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中国优生与遗传杂志 2016 年第 24 卷第 2 期
11 204例新生儿串联质谱筛查结果分析
郑文吉，王 飞，余 颀，陈志央，庄丹燕
（宁波市妇女儿童医院 宁波市新生儿疾病筛查中心，浙江 宁波 315012）
摘 要：目的 通过采用串联质谱技术对我院新生儿进行多种遗传代谢病的筛查，探讨其应用价值，并了解我市串联质谱目标筛查疾病的发病情况。方法 采集新生儿足跟血干血滤纸片，利用串联质谱筛查技术对新生儿进行氨基酸代谢、有机酸代谢和脂肪酸氧化代谢三类共26种遗传代谢病初筛，可疑阳性者召回采集尿液、血浆进行有机酸、氨基酸及基因突变的分析，并结合其临床表现进行确诊。结果 11 204例新生儿中筛查出可疑阳性295例，阳性率1/38；确诊5例患儿，男4例，女1例，发病率为1/2241。结论 应用串联质谱技术进行新生儿疾病筛查，有利于新生儿遗传代谢病的早期发现及诊治，有效保障儿童健康提高出生人口素质。
关键词：新生儿；多种遗传代谢病；串联质谱筛查中图分类号：R 722. 1 文献标识码：B 文章编号：1006-9534（2016）02-0082-03DOI:10.13404/j.cnki.cjbhh.2016.02.036遗传代谢性疾病（IMD ）是新生儿疾病筛查的重要内容之一，早期筛查并及时予以有效治疗是确保新生儿健康成长的关键[1]。早期诊治是确保新生儿健康成长的关键，并对生育下一胎有很重要的指导意义。IMD 的诊断较多依赖生化与分子生物学检测，对技术和设备要求较高，往往是临床诊治的难点[2]。近年来发展的串联质谱技术（MS/MS）因其具有快速、灵敏、高通量和选择性强等特点，提高了筛查效率及准确性。我院从2014年开始开展了应用串联质谱技术，现对开展情况进行了回顾性分析，结果报道如下。
理时，按照萃取液：内标液110：1的比例配制萃取溶液，从干滤纸血片上剪下3. 2mm 的血斑放入96孔板的孔中，每孔加入含氨基酸与酰基肉碱同位素内标的工作液100μL ，粘性微孔板封套密封，放置于振荡孵育器上45℃下恒温振荡孵育45min ，萃取血片中的氨基酸与酰基肉碱。然后将萃取液转移75 μL 至V 型底96孔板中，用铝箔制微孔板封套密封并放置在自动进样器上等待上机检测。
1. 2. 2 仪器检测 自动进样器设定每个样本自动进样20μL ，扫描方式采用多反应监测扫描模式（multiple reaction monitor，MRM ），2 min内同时检测干滤纸血斑中几十种氨基酸与酰基肉碱浓度。分析物定量采用内标法由Neolynx 软件自动计算出所测样品的浓度以及各个指标的比值，对26种氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢病进行串联质谱检测。1. 2. 3 结果判读 检测结果根据截断值进行阴阳性判定。截断值设定最初按照1000例正常新生儿进行计算，采用频数分布，以0. 5%～99. 5%的置信区间为截断参考范围。分析物检测值超出截断值判定为筛查阳性病例，召回复查。根据指标超出截断范围的程度选择尿喋呤谱分析、尿有机酸分析、血氨基酸分析、肉碱谱分析以及基因突变分析等明确诊断。
1 对象与方法
1. 1 一般资料
1. 1. 1 研究对象 选取2014年7月～2015年7月，在宁波市妇女儿童医院分娩的并自愿选择串联质谱筛查的活产新生儿11 204例为研究对象，其中男5942例，女5262例。1. 1. 2 筛查标本的采集与递送：新生儿在出生72h ，充分哺乳（6次以上）后，由接产医院按《新生儿疾病筛查血片采集技术规范》要求采足跟（内、外侧）血，滴于&903号滤纸片上，自然干燥制成干滤纸血片后密封于干净塑料袋中，放置于4℃冰箱中，5个工作日内递送至我院筛查中心实验室进行分析检测。1. 1. 3 仪器与试剂 仪器：串联质谱仪：Quattro micro API MS/MS，Waters 2777自动进样器，Waters 1525u 高效液相色谱泵。试剂：试剂购自芬兰的 PerkiElmer 生命科学有限公司，NeoBaseTM Non-derivatized MSMS Kit 非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测试试剂盒（串联质谱
15
N 2-13C-甘氨酸，2H 4-丙氨酸，法）。氨基酸同位素内标：
2
H 8-缬氨酸，2H 3-亮氨酸，2H 3-蛋氨酸，2H 5-苯丙氨酸，13222C 6-酪氨酸，H 2-瓜氨酸，H 2-鸟氨酸，H 4-13C-精氨酸，1313C 5-脯氨酸，C 5-琥珀酰丙酮衍生液。酰基肉碱内标8种：2
H 9-游离肉碱，2H 3-乙酰肉碱，2H 3-丙酰肉碱，2H 3-丁酰
222H 9-戊酰肉碱，H 6-戊二酰基肉碱，H 3-己酰基肉碱，肉碱，222
H 3-辛酰肉碱，H 9-癸酰肉碱，H 3-十二酰基肉碱，2H 3-十四酰基肉碱，2H 3-十六酰基肉碱，2H 3-十八酰基肉碱。1. 2 方法
1. 2. 1 样品处理方法 首先用1ml 的萃取液溶解内标液干粉制成储备工作液，置于2-8℃冰箱中储备待用。样本处
2 结果
2. 1 串联质谱筛查结果
2014年7月至2015年7月我院新生儿活产12 339例，自愿选择参加串联质谱筛查11 204例，筛查率为90. 80%；可疑阳性应召回295例，筛查阳性率2. 63%；实际召回284例，召回率96. 27%；确诊5例遗传代谢病患儿。2. 2 筛查可疑阳性召回情况
筛查可疑阳性召回率男女无明显差异，低体重及早产儿筛查阳性率明显高于正常体重及足月出生新生儿。而确诊5例患儿均为足月正常体重新生儿，具体详见表1。2. 3 确诊5例多种遗传代谢病
筛查11 204例新生儿，确诊多种遗传代谢病5例，发病率为1/2241。其中2例为原发性肉碱缺乏症、1例为母源性肉碱缺乏症、1例为中链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症（戊二酸血症Ⅱ型）、1例为3-甲基巴豆酰辅酶A 羧化酶缺乏症。具体情况见表2。
表1 不同性别、体重及孕周新生儿串联质谱筛查召回情况
性别男
串联筛查例数（人）可疑阳性例数（人）可疑阳性率（%）确诊病例（人）
59421472.474
女52621482.811
＜2500g 1207705.80
体重2500-3999g 93252092.245
≥4000g 672162.380
＜37w 2221883.960
孕周
≥37w 89832072.35
表2 确诊的5例多种遗传代谢病情况
确诊疾病
原发性肉毒碱缺乏症原发性肉毒碱缺乏症母源性肉碱缺乏症
中链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症；戊二酸血症Ⅱ型
3-甲基巴豆酰辅酶A 羧化酶缺乏症
男
3750
39+
C5-OH 增高
新生儿新生儿性别体重男男女男
[**************]0
出生孕周主要异常指标38+39+38+38+
C0下降C0下降
C0及多种肉碱降低
C6、C8、C10；1增高伴C8/C10增高
实际测值C0=3.02C0=7.47C0=4.42C6=0.59C8=2.56C10：1=0.98
正常参考值
（μmol/L）10.3～ 5710.3～ 5710.3～ 570.03 ～0.150.01 ～0.140.01 ～0.27
C5OH+C4DC=3.140.07 ～0.42
3 讨论
遗传代谢性疾病（IMD ）主要是由于遗传代谢途径异常所致疾病，可引起机体代谢物沉积以及重要生理活性物质缺失等，从而诱发多种临床症状[3]。近年来发展的串联质谱技术有可能成为新生儿遗传代谢病筛查的常规方法，能在几分钟内对一份标本进行包括氨基酸、有机酸代谢、脂肪酸氧化等几十种代谢产物的分析，实现了“一种实验检测多种疾病”的要求，并大大提高了实验效率和准确性[4]。
串联质谱的原理是将2个质谱仪经一个碰撞室串联而成，目的是提高检测的特异性和灵敏性[5]，具有超敏性、高特异性、高选择性和快速检验的特点。宁波市于2014年7月开始在我院原有4病筛查（CH 、PKU 、CAH 、G 6PD ）的基础上率先展开串联质谱技术，至2015年7月我院活产分娩12 339例，4病筛查12 227例，4病筛查率99. 09%，采用MS/MS筛查11 204例，筛查率为90. 80%，确诊4种疾病5例，发病率为1/2241，高于韩连书[6]报道的1/3529，
1）我和黄新文[7]报道的1/5626，可能与以下因素有关：
院出生的婴儿高危儿比较集中；2）本研究样本量偏少；3）非户籍高危孕妇较多，她们缺少孕期相关检查。由此可见，在串联质谱未能广泛普及时，在高危儿集中地区的筛查中应用具有重要价值。筛查的可疑阳性295例，阳性率为2. 63%，高于台州市郑新灵[8]报道0. 6%，可能与我院开展MS/MS筛查还在初级阶段，研究样本量偏少，医生的经验不足有关。另外，从表1中可以看出低体重及早产儿筛查可疑阳性率明显高于正常体重及足月出生新生儿，而我院早产儿、低体重儿比较集中。
串联质谱技术是一项十分有潜力的技术，随着该技术的逐渐普及，将使新生儿疾病筛查在内容和质量上都提高到一个新水平。本研究发现5例遗传代谢病，详见表2，其中2例为原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency，PCD ），其临床表现差异大，患者可长期无症状，但该病是
潜在致死性疾病，婴儿期常以急性低酮性低血糖、瑞氏样
综合征起病甚至猝死。洪芳等[9]建议推广新生儿串联质谱筛查，早期发现终身干预能有效减低PCD 的致残致死率。该方法还可同时自动计算相关物质的比值，两者结合可提高对某些疾病诊断的准确性[10]。本研究中表2的3号病例检测C 0=3. 74，结果偏低，建议立即召回复查C 0=4. 42，同时检测母亲C 0=1. 81，确诊为母源性肉毒碱缺乏症。黄新文[11]等也提出有些病例有必要对其母亲进行串联质谱检查。由此可见，MS/MS技术不仅可以早期诊断新生儿IMD 还可以诊断母亲的IMD ，而且为在我市全面展开采用MS/MS 筛查新生儿IMD 提供依据。
综上所述，为提高出生人口素质，在新生儿未出现疾病表现和未损害器官之前，及早做出诊断和治疗，我们应该普及新生儿筛查。随着串联质谱技术的研究与发展，它应用于遗传代谢病的筛查，有高灵敏性、高特异性、高选择性、快速性和检测的广泛性等优点，将成为遗传代谢病常规诊断的工具在世界范围内推广应用。
参 考 文 献
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（下转第87页）
中使用这类抗生素，就会使病人发生不可逆转的听力损失。而早期的筛查可告知家长避免使用这类抗生素，减少聋儿的发生。线粒体DNA 突变属于母系遗传，特点是女性能将突变的基因传给儿和女，但只有女儿能传给下一代。此9例新生儿中追问家族史，有3例家族中有不同程度的耳聋患者。若这部分患者在早期进行基因检测，则可减少耳聋发病机率，提高生活质量。在新生儿中开展线粒体基因检测，不仅可以检出群体携带率，还可以推断先证者母系家族的未发病成员，避免携带基因突变的家族成员使用氨基糖甙类抗生素，以降低耳聋患病率。
目前新生儿听力筛查技术已在全国广泛开展，但听力筛查有一定的局限性，可能会漏掉一部分迟发性听力损失患儿，也无法对耳聋进行病因学诊断。通过基因筛查不仅可以发现先天性遗传性聋患者，更重要的是发现药物敏感性耳聋基因携带者和迟发性聋基因携带者，同时明确的病因学诊断也给今后的遗传咨询带来益处[8]。在新生儿中开展GJB 2与线粒体基因筛查，还可以进一步扩大随访对象，发现高危人群，及早进行干预，降低耳聋发病率，减轻个人、家庭、社会负担。
参 考 文 献
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收稿日期：2015-09-23
（上接第49页）
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收稿日期：2015-10-20
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收稿日期：2015-09-25
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（上接第85页）
在政府主导下医疗保健教育及全社会的关心和支持下才能使PKU 患儿的防治有所作为，促进患儿预后改善保证下一代的健康成长。
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收稿日期：2015-10-01
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11 204例新生儿串联质谱筛查结果分析
郑文吉，王 飞，余 颀，陈志央，庄丹燕
（宁波市妇女儿童医院 宁波市新生儿疾病筛查中心，浙江 宁波 315012）
摘 要：目的 通过采用串联质谱技术对我院新生儿进行多种遗传代谢病的筛查，探讨其应用价值，并了解我市串联质谱目标筛查疾病的发病情况。方法 采集新生儿足跟血干血滤纸片，利用串联质谱筛查技术对新生儿进行氨基酸代谢、有机酸代谢和脂肪酸氧化代谢三类共26种遗传代谢病初筛，可疑阳性者召回采集尿液、血浆进行有机酸、氨基酸及基因突变的分析，并结合其临床表现进行确诊。结果 11 204例新生儿中筛查出可疑阳性295例，阳性率1/38；确诊5例患儿，男4例，女1例，发病率为1/2241。结论 应用串联质谱技术进行新生儿疾病筛查，有利于新生儿遗传代谢病的早期发现及诊治，有效保障儿童健康提高出生人口素质。
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理时，按照萃取液：内标液110：1的比例配制萃取溶液，从干滤纸血片上剪下3. 2mm 的血斑放入96孔板的孔中，每孔加入含氨基酸与酰基肉碱同位素内标的工作液100μL ，粘性微孔板封套密封，放置于振荡孵育器上45℃下恒温振荡孵育45min ，萃取血片中的氨基酸与酰基肉碱。然后将萃取液转移75 μL 至V 型底96孔板中，用铝箔制微孔板封套密封并放置在自动进样器上等待上机检测。
1. 2. 2 仪器检测 自动进样器设定每个样本自动进样20μL ，扫描方式采用多反应监测扫描模式（multiple reaction monitor，MRM ），2 min内同时检测干滤纸血斑中几十种氨基酸与酰基肉碱浓度。分析物定量采用内标法由Neolynx 软件自动计算出所测样品的浓度以及各个指标的比值，对26种氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢病进行串联质谱检测。1. 2. 3 结果判读 检测结果根据截断值进行阴阳性判定。截断值设定最初按照1000例正常新生儿进行计算，采用频数分布，以0. 5%～99. 5%的置信区间为截断参考范围。分析物检测值超出截断值判定为筛查阳性病例，召回复查。根据指标超出截断范围的程度选择尿喋呤谱分析、尿有机酸分析、血氨基酸分析、肉碱谱分析以及基因突变分析等明确诊断。
1 对象与方法
1. 1 一般资料
1. 1. 1 研究对象 选取2014年7月～2015年7月，在宁波市妇女儿童医院分娩的并自愿选择串联质谱筛查的活产新生儿11 204例为研究对象，其中男5942例，女5262例。1. 1. 2 筛查标本的采集与递送：新生儿在出生72h ，充分哺乳（6次以上）后，由接产医院按《新生儿疾病筛查血片采集技术规范》要求采足跟（内、外侧）血，滴于&903号滤纸片上，自然干燥制成干滤纸血片后密封于干净塑料袋中，放置于4℃冰箱中，5个工作日内递送至我院筛查中心实验室进行分析检测。1. 1. 3 仪器与试剂 仪器：串联质谱仪：Quattro micro API MS/MS，Waters 2777自动进样器，Waters 1525u 高效液相色谱泵。试剂：试剂购自芬兰的 PerkiElmer 生命科学有限公司，NeoBaseTM Non-derivatized MSMS Kit 非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测试试剂盒（串联质谱
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N 2-13C-甘氨酸，2H 4-丙氨酸，法）。氨基酸同位素内标：
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H 8-缬氨酸，2H 3-亮氨酸，2H 3-蛋氨酸，2H 5-苯丙氨酸，13222C 6-酪氨酸，H 2-瓜氨酸，H 2-鸟氨酸，H 4-13C-精氨酸，1313C 5-脯氨酸，C 5-琥珀酰丙酮衍生液。酰基肉碱内标8种：2
H 9-游离肉碱，2H 3-乙酰肉碱，2H 3-丙酰肉碱，2H 3-丁酰
222H 9-戊酰肉碱，H 6-戊二酰基肉碱，H 3-己酰基肉碱，肉碱，222
H 3-辛酰肉碱，H 9-癸酰肉碱，H 3-十二酰基肉碱，2H 3-十四酰基肉碱，2H 3-十六酰基肉碱，2H 3-十八酰基肉碱。1. 2 方法
1. 2. 1 样品处理方法 首先用1ml 的萃取液溶解内标液干粉制成储备工作液，置于2-8℃冰箱中储备待用。样本处
2 结果
2. 1 串联质谱筛查结果
2014年7月至2015年7月我院新生儿活产12 339例，自愿选择参加串联质谱筛查11 204例，筛查率为90. 80%；可疑阳性应召回295例，筛查阳性率2. 63%；实际召回284例，召回率96. 27%；确诊5例遗传代谢病患儿。2. 2 筛查可疑阳性召回情况
筛查可疑阳性召回率男女无明显差异，低体重及早产儿筛查阳性率明显高于正常体重及足月出生新生儿。而确诊5例患儿均为足月正常体重新生儿，具体详见表1。2. 3 确诊5例多种遗传代谢病
筛查11 204例新生儿，确诊多种遗传代谢病5例，发病率为1/2241。其中2例为原发性肉碱缺乏症、1例为母源性肉碱缺乏症、1例为中链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症（戊二酸血症Ⅱ型）、1例为3-甲基巴豆酰辅酶A 羧化酶缺乏症。具体情况见表2。
表1 不同性别、体重及孕周新生儿串联质谱筛查召回情况
性别男
串联筛查例数（人）可疑阳性例数（人）可疑阳性率（%）确诊病例（人）
59421472.474
女52621482.811
＜2500g 1207705.80
体重2500-3999g 93252092.245
≥4000g 672162.380
＜37w 2221883.960
孕周
≥37w 89832072.35
表2 确诊的5例多种遗传代谢病情况
确诊疾病
原发性肉毒碱缺乏症原发性肉毒碱缺乏症母源性肉碱缺乏症
中链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症；戊二酸血症Ⅱ型
3-甲基巴豆酰辅酶A 羧化酶缺乏症
男
3750
39+
C5-OH 增高
新生儿新生儿性别体重男男女男
[**************]0
出生孕周主要异常指标38+39+38+38+
C0下降C0下降
C0及多种肉碱降低
C6、C8、C10；1增高伴C8/C10增高
实际测值C0=3.02C0=7.47C0=4.42C6=0.59C8=2.56C10：1=0.98
正常参考值
（μmol/L）10.3～ 5710.3～ 5710.3～ 570.03 ～0.150.01 ～0.140.01 ～0.27
C5OH+C4DC=3.140.07 ～0.42
3 讨论
遗传代谢性疾病（IMD ）主要是由于遗传代谢途径异常所致疾病，可引起机体代谢物沉积以及重要生理活性物质缺失等，从而诱发多种临床症状[3]。近年来发展的串联质谱技术有可能成为新生儿遗传代谢病筛查的常规方法，能在几分钟内对一份标本进行包括氨基酸、有机酸代谢、脂肪酸氧化等几十种代谢产物的分析，实现了“一种实验检测多种疾病”的要求，并大大提高了实验效率和准确性[4]。
串联质谱的原理是将2个质谱仪经一个碰撞室串联而成，目的是提高检测的特异性和灵敏性[5]，具有超敏性、高特异性、高选择性和快速检验的特点。宁波市于2014年7月开始在我院原有4病筛查（CH 、PKU 、CAH 、G 6PD ）的基础上率先展开串联质谱技术，至2015年7月我院活产分娩12 339例，4病筛查12 227例，4病筛查率99. 09%，采用MS/MS筛查11 204例，筛查率为90. 80%，确诊4种疾病5例，发病率为1/2241，高于韩连书[6]报道的1/3529，
1）我和黄新文[7]报道的1/5626，可能与以下因素有关：
院出生的婴儿高危儿比较集中；2）本研究样本量偏少；3）非户籍高危孕妇较多，她们缺少孕期相关检查。由此可见，在串联质谱未能广泛普及时，在高危儿集中地区的筛查中应用具有重要价值。筛查的可疑阳性295例，阳性率为2. 63%，高于台州市郑新灵[8]报道0. 6%，可能与我院开展MS/MS筛查还在初级阶段，研究样本量偏少，医生的经验不足有关。另外，从表1中可以看出低体重及早产儿筛查可疑阳性率明显高于正常体重及足月出生新生儿，而我院早产儿、低体重儿比较集中。
串联质谱技术是一项十分有潜力的技术，随着该技术的逐渐普及，将使新生儿疾病筛查在内容和质量上都提高到一个新水平。本研究发现5例遗传代谢病，详见表2，其中2例为原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency，PCD ），其临床表现差异大，患者可长期无症状，但该病是
潜在致死性疾病，婴儿期常以急性低酮性低血糖、瑞氏样
综合征起病甚至猝死。洪芳等[9]建议推广新生儿串联质谱筛查，早期发现终身干预能有效减低PCD 的致残致死率。该方法还可同时自动计算相关物质的比值，两者结合可提高对某些疾病诊断的准确性[10]。本研究中表2的3号病例检测C 0=3. 74，结果偏低，建议立即召回复查C 0=4. 42，同时检测母亲C 0=1. 81，确诊为母源性肉毒碱缺乏症。黄新文[11]等也提出有些病例有必要对其母亲进行串联质谱检查。由此可见，MS/MS技术不仅可以早期诊断新生儿IMD 还可以诊断母亲的IMD ，而且为在我市全面展开采用MS/MS 筛查新生儿IMD 提供依据。
综上所述，为提高出生人口素质，在新生儿未出现疾病表现和未损害器官之前，及早做出诊断和治疗，我们应该普及新生儿筛查。随着串联质谱技术的研究与发展，它应用于遗传代谢病的筛查，有高灵敏性、高特异性、高选择性、快速性和检测的广泛性等优点，将成为遗传代谢病常规诊断的工具在世界范围内推广应用。
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中使用这类抗生素，就会使病人发生不可逆转的听力损失。而早期的筛查可告知家长避免使用这类抗生素，减少聋儿的发生。线粒体DNA 突变属于母系遗传，特点是女性能将突变的基因传给儿和女，但只有女儿能传给下一代。此9例新生儿中追问家族史，有3例家族中有不同程度的耳聋患者。若这部分患者在早期进行基因检测，则可减少耳聋发病机率，提高生活质量。在新生儿中开展线粒体基因检测，不仅可以检出群体携带率，还可以推断先证者母系家族的未发病成员，避免携带基因突变的家族成员使用氨基糖甙类抗生素，以降低耳聋患病率。
目前新生儿听力筛查技术已在全国广泛开展，但听力筛查有一定的局限性，可能会漏掉一部分迟发性听力损失患儿，也无法对耳聋进行病因学诊断。通过基因筛查不仅可以发现先天性遗传性聋患者，更重要的是发现药物敏感性耳聋基因携带者和迟发性聋基因携带者，同时明确的病因学诊断也给今后的遗传咨询带来益处[8]。在新生儿中开展GJB 2与线粒体基因筛查，还可以进一步扩大随访对象，发现高危人群，及早进行干预，降低耳聋发病率，减轻个人、家庭、社会负担。
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在政府主导下医疗保健教育及全社会的关心和支持下才能使PKU 患儿的防治有所作为，促进患儿预后改善保证下一代的健康成长。
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