果胶甲基酯酶PME参与调控大麦根尖铝毒敏感性

第38卷第3期2011年5月

浙江大学学报(理学版)

Journal of Zhejiang University(Science Edition)

http://ww w. journals. zju. edu. cn/sci

Vol. 38No. 3M ay 2011

DOI:10. 3785/j. issn. 1008-9497. 2011. 03. 019

果胶甲基酯酶PME 参与调控大麦根尖铝毒敏感性

潘伟槐1, 郑仲仲2, 郭天荣1, 王超2, 寿建昕1, 潘建伟2

(1. 绍兴文理学院生命科学学院, 浙江绍兴312000; 2. 浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江金华321004) 摘要:利用大麦耐铝品种和敏感品种来分析根尖果胶甲基酯酶(P M E) 在大麦铝毒敏感性中的调控作用. 通过对耐铝性差异极其显著的2个大麦明品种2000-2与沪麦16经铝处理后的M or in 荧光检测, 观察到2000-2根尖荧光明显比沪麦16强, 铝试剂比色法测定结果进一步表明, 敏感品种根尖细胞壁上铝积累量比耐铝品种高, 达到极显著差异(p

中图分类号:Q 946 文献标志码:A 文章编号:1008-9497(2011) 03-326-07

PA N W e-i hua i 1, ZH ENG Zho ng -zho ng 2, GU O T ian -r ong 1, WA N G Chao 2, SHO U Jian -xin 1, PA N Jian -w ei 2(1. College of L if e S ciences , Shaox ing College of A rts and Sciences , Shaox ing 312000, Zhej iang Pr ovince , Chi-na; 2. College of Chemistr y and Lif e Sciences , Zhej iang N or mal Univer sity , J inhua 321004, Zhej iang Pr ov ince, China)

Involvement of PME activity in regulation of Al toxic sensitivity in the root tips of barley. Jo urnal of Zhejiang U niversit y(Science Edit ion) , 2011, 38(3) :326-332

Abstract:It has been pr oposed that A luminum(Al) accumulation o n cell w alls o f r oo t tips is t he primar y prerequisite of to xic effects of A l on r oot tips in plants. In this study, pect in methylester ase(PM E) r egulat ion o f A l to xicity sen -sit ivity and A l accumulation on cell wa lls wer e inv estigated in the ro ot tips o f tw o bar ley cultivars signif icantly differ -ent in A l resistance. M o rin fluor escent staining show ed that the fluor escence signal of r oot tips w as much stro ng er in A-l sensitive cultivar 2000-2than in A-l resistant Humai 16aft er Al t reatments, indicating t hat mor e A l w as accumu -lated on the roo t t ip of cv. 2000-2than cv. Humai 16. Aluminon spectr ophotometr ic assay further confir med t hat the Al content in pr imary ro ot t ips was significantly hig her in the A-l sensitiv e cultiv ar than in the A-l r esistant one (t -test, p

Key Words:ba rley ro ot tips; a luminum (A l) tox icity ; pect in met hy lesterases

发现Al 对植物的毒害作用以来, 对植物Al 毒的研

0 引言

自从1918年H ARTWELL 和PEM BER 首次

究已有90多年的历史, 许多研究者一直致力于植物铝毒研究[1], 但至今人们对植物Al 毒机制仍不清楚. 铝在根尖细胞壁上的积累是铝对植物根尖产生

收稿日期:2010-12-28.

基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(Y3100207) .

作者简介:潘伟槐(1963-) , 男, 副教授, 硕士, 主要从事植物生理和逆境生理研究.

第3期潘伟槐, 等:果胶甲基酯酶PM E 参与调控大麦根尖铝毒敏感性

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毒害的先决条件, 是植物铝毒敏感性的重要特征. RYAN P R 等[2]将玉米(Zea mays) 根尖顶端2~3m m(包括根冠、分生组织和伸长区) 暴露到A l 处理液中, 即可引起根生长抑制, 而将根尖以外的根部位暴露到Al 处理液中, 根生长不受影响. DEL -H A IZE 等[3]的研究结果表明, 根尖积累的A l 及其所产生的物理损伤远远超过铝毒对根其他部位的影响. 因此, 植物根尖是Al 诱导根生长抑制的作用靶. 有研究表明, 在玉米敏感品种中, 根尖过渡区的远端(distal part of the transition zones, DT Zs) , 即离根顶端2~3mm 是铝毒最初的作用靶, 这一区域的细胞处于快速伸长的前期阶段, 在铝胁迫下, 这一区域比其它区域积累更多的铝, 从而抑制根伸长

[4-8]

有关铝如何结合到细胞壁上已有广泛的研究, 一种观点认为由于细胞壁带负电荷, 外源阳离子能通过离子交换的形式结合到细胞壁上, 细胞壁阳离子交换能力(cation ex chang e capacity, CEC) 越强, Al 3+结合到细胞壁上的数量越多, 对根尖细胞的毒害就越大. 然而, 对于细胞壁阳离子交换能力(CEC) 在铝毒及耐铝性的作用, 不同研究者的实验结果并不一致. 另一种比较流行的观点认为果胶(pec -tin) 是Al 3+结合到细胞壁上的主要作用位点. 果胶是一种富含半乳糖醛酸(galacturonic acid, Ga) 的多糖, 是初生细胞壁的主要成分(约占1/3) .

果胶被分泌到胞外时甲基化程度很高, 但果胶甲基酯酶(pectin methy lesterase, PM E) 能使果胶去甲基化后转变为含有大量游离羧基的果胶酸(见图1) , 这些游离羧基易被二价阳离子如Ca 、Cu 2+、三价阳离子如A l 3+等结合, 从而使果胶变硬, 但三价Al 3+比Ca 2+、Cu 2+等二价阳离子更易与果胶酸的游离羧基结合, 能置换果胶中的Ca 而与果胶羧基牢固结合, 但这种结合受内外因子的影响, 如PME 活性、铝活性浓度、溶液中的其他阳离子浓度、溶液pH 值、根细胞壁CEC 和不同果胶结构的别构效应. SCH M OH L 等的研究还表明, 根尖细胞壁PM E 活性越高, 果胶甲基化程度越低, 铝积累却越多, 这暗示了PME 活性直接影响了铝毒对植物的毒害程度

[5, 14, 16-17]

[5]

[14-15]

[12-13]

. MASSOT 等

[9]

的研究表明, A l 对植物的毒

害越大, 根伸长率越小, 因此, 根伸长抑制是植物Al 毒最早观察到的现象. LLU GANY 等[10]用Al 处理玉米敏感品种30m in, 立即出现根伸长抑制, 根伸长率(ro ot elongation rate, RER) 明显下降, 并且敏感品种的根伸长率下降比耐铝品种更为明显. 徐阿炳等[11]以酸铝营养液培养方法鉴定3871份中国大麦种质资源, 品种间耐酸铝性存在显著性差异, 315份为1级敏感品种, 根伸长率0~5%; 94份为10级敏感品种, 根伸长率为45%~50%, 其它3462个品种在两者之间, 这个结果也充分证实了根伸长率是一个十分灵敏的指标.

图1 在P M E 作用下果胶去甲基化过程[17]

Fig. 1 Demethylester ification of pect ins by pectin methylester ases(PM E)

ISH IKAWA 等[18]根据根净伸长率分析了水稻、玉米、豌豆和大麦等4种作物的耐铝性大小, 即水稻(79. 9%) >玉米(69. 2%) >豌豆(59. 6%) >大麦(4. 4%). 这说明大麦是一种铝毒极其敏感的作物, 是研究植物铝毒敏感性的好材料. 然而PM E 是否在大麦铝毒敏感性中起作用仍没有直接的证据. 本研究试图弄清具有不同耐铝性的大麦品种的根尖PM E 的活性与铝毒敏感性的关系, 对进一步理解大麦铝毒及耐铝品种的耐铝机制具有重要的生物学意义.

1 材料与方法

1. 1 材料

大麦(H ordeum vulgar e L. ) 品种沪麦16(cv. H umai 16) 、秀3(cv. Xiu 3) 、2000-1(cv. 2000-1) 和2000-2(cv. 2000-2). 1. 2 种子萌发及其培养

种子的萌发和培养参照文献[19], 种子露白, 选取长势良好的种子进行水培法培养. 在含

-1

(

328

浙江大学学报(理学版)

第38卷

再进行各种铝处理实验.

1. 3 铝处理及其根伸长率的测定

将培养2d 后的幼苗进行铝处理, 分别用20 mol L Al (0. 1mmo l L CaCl 2, pH 4. 5) 和0. 1m mol L -1CaCl 2(pH 4. 5) (对照组) 处理24h. 在铝处理前, 分别测量对照组和铝处理组每组的10个种子的初生根(最长的根) 根长, 分别记为L CK0和L Al0, 经过24h 处理后再分别测量对照组和铝处理组相对应的根长, 分别记为L CK 24和L Al24. 根相对伸长率(ro ot relativ e elong ation rates, RER) 按下列公式计算[19]:RER =(L Al24-L Al0) /(L CK24-L CK0) 100.

1. 4 根尖细胞壁铝积累的荧光检测

Mor in(Sigm a) 是一种铝特异性荧光染料, 对于检测结合于细胞壁上的铝是十分有效的[20]. 将20 mol L -1Al 3+(0. 1mmo l L -1CaCl 2, pH 4. 5) 处理24h 后的根尖材料(约10mm 长) 浸于5m mol L

-1-1

-1

成每克干重Al 质量比( g /gDW). 所有数据均采用X SD 表示, 并用SPSS13. 0软件进行独立样品t 检验(independent samples t -test).

1. 6 根尖果胶甲基酯酶PME 的提取和活性测定

PM E 提取方法参照文献[19], PM E 活性测定参照文献[19, 24].

2 结果与分析

2. 1 不同大麦品种耐铝性的鉴定

用20 mol L -1铝处理24h 后, 4个大麦品种沪麦16(cv. Humai 16) 、秀3(cv. Xiu 3) 、2000-1(cv. 2000-1) 和2000-2(cv. 2000-2) 的根相对伸长率RER 如图2(a) 所示. 从图中可知, 在铝毒作用下, 品种2000-2根伸长率为5%, 而品种沪麦16为49. 88%, 两者的根相对生长率存在极显著性差异(-t test, p

铝对根尖产生毒害的第一步是铝结合到根尖细胞壁上. 用铝特异性荧光染料M or in 检测铝在耐铝品种沪麦16和敏感品种2000-2根尖细胞壁上的积累水平, 结果如图3(a) 和(b) 所示. 用20 mol L -1铝处理24h 后, 两个大麦品种的根尖细胞壁上均发出绿色荧光, 但敏感品种的荧光强度比耐铝品种强, 表明敏感品种根尖细胞壁上铝积累量比耐铝品种高.

为进一步证实铝在耐铝品种根尖细胞壁上的积累水平比敏感品种高, 利用铝试剂(Aluminon) 测定经不同铝浓度处理后的2个品种(耐铝品种沪麦16和敏感品种2000-2) 的根尖铝积累量. 如图3(c) 所示, 虽然经20 mo l L

-1

NH 4OAC 缓冲液(pH 5. 0) 中5m in,

-1

然后在100 mo l L M orin (5m mol L

NH 4OAC, pH 5. 0) 中染色1h, 再在5mmo l L -1NH 4OAC 缓冲液(pH 5. 0) 中浸10min, 在荧光显微镜下(Nikon, Japan, 510nm 蓝光激发) 观察、拍照. 1. 5 根尖Al 3+积累量的测定

设一个对照和5个处理浓度(0、20、40、80和160 mo l L Al , 0. 1m mol L CaCl 2, pH 4. 5) , 培养24h 后切取幼苗初生根10mm, 分别进行消化后测定Al 3+积累量. 样品的消化采用H NO 3-H ClO 4分解法:将根放入相应的称量瓶中, 在100 下烘干、研磨, 准确称取磨细的干样5m g, 加入0. 2mL 的浓H NO 3, 过夜, 再加入40 L 的H ClO 4, 加热煮沸蒸至溶液无色, 近干, 取出后冷却加ddH 2O 定容至10mL, 此为消化液待用.

Al 3+积累量的测定采用铝试剂(Alumino n) 分光光度法. 分别配制Al 浓度为0、0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1、1. 2、1. 4、1. 6和1. 8 g mL -1标准溶液, 每10mL 溶液中含0. 4mL pH 6. 2的醋酸-醋酸铵缓冲液及0. 2mL 0. 2%的铝试剂, 于 =510nm 处测定OD 值, 制作标准曲线和回归方程, y =5. 119x -5. 663, r =0. 990, r 2=0. 981, 此标准曲线的线性关系为极显著. 其中x 为吸光度(OD 值) , y 为Al 3+质量浓度( g m L -1). 样品Al 3+质量浓度的测定时, 取消化液5mL, 加入0. 4mL pH 6. 2的醋酸-醋酸铵缓冲液以及0. 2mL 0. 2%的铝试剂, 用ddH 2O 定容至10mL, 测定OD 值. 根据标准曲l 3+, [23]

[21-22]

-1

Al 处理24h 后, 2个品

种初生根的铝积累量与对照相比, 均有显著增加(t -test, p

第3期潘伟槐, 等:果胶甲基酯酶PM E 参与调控大麦根尖铝毒敏感性

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图2 4个大麦品种的耐铝性鉴定

Fig. 2 Ident ificatio n o f A l r esistance in four barley cultivar s

(a) 经20 mol L -1铝处理24h 后的4个大麦品种的初生根相对伸长率, 不同字母表示有显著性差异(t -test, p

(a) Relative elonggation rates(RERs) of the prim ary roots treated by 20 mol L -1Al for 24h. Different letters indicate a significant differ -ence in the RERs(t -test, p

图3 大麦根尖铝积累分析

Fig. 3 A ssay s for Al accumulation in the pr imary ro ot tips of bar ley

(a) 和(b) 用铝特异性结合的荧光染料M orin 检测两个大麦品种2000-2(a) 和沪麦16(b ) 初生根根尖铝积累量, 图中标尺为1mm; (c) 用铝试剂测定两个大麦品种沪麦16和2000-2初生根根尖铝积累量, 不同字母表示有显著性差异(-t text, p

(a) an d (b) Determ ination of Al accumu lation in the primary root tips of cv. 2002-2(a) and cv. Hum ai 16(b) usin g morin staining after 24-h exp os ure to 20 m ol L -1Al 3+, bar=1mm in (a) and (b) ; (c) Determination of Al con tents in the primary root tips of cv. H um ai 16and cv. 2000-2usin g Aluminon agent, Different letters indicate a significant differ ence in th e Al comtents(-t test, p

2. 3 铝毒诱导大麦根尖细胞果胶甲基酯酶PME

活性变化目前大多认为铝最主要的结合位点是细胞壁上的果胶层, 只有少量铝结合于细胞壁的其它成分. 只有当果胶去甲基化后变成果胶酸时, 铝才能结合到果胶上. 而果胶去甲基化需由果胶甲基酯酶PME 来完成. 因此, 推测铝可能通过影响PME 的活性表达从而达到与去甲基的果胶相结合. 本实验检测了在铝处理过程中, 耐铝品种沪麦16和敏感品种2000-2的根尖PM E 活性变化, 结果如图4所示. 从图4中可知, 20 mo l L

-1

test, p 0. 05). 20 m ol L

-1

铝处理24h 后, 2个品种

的根尖PM E 活性均下降, 但敏感品种2000-2的PME 活性下降达到显著性差异(t -test, p 0. 05). 这些结果表明, 敏感品种根尖PME 活性对铝毒反应非常敏感, 先促进后抑制, 但耐铝品种根尖PM E 活性对铝毒反应并不敏感.

3 讨论

M ICH ELI

[17]

铝处理4h 后, 与各自对

的研究表明, 果胶和PM E 同时被

, 照相比, 2个品种的根尖PM E 活性均上升, 但敏感t -

330

浙江大学学报(理学版) 第38卷

分泌到胞外后才被剪切成成熟的PM E. 这时才有可能使细胞壁果胶去甲基化. DARLEY 等[25]认为PM E 使果胶去甲基化有2个重要作用, 一方面, 游离羧基的形成提高了多聚物的净电荷, 促进了与阳离子如Ca 2+等结合形成交联的能力, 使细胞壁变硬, 细胞壁一定程度的变硬可加强细胞与细胞之间的黏附. 体外研究表明, 外源PME 与细胞壁共培养, 使细胞壁变硬. 有较多的研究表明, PME 活性过高将与组织生长率呈负相关. 另一方面, 多聚半乳糖醛酸酶(polyg alacturo nases, PG) 对甲基化果胶活性很低, 但对去甲基化果胶有很高的活性, 因此, PME 活性能使果胶更易被水解酶所水解, 使细胞壁软化. 这对细胞分裂、伸长是至关重要的一步

[26]

性, 暗示PME 活性参与调控大麦铝毒敏感性.

已有研究表明, 二价阳离子如Ca 2+、Mg 2+等能促进PM E 的活性, 但一价阳离子却没有这种促进作用

[28-29]

. 在本实验中, 铝在短时间内(4h) 能促进

敏感品种根尖PM E 活性上升, 很可能一方面A l

等阳离子直接与PM E 作用, 使PME 结合到细胞壁上, 增加了PM E 对果胶底物的亲和力, 从而提高了PME 的活性, 因为有研究表明, 结合于细胞壁上的PME 活性远比可溶性PM E 高代细胞壁上的Ca

[30]2+

; 另一方面铝可取

(大部分Ca 在细胞壁上与果

胶酸结合成为果胶酸钙) , 使细胞壁上的游离Ca 浓度上升, 这种Ca 2+浓度的上升也促进了PME 的活性. 因此, 铝在短时间内可直接或间接地促进PME 的活性. 铝处理24h 后, 大麦敏感品种的PME 活性显著性下降, 这可能是由于铝处理的初期PME 活性的显著性上升, 使果胶去甲基化后, 导致果胶酸含量上升(果胶甲基化程度下降) , 促进了更多的铝结合于细胞壁果胶层产生交联而使细胞壁变硬(见图5) , 改变了细胞壁的生物学特性与功能, 如细胞壁伸展性的下降、细胞壁孔径变小抑制了PME 、酸性磷酸酶或过氧化物酶等胞外酶、高分子溶质以及其他蛋白因子的分泌, 同时也改变了原有细胞壁酶的动力学特征. 当然, 过量的铝也可能直接导致PM E 酶活性下降. 另外, 铝处理24h 能明显抑制大麦敏感品种的根尖PM E 活性, 这与SCH MOH L 等[5]在马铃薯中的结果不同, 这可能源于不同物种对铝毒反应的浓度不同. H ORST 等[31]和SIVAGURU 等[7-8]的研究表明, 大量铝与玉米根尖细胞壁结合后引起细胞壁-质膜-细胞骨架连续体(cell w al-l plasm a m em brane -cy toskeleton co ntin -uum) 结构改变, 导致铝敏感区域(根尖过度区远端, the distal part o f the transition zo ne, DTZ, 即离根

图4 铝毒诱导大麦根尖果胶甲基酯酶PM E 活性变化Fig. 4 A-l induced PM E activ ity changes in root tips of barley

大麦品种2000-2和沪麦16根尖用20 mol L -1铝分别处理4h 和24h, 然后分别提取PM E 及活性测定, 不同字母表示有显著性差异(t -test, p

cv. 2000-2and cv. H um ai 16w ere treated by 20 m ol L -1Al for 4and 24h, r espectively, an d then PM E w as isolated and its activ-i ty was detected. Differ ent letter in dicate a significant differen ce be -tw een tw o treatm ents(t -test, p

目前认为, 细胞壁变硬有3种可能原因:(1) 新细胞壁多聚物的沉积; (2) 由于金属离子的作用,

PM E 活性上升, 使细胞壁交联活性上升; (3) 细胞壁松弛蛋白如苹果青霉(ex pansin) 停止产生. 然而, 活体细胞壁变硬很可能是以上3种原因综合的结果

-1

本研究结果表明, 用20 m ol L 铝处理大麦敏感品种2000-24h, 根尖PME 活性有显著性上升, 处理24h 后PM E 活性与4h 相比有极显著性下降, 与对照相比也有显著性下降, 在耐铝品种沪麦16中并不存在这种现象(见图4). M orin 荧光检测和根铝积累量测定结果表明, 敏感品种根尖细胞壁比耐铝品种积累更多的铝(见图3) , 这与YANG 等对水稻的研究结果一致[27], 表明铝毒敏感品种根尖

[14-15]

图5 PM E 参与调控大麦根尖铝毒敏感性的可能机制F ig. 5 A possible mechanism o n P M E involved in the r eg ulation of A l sensitiv ity in bar ley

第3期潘伟槐, 等:果胶甲基酯酶PM E 参与调控大麦根尖铝毒敏感性

321.

331

尖顶端2~3m m) 细胞骨架的重排, 细胞骨架重排将干扰新合成的细胞壁材料的定位, 从而引起细胞纵向伸长抑制和横向伸长的促进.

在耐铝品种中, 铝并没有明显促进或抑制PME 的活性, 这可能是由于铝处理激活了耐铝机制如有机酸的分泌等等, 当然也可能是耐铝品种根尖细胞壁的阳离子交换能力CEC 比敏感品种低, 导致铝在根尖细胞壁上积累较少. M orin 荧光检测和根铝积累量测定结果表明, 耐铝品种根尖细胞壁上铝积累量的确比敏感品种低(见图3) , 这样, 由于铝未能大量结合于细胞壁, 造成耐铝品种根尖PME 活性对铝毒不敏感, 这时, 细胞壁仍能保持一定的伸展性, 细胞仍能伸长. 同时, 这暗示了结合于细胞壁上的铝只有达到一定浓度后才能促进或抑制PME 活性. 以上分析表明, 敏感品种2000-2根伸长对铝毒敏感的可能机制是铝毒初期(4h) 通过直接或间接的方式促进PME 的活性, 引起细胞壁果胶酸含量上升, 使铝在根尖细胞壁上大量积累, 24h 后, 引起细胞壁变硬, 改变了细胞壁的生物学特性与功能, 降低了细胞壁的伸展性和孔径, PM E 等细胞壁酶活性受抑, 细胞骨架重排, 最终导致细胞纵向伸长受阻, 从宏观上表现为根伸长抑制或停止, 如图5所示.

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2个对铝毒敏感性差异极显著的大麦品种

2000-2与沪麦16, 经铝处理后, M orin 荧光检测和铝试剂比色法测定均显示敏感品种根尖细胞壁上铝积累量比耐铝品种高, 达到极显著差异(p

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(责任编辑涂红)

第38卷第3期2011年5月

浙江大学学报(理学版)

Journal of Zhejiang University(Science Edition)

http://ww w. journals. zju. edu. cn/sci

Vol. 38No. 3M ay 2011

DOI:10. 3785/j. issn. 1008-9497. 2011. 03. 019

果胶甲基酯酶PME 参与调控大麦根尖铝毒敏感性

潘伟槐1, 郑仲仲2, 郭天荣1, 王超2, 寿建昕1, 潘建伟2

中图分类号:Q 946 文献标志码:A 文章编号:1008-9497(2011) 03-326-07

Involvement of PME activity in regulation of Al toxic sensitivity in the root tips of barley. Jo urnal of Zhejiang U niversit y(Science Edit ion) , 2011, 38(3) :326-332

Key Words:ba rley ro ot tips; a luminum (A l) tox icity ; pect in met hy lesterases

发现Al 对植物的毒害作用以来, 对植物Al 毒的研

0 引言

自从1918年H ARTWELL 和PEM BER 首次

究已有90多年的历史, 许多研究者一直致力于植物铝毒研究[1], 但至今人们对植物Al 毒机制仍不清楚. 铝在根尖细胞壁上的积累是铝对植物根尖产生

收稿日期:2010-12-28.

基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(Y3100207) .

作者简介:潘伟槐(1963-) , 男, 副教授, 硕士, 主要从事植物生理和逆境生理研究.

第3期潘伟槐, 等:果胶甲基酯酶PM E 参与调控大麦根尖铝毒敏感性

327

[4-8]

[5, 14, 16-17]

[5]

[14-15]

[12-13]

. MASSOT 等

[9]

的研究表明, A l 对植物的毒

图1 在P M E 作用下果胶去甲基化过程[17]

Fig. 1 Demethylester ification of pect ins by pectin methylester ases(PM E)

1 材料与方法

1. 1 材料

大麦(H ordeum vulgar e L. ) 品种沪麦16(cv. H umai 16) 、秀3(cv. Xiu 3) 、2000-1(cv. 2000-1) 和2000-2(cv. 2000-2). 1. 2 种子萌发及其培养

种子的萌发和培养参照文献[19], 种子露白, 选取长势良好的种子进行水培法培养. 在含

-1

(

328

浙江大学学报(理学版)

第38卷

再进行各种铝处理实验.

1. 3 铝处理及其根伸长率的测定

1. 4 根尖细胞壁铝积累的荧光检测

-1-1

-1

成每克干重Al 质量比( g /gDW). 所有数据均采用X SD 表示, 并用SPSS13. 0软件进行独立样品t 检验(independent samples t -test).

1. 6 根尖果胶甲基酯酶PME 的提取和活性测定

PM E 提取方法参照文献[19], PM E 活性测定参照文献[19, 24].

2 结果与分析

2. 1 不同大麦品种耐铝性的鉴定

-1

NH 4OAC 缓冲液(pH 5. 0) 中5m in,

-1

然后在100 mo l L M orin (5m mol L

NH 4OAC, pH 5. 0) 中染色1h, 再在5mmo l L -1NH 4OAC 缓冲液(pH 5. 0) 中浸10min, 在荧光显微镜下(Nikon, Japan, 510nm 蓝光激发) 观察、拍照. 1. 5 根尖Al 3+积累量的测定

[21-22]

-1

Al 处理24h 后, 2个品

种初生根的铝积累量与对照相比, 均有显著增加(t -test, p

第3期潘伟槐, 等:果胶甲基酯酶PM E 参与调控大麦根尖铝毒敏感性

329

图2 4个大麦品种的耐铝性鉴定

Fig. 2 Ident ificatio n o f A l r esistance in four barley cultivar s

(a) 经20 mol L -1铝处理24h 后的4个大麦品种的初生根相对伸长率, 不同字母表示有显著性差异(t -test, p

(a) Relative elonggation rates(RERs) of the prim ary roots treated by 20 mol L -1Al for 24h. Different letters indicate a significant differ -ence in the RERs(t -test, p

图3 大麦根尖铝积累分析

Fig. 3 A ssay s for Al accumulation in the pr imary ro ot tips of bar ley

2. 3 铝毒诱导大麦根尖细胞果胶甲基酯酶PME

-1

test, p 0. 05). 20 m ol L

-1

铝处理24h 后, 2个品种

3 讨论

M ICH ELI

[17]

铝处理4h 后, 与各自对

的研究表明, 果胶和PM E 同时被

, 照相比, 2个品种的根尖PM E 活性均上升, 但敏感t -

330

浙江大学学报(理学版) 第38卷

[26]

性, 暗示PME 活性参与调控大麦铝毒敏感性.

已有研究表明, 二价阳离子如Ca 2+、Mg 2+等能促进PM E 的活性, 但一价阳离子却没有这种促进作用

[28-29]

. 在本实验中, 铝在短时间内(4h) 能促进

敏感品种根尖PM E 活性上升, 很可能一方面A l

[30]2+

; 另一方面铝可取

(大部分Ca 在细胞壁上与果

图4 铝毒诱导大麦根尖果胶甲基酯酶PM E 活性变化Fig. 4 A-l induced PM E activ ity changes in root tips of barley

大麦品种2000-2和沪麦16根尖用20 mol L -1铝分别处理4h 和24h, 然后分别提取PM E 及活性测定, 不同字母表示有显著性差异(t -test, p

目前认为, 细胞壁变硬有3种可能原因:(1) 新细胞壁多聚物的沉积; (2) 由于金属离子的作用,

PM E 活性上升, 使细胞壁交联活性上升; (3) 细胞壁松弛蛋白如苹果青霉(ex pansin) 停止产生. 然而, 活体细胞壁变硬很可能是以上3种原因综合的结果

-1

[14-15]

图5 PM E 参与调控大麦根尖铝毒敏感性的可能机制F ig. 5 A possible mechanism o n P M E involved in the r eg ulation of A l sensitiv ity in bar ley

第3期潘伟槐, 等:果胶甲基酯酶PM E 参与调控大麦根尖铝毒敏感性

321.

331

尖顶端2~3m m) 细胞骨架的重排, 细胞骨架重排将干扰新合成的细胞壁材料的定位, 从而引起细胞纵向伸长抑制和横向伸长的促进.

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2个对铝毒敏感性差异极显著的大麦品种

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(责任编辑涂红)

果胶甲基酯酶PME参与调控大麦根尖铝毒敏感性

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