的治疗方法都离不开PD 动物模型。然而，PD 在动物中没有自发的倾向，进行PD 实验研究需要建立适当的动物模型。随着基因工程技术的不断发展，尤其1997年发现了遗传因素在PD 发病中的重要作用，表达致病基因的转基因动物，或通过基因敲除技术建立各种疾病相关基因的敲除鼠模型，在探索PD 的发病机制、疾病诊断、预防及治疗等方面起着越来越重要的作用。
通过破坏基因外显子3建立的Nurrl （nuclear
10％～20％的2型糖尿病病人中。
纯合子Glut-4-/-小鼠没有出现糖尿病表型，仅表现轻度的胰岛素抵抗和糖耐量异常，其空腹和餐后乳酸和FFAs 水平下降。雄性Glut-4+/-小鼠并未随年龄增长变得肥胖，但是Glut-4在骨骼肌的表达下降90％～95％，出现外周胰岛素抵抗，随后发展成高血压和糖尿病。Glut-4的一个等位基因敲除可导致严重的外周胰岛素抵抗，而肝的胰岛素敏感性依然存在，表明骨骼肌和脂肪组织
receptor1）基因敲除小鼠模型，具有症状相类性、
病理一致性、慢性进行性及可早期神经保护介入等特点，可作为PD 理想的动物模型。
Nurrl ，即核受体相关因子1，是一种转录因
子，属于核甾体／甲状腺激素受体超家族成员。
Nurrl 在中脑优势表达，作为基因转录调控蛋白与
6生物学通报2009年第44卷第12期
黑质多巴胺能神经元细胞的发育、发展和生存有密切的关系。普遍认为它是帕金森病相关基因。现有研究表明Nurrl 对中脑多巴胺能神经元的发育、生存及其功能维持起重要作用，Nurrl 的激活可增加多巴胺表型标志基因如酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)等靶基因表达。更有研究表明
已完成，人类将进入后基因组时代(post—genomic
time) ，即研究人类功能基因各自的作用和表型。基
因敲除动物模型的建立为这项宏大的工程提供一种有效的方法。基因敲除小鼠的应用在深度和广度方面必将会有长足的进展，深度方面比如覆盖小鼠全基因组的基因敲除小鼠资源库的构建；广度方面则体现在对其他动物，尤其是人的发育与相关疾病方面的研究。随着基因敲除技术的不断改进以及基因敲除的更加深入广泛的应用，相信在不久的将来，基因敲除技术能给人类疾病方面的研究和生命科学的发展带来更多惊喜。
主要参考文献
1234
卢丽, 陈系古, 黄冰. 基因敲除动物的研究和应用. 中国实验动物学报，2006，14（2）：152—156.
刘英, 张瑞君, 伍志传等. 转基因疾病动物模型的研究进展. 动物医学进展,2006,27(12):44—49.
贺松，张德纯. 基因敲除方法及其应用. 中国微生态学杂志，
Nurrl 参与了PD 的发病过程。
为了研究Nurrl 基因的生物学功能，Nurrl 基因敲除小鼠模型已由Cormeely 等建立，这种小鼠表现大量多巴胺能前体神经元凋亡，最终导致黑质体多巴胺能神经元发育不全。当Nurrl +/-组小鼠长到15个月或更大的时候，开始呈现出PD 的症状，提示黑质多巴胺能功能缺陷呈慢性进行性缺陷，表现为在旋转爬杆试验中运动执行功能的明显损害，在行为、生物化学及病理组织学的许多特征与在PD 所见到的慢性进行性的黑质多巴胺能神经元退化相似。因此，Nurrl +/-小鼠是一种有用的动物模型来研究PD 的发病机制和探索疾病的治疗策略。
虽然家族性PD 只占本病总数的5％～10％，但对它们的研究却有望成为打开PD 发病机制神秘大门的一把钥匙，而对具体发病机制的阐明则有利于PD 的根本治疗，即神经保护治疗。帕金森病的神经保护治疗是指一个过程，即某种治疗能有益地影响PD 的病理生理学基础，主要有线粒体复合物－1缺陷、自由基损害和氧化应激、蛋白体功能障碍、凋亡、炎症（小胶质细胞活化），同“多巴胺拟拟剂等对症治疗”相比，它可能推迟发病或延缓病情的发展。
2009,21(2):181—184.
Chao Li,Zhong Huang, Ronald Kingsley et al . Biochemical A-lterations in the Retinas of Very Low-Density Lipoprotein Re-ceptor Knockout Mice.Arch Ophthalmol. 2007,125:795—803. 567
谢谨捷，杨娅. 基因敲除鼠在动脉粥样硬化研究中的应用. 基础医学与临床，2008，28（4）：400—402.
刘清南, 袁中华. 敲除Adipophilin 基因对脂质代谢相关疾病的作用. 中国生物化学与分子生物学报,2009,25(6):495—500.
Veurink G.,Liu D.,Taddei K. et al .Reduction of inclusion body pathology in ApoE-deficient mice fed a combination of antio-xidants.Free Radic Biol Med,2003,34(8)1070—1077.
8LASSILA M.,JANDELEIT-DAHM K.,SEAH K.K. et al .Imatin-ib attenuates diabetic mephropathy in apolipoprote in E-knock out mice.J Am Soc Nephrol,2005,16(2):363—373.
Nurrl 基因敲除小鼠可作为帕金森病研究的
动物模型，是因为动物模型的症状应与同人类患者的特性相似，PD 渐进发展，在经过一个长期的过程后出现典型的临床症状。在临床症状出现前，可对新药和治疗对策能给予评价。对于PD 的早期诊断和早期防治，一直是学界研究的热点和难点，故对Nurrl 基因敲除模型进行早期治疗，进行神经保护治疗是防治PD 的主要切入点。
910111213
周丽斌. 基因敲除技术在2型糖尿病研究中的应用. 国外医学：内分泌学分册，2002，3：177—180.
曲军卫，王勇，周晓军等. 应用基因敲除技术研究胰岛素抵抗的进展. 中国糖尿病杂志，2006，6：474—475.
万海英，汤华. 基因敲除技术现状及应用. 医学分子生物学杂志，2007，4（1）：86—90.
王小同. 中医药抗帕金森病理想的动物模型Nurr1基因敲除小鼠. 中华医学药学刊，2007，25（6）：1117—1119.
Jiang C.,Wan X.,He Y. et al . Age-dependent dopaminergicd-ysfunction in Nurrl knockout mice. Exp Neurol, 2005,191(1):154—162.
3展望
基因敲除动物模型建立，将为哺乳动物正常
14
姚庆和，张华，高国栋. 帕金森病小鼠模型行为学检测方法的比较研究. 中国实验动物学报，2006，14（4）：264—270.
生物学研究提供一个很有力的手段，该模型对生物学、免疫学、肿瘤学、神经生物学及医学和育种学等产生深远的影响。尤其是人类基因测序工作
（E-mail:[email protected]刘
欣
2009年第44卷第12期生物学通报3
基因敲除小鼠在疾病研究中的应用
桑景荭
刘
欣
北京
（首都医科大学基础医学院
100069）
摘要人类疾病动物模型在揭示人类疾病的发生机制或建立治疗方法中具有极重要的作
用。然而，许多疾病难以用人工诱发的方法制造动物模型, 还有许多疾病在实验动物身上不发生, 而难以通过自发或人工定向培育的方法获得动物模型。基因敲除技术的出现, 为人类精确地研究基因与疾病的直接关系提供了可能, 而且可以在个体发生的每个阶段中进行遗传功能的分析。综述了基因敲除小鼠模型在几种疾病研究中的研究与应用及其发展前景。
关键词
基因敲除小鼠
动物模型
动脉粥样硬化
2型糖尿病帕金森病
中国图书分类号：R332Q31文献标识码：A
疾病都与基因有关，基因敲除动物模型的建立, 为研究人类疾病提供了一个崭新方法, 尤其是遗传性疾病。通过基因敲除动物，能够通过表型变化，生理指标检测等直接分析被敲除基因的功能。
基因敲除又称基因打靶(genetargeting) ，是通过外源DNA 与染色体DNA 之间的同源重组，精细地定点修饰和改造基因DNA 片段的技术。它是于20世纪80年代后半期在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的，具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA 共同稳定遗传的特点，目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。阔的应用前景。
综上所述，杜氏藻是一种优越的经济藻类，具有独特的生理特性。随着科技的发展以及消费者对天然产品的需求日益增加，杜氏藻的效能和应用价值将越来越广泛地被开发出来，进而在医药、食品、养殖业、化妆品等领域发挥越来越重要的作用。
主要参考文献
1
Leon R., Vila M., Hernanz D. et al . Production of phytoene by herbicide-treated microalgae Dunaliella bardawil in two-phase systems. Biotechnol Bioeng ,2005,92:695—701. 234
尹鸿萍, 盛玉青. 盐藻多糖体内抑菌及抗炎作用的研究. 中国生化药物杂志，2006,27(6):361—363.
朱红红, 尹鸿萍. 盐藻多糖抗病毒实验研究. 南京中医药大学学报,2007,23(5):310—312.
黄小娟, 沈洛夫, 姜建国等. 卤代物对盐藻生长抑制实验的联合效应的观察. 癌变·畸变·突变,2005,17(1):27—28.
基因敲除（gene knock-out ）是指借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法，通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将模式生物正常的功能基因的编码区破坏，使特定基因失活，以研究该基因的功能，或者通过外源基因来替换宿主基因组中的相应部分，以便测定它们是否具有相同的功能，或者将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。
1基因敲除小鼠技术的建立
目前，比较广泛应用的基因敲除动物主要是
基因敲除小鼠，因为基因敲除技术基于完善的胚胎干细胞系统和胚胎重建技术。人类几乎所有的芳香物、卤化物和杀虫剂等，因此在污水的三级处理过程中也具有潜在应用价值。研究显示，特氏杜氏藻中的金属结合肽和植物螯合肽可将无机砷代谢成砷聚合物，从而达到去除环境中重金属的目的。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
6环境指示
相对其他测试生物(如动物) 而言，藻类对生活
污水或工业废水有更高的敏感性。利用藻类来指示环境毒性的研究，最近有很多报道。Santin-
Montanya 等报道了7种微藻对海洋环境杀虫剂的
测试方法，指出普氏杜氏藻是禾草灭、稀禾定、苯嗪草酮、二氯吡啶酸等杀虫剂的最佳指示剂。黄小娟等
［4］
利用杜氏藻生长阻碍实验，测定排放到环
境中特别是饮用水中的有机毒物，从而得知被测化合物的生物毒性。这种行之有效的测试饮用水污染的方法，在水质污染监测和控制方面有着广
（E-mail:[email protected]）
4生物学通报2009年第44卷第12期
2007年诺贝尔生理学或医学奖授予了来自美
国的Mario R ．Capecchi 、Oliver Smithies 和来自英国的Martin J ．Evans 。他们因利用基因靶向技术使小鼠体内的特定基因失去活性，培育出研究价值极高的“基因敲除小鼠”而获此殊荣。诺贝尔奖评审委员会在新闻公报中说到：“今年的奖项所涉及的发现引领人们掌握了一个无比强大的研究武器”。
在生物、医学等各方面的研究中，模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。其中最具代表性的应用就是在人类疾病动物模型方面的应用，人类的很多疾病，都是由基因决定的，构建相应的基因敲除动物模型，对人类疾病的研究来说不失为一个好方法。
迄今为止，基因敲除技术已经帮助人们构建了数百个人类疾病的小鼠模型，包括心血管疾病、神经退化性疾病、糖尿病、癌症等小鼠模型。通过对这些模型的研究，可以找到相关疾病的潜在治疗靶点。预计在不久的将来，有可能完成小鼠所有基因的敲除实验，来研究不同基因在生命活动中所扮演的具体角色。
性疾病，它会随着年龄的增加而逐渐的发展。目前对于动脉粥样硬化的发生机制存在着许多假说，但是这些假说最终都汇集到动脉内皮受损导致的炎症，而不同的假说只是内皮受损的机制不同。在这些假说中，脂浸润导致内皮损伤的机制由于实验证据颇多，被广泛的认同。脂浸润假说认为，血液中过多的脂类物质（包括甘油三酯，胆固醇等）与载脂蛋白结合而成的低密度脂蛋白（LDL ）可以浸润渗透入血管内皮，从而被内皮细胞吸收导致细胞死亡，进而引发炎症。另外，进入内皮的脂类分子经过超氧化作用形成至炎作用极强的致炎因子，诱导炎性细胞侵入血管内皮。经典动脉粥样硬化动物模型同样是利用脂代谢紊乱诱发动脉硬化来造模的。而目前常用的基因敲除小鼠模型通常有2种，一种是敲除了低密度脂蛋白受体（LdlR ）的基因工程小鼠，另一种是敲除了载脂蛋白E （ApoE ）的基因工程小鼠。
事实上，这2种敲除方式所利用的原理十分相似。敲除了LdlR 的小鼠由于其细胞几乎无法吸收低密度脂蛋白，而造成内环境（血液）中低密度脂蛋白的含量维持在很高的水平，促进了脂浸润的过程，从而诱发动脉粥样硬化。而载脂蛋白E 是脂蛋白的成分之一，同时它又是低密度脂蛋白受体的配体，也就是说，低密度脂蛋白是通过
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究
基因敲除小鼠疾病模型的建立与相关疾病研在动脉粥样硬化(artherosclerosis)研究中的应据统计，全球每年死于心血管疾病的人数达
ApoE 与LdlR 的相互识别才可以进入细胞的。因
此，敲除了ApoE 的小鼠由于LDL 无法与受体相识别从而滞留在血液当中。这2种基因敲除小鼠作为动脉粥样硬化模型的质量相当高，一般8周龄的小鼠就可以发现明显的硬化斑块。有研究者就利用Ldlr -/-的小鼠研究发现动脉粥炎硬化形成的炎症反应过程中，肥大细胞的浸润是非常关键的一步，去除肥大细胞或是一只肥大细胞脱颗粒作用可以很显著的减少动脉粥样硬化的形成，这个成果对于动脉粥样硬化的预防与治疗中有很重要的意义。
由于动脉粥样硬化是绝大多数心血管疾病的诱因，包括最常见的高血压症，以及常诱发紧急事件的冠心病、急性心肌梗塞、主动脉瘤和主动脉夹层、硬膜下出血和蛛网膜下出血等。基因敲除
2.1
用
到1700万~1900万，约占总死亡人数的30%。因此，很长时间以来，对于心血管疾病的研究都是医学和生命科学关注的焦点。用于心血管疾病研究的经典实验动物模型通常是采用手术、饲喂或是药物处理的方法制作，譬如动脉粥样硬化的模型通常以饲喂高胆固醇配合维生素D 的方法，或是手术破坏血管内膜获得；心肌缺血和心肌缺血再灌注损伤模型通常采用手术结扎冠脉。然而，随着科学技术的发展以及人类对心血管疾病发生机理的深入了解，基因工程技术也逐步应用到了心血管疾病研究领域，为研究提供了更加便利，快速和真实的动物模型。通过基因靶向技术得到的小鼠在心血管疾病的研究中发挥了重要作用，其中比较突出的是动脉粥样硬化模型。
动脉粥样硬化是一种与炎症反应相关的进行
LdlR 或ApoE 的小鼠为攻克这些疾病，提供了强
有力的实验工具。
2.2在2型糖尿病（diabetes mellitus ）研究中的应
2009年第44卷第12期生物学通报5
用2型糖尿病人存在着明显的胰岛素抵抗，产Glut-4蛋白的表达异常足以改变体内的糖平衡。
另外，这种小鼠还出现与2型糖尿病病人相似的糖尿病性心肌病和脂肪肝。因此，Glut-4+/-小鼠是研究非肥胖性2型糖尿病发病的良好模型。
过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ属于核受体超家族，参与脂肪生成。在人类PPAR-γ突变与某一类型的肥胖和严重的胰岛素抵抗相关。
生胰岛素抵抗的主要原因是胰岛素信号转导出现缺陷，同时也影响胰岛素的分泌。胰岛素的形成是一个复杂的、多基因参与的过程。利用基因敲除技术可以探究单个基因在产生胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷中的作用。现在通过基因敲除模型，已经发现了多种与2型糖尿病有关的基因，如IR 基因、Glu-4基因、PPAR γ等。
通过实验发现：胰岛素受体(IR)基因缺失杂合子小鼠无明显的代谢异常，仅10％在成年时出现糖尿病。IR 缺失纯合子(IR)小鼠出生时表型与野生型小鼠相似，但哺乳不久即出现代谢异常，生长迟缓等症状，最后发生糖尿病酮症酸中毒，在出生后1周内死亡。胰岛素受体底物1(IRS-1)是IR 和胰岛素样生长因子1(IGF-1)受体酪氨酸激酶的重要底物。利用基因敲除产生的IRS-1-/-小鼠出现生长迟缓和外周胰岛素抵抗，并有高甘油三脂血症，胰岛素代偿性分泌增加，空腹血糖保持正常。
PPAR-γ是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮(TZD)类药物
的主要功能受体。PPAR-γ-/-小鼠于胚胎期死亡。
PPAR-γ+/-小鼠体重正常，血糖、胰岛素浓度和游
离脂肪酸(FFA)浓度亦无明显改变，但PPAR-γ抑制瘦素表达作用的部分丧失，瘦素表达升高；口服葡萄糖实验后糖耐量正常，但血胰岛素浓度较低，这表明胰岛索敏感性升高。
PPAR-γ在胰岛素敏感性的调控中起双重角
色，噻唑烷二酮类激活的PPAR-γ增强了脂肪细胞的分化，产生小而对胰岛素敏感的脂肪细胞。相反，在PPAR γ2个等位基因存在时，PPAR γ的高表达却促进高脂饮食下的脂肪细胞肥大，形成大的脂肪细胞，产生胰岛素抵抗。
IRS-1-/-小鼠保留部分胰岛素作用促使了另一胰
岛素受体底物IRs-2的发现。在ZRS 小鼠肌肉中，胰岛素诱导的磷脂酰肌醇3激酶（PJ 3k ）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK ）活化水平下降，而在肝脏中显示正常，这是由于酪氨酸磷酸化的IRS-
2.3
应用
在帕金森病（Parkinson disease PD ）研究中的帕金森病是一种严重危害中老年健康的中
枢神经系统退行性疾病。随着社会老龄化，其患病率逐步升高。因此，对PD 的研究越来越受到关注。
2在IRS-1-/-小鼠肝脏中增加，代偿了IRS-1的缺
失，介导胰岛素的信号转导。在肌肉中，这种代偿作用并不存在。IRS-2-/-小鼠存在着外周胰岛素抵抗和B 细胞功能的障碍，在早期即出现明显的糖耐量异常，10周时发展成糖尿病。组织病理学显示IRS-2-/-小鼠的胰岛B 细胞体积明显减小，以致不能代偿外周胰岛素抵抗。这是第一个胰岛素信号蛋白单基因突变影响胰岛素分泌和功能的2型糖尿病动物模型，然而至今还未发现2型糖尿病病人的IRS-2的突变，IRS-1的突变却出现在
PD 动物模型的制作是研究的基础和关键，无
论研究其发病机制，还是探索新的治疗方法都离不开PD 动物模型。然而，PD 在动物中没有自发的倾向，进行PD 实验研究需要建立适当的动物模型。随着基因工程技术的不断发展，尤其1997年发现了遗传因素在PD 发病中的重要作用，表达致病基因的转基因动物，或通过基因敲除技术建立各种疾病相关基因的敲除鼠模型，在探索PD 的发病机制、疾病诊断、预防及治疗等方面起着越来越重要的作用。
通过破坏基因外显子3建立的Nurrl （nuclear
10％～20％的2型糖尿病病人中。
纯合子Glut-4-/-小鼠没有出现糖尿病表型，仅表现轻度的胰岛素抵抗和糖耐量异常，其空腹和餐后乳酸和FFAs 水平下降。雄性Glut-4+/-小鼠并未随年龄增长变得肥胖，但是Glut-4在骨骼肌的表达下降90％～95％，出现外周胰岛素抵抗，随后发展成高血压和糖尿病。Glut-4的一个等位基因敲除可导致严重的外周胰岛素抵抗，而肝的胰岛素敏感性依然存在，表明骨骼肌和脂肪组织
receptor1）基因敲除小鼠模型，具有症状相类性、
病理一致性、慢性进行性及可早期神经保护介入等特点，可作为PD 理想的动物模型。
Nurrl ，即核受体相关因子1，是一种转录因
子，属于核甾体／甲状腺激素受体超家族成员。
Nurrl 在中脑优势表达，作为基因转录调控蛋白与
6生物学通报2009年第44卷第12期
黑质多巴胺能神经元细胞的发育、发展和生存有密切的关系。普遍认为它是帕金森病相关基因。现有研究表明Nurrl 对中脑多巴胺能神经元的发育、生存及其功能维持起重要作用，Nurrl 的激活可增加多巴胺表型标志基因如酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)等靶基因表达。更有研究表明
已完成，人类将进入后基因组时代(post—genomic
time) ，即研究人类功能基因各自的作用和表型。基
因敲除动物模型的建立为这项宏大的工程提供一种有效的方法。基因敲除小鼠的应用在深度和广度方面必将会有长足的进展，深度方面比如覆盖小鼠全基因组的基因敲除小鼠资源库的构建；广度方面则体现在对其他动物，尤其是人的发育与相关疾病方面的研究。随着基因敲除技术的不断改进以及基因敲除的更加深入广泛的应用，相信在不久的将来，基因敲除技术能给人类疾病方面的研究和生命科学的发展带来更多惊喜。
主要参考文献
1234
卢丽, 陈系古, 黄冰. 基因敲除动物的研究和应用. 中国实验动物学报，2006，14（2）：152—156.
刘英, 张瑞君, 伍志传等. 转基因疾病动物模型的研究进展. 动物医学进展,2006,27(12):44—49.
贺松，张德纯. 基因敲除方法及其应用. 中国微生态学杂志，
Nurrl 参与了PD 的发病过程。
为了研究Nurrl 基因的生物学功能，Nurrl 基因敲除小鼠模型已由Cormeely 等建立，这种小鼠表现大量多巴胺能前体神经元凋亡，最终导致黑质体多巴胺能神经元发育不全。当Nurrl +/-组小鼠长到15个月或更大的时候，开始呈现出PD 的症状，提示黑质多巴胺能功能缺陷呈慢性进行性缺陷，表现为在旋转爬杆试验中运动执行功能的明显损害，在行为、生物化学及病理组织学的许多特征与在PD 所见到的慢性进行性的黑质多巴胺能神经元退化相似。因此，Nurrl +/-小鼠是一种有用的动物模型来研究PD 的发病机制和探索疾病的治疗策略。
虽然家族性PD 只占本病总数的5％～10％，但对它们的研究却有望成为打开PD 发病机制神秘大门的一把钥匙，而对具体发病机制的阐明则有利于PD 的根本治疗，即神经保护治疗。帕金森病的神经保护治疗是指一个过程，即某种治疗能有益地影响PD 的病理生理学基础，主要有线粒体复合物－1缺陷、自由基损害和氧化应激、蛋白体功能障碍、凋亡、炎症（小胶质细胞活化），同“多巴胺拟拟剂等对症治疗”相比，它可能推迟发病或延缓病情的发展。
2009,21(2):181—184.
Chao Li,Zhong Huang, Ronald Kingsley et al . Biochemical A-lterations in the Retinas of Very Low-Density Lipoprotein Re-ceptor Knockout Mice.Arch Ophthalmol. 2007,125:795—803. 567
谢谨捷，杨娅. 基因敲除鼠在动脉粥样硬化研究中的应用. 基础医学与临床，2008，28（4）：400—402.
刘清南, 袁中华. 敲除Adipophilin 基因对脂质代谢相关疾病的作用. 中国生物化学与分子生物学报,2009,25(6):495—500.
Veurink G.,Liu D.,Taddei K. et al .Reduction of inclusion body pathology in ApoE-deficient mice fed a combination of antio-xidants.Free Radic Biol Med,2003,34(8)1070—1077.
8LASSILA M.,JANDELEIT-DAHM K.,SEAH K.K. et al .Imatin-ib attenuates diabetic mephropathy in apolipoprote in E-knock out mice.J Am Soc Nephrol,2005,16(2):363—373.
Nurrl 基因敲除小鼠可作为帕金森病研究的
动物模型，是因为动物模型的症状应与同人类患者的特性相似，PD 渐进发展，在经过一个长期的过程后出现典型的临床症状。在临床症状出现前，可对新药和治疗对策能给予评价。对于PD 的早期诊断和早期防治，一直是学界研究的热点和难点，故对Nurrl 基因敲除模型进行早期治疗，进行神经保护治疗是防治PD 的主要切入点。
910111213
周丽斌. 基因敲除技术在2型糖尿病研究中的应用. 国外医学：内分泌学分册，2002，3：177—180.
曲军卫，王勇，周晓军等. 应用基因敲除技术研究胰岛素抵抗的进展. 中国糖尿病杂志，2006，6：474—475.
万海英，汤华. 基因敲除技术现状及应用. 医学分子生物学杂志，2007，4（1）：86—90.
王小同. 中医药抗帕金森病理想的动物模型Nurr1基因敲除小鼠. 中华医学药学刊，2007，25（6）：1117—1119.
Jiang C.,Wan X.,He Y. et al . Age-dependent dopaminergicd-ysfunction in Nurrl knockout mice. Exp Neurol, 2005,191(1):154—162.
3展望
基因敲除动物模型建立，将为哺乳动物正常
14
姚庆和，张华，高国栋. 帕金森病小鼠模型行为学检测方法的比较研究. 中国实验动物学报，2006，14（4）：264—270.
生物学研究提供一个很有力的手段，该模型对生物学、免疫学、肿瘤学、神经生物学及医学和育种学等产生深远的影响。尤其是人类基因测序工作
（E-mail:[email protected]刘
欣