1999年4月 热带农业科学 第2期
简介激光共聚焦扫描显微镜
何川生 卢秀萍
(云南省烟草科学研究所)
摘要 介绍了激光共聚焦扫描显微镜的工作原理、基本构造、适用领域及其在生物学和农业研究中的应用前景。
激光共聚焦扫描显微镜(laserscanningconfocalmicroscope),简称LSCM,是近年来发展起来的一项高科技新产品,是一种先进的分子生物学分析仪器。它的工作原理是在荧光显微成像的基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外光或激光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,观察细胞的形态变化和生理功能变化,成为形态学、分子细胞生物学、遗传学、生物化学、材料科学、病理学等诸多领域中有力的研究工具。1987年White和Amos在英国 Nature 杂志发表了 ConfocalMicroscopyComesofAge 一文[1],标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。1998年云南省烟草科学研究所率先在全国烟草行业购置了第一台Bio-RadMRC-1024激光扫描共聚焦显微镜后,引起了广大烟草及其它行业的科研工作者的浓厚的兴趣,纷纷希望将这一仪器用于解决有关学科领域碰到的新问题。本文作者在广泛收集中外文献资料的基础上,就LSCM的工作原理、适用领域以及在生
收稿日期:1998-01-12。
物学和农业研究中的应用前景做一概述,以供国内同行参考。1 LSCM的工作原理
LSCM是一种紫外和激光双重扫描相结合的显微镜,它综合了普通显微镜和荧光显微镜的功能,并配有微机数字化图像分析系统和电子摄影,结合特异性荧光染料可在LSCM下进行亚细胞水平结构的功能的研究
[2,3]
。LSCM采用激光做光源,激光束经
照明针孔,由分光镜反射至物镜并聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一点进行扫描,然后,激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(photomultipletube)探测收集,并将信号输送到计算机,在显示屏上显示图像。在此过程中,只有焦平面上的光才能穿过探测针孔,焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的不能通过小孔,因此,非观察点的背景呈黑色,反差增加成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是
何川生等 简介激光共聚焦扫描显微镜
共振的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,即共聚焦。这样避免了传统光学显微镜由于光散射造成的图像信噪比降低,图像清晰度和分辨率不高的缺点。LSCM主要配置有激光器、扫描头、显微镜和计算机图像处理系统四大部件,包括数据采集、处理、转换及相应应用软件、图像输出设备及光学
装置(如图1)。1 1 激光器
我所购置的MRC-1024型LSCM采用的是气冷式氪 氩离子混合激光管,输出功率为15mw激发光波长为488nm、568nm、647nm。激光束经光纤电缆导入扫描
头。
图1 LSCM基本结构图
1 2 扫描头
扫描头包括:(1)探测通道,由光电倍增管和相应的共焦针孔及滤过轮组成;(2)滤光块,本机配有做细胞标记用的T1/T2A滤光块,有测活细胞钙离子的B1及Open滤光块,测pH及其它离子,可根据标本不同进行选择;(3)扫描透射探测器(非共焦模式),用于透射光观察样品,扫描头有管道与光学显微镜相连。1 3 光学显微镜
可配置正置或倒置显微镜,本机为ZeissAxiophot型正置显微镜主机,并配有ZeissAxiovert135型倒置显微镜。1 4 计算机及界面
(1)本机配置的计算机硬件:内存64MB,硬盘子1GB。软件:用于图像采集和分析的OS/2、Win3 1等和测定钙离子的TimeCourse/Ratiometric等软件。(2)MRC-1024共聚焦界面,硬件:24比特图像获得及显示卡的相应软件Lasersharp等。(3)21
1999年4月 热带农业科学 第2期寸彩色显示屏,分辨率1280 1024。2 LSCM在生物学和农业中的应用2 1 光学显微镜作为细胞生物学的研究工具,可以分辨出小于其照明光源波长一半的细胞,随着光学、视频、计算机等技术飞速发展而诞生的LSCM,则使现代显微镜有能力研究和分析细胞在变化过程中的结构,特别是对活细胞离子含量变化的定量检测,完整细胞的三维立体图像重建等方面,是传统的光学和电子显微镜所无法比拟的。
自从MarvinMinsky于1957年提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理,并获得美国专利后,Egger和Petran1967年成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面,1970年牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜,
1977年作为牛津集团成员的Sheppard和Wilson首次描述了光与被照物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学[4],1984年Bio-Rad公司推出了世界第1台共聚焦显微镜商品,型号为SOM-100,扫描方式为台阶式扫描,1986年的MRC-500即改为光束扫描,用作生物荧光显微镜的共聚焦系统,随后又推出了MRC-600(1989年)、MRC-600uv(1991年),MRC-1000(1993年)、MRC-1000uv、MCR-1024(1995年)。随着技术的不断改进,应用的范围也越来越广泛,市场占有率迅速提高,曾两次荣获英国女王奖,世界各地使用其发表的论文数量呈迅速增长趋势,据笔者不完全统计至1995年共发表论文951篇,到1998年2月则高达2365篇,内容涉及14个学科(见表1)。
表1 LSCM应用学科领域
学 科微生物学生物化学
钙和离子浓度检测细胞生物学细胞骨架
胚胎和发育生物学食品科学遗传学材料学实验显微学神经生物学寄生生物学病理学
[***********]641341448
1995年统计论文数1998年2月统计论文数
[***********][**************]8
何川生等 简介激光共聚焦扫描显微镜
植物学
43
94
2 2 LSCM在植物学和病理上的应用
LSCM借助免疫荧光标记方法,运用激光扫描、光学显微镜、计算机技术相结合,可对植物体细胞内荧光标记的物质进行定量、定性、定位的监测,如需要检测细胞膜、细胞核、细胞质内3种不同的物质,采用3种不同荧光标记的抗体标记样品,经激光扫描,共聚焦采集后数据成像,即可在3个相应的部位观察到所标记的抗体阳性反应,并有重叠图像显示相互关系,同时可测得细胞的面积、长度、平均荧光强度、积分荧光强度以及胞质内颗粒的数量等。同样方法也可用于各类植物病毒病的观察和检测,通过使用特异的荧光探针可对单细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、内质网、高尔基复合体、细胞骨架、受体、结构蛋白、RNA、DNA、酶等成份进行定性和定量分析。2 3 栽培学及生理学上的应用
运用LSCM可以准确地测定细胞内Ca2+、K+、Na+、Mg2+等的含量,较多的是用于Ca的测定。Ca
2+
2+
还以 波 的形式从刺激点向整个细胞扩散,这种钙波(calciumwave)代表了钙离子的空间分布。细胞在外界条件刺激或病理状态下,胞内Ca
2+
的浓度会发生相应的变化,通
过对钙振荡与钙波的监测记录,可以间接了解Ca2+对刺激介质,如化学因子、生长因子、药物及各种激素的反应和作用,对揭示植物生理变化规律及环境影响因素具有重要意义。
2 4 LSCM的图像分析功能
LSCM具有深度识别能力,使其具有纵向分辨率,其主要结构是显微镜上加了一个微距步进马达,可使载物台上下步进移动,其最小步距可为0 1nm,可通过对样品实行无损伤光学切片,即所谓 细胞CT 。这一技术使我们研究细胞时,可克服人工切片的不足,并可将多层影像进行叠加,经计算机三维重建后,得到样品的三维立体结构,这是LSCM的主要功能与优点之一。三维重建后的图像,不但能揭示细胞内部的结构,而且还可以提供细胞的立体数据,如将重组的图像旋转、随意观察细胞的各个侧面,也可研究细胞内亚显微结构的立体形态学变化及其空间关系。同时,LSCM还可研究细胞核和染色体的三维立体形态,借光学切片功能测定细胞深层的荧光分布及细胞内各种物质的变化,如对DNA、RNA、蛋白质的含量、分子扩散、细胞骨架等进行准确的定性、定量、定位测定[5]。
3 参考文献
1 WhiteJG,etal.Confocalmicroscopycomesof
在细胞生命活动中
作为信息传递、递质合成与释放等的第二信使,其在细胞内浓度的变化很大程度上影响着诸如细胞运动、电兴奋、细胞分化增殖和糖代谢等生理功能的改变。正常情况下,细胞内游离Ca2+浓度并不是一成不变的,而胞内Ca
2+
周期性的变化是细胞生理功能的
体现。在大多数细胞中,胞内Ca2+的升高并非是单一性持续增加,而是波动性升高,称为钙振荡(calciumoscillation),代表了钙离子升高的时间分布。在一些植物细胞中,钙离子的升高不单是由于钙扩散所致,而且
1999年4月 热带农业科学 第2期
age.Nature(London).1987(328):183~1842 DemandolxD,etal.Multicolouranalysisandlocal
imagecorrelationinConfocalMicroscopy.Micros.1997(185);21~36
3 JuskaitisR,etal.Efficientreal-timeconfocal
microscopywithwhitelightsources.Nature.1996
5
(383):804~805
4 WilsonT.SheppardCJR.Theoryandpracticeof
scanningmicroscopy.London:Plenumpress,1990BrakenhoffGT,etal.Three-dimensionalimaginginfluorescencebyconfocalscanningmicroscopy.JMicros,1989,153(2):151~159
月桂酸皂 天然橡胶胶乳表面活性剂
张慧坚
(中国热带农业科学院图书与科技信息中心)
摘要 运用表面活性剂理论,分析了月桂酸皂的结构及作用机理,概述了月桂酸皂在天然胶乳上的应用效果,探讨了其存在问题。
表面活性物质种类繁多,应用极广泛。在许多工业部门中,表面活性剂是不可缺少的化学助剂,其优点是用量小而收效大。特别是第二次世界大战之后,随着石油化学的发展,兴起了合成表面活性剂的工业,进一步促进了表面活性剂在各方面的应用。如今,表面活性剂在民用和工业洗涤、石油、纺织、农药、医药、冶金、采矿、机械、建筑、航空、食品等多领域中得到了广泛的应用[1]。
表面活性剂一般都是线型分子,它由2种不同性质的原子基团即亲水基团和亲油基团组成。按化学结构来分类,表面活性物
收稿日期:1998-11-27。
质大体上可分为离子型和非离子型两种
[2]
。常用于提高胶乳稳定性的高级脂肪
酸皂就是阴离子型表面活性剂,它能增强胶粒表面电荷、保护层、水合度,以免胶乳凝固,还能与胶乳中的Ca
2+
、Mg
2+
反应,生成
不溶性的钙镁皂,除去这些离子对胶乳的去稳定作用。采用适量的稳定剂,可使胶乳稳定性即机械稳定性和化学稳定性(包括热稳定性)适应工艺的要求。据袁子成等报道,在碳原子数不同的饱和脂肪酸皂中,以月桂酸(十二碳酸)皂的效果最好
[3~5]
。以下综
述了月桂酸皂的结构、性质及其应用,探讨
1999年4月 热带农业科学 第2期
简介激光共聚焦扫描显微镜
何川生 卢秀萍
(云南省烟草科学研究所)
摘要 介绍了激光共聚焦扫描显微镜的工作原理、基本构造、适用领域及其在生物学和农业研究中的应用前景。
激光共聚焦扫描显微镜(laserscanningconfocalmicroscope),简称LSCM,是近年来发展起来的一项高科技新产品,是一种先进的分子生物学分析仪器。它的工作原理是在荧光显微成像的基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外光或激光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,观察细胞的形态变化和生理功能变化,成为形态学、分子细胞生物学、遗传学、生物化学、材料科学、病理学等诸多领域中有力的研究工具。1987年White和Amos在英国 Nature 杂志发表了 ConfocalMicroscopyComesofAge 一文[1],标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。1998年云南省烟草科学研究所率先在全国烟草行业购置了第一台Bio-RadMRC-1024激光扫描共聚焦显微镜后,引起了广大烟草及其它行业的科研工作者的浓厚的兴趣,纷纷希望将这一仪器用于解决有关学科领域碰到的新问题。本文作者在广泛收集中外文献资料的基础上,就LSCM的工作原理、适用领域以及在生
收稿日期:1998-01-12。
物学和农业研究中的应用前景做一概述,以供国内同行参考。1 LSCM的工作原理
LSCM是一种紫外和激光双重扫描相结合的显微镜,它综合了普通显微镜和荧光显微镜的功能,并配有微机数字化图像分析系统和电子摄影,结合特异性荧光染料可在LSCM下进行亚细胞水平结构的功能的研究
[2,3]
。LSCM采用激光做光源,激光束经
照明针孔,由分光镜反射至物镜并聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一点进行扫描,然后,激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(photomultipletube)探测收集,并将信号输送到计算机,在显示屏上显示图像。在此过程中,只有焦平面上的光才能穿过探测针孔,焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的不能通过小孔,因此,非观察点的背景呈黑色,反差增加成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是
何川生等 简介激光共聚焦扫描显微镜
共振的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,即共聚焦。这样避免了传统光学显微镜由于光散射造成的图像信噪比降低,图像清晰度和分辨率不高的缺点。LSCM主要配置有激光器、扫描头、显微镜和计算机图像处理系统四大部件,包括数据采集、处理、转换及相应应用软件、图像输出设备及光学
装置(如图1)。1 1 激光器
我所购置的MRC-1024型LSCM采用的是气冷式氪 氩离子混合激光管,输出功率为15mw激发光波长为488nm、568nm、647nm。激光束经光纤电缆导入扫描
头。
图1 LSCM基本结构图
1 2 扫描头
扫描头包括:(1)探测通道,由光电倍增管和相应的共焦针孔及滤过轮组成;(2)滤光块,本机配有做细胞标记用的T1/T2A滤光块,有测活细胞钙离子的B1及Open滤光块,测pH及其它离子,可根据标本不同进行选择;(3)扫描透射探测器(非共焦模式),用于透射光观察样品,扫描头有管道与光学显微镜相连。1 3 光学显微镜
可配置正置或倒置显微镜,本机为ZeissAxiophot型正置显微镜主机,并配有ZeissAxiovert135型倒置显微镜。1 4 计算机及界面
(1)本机配置的计算机硬件:内存64MB,硬盘子1GB。软件:用于图像采集和分析的OS/2、Win3 1等和测定钙离子的TimeCourse/Ratiometric等软件。(2)MRC-1024共聚焦界面,硬件:24比特图像获得及显示卡的相应软件Lasersharp等。(3)21
1999年4月 热带农业科学 第2期寸彩色显示屏,分辨率1280 1024。2 LSCM在生物学和农业中的应用2 1 光学显微镜作为细胞生物学的研究工具,可以分辨出小于其照明光源波长一半的细胞,随着光学、视频、计算机等技术飞速发展而诞生的LSCM,则使现代显微镜有能力研究和分析细胞在变化过程中的结构,特别是对活细胞离子含量变化的定量检测,完整细胞的三维立体图像重建等方面,是传统的光学和电子显微镜所无法比拟的。
自从MarvinMinsky于1957年提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理,并获得美国专利后,Egger和Petran1967年成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面,1970年牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜,
1977年作为牛津集团成员的Sheppard和Wilson首次描述了光与被照物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学[4],1984年Bio-Rad公司推出了世界第1台共聚焦显微镜商品,型号为SOM-100,扫描方式为台阶式扫描,1986年的MRC-500即改为光束扫描,用作生物荧光显微镜的共聚焦系统,随后又推出了MRC-600(1989年)、MRC-600uv(1991年),MRC-1000(1993年)、MRC-1000uv、MCR-1024(1995年)。随着技术的不断改进,应用的范围也越来越广泛,市场占有率迅速提高,曾两次荣获英国女王奖,世界各地使用其发表的论文数量呈迅速增长趋势,据笔者不完全统计至1995年共发表论文951篇,到1998年2月则高达2365篇,内容涉及14个学科(见表1)。
表1 LSCM应用学科领域
学 科微生物学生物化学
钙和离子浓度检测细胞生物学细胞骨架
胚胎和发育生物学食品科学遗传学材料学实验显微学神经生物学寄生生物学病理学
[***********]641341448
1995年统计论文数1998年2月统计论文数
[***********][**************]8
何川生等 简介激光共聚焦扫描显微镜
植物学
43
94
2 2 LSCM在植物学和病理上的应用
LSCM借助免疫荧光标记方法,运用激光扫描、光学显微镜、计算机技术相结合,可对植物体细胞内荧光标记的物质进行定量、定性、定位的监测,如需要检测细胞膜、细胞核、细胞质内3种不同的物质,采用3种不同荧光标记的抗体标记样品,经激光扫描,共聚焦采集后数据成像,即可在3个相应的部位观察到所标记的抗体阳性反应,并有重叠图像显示相互关系,同时可测得细胞的面积、长度、平均荧光强度、积分荧光强度以及胞质内颗粒的数量等。同样方法也可用于各类植物病毒病的观察和检测,通过使用特异的荧光探针可对单细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、内质网、高尔基复合体、细胞骨架、受体、结构蛋白、RNA、DNA、酶等成份进行定性和定量分析。2 3 栽培学及生理学上的应用
运用LSCM可以准确地测定细胞内Ca2+、K+、Na+、Mg2+等的含量,较多的是用于Ca的测定。Ca
2+
2+
还以 波 的形式从刺激点向整个细胞扩散,这种钙波(calciumwave)代表了钙离子的空间分布。细胞在外界条件刺激或病理状态下,胞内Ca
2+
的浓度会发生相应的变化,通
过对钙振荡与钙波的监测记录,可以间接了解Ca2+对刺激介质,如化学因子、生长因子、药物及各种激素的反应和作用,对揭示植物生理变化规律及环境影响因素具有重要意义。
2 4 LSCM的图像分析功能
LSCM具有深度识别能力,使其具有纵向分辨率,其主要结构是显微镜上加了一个微距步进马达,可使载物台上下步进移动,其最小步距可为0 1nm,可通过对样品实行无损伤光学切片,即所谓 细胞CT 。这一技术使我们研究细胞时,可克服人工切片的不足,并可将多层影像进行叠加,经计算机三维重建后,得到样品的三维立体结构,这是LSCM的主要功能与优点之一。三维重建后的图像,不但能揭示细胞内部的结构,而且还可以提供细胞的立体数据,如将重组的图像旋转、随意观察细胞的各个侧面,也可研究细胞内亚显微结构的立体形态学变化及其空间关系。同时,LSCM还可研究细胞核和染色体的三维立体形态,借光学切片功能测定细胞深层的荧光分布及细胞内各种物质的变化,如对DNA、RNA、蛋白质的含量、分子扩散、细胞骨架等进行准确的定性、定量、定位测定[5]。
3 参考文献
1 WhiteJG,etal.Confocalmicroscopycomesof
在细胞生命活动中
作为信息传递、递质合成与释放等的第二信使,其在细胞内浓度的变化很大程度上影响着诸如细胞运动、电兴奋、细胞分化增殖和糖代谢等生理功能的改变。正常情况下,细胞内游离Ca2+浓度并不是一成不变的,而胞内Ca
2+
周期性的变化是细胞生理功能的
体现。在大多数细胞中,胞内Ca2+的升高并非是单一性持续增加,而是波动性升高,称为钙振荡(calciumoscillation),代表了钙离子升高的时间分布。在一些植物细胞中,钙离子的升高不单是由于钙扩散所致,而且
1999年4月 热带农业科学 第2期
age.Nature(London).1987(328):183~1842 DemandolxD,etal.Multicolouranalysisandlocal
imagecorrelationinConfocalMicroscopy.Micros.1997(185);21~36
3 JuskaitisR,etal.Efficientreal-timeconfocal
microscopywithwhitelightsources.Nature.1996
5
(383):804~805
4 WilsonT.SheppardCJR.Theoryandpracticeof
scanningmicroscopy.London:Plenumpress,1990BrakenhoffGT,etal.Three-dimensionalimaginginfluorescencebyconfocalscanningmicroscopy.JMicros,1989,153(2):151~159
月桂酸皂 天然橡胶胶乳表面活性剂
张慧坚
(中国热带农业科学院图书与科技信息中心)
摘要 运用表面活性剂理论,分析了月桂酸皂的结构及作用机理,概述了月桂酸皂在天然胶乳上的应用效果,探讨了其存在问题。
表面活性物质种类繁多,应用极广泛。在许多工业部门中,表面活性剂是不可缺少的化学助剂,其优点是用量小而收效大。特别是第二次世界大战之后,随着石油化学的发展,兴起了合成表面活性剂的工业,进一步促进了表面活性剂在各方面的应用。如今,表面活性剂在民用和工业洗涤、石油、纺织、农药、医药、冶金、采矿、机械、建筑、航空、食品等多领域中得到了广泛的应用[1]。
表面活性剂一般都是线型分子,它由2种不同性质的原子基团即亲水基团和亲油基团组成。按化学结构来分类,表面活性物
收稿日期:1998-11-27。
质大体上可分为离子型和非离子型两种
[2]
。常用于提高胶乳稳定性的高级脂肪
酸皂就是阴离子型表面活性剂,它能增强胶粒表面电荷、保护层、水合度,以免胶乳凝固,还能与胶乳中的Ca
2+
、Mg
2+
反应,生成
不溶性的钙镁皂,除去这些离子对胶乳的去稳定作用。采用适量的稳定剂,可使胶乳稳定性即机械稳定性和化学稳定性(包括热稳定性)适应工艺的要求。据袁子成等报道,在碳原子数不同的饱和脂肪酸皂中,以月桂酸(十二碳酸)皂的效果最好
[3~5]
。以下综
述了月桂酸皂的结构、性质及其应用,探讨