上海斯丹赛生物技术有限公司
SIDANSAI Biotechnology CO.,LTD
小鼠：
分 类 ： 小 鼠 属 于 哺 乳 纲 （ Mammalia ） 、 啮 齿 目
（ Rodentia ）、鼠科（ Muridae ）、小鼠属（ Mus ）动物。 特 征：生长期短、成熟早、繁殖力强。 性成熟：6~7周。雌性35～50日龄，雄性45～60日龄； 体成熟：雌性为65～75日龄，雄性为70～80日龄；性周期为 4～5天，妊娠期为19～21天；哺乳期为20～22天；一 次排卵10～23个（视品种而定），每胎产仔数为8～15 只，一年产仔胎数6～10胎，属全年、多发情性动物， 繁殖率很高，生育期为一年。
确定靶基因
同源重组介导的小 鼠基因打靶流程
构建同源重组载体 载体线性化导入ES 筛选同源重组成功的ES ES显微注射囊胚
野生型
F0代（嵌合体）
野生型
野生型
F1代（杂合体）
F1代（杂合体）
野生型
F2代（杂合体） F2代（纯合体）
确定靶基因
TALEN介导的小 鼠基因打靶流程
构建TALEN载体 TALEN活性检测 体外转录mRNA 小鼠3T3细胞
注：KI加同源载体 Donor DNA
将mRNA注射入一细胞期受精卵
野生型
F0代（嵌合体）
野生型
野生型
F1代（杂合体）
F1代（杂合体）
野生型
F2代（杂合体）
F2代（纯合体）
Step1 设计TALEN打靶载体
针对靶基因的两个不同位点分别设计一个2X3的TALEN组合
5’
3’
3’
5’
Spacer 12-21bp
Step2 构建TALEN打靶载体
通过FastTALETM一步连接法完成TALEN载体的构建
上游引物测序结果比对
下游引物测序结果比对
Step3 细胞水平TALEN活性验证
Day1:小鼠3T3细胞铺板 筛选出一对高活性的 TALEN质粒用于后续实验 Day2：Fugene 共转TALEN 左右臂质粒和EIP质粒 ①PCR产物测序结果 查看套峰
Day3:药物筛选 （puromycin, 1μg/ml）
②PCR产物进行TA克隆 测序，计算突变率
Day6:收集剩余细胞, 抽基因组DNA
PCR靶向序列片段， 扩增出500bp左右
在靶位点上下游设计PCR引物，对打靶后的细胞基因组 DNA进行PCR
PCR-F >200bp TALEN-L >200bp
TALEN-R
PCR-R
Marker 560bp
目的基因片段PCR扩增
活性检测方法①： PCR产物测序结果查看峰图
方法： TALEN质粒转染细胞 药物筛选，收集细胞提取基因组DNA PCR扩增
PCR产物测序
打靶效率中等的样品
活性检测方法②： PCR产物连T载体，单克隆测序计算突变率
挑取30-50个克隆，将测序结果与目标基因的原始系列 进行比对，计算突变率。
注：图中第一排WT为原始序列，---表示缺失，红色为插入或置换。
Step4 体外转录生成mRNA
TALEN质粒线性化
根据载体所带启动子选择 相应试剂盒进行体外转录
mRNA浓度、纯度检测
原核启动子：sp6或T7 mRNA转录后的大小检测： 若片段大于1.5kb可用琼脂糖凝胶电泳检测；若片段较小，建议用聚 丙烯酰
胺凝胶电泳检测。
Step5 胚胎注射mRNA
TALEN左右臂 mRNA按1:1 比例混合
注射至一细胞 期受精卵 细胞质中
37℃培养24h 至二细胞期
移至代孕雌鼠 中，至小鼠 出生（3周）
注射浓度 300-500 ng/ul 注射体积：5-15 pl
Step6 F0代突变体小鼠检测
F0代小鼠剪尾， 抽提基因组DNA T7E1酶切鉴定法： 剪小鼠的尾巴或脚趾 提取基因组DNA PCR靶向基因序列 PCR扩增靶基因位点 PCR产物于94℃失活、50-60℃退火 T7E1酶切鉴定PCR 产物，进行初步筛选
T7E1酶37℃作用1h
琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物连TA克隆 进行测序，进一步确认 F0代突变体小鼠
Step7 获得F1代杂合体小鼠
F0代突变体小鼠 x 野生型小鼠
F1代小鼠剪尾， 抽提基因组DNA
F1代杂合子小鼠
PCR靶向基因序列
通过PCR产物测序 查看峰图及TA克隆 测序结果比对， 鉴定F1代杂合体小鼠
同源重组介导的knockout animal model
经由ES，同源重组打靶得到Knockout ES细胞系后，再注射到囊胚
TALEN介导的knockout animal model
无需经过ES阶段，直接注射到胚胎 进行打靶
打靶效率高 打靶效率低 TALEs特异性识别DNA碱基序列， Fok1切断双链DNA从而造成双链断裂 细胞内自然发生的同源染色体随机交换， (DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修 复引起基因的突变和促进靶位点DNA -6 -8 打靶效率通常只有10 至10 同源重组。外源引发DNA断裂，几率 高，提高几百倍甚至千倍 同源臂很长，一般3-5 kb, 克隆困难 周期长：12-18个月 成本高：12万 knockout 不需要同源序列 knockin 同源序列1 k以内，易于克隆 周期短：6-10个月 成本低：10万
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小鼠：
分 类 ： 小 鼠 属 于 哺 乳 纲 （ Mammalia ） 、 啮 齿 目
（ Rodentia ）、鼠科（ Muridae ）、小鼠属（ Mus ）动物。 特 征：生长期短、成熟早、繁殖力强。 性成熟：6~7周。雌性35～50日龄，雄性45～60日龄； 体成熟：雌性为65～75日龄，雄性为70～80日龄；性周期为 4～5天，妊娠期为19～21天；哺乳期为20～22天；一 次排卵10～23个（视品种而定），每胎产仔数为8～15 只，一年产仔胎数6～10胎，属全年、多发情性动物， 繁殖率很高，生育期为一年。
确定靶基因
同源重组介导的小 鼠基因打靶流程
构建同源重组载体 载体线性化导入ES 筛选同源重组成功的ES ES显微注射囊胚
野生型
F0代（嵌合体）
野生型
野生型
F1代（杂合体）
F1代（杂合体）
野生型
F2代（杂合体） F2代（纯合体）
确定靶基因
TALEN介导的小 鼠基因打靶流程
构建TALEN载体 TALEN活性检测 体外转录mRNA 小鼠3T3细胞
注：KI加同源载体 Donor DNA
将mRNA注射入一细胞期受精卵
野生型
F0代（嵌合体）
野生型
野生型
F1代（杂合体）
F1代（杂合体）
野生型
F2代（杂合体）
F2代（纯合体）
Step1 设计TALEN打靶载体
针对靶基因的两个不同位点分别设计一个2X3的TALEN组合
5’
3’
3’
5’
Spacer 12-21bp
Step2 构建TALEN打靶载体
通过FastTALETM一步连接法完成TALEN载体的构建
上游引物测序结果比对
下游引物测序结果比对
Step3 细胞水平TALEN活性验证
Day1:小鼠3T3细胞铺板 筛选出一对高活性的 TALEN质粒用于后续实验 Day2：Fugene 共转TALEN 左右臂质粒和EIP质粒 ①PCR产物测序结果 查看套峰
Day3:药物筛选 （puromycin, 1μg/ml）
②PCR产物进行TA克隆 测序，计算突变率
Day6:收集剩余细胞, 抽基因组DNA
PCR靶向序列片段， 扩增出500bp左右
在靶位点上下游设计PCR引物，对打靶后的细胞基因组 DNA进行PCR
PCR-F >200bp TALEN-L >200bp
TALEN-R
PCR-R
Marker 560bp
目的基因片段PCR扩增
活性检测方法①： PCR产物测序结果查看峰图
方法： TALEN质粒转染细胞 药物筛选，收集细胞提取基因组DNA PCR扩增
PCR产物测序
打靶效率中等的样品
活性检测方法②： PCR产物连T载体，单克隆测序计算突变率
挑取30-50个克隆，将测序结果与目标基因的原始系列 进行比对，计算突变率。
注：图中第一排WT为原始序列，---表示缺失，红色为插入或置换。
Step4 体外转录生成mRNA
TALEN质粒线性化
根据载体所带启动子选择 相应试剂盒进行体外转录
mRNA浓度、纯度检测
原核启动子：sp6或T7 mRNA转录后的大小检测： 若片段大于1.5kb可用琼脂糖凝胶电泳检测；若片段较小，建议用聚 丙烯酰
胺凝胶电泳检测。
Step5 胚胎注射mRNA
TALEN左右臂 mRNA按1:1 比例混合
注射至一细胞 期受精卵 细胞质中
37℃培养24h 至二细胞期
移至代孕雌鼠 中，至小鼠 出生（3周）
注射浓度 300-500 ng/ul 注射体积：5-15 pl
Step6 F0代突变体小鼠检测
F0代小鼠剪尾， 抽提基因组DNA T7E1酶切鉴定法： 剪小鼠的尾巴或脚趾 提取基因组DNA PCR靶向基因序列 PCR扩增靶基因位点 PCR产物于94℃失活、50-60℃退火 T7E1酶切鉴定PCR 产物，进行初步筛选
T7E1酶37℃作用1h
琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物连TA克隆 进行测序，进一步确认 F0代突变体小鼠
Step7 获得F1代杂合体小鼠
F0代突变体小鼠 x 野生型小鼠
F1代小鼠剪尾， 抽提基因组DNA
F1代杂合子小鼠
PCR靶向基因序列
通过PCR产物测序 查看峰图及TA克隆 测序结果比对， 鉴定F1代杂合体小鼠
同源重组介导的knockout animal model
经由ES，同源重组打靶得到Knockout ES细胞系后，再注射到囊胚
TALEN介导的knockout animal model
无需经过ES阶段，直接注射到胚胎 进行打靶
打靶效率高 打靶效率低 TALEs特异性识别DNA碱基序列， Fok1切断双链DNA从而造成双链断裂 细胞内自然发生的同源染色体随机交换， (DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修 复引起基因的突变和促进靶位点DNA -6 -8 打靶效率通常只有10 至10 同源重组。外源引发DNA断裂，几率 高，提高几百倍甚至千倍 同源臂很长，一般3-5 kb, 克隆困难 周期长：12-18个月 成本高：12万 knockout 不需要同源序列 knockin 同源序列1 k以内，易于克隆 周期短：6-10个月 成本低：10万
SIDANSAI Biotechnology CO.,LTD www.sidansai.com