1目的：建立一个培养基配制操作规程，保证检验结果的准确。 2范围：适用于微生物限度检查用培养基。 3责任人：质检员、化验主管。 4内容：
4．1微生物限度检查用培养基的配制
4．1．1配制用具：蒸汽灭菌器、电炉、搪瓷缸、玻璃棒、三角瓶、棉塞、细绳、牛皮纸、天平、量筒。
4．1．2根据配制量称取干燥培养基质，置搪瓷缸中，加入规定的纯化水或琼脂等使其溶解，将搪瓷缸放到电炉上加热煮沸。
4．1．3根据培养基的配方要求调节PH 值，将配好的培养基分装到若干个三角瓶中，瓶口塞好棉塞，盖上牛皮纸捆扎好，放入灭菌器中，灭菌条件为121℃高压灭菌15分钟。
4．
方法：称取使用该处方生产的符合规定的脱水缓冲液16克，加入1000ml 纯化水中，微温溶解，分装，115℃高压灭菌30分钟备用。将配好的缓冲液分装到若干支试管中，直接接种法缓冲液9ml/管，试管口塞好棉塞；放入灭菌器中进行灭菌。
4．方法：称取使用该处方生产的符合规定的脱水培养基33克，加入1000ml 纯化水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。 4
方法：称取使用该处方生产的符合规定的脱水培养基30.5克，加入1000ml 纯化水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。 4
方法：称取使用该处方生产的符合规定的脱水培养基37克，加入1000ml 纯化水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌20分钟备用。
4.1.8培养基配制注意事项：
（1） 采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH 进行校验。 （2） 配制的培养基不应有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。 （3） 培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞
子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。
（4） 培养基配制后应在2小时内灭菌，避免细菌繁殖。
（5） 灭菌后的培养基应保存在2～25℃，防止污染，可在3周内用毕；保
存于密闭容器中，可在1年内使用。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。
（6） 宜采用水浴加热熔化琼脂培养基，勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以
免营养成份过度受热而破坏。
（7） 已熔化的培养基应8小时内一次用完，剩余培养基不宜再用。 4.2培养基的适用性检查
4．2．1微生物限度检查中计数用培养基包括：（营养琼脂、玫瑰红钠琼脂）、控制菌检查用培养基包括胆盐乳糖培养基。 4．2．2计数培养基适用性检查试验用菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B ）44102]
金黄色葡糖球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B ）26003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B ）63501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F ）98001] 黑曲霉菌（Aspergillus niger）[CMCC（F ）98003]
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B ）10104]
4.2.3检查方法
4.2.3.1培养基制备 按规定程序新鲜配制营养琼脂（被检培养基和对照培养基）、玫瑰红钠培养基（被检培养基和对照培养基）、胆盐乳糖培养基，灭菌后备用。
4.2.3.2营养琼脂培养基
4.2.3.2.1方法： 取7个无菌平皿，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡糖球菌、枯草芽孢杆菌各2皿，每皿接种1ml 菌液（含菌50～100cfu ），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照营养琼脂培养基，混匀，凝固后于30～35℃倒置培养48h ，计数；被检培养基同法操作。
4.2.3.2.2结果判断：若被检培养基的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。 4.2.3.3玫瑰红钠琼脂培养基
4.2.3.3.1方法： 取5个无菌平皿，分别接种白色念珠菌，黑曲霉菌各2皿，每皿接种1ml 菌液（含菌50～100cfu ），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固后于倒置培养72h ，计数；被检培养基同法操作。
4.2.3.3.2结果判断：若被检培养基的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。 4.2.3.4胆盐乳糖培养基
4.2.3.4.1方法：新鲜配制100ml/瓶的对照胆盐乳糖培养基4瓶，121℃灭菌15min ，备用。分别接种大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及金黄色葡糖球菌各一瓶，接种菌液量1ml （不大于100cfu ），另一瓶不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作，置规定温度培养。
4.2.3.4.2结果判断：培养18小时，与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊；培养48小时，空白培养瓶和接种金黄色葡糖球菌的培养瓶应不得浑浊。 4.2.3.5MUG 培养基
4.2.3.5.1方法：新鲜配制5ml/支的对照MUG 培养基，121℃灭菌15min ，备用。取3支，接种大肠埃希菌2支，接种菌液0.2ml （不大于100cfu ），另一支不接种菌作为空白对照，培养5小时，在366nm 紫外光灯下观察结果；被检培养基同法操作，置规定温度培养。
4.2.3.5.2结果判断：空白培养管应不得浑浊，且366nm 处观察无荧光；与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊，366nm 处应呈现荧光。若荧光不明显，则可延长至24h 。 4.2.3.6麦康凯琼脂培养基
4.2.3.6.1方法：新鲜配制对照麦康凯琼脂培养基，121℃灭菌15min ，冷却至60℃倾注平皿，35℃培养箱预培8h 后备用。取5个无菌麦康凯琼脂平板，分别涂布接种大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌各5皿，接种菌液0.1ml （含菌50～100cfu ），另一平板不接种菌作空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养；被检培养基同法操作。
4.2.3.6.2结果判断：培养18小时，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致；培养24小时，空白平板应无菌落生长。 4.2.3.7四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB ）
4.2.3.7.1方法：新鲜配制10ml/支的对照TTB 培养基基础，121℃灭菌15min ，备用。临用前，无菌操作加入0.2ml 碘试液和0.1ml 亮绿试液。取5支，分别接种乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌各2支，接种菌液1ml （不大于100cfu ），另一支不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作，置规定温度培养。 4.2.3.7.2结果判断：培养18小时，与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基上清浑浊；培养24h ，空白的培养管和接种金黄色葡糖球菌的培养管不得浑浊。
用于TTB 中的碳酸钙对浑浊现象观察有影响，因此若浑浊现象不明显，则将各培养物接种至胆盐硫乳琼脂（DHL ）或沙门、志贺属琼脂（SS ）平板上划线观察TTB 培养物生长情况，空白对照和接种金黄色葡萄球菌的培养管划线后应无菌生长，对照和被检TTB 培养划线接种至琼脂平板后应有菌落生长，且颜色形态一致。
1目的：建立一个培养基配制操作规程，保证检验结果的准确。 2范围：适用于微生物限度检查用培养基。 3责任人：质检员、化验主管。 4内容：
4．1微生物限度检查用培养基的配制
4．1．1配制用具：蒸汽灭菌器、电炉、搪瓷缸、玻璃棒、三角瓶、棉塞、细绳、牛皮纸、天平、量筒。
4．1．2根据配制量称取干燥培养基质，置搪瓷缸中，加入规定的纯化水或琼脂等使其溶解，将搪瓷缸放到电炉上加热煮沸。
4．1．3根据培养基的配方要求调节PH 值，将配好的培养基分装到若干个三角瓶中，瓶口塞好棉塞，盖上牛皮纸捆扎好，放入灭菌器中，灭菌条件为121℃高压灭菌15分钟。
4．
方法：称取使用该处方生产的符合规定的脱水缓冲液16克，加入1000ml 纯化水中，微温溶解，分装，115℃高压灭菌30分钟备用。将配好的缓冲液分装到若干支试管中，直接接种法缓冲液9ml/管，试管口塞好棉塞；放入灭菌器中进行灭菌。
4．方法：称取使用该处方生产的符合规定的脱水培养基33克，加入1000ml 纯化水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。 4
方法：称取使用该处方生产的符合规定的脱水培养基30.5克，加入1000ml 纯化水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。 4
方法：称取使用该处方生产的符合规定的脱水培养基37克，加入1000ml 纯化水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌20分钟备用。
4.1.8培养基配制注意事项：
（1） 采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH 进行校验。 （2） 配制的培养基不应有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。 （3） 培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞
子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。
（4） 培养基配制后应在2小时内灭菌，避免细菌繁殖。
（5） 灭菌后的培养基应保存在2～25℃，防止污染，可在3周内用毕；保
存于密闭容器中，可在1年内使用。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。
（6） 宜采用水浴加热熔化琼脂培养基，勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以
免营养成份过度受热而破坏。
（7） 已熔化的培养基应8小时内一次用完，剩余培养基不宜再用。 4.2培养基的适用性检查
4．2．1微生物限度检查中计数用培养基包括：（营养琼脂、玫瑰红钠琼脂）、控制菌检查用培养基包括胆盐乳糖培养基。 4．2．2计数培养基适用性检查试验用菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B ）44102]
金黄色葡糖球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B ）26003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B ）63501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F ）98001] 黑曲霉菌（Aspergillus niger）[CMCC（F ）98003]
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B ）10104]
4.2.3检查方法
4.2.3.1培养基制备 按规定程序新鲜配制营养琼脂（被检培养基和对照培养基）、玫瑰红钠培养基（被检培养基和对照培养基）、胆盐乳糖培养基，灭菌后备用。
4.2.3.2营养琼脂培养基
4.2.3.2.1方法： 取7个无菌平皿，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡糖球菌、枯草芽孢杆菌各2皿，每皿接种1ml 菌液（含菌50～100cfu ），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照营养琼脂培养基，混匀，凝固后于30～35℃倒置培养48h ，计数；被检培养基同法操作。
4.2.3.2.2结果判断：若被检培养基的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。 4.2.3.3玫瑰红钠琼脂培养基
4.2.3.3.1方法： 取5个无菌平皿，分别接种白色念珠菌，黑曲霉菌各2皿，每皿接种1ml 菌液（含菌50～100cfu ），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固后于倒置培养72h ，计数；被检培养基同法操作。
4.2.3.3.2结果判断：若被检培养基的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。 4.2.3.4胆盐乳糖培养基
4.2.3.4.1方法：新鲜配制100ml/瓶的对照胆盐乳糖培养基4瓶，121℃灭菌15min ，备用。分别接种大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及金黄色葡糖球菌各一瓶，接种菌液量1ml （不大于100cfu ），另一瓶不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作，置规定温度培养。
4.2.3.4.2结果判断：培养18小时，与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊；培养48小时，空白培养瓶和接种金黄色葡糖球菌的培养瓶应不得浑浊。 4.2.3.5MUG 培养基
4.2.3.5.1方法：新鲜配制5ml/支的对照MUG 培养基，121℃灭菌15min ，备用。取3支，接种大肠埃希菌2支，接种菌液0.2ml （不大于100cfu ），另一支不接种菌作为空白对照，培养5小时，在366nm 紫外光灯下观察结果；被检培养基同法操作，置规定温度培养。
4.2.3.5.2结果判断：空白培养管应不得浑浊，且366nm 处观察无荧光；与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊，366nm 处应呈现荧光。若荧光不明显，则可延长至24h 。 4.2.3.6麦康凯琼脂培养基
4.2.3.6.1方法：新鲜配制对照麦康凯琼脂培养基，121℃灭菌15min ，冷却至60℃倾注平皿，35℃培养箱预培8h 后备用。取5个无菌麦康凯琼脂平板，分别涂布接种大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌各5皿，接种菌液0.1ml （含菌50～100cfu ），另一平板不接种菌作空白对照，涂布均匀后于规定温度倒置培养；被检培养基同法操作。
4.2.3.6.2结果判断：培养18小时，被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致；培养24小时，空白平板应无菌落生长。 4.2.3.7四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB ）
4.2.3.7.1方法：新鲜配制10ml/支的对照TTB 培养基基础，121℃灭菌15min ，备用。临用前，无菌操作加入0.2ml 碘试液和0.1ml 亮绿试液。取5支，分别接种乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌各2支，接种菌液1ml （不大于100cfu ），另一支不接种菌作为空白对照；被检培养基同法操作，置规定温度培养。 4.2.3.7.2结果判断：培养18小时，与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基上清浑浊；培养24h ，空白的培养管和接种金黄色葡糖球菌的培养管不得浑浊。
用于TTB 中的碳酸钙对浑浊现象观察有影响，因此若浑浊现象不明显，则将各培养物接种至胆盐硫乳琼脂（DHL ）或沙门、志贺属琼脂（SS ）平板上划线观察TTB 培养物生长情况，空白对照和接种金黄色葡萄球菌的培养管划线后应无菌生长，对照和被检TTB 培养划线接种至琼脂平板后应有菌落生长，且颜色形态一致。