蝉花生物活性物质研究
盖 悦 2010.01.26
蝉花(Cordyceps cicadae) 属虫生性药用真菌，是我国传统名贵中药材，又名蝉蛹草、蝉茸、胡蝉、蜩等，是蝉在土中的若虫被麦角菌科真菌的分生孢子寄生致死的带菌尸体，其在头部长菌丝形成的子座，形似花蕾故名蝉花，形态见图1。其药用始载于南北朝刘宋时代的《雷公炮炙论》。宋朝唐慎微所著《经史证类备急本草》言“蝉花味甘寒，无毒，主小儿天吊，惊痫，瘛疭，夜啼，心悸”。中医药学家认为， 蝉花具有疏散风热、透疹、熄风止痉、明目退翳之功效。现代医学研究表明，它具有免疫调节、改善机体营养状况、改善肾功能、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮等作用。由于蝉花与冬虫夏草均为虫菌复合体，都属于菌物界、真菌门、子囊菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，所以医家常认为蝉花是一种与冬虫夏草相近的珍贵药材，可作为冬虫夏草的代用品。近年国内外对中药蝉花的开发与应用进行了一些研究，现就此作一归纳总结。
图1. 天然蝉花的形态
一、蝉花主要生物活性成分及其药理作用
1.1多糖
多糖具有独特的生物活性，是许多中草药的主要活性物质，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗衰老等功效，近年来尤以免疫调节作用成为研究开发的热点。Kiho和Nagai[1]从蝉花中分离出半乳甘露聚糖C-3（galactomannan），它是一种水溶性多糖，相对分子量27000，由D-甘露糖和D-半乳糖以4:3比例组成，以20 mg/kg的剂量对小鼠S180肉瘤的抗肿瘤作用，结果抑制率为47%。迟秋阳和陈宝骥[2]等从蝉花中提取的多糖，以冬虫夏草多糖为阳性对照，对小鼠进行淋巴转化试验、Ea及E玫瑰花试验、特异性免疫玫瑰花试验、巨噬细胞吞噬试验、
抗绵羊红细胞抗体效价试验，结果表明蝉花多糖具有明显的提高免疫功能作用。Takano和Yahagi[3]从蝉花发酵液中分离出一种可以促进Th1免疫反应的蛋白多糖，该多糖可以增加大鼠派氏集合淋巴结细胞中白介素-2和干扰素-γ的浓度，并且通过毒理实验表明该蛋白多糖对大鼠没有毒副作用。
谭艾娟和立琨[4] 等报道蝉花发酵液中含有丰富的透明质酸（Hyaluronic acid，HA），达11.35 mg/mL。透明质酸是由乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸为结构单元的高分子非蛋白酸性粘多糖，由于保湿型强、生物相容性好，在高档化妆品中应用广泛，还常作为粘弹性保护剂用于眼科如眼球晶体移植手术、视网膜剥离手术、开放性玻璃体切除手术及青光眼手术等，也用于治疗类风湿性关节炎和骨性关节炎等疾病；此外，HA具有抗癌作用，可有效刺激免疫系统、阻止癌细胞扩散[5]。HA为蝉花的次级代谢产物，从蝉花发酵液中提取可以克服从动物组织中提取HA受原料限制的不足，又有利于蝉花的综合利用开发。
1.2 含氮类化合物
1.2.1 核苷类
蝉花中核苷类成分包括腺苷、虫草素、鸟苷、尿苷、腺嘌呤、鸟嘌呤等。 腺苷是一种嘌呤核苷，其含量是评价各种虫草内在质量的主要指标，结构见图2A。温鲁和唐玉玲[6]报道蝉花菌丝体中的腺苷含量为1.90 mg/g，约为冬虫夏草的4倍。腺苷涉及到中枢神经系统中不同生理过程的调节，能抑制中枢神经元的兴奋性，可以扩张冠状及周围血管、增加冠状动脉血流量、降低血压、减慢心率等作用，腺苷还具有抗血小板聚集、抗辐射和抗肿瘤等作用[7]。
虫草素作为第一个从真菌中分离出来的核苷类成分，为一种细胞毒性物质，结构见图2B。李瑞雪和胡飞[8]从蝉花菌丝体中测得虫草素的含量可达2.77 mg/g，远高于冬虫夏草，与蛹虫草含量相当。研究表明，虫草素有抗肿瘤、抗白血病、抗菌、免疫调节、清除体内自由基等多方面的药理作用。虫草素对膀胱癌、肾癌、结肠癌以及纤维胚胎细胞瘤具有抗癌活性，对鼠艾氏腹水癌、人鼻咽癌KB细胞、人表皮样疣、人宫颈癌Hela细胞、Lewis肺癌等具有明显的控制作用，对多种实体恶性肿瘤有很强的抑制作用[9-13]。虫草素可引起白血病细胞的凋亡和有丝分裂细胞S、G2期的延长[14]。美国1997年将虫草素用于I期临床实验，治疗急性前B和前T淋巴细胞白血病患者[15]。上海国宝生物工程研究所同交通大学附属儿
童医院合作，对用虫草素、多糖合剂白血病患者的治疗效果进行了观察研究。结果证实，虫草素能显著增强细胞免功能和巨噬细胞吞噬能力，刺激血液中补体和抗体的生成，增加血中免疫球蛋白数量，促进强化疗后受损的细胞免疫恢复，提高机体的抗感染能力，从而增强疗效[9]。虫草素能抑制病毒的RNA合成，对枯草杆菌、鸟结核杆菌、牛型结核分枝杆菌、梭菌、链球菌、鼻疽杆菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌及石膏样小芽饱癣菌等均有一定抑制作用，还现出一定的抗真菌、抗HIV-I型病毒活性，但以对枯草杆菌的抑制作用最强[9, 16, 17]。作为一种新型的广谱抗菌素，虫草素以其特有的抗菌、抗病毒活性，引起全球科技发达国家的高度重视。体外试验证实，虫草素能明显促进人外周血单核细胞释放IL-10，同时抑制IL-2产生，从而对人体自身免疫性疾病、炎性疾病发挥潜在的治疗作用，使机体免受过度的免疫病理损伤[18]。还有研究表明，虫草素能诱导机体成熟树突状细胞调节性T细胞增殖，因而能增强自身免疫性疾病的治疗效果[19, 20]。
柴一秋和韦忠民[21,22]从蝉花的人工固体或液体发酵培养物中提取得到N6-(2-羟乙基)腺苷[N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine]，该化合物也是一种腺苷衍生物，是虫草的特有成分，已用它作为虫草制品的质量控制指标之一。N6-(2-羟乙基)腺苷通过与α受体结合抑制了神经递质释放而产生镇痛作用，其镇痛机理不同于目前常用的阿片类镇痛剂，不具有成瘾性，安全，用小鼠扭体法测定有99%的镇痛率。另外，Furuya和Hirotani[23]研究显示N6-(2-羟乙基)腺苷具有Ca2+拮抗作用和肌肉收缩活性，可能对心率失常、心肌缺血、心绞痛、高血压、血栓等心血管系统疾病有作用。
A. Cordycepin B. Adenosine
图2. 虫草素和腺苷的结构式
1.2.2 环肽化合物
Duarte N等[24]从蝉花中分离得五种环肽化合物，分别为白僵菌酮（Bassiatin）、
白僵菌酮甲（Bassiatin A）、白僵菌素（Beauvericin）、白僵菌素甲（Beauvericin A）、白僵菌素乙（Beauvericin B），结构见图3。白僵菌酮和白僵菌酮甲具有相似的药理作用，为一种新型的血小板凝聚抑制剂，均对ADP诱导的兔血小板凝聚有明显的抑制作用(IC50=1.9×10-4 mol/L)[25]。药理实验结果显示白僵菌素类成分具有抗肿瘤、抗惊厥、抗心律失常、镇静等作用[26]。
A.白僵菌酮 B. 白僵菌酮甲 C.白僵菌素类化合物
（白僵菌素，R1及R2均为CH3；白僵菌素甲，R1为CH3，R2为CH2CH3；
白僵菌素乙，R1及R2均为CH2CH3）
图3. 环肽化合物的结构式
1.3 甾醇类化合物
Kuo和Lin[27]从蝉花菌丝体中分离出麦角固醇（Ergosterol）和麦角固醇过氧化物（Ergosterol peroxide），结构见图4。麦角固醇是真菌类细胞膜上重要的固醇类，在虫草类真菌中含量相对稳定，通常作为质量控制指标之一，具有抗氧化能力，且为维生素D2的前驱物，具有重要的药理作用。Kuo和Weng[28]报道麦角固醇过氧化物具有抑制肿瘤生长及抗炎的活性以及抗动脉粥样硬化的作用，可抑制植物血球凝聚素（PHA）活化的人T细胞分化与增殖。
图4. 麦角固醇过氧化物
1.4 多球壳菌素
Fujita等[29]通过免疫抑制细胞模型从蝉花培养滤液中筛选获得活性成分多球
壳菌素（ISP-1），即(2S,3R, 4R) - 2 - amino - 3, 4 - dihydroxy -2- hydroxymethyl -14- oxoeicos -6- enoic acid，myriocin / thermozymocidin，结构式见图5。药理研究表明，多球壳菌素具有显著的双向免疫调节作用，能阻断白介素-2受体以下的途径，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）活性，从而特异性抑制T细胞的增殖；多球壳菌素对同种细胞障碍性T细胞的诱导均有很强的抑制活性，在这些方面比环孢菌素A强10~100倍；Miyake[30]也报道了在同种混合淋巴球混合反应方面，多球壳菌素也比临床广泛应用的环孢菌素显示更强的活性。付德才和郑汝娜[31]对多球壳菌素进行构效关系的研究及结构改造与优化后获得FTY720，具有独特的化学结构和药理作用机制、毒副作用小等特点，显示了良好的临床应用前景，有望成为新一代的免疫抑制剂而广泛用于器官移植和自身免疫性疾病的治疗等。
另外，Hojjati和Li[32]报道多球壳菌素可抑制动脉粥样硬化形成，利用多球壳菌素抑制鞘脂类合成的关键酶——丝氨酸棕榈酰转移酶的机理，连续60天对8周龄的动脉粥样硬化的大鼠每隔一天注射浓度为0.3 mg/kg多球壳菌素，结果显示多球壳菌素对鞘脂类的合成有明显的抑制作用，该大鼠动脉硬化损伤面积明显减少，因此，多球壳菌素抑制SPT活性可能作为治疗动脉粥样硬化的一个选择。肖朝华和周建华[33]利用高糖模拟糖尿病病人体内的高糖环境，探讨多球壳菌素在糖尿病肾病肾脏肥大和早起肾硬化过程中所起的作用，结果表明多球壳菌素不但可有效抑制肾小球系膜细胞系肥大，并能明显减少细胞外基质分泌，因此有望将其用于包括糖尿病肾病在内的肾小球硬化的治疗[34]。
图5 . 多球壳菌素（ISP-1）的结构式
1.5虫草酸
蝉花中含有较高浓度的虫草酸（甘露醇），温鲁和唐玉玲[35]检测出蝉花中的虫草酸含量达78.57 mg/g，高于冬虫夏草和蛹虫草。据药理研究及临床试验表明，虫草酸具有平喘祛痰、利尿、提高血浆渗透压、抗氧化等作用，对多种疾病有一定疗效。2006年10月，Pharmaxis制药公司在澳大利亚注册上市了慢性肺部疾
病治疗药Bronchitol，该药有效成分就为虫草酸。近年，人们还逐渐认识到虫草酸的一些独特生理功能，如食用后不引起血糖水平波动，不引起牙齿龋变及具有低热值等特性，虫草酸作为甜味剂和食品添加剂的用量在世界范围内迅速增加虫草酸的含量与蝉花内在质量存在一定关系，值得进一步研究和开发利用。
1.6 其它
除以上所述之外，蝉花还具有其他的药用价值，对其相应的活性成分值得进一步研究。宋捷民和忻家础[36]实验表明蝉花具有明显的抗失血性贫血和抗盐酸苯肼贫血作用，对于失血性贫血的RBC、Hb和盐酸苯肼贫血的RBC高剂量组效果优于低剂量组，呈现明显的量效关系，且高剂量组的作用与阿胶组相似。周金慧和陈以平[37]报道，以蝉花菌丝体进行临床研究，表明其具有降低血、尿肌酐，提高内生肌酐清除率，改善血清蛋白含量，减少尿蛋白的排出等功能。因此，对早、中期慢性肾功能不全患者疗效确切。经进一步研究证实：蝉花对肾间质小管病变有较好疗效，能保护肾小管细胞Na+-K+-ATP酶，减轻细胞溶酶体和细胞脂质过氧化损伤，改善肾血流动力学，减轻内皮细胞损伤和血液凝固性。
二、多糖及虫草素的化学研究
综合文献，现将国内研究最多的多糖、虫草素和多球壳菌素的研究成果做一简要介绍。
2.1 虫草素
早在1951年，德国的Cunningham等就从我国传统中药蛹虫草（Cordyceps militaris (L.) Link）的培养滤液中分离发现虫草素（Cordycepin）[38]。虫草素为腺苷（Adenosine）的类似物，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，为一种细胞毒性物质。随后，在20世纪70年代国外就发现虫草素有抑制肿瘤作用，但虫草素在体内的快速代谢和虫草素昂贵的生产成本限制了其进一步的研究和开发利用[39]。20世纪90年代，国外研究发现添加腺苷脱氨酶（ADA）抑制剂对虫草素抗肿瘤活性的表达起着重要作用；同时，国内外在虫草素生产技术方面取得了一定的进步从而使虫草素的研究获得突破性进展。
2.1.1 虫草素的提取
虫草素在蛹虫草中含量比在蝉花及冬虫夏草中含量高得多，因此虫草素一般从蛹虫草子实体中提取。温鲁、凌建亚和申小兵等认为，用水作溶剂，在超声波
振荡器中震荡提取，效果最好[40-42]。鞠建明等认为，用50%甲醇为提取溶剂，超声提取30min效果最好[43]。张嘉等选择的最佳提起方法为用75%乙醇超声波提取3次，每次提取40min，料液比为1:20[44]。王英娟等采用水热回流法提取虫草多糖和虫草素，方法为：用10倍量的水于80℃热回流提取3次，每次90min[45]。
2.1.2 虫草素的纯化工艺
报道的从蛹虫草子实体中提取纯化虫草素的方法有多种。车振明等的提取纯化工艺为：先用水进行加温震荡提取，将提取液用乙醇沉淀去除蛋白质，用活性炭吸附除去色素等杂质，然后上732-阳离子交换色谱柱进行柱层析，洗脱液进行结晶得到虫草素纯品[46]。汪宇等的提取纯化工艺为：50%乙醇80℃水浴恒温浸提，浓缩，用二氯甲烷萃取，上硅胶柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，最后用甲醇和乙醇结晶得到产品[47]。潘中华等的提取纯化工艺为：先将原料用石油醚脱脂、80℃水浴提取10小时、调节等电点沉淀除去蛋白质、732-NH4离子交换树脂分离、浓缩结晶得到产品[48]。
2.1.3 虫草素的检测方法
虫草菌素的检测方法比较多，HPLC是使用最普遍的方法。一般均采用反相色谱法，多数以十八烷基键合硅胶为固定相，有的用甲醇-水（85:15）、甲醇-pH6.5的磷酸盐缓冲液（17:3）、或乙腈-水（90:10）作为流动相进行等度洗脱[49-52]，有的用甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（10:90）、或甲醇-pH=6.86（加1%四氢呋喃）磷酸缓冲溶液（15:85）作流动相进行等度洗脱，也有的用水和乙腈作流动相进行梯度洗脱[53,47]。以上各不同方法流动相的流量一般均控制在0.8-lmL/min，检测波长260nm，进样量一般控制在5-10μL。
此外，也有研究者用紫外分光光度法和毛细管电泳法来测定虫草索的含量。但虫草样品中多数都同时含有虫草素和腺苷，此二者的分子结构相近(仅在戊糖上有微小差异)，具有相同的紫外吸收基团-腺嘌呤，它们的UVλmax均在260nm左右。如果以260nm作为检测波长来测定虫草素含量，就无法排除腺苷等分子结构相近的其它核苷酸的干扰，从而导致检测值比实际值偏大。因此用紫外分光光度法来测定分析生物样品中虫草素含量是不可行的。而毛细管电泳法与HPLC比较，虽然毛细管电泳法具有分辨率高、操作简便、不需要昂贵的有机试剂和预装柱等优点，但其在进样准确性、迁移时间的重现性、检测灵敏度等方面都不如
HPLC。因此，检测生物样品中的微量虫草素含量还是以用HPLC法为佳。
2.2 多糖
多糖是存在于自然界的醛糖和（或）酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物，也是一切有生命的有机体必不可少的成分，它与维持生命的种种生理机能有着密切的联系。近年来，来源于菌类的多糖成分已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，它们所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相继被发现。多糖具有复杂的结构，这是因为它们具有许多不同的单糖残基、不同的连接位置和不同类型的糖苷键，能形成具有不同的构象、不同的相对分子质量，以及链内和链间氢键的二级结构。由于多糖的生物活性与其纯度和化学结构即糖苷键的不同连接方式以及高级结构密切相关，高级结构在活性方面比一级结构起更大作用，因此对多糖的研究开发包含了分离、纯化、结构分析、活性测定及结构修饰。
2.2.1 多糖的提取、分离与纯化
2.2.1.1预处理
在提取之前先以石油醚、乙醚等有机溶剂除去脂溶性杂质，再用85-95%乙醇除去单糖、低聚糖及苷类等干扰性成分，这样处理至少三次及以上方可除尽杂质。
2.2.1.2提取
多糖通常以水作溶剂来提取，可以用水煮提取，也可以用冷水浸提。水提取的多数是中性多糖，而用弱碱性水溶液可以提取含有糖醛酸的多糖，应注意的是在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，提取时应尽量避免酸性条件。对于糖蛋白，可利用加酶提取法，如在提取液中加入胶酶等单酶或双酶；或者用复合酶法，在水溶液中先加入中性链蛋白酶、果胶酶和纤维素酶酶解后提取多糖。根据多糖的溶解性可以用超滤离心分离法提取多糖；或利用多糖不溶于高浓度的乙醇的性质，以沉淀提纯多糖，但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组份的分级分离。
2.2.1.3除蛋白
用醇析所获得的粗多糖常含有较多的蛋白质，需要除蛋白。除蛋白的方法传统上有Sevag法、三氟三氯乙烷法及三氯乙酸-正丁醇法等。Sevag法是用得最多
的方法，该方法是将多糖的水溶液与氯仿混合，并震摇成乳化液，此时蛋白质变性成胶状，离心后蛋白层存在于有机相和水相之间。为了加速蛋白质的变性，最好用pH=4~5的缓冲溶液代替水，并加少量正丁醇或正戊醇，或将氯仿与正丁醇按体积比5:1加入糖液1份中振摇后离心去蛋白质。另外，也可以利用蛋白酶可水解蛋白质的特性，在多糖的水提液中加入中性蛋白酶和糜蛋白酶，与Sevag法结合进行脱蛋白；或将蛋白酶与三氯乙酸法结合除蛋白。有机溶剂与蛋白酶结合的方法效率要高得多，节省许多试剂和资金。但是应该要注意的是，蛋白酶的加入量要适当，否则会增加除蛋白的难度。除蛋白的效果可以用茚三酮反应检测，结果呈阴性；同时在200~280nm处测定除蛋白后样品的紫外吸收曲线来检测效果，除掉蛋白质的多糖溶液一般在260~280nm的紫外吸收峰会消失，说明多糖不含有蛋白质。
2.2.1.4除色素
在多糖提取过程中，由于氧化作用会有色素生成，色素的存在会影响多糖的色谱分析和性质测定。可以用食品级粉末状活性炭吸附，也可以用H2O2对色素的有色基团产生破坏而除去色素，还可以用大孔吸附或阴离子交换树脂柱层析脱去色素，同时这个方法还可以使多糖混合组分初步分离。
2.2.1.5分离与纯化
样品中一般会存在多种多糖，因此要获取均一多糖需要对多糖混合物进行分级并纯化。最简单有效的方法是利用多糖在乙醇中的溶解度的不同进行分离。向粗多糖饱和水溶液中加入乙醇，使乙醇的最终浓度依次达到40%、60%、70%和80%，离心每次所得沉淀，可将粗多糖分成五个等级。但是，乙醇沉淀不一定得到纯的多糖，要得到均一多糖还需要用更加精细的方法，例如色谱、电泳、超滤等技术进行分离纯化。最常用的纯化多糖的方法是色谱法，包括离子交换色谱和凝胶色谱等。色谱法是利用填料对不同种类的糖如不同构型的吡喃糖苷及呋喃糖苷在吸附作用上的差异，使混合物中各糖分达到彼此分离的目的。根据不同的多糖特性选用不同的色谱柱。其中，离子交换色谱要注意树脂类型和粒度、洗脱剂种类、pH值和洗脱速率、分离温度和分离柱的径高比等，洗脱剂的选择可以根据多糖的酸碱性进行调节。凝胶色谱中用的比较多的是交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，主要是利用了分子筛的原理。影响凝胶分离的因素主要是凝胶类型和
粒度、洗脱剂种类、pH值和洗脱速率、分离温度和分离柱的径高比等。实验中对多糖进行分级时，常将粗多糖经色谱柱洗脱，按洗脱曲线的不同峰收集不同的组份，从而分级得到各个均一多糖组份。
2.2.2多糖的理化性质测定
2.2.2.1多糖的含量测定
多糖含量是利用糖的还原性进行测定。测定还原性多糖的方法有3,5-二硝基水杨酸盐（DNS）比色法和Somogyi-Nelson法。另一类测定方法是利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质这一性质进行测定，这类方法有地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。苯酚-硫酸法是用得较多的方法，苯酚-硫酸试剂可与游离的单糖或寡糖、多糖中的己糖、戊糖及糖醛酸起显色反应，己糖在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。此法是先用标准糖制作标准曲线后，再通过多糖的显色反应测定吸光度，然后根据其在曲线上的位置推算出其含量。此法操作简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅需制作一条标准曲线。蒽酮-硫酸法是另一种常用的方法，其原理是利用糖类遇浓硫酸脱水后生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色深度与多糖的含量呈线性关系。
2.2.2.2纯度鉴定
将粗多糖各组份分离后，还要测定所得的各组份是否均一。多糖纯度标准不能用通常化合物的标准来衡量，因为即使多糖为纯品其微观也并不均一。测定多糖纯度方法有功能团分析、比旋光度、纸色谱和高效液相色谱、高压电泳、超滤离心分析法等，其中色谱法和电泳法较常用，并需用三种或以上的纯度鉴定方法证明才能保证为纯品。其中色谱法常用的有柱色谱和HPLC等；电泳鉴定纯度的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳和醋酸纤维膜电泳等。若为纯品，则在色谱柱中洗脱后得单一对称峰，电泳后会得单一斑点。
2.2.2.3相对分子质量测定
多糖的相对分子质量测定是研究多糖性质的一项较为重要的工作，因为多糖的性质往往与它的相对分子质量大小有关。常用于多糖相对分子质量测定的方法有凝胶色谱法、蒸汽压渗透计法、端基法、粘度法、光散射法、渗透压法和超滤
法等。凝胶色谱法是比较常用的方法。以Sephadex G-200、G-150或G-75装柱，以一定离子强度的氯化钠水溶液进行平衡，然后将各种不同的已知相对分子质量的多糖分别相继上柱，同一离子强度的氯化钠水溶液洗脱，分步收集，苯酚-硫酸法检测，分别求得洗脱体积（Ve），再将蓝色葡聚糖（Mr>200万）上同一根色谱柱，求出柱的空体积（Vo），根据Ve/Vo。与相对分子质量的对数之间存在着线性关系，可绘制标准曲线。最后，将待测样品按上述不变的条件上柱，求得待测多糖的Ve。通过标准曲线上的Ve/Vo，查得待测多糖的相对分子质量对数，便可求出相对分子质量；聚丙酰胺凝胶电泳也可用于多糖相对分子质量的测定。在测定过程中要注意标准品的选择，尽量使用与被测多糖结构相似的标准品，因为不同结构的标准品虽然其绝对分子质量相同，但在一定的条件下所表现的相对分子质量则有所不同。多糖相对分子质量的测定没有一种绝对的方法，其相对分子质量只代表相似链长的平均而不是确切的分子大小，往往用不同的方法会得到不同的相对分子质量。
2.2.2.4结构分析
由于分子生物学和分析技术的高速发展，多糖的分离和结构测定也取得了很大进展，糖化学家们利用化学、物理和生物学手段对多糖分子的结构和功能进行研究，而高新技术的发展使分析手段更快速、高效和灵敏，但化学分析法仍然是经典的方法。经典的化学分析方法主要有酸水解法、碱降解法、甲基化法、碘酸盐氧化法、、酶水解法等等。物理分析法主要有HPLC法、MS法、NMR法和红外光谱法等。生物学方法主要是酶学方法，即利用各种特异性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片段，再与其他定性、定量方法联用推测多糖的结构。目前，较为先进的酶学方法是试剂阵列分析方法（RAAM），由Edge等创立。它是利用一系列特定的外切糖苷酶的混合物对多糖或寡糖进行酶解，将酶解所得的片段分离，并通过其流体力学体积与计算机数据库中的数据进行比较，从而大大提高了多糖结构分析的速度和精度。另外，还有一种类似固相蛋白测序的技术，它首先将多糖或寡糖固定在一个固定载体上，再依次用糖苷酶作用，对每一种外切酶酶解下来的单糖进行定性、定量分析。
2.3多球壳菌素
多球壳菌素（ISP-1）具有显著的免疫抑制活性和抗动脉粥样硬化活性。杨
明静和徐红娟等[54,55]对蝉花中免疫抑制剂活性成分ISP-1进行了分离纯化研究，依次采用NKA大孔吸附树脂吸附、硅胶柱色谱系统，确定了蝉花ISP分离纯化的工艺为：选用NKA型非极性大孔吸附树脂进行纯化，上柱样品以1BV/h的速度流过树脂，待吸附平衡后，用4BV的水以2BV/h的速度淋洗树脂，再用4BV的50%乙醇以2BV/h的速度淋洗树脂，流出液弃之。然后用95%的乙醇溶液以1BV/h的流速进行洗脱，收集4BV的洗脱液。60℃减压浓缩至干，甲醇溶解，即得ISP类次生代谢产物甲醇溶液。经正丁醇萃取后，ISP的含量由35%上升到54.98%，达到蝉花免疫抑制有效部位的标准，再进一步通过硅胶柱色谱纯化得到单一活性成分。
三、蝉花生物活性物质的分离纯化
根据现有的资料，目前国内外对蝉花活性成分分离纯化的报道相对较少，并且主要集中在多糖、虫草素以及多球壳菌素（ISP-1）这几种活性成分上。温鲁等对蝉花活性成分进行了检测，测得蝉花中含多糖94.88mg/g，虫草素0.02mg/g，腺苷1.90mg/g，虫草酸78.57mg/g。Kuo等从9.7Kg的蝉花中纯化出15mg麦角固醇单体（纯度93.98%）。可见蝉花中具有较强生物活性的物质含量都很少，多则百分之几，少则百万分之几，甚至更少，所以在进行提取分离时尽量设法使蛋白质、色素等杂质不被提取出来，或在处理过程中尽可能的除去杂质，最后获得有效成分。
3.1 提取
由于还未确定蝉花的有效成分，所以应在药理或临床试验的配合下，先经不同溶剂提取，以确定有效部位，然后在逐步划分，追踪有效成分最集中的部位，最后分得有效活性单体。关于活性物质的粗提，我们通常采用不同极性的溶剂，由低极性到高极性按如下顺序分步提取：（1）石油醚，用来提取脂溶性大的化合物；（2）氯仿或乙酸乙酯，提取生物碱及中性成分；（3）丙酮、乙醇或甲醇，提取极性化合物，如生物碱的盐、苷类等；（4）水，提取水溶性化合物，如糖类、氨基酸等，进一步还可分为冷水、热水、酸水、碱水等步骤。这样，除了一些不溶性成分外，原料中的各类成分都能被提取出来。通过生物活性筛选，确定哪一部位有效以后，再进一步分离。
根据目前的研究，中药蝉花活性成分中有中等极性成分（如甾醇类等），也
有极性成分（如多糖、苷类等），所以总体来说极性溶剂（乙醇和水）的提取率应高于低极性溶剂（石油醚和乙酸乙酯）。所有提取物中都会含有较多的糖和蛋白质杂志。糖的含量随溶剂极性的变大而增高，石油醚提取物中含量最低，水提取物中含量最高。蛋白质的含量与溶剂的极性没有明显的关系。中等极性化合物应集中于乙酸乙酯提取物中，核苷类物质（腺苷和虫草素等）在乙醇提取物中含量丰富，多糖类活性物质在水提取物中。
3.2 分离纯化
确定有效部位后，对得到的活性物粗品需进一步的分离纯化。主要是借助色谱技术：（1）经典色谱技术，如吸附色谱（薄层色谱和柱色谱）、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱等，均可广泛地用于各类活性物的制备；（2）高效液相色谱（HPLC），用来分离微量的活性成分。
3.3提取、分离和纯化步骤
根据文献以及天然产物基本分离方法，初步拟定蝉花的分离提取流程见图6，称取干燥样品1Kg，机械粉碎，95%乙醇浸提3次，得到的固体残留物于通风处晾干备用。将乙醇提取液，浓缩成浸膏，溶于蒸馏水中，依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯各萃取三次，分别浓缩抽干，得到石油醚提取物（PE），氯仿提取物（CE）、乙酸乙酯提取物（EAE），剩余的水层也浓缩抽干得乙醇提取物（EE）。各个极性的提取物再经硅胶层析、凝胶层析和反相ODS柱进一步分离纯化。另外，晾干后的固体残留物，加蒸馏水，于75℃超声水浴中振荡，再重复提取两次，合并提取液，减压浓缩，离心，弃去残渣，上清液在不断搅拌下，缓缓加入三倍体积的95%乙醇，离心，弃去上清液，收集沉淀，沉淀以丙酮洗涤三次，真空干燥。产物加水溶解，乙醇沉淀，离心，丙酮洗涤，此复溶复沉过程重复三次，即得糖蛋白（GP）。取GP，用中性酶+Sevag法除蛋白6次得粗多糖CP，CP对交联葡聚糖凝胶Sephadex G-100进行层析分离。G系交联葡聚糖凝胶亲水性强，只能在水中溶胀（仅有极少数的有机溶剂可使之溶胀），有机溶剂或含有机溶剂较多的水溶液会改变其孔隙，使之收缩失去或降低凝胶的分离能力。在水中溶胀时，室温则需要较长的时间才能达到充分溶胀的程度，然而煮沸到100℃，可缩短其溶胀时间。交联葡聚糖凝胶Sephadex G-100根据其材料的性质，沸水浴中溶胀5小时即可使用。所得各分离组分，根据药理实验结果再确定进一步分离。
图6. 分离提取流程图
四、小结
确定和分析蝉花的特定生物活性成分及其药理作用，对蝉花的进一步开发是非常必要的。蝉花具有多种生物活性成分，药理作用广泛，是一种应用前景广阔的药食两用资源，并有与冬虫夏草相似的组分和功效，因此有人在临床上用蝉花代替冬虫夏草并积累了一些实践经验，有望将其开发为冬虫夏草的替代品。但是，目前大多数有关蝉花的研究是以原材料为主的药理方面的研究，而对其相关有效成分的实验研究尚少，应用方面的研究就更少，例如关于蝉花的发明专利能查到的仅有几篇，如“蝉花菌丝体胶囊剂及制备方法”（刘海全，上海医药工业研究院，2002年），“蝉花在制备治疗慢性肾功能衰竭的药物中的应用”（陈以平，上海中医药大学附属龙华医院，2002年）和“蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取物的提取分离方法”（毛先兵等，重庆市中药研究院，2008年），更无人工培养的高科技产品面世。所以我们对于蝉花的有效成分特别是生物活性物质的了解仍然有限， 因此很有必要对这些有效成分及其作用机理进行系统而深入的研究，从而有效的开发和利用我们丰富的蝉花资源，深入挖掘这一宝贵资源的潜力。
附：实验仪器、材料和试剂
1. 旋转蒸发仪
进口品牌：
德国 IKA，德国海道夫Heidolph
规格：0.25~3.0L 价格：2~3万元
国产品牌：
上海沪西，上海豫康，上海亚荣
规格：2L 价格：3000~4000元
规格：5L 价格：1~2万元
规格：10L 价格：2万元
规格：20L 价格：3万元
2. 真空泵
循环水式真空水泵： SHB-Ⅲ型 郑州长城科工贸有限公司 1000~2000元
隔膜真空泵： 瑞士BUCHI 2~3万
3. 低温冷却循环泵
品牌: 上海比朗
规格：可选
-20℃ 5L 价格：7000元
-20℃ 10L 价格：17000元
-40℃ 5L 价格：16000元
-40℃ 20L 价格：34000元
4. 中低压制备色谱仪
进口品牌：瑞士BUCHI 公司
适用于所有有机溶剂，耐酸碱
可选配：泵（单泵，双泵）、各规格色谱柱、紫外/可见检测器、自动馏分收集器 价格：10~30万
5. 自动部分收集器
品牌：上海沪西，上海嘉鹏，上海琪特
规格：收集试管100mL×16支， 12mL×100支，5mL×160支，30支无限量（外接容
器）
价格：4500元
6. 三用紫外分析仪
品牌：上海嘉鹏
规格：ZF-7型 价格：1600元
7. 超声波清洗仪
昆山市超声仪器有限公司
规格：可选
3L 价格：2500~3000元
6L 价格：4000~5000元
10L 价格：5500~6000元
8. 干燥箱
上海精宏实验设备有限公司
规格：+10~200℃ 400×400×450 价格：2000~3000元
+10~200℃ 500×600×750 价格：4000~5000元
9. 其他需要使用的仪器
HPLC：美国Waters公司，美国Agilent Technology
紫外/可见光分光光度计
IR：Avatar TM 360. E.S.P TM傅立叶转换分光光度计
NMR：Mercury plus 400型和AV 500型核磁共振光谱仪
ESI-MS：Micromass公司 Quatrro 质谱仪
10. 材料与试剂
柱层析：
青岛海洋化工厂柱层析硅胶（200～300目，300~ 400目）
Pharmacia公司Sephadex LH-20葡聚糖凝胶
Fuji公司ODS反相硅胶（20-45μm）
TLC硅胶板：
Merk公司RP-18F254s高效薄层层析板
Merk公司高效制备板
烟台江友硅胶开发有限公司薄层层析硅胶板
TLC显色剂：
10%硫酸乙醇溶液
生物碱试验试剂：Dragendorff试剂（碘化铋钾试剂）
试剂：除HPLC用色谱纯外，所用试剂均为是市售AR级试剂。
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蝉花生物活性物质研究
盖 悦 2010.01.26
蝉花(Cordyceps cicadae) 属虫生性药用真菌，是我国传统名贵中药材，又名蝉蛹草、蝉茸、胡蝉、蜩等，是蝉在土中的若虫被麦角菌科真菌的分生孢子寄生致死的带菌尸体，其在头部长菌丝形成的子座，形似花蕾故名蝉花，形态见图1。其药用始载于南北朝刘宋时代的《雷公炮炙论》。宋朝唐慎微所著《经史证类备急本草》言“蝉花味甘寒，无毒，主小儿天吊，惊痫，瘛疭，夜啼，心悸”。中医药学家认为， 蝉花具有疏散风热、透疹、熄风止痉、明目退翳之功效。现代医学研究表明，它具有免疫调节、改善机体营养状况、改善肾功能、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮等作用。由于蝉花与冬虫夏草均为虫菌复合体，都属于菌物界、真菌门、子囊菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，所以医家常认为蝉花是一种与冬虫夏草相近的珍贵药材，可作为冬虫夏草的代用品。近年国内外对中药蝉花的开发与应用进行了一些研究，现就此作一归纳总结。
图1. 天然蝉花的形态
一、蝉花主要生物活性成分及其药理作用
1.1多糖
多糖具有独特的生物活性，是许多中草药的主要活性物质，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗衰老等功效，近年来尤以免疫调节作用成为研究开发的热点。Kiho和Nagai[1]从蝉花中分离出半乳甘露聚糖C-3（galactomannan），它是一种水溶性多糖，相对分子量27000，由D-甘露糖和D-半乳糖以4:3比例组成，以20 mg/kg的剂量对小鼠S180肉瘤的抗肿瘤作用，结果抑制率为47%。迟秋阳和陈宝骥[2]等从蝉花中提取的多糖，以冬虫夏草多糖为阳性对照，对小鼠进行淋巴转化试验、Ea及E玫瑰花试验、特异性免疫玫瑰花试验、巨噬细胞吞噬试验、
抗绵羊红细胞抗体效价试验，结果表明蝉花多糖具有明显的提高免疫功能作用。Takano和Yahagi[3]从蝉花发酵液中分离出一种可以促进Th1免疫反应的蛋白多糖，该多糖可以增加大鼠派氏集合淋巴结细胞中白介素-2和干扰素-γ的浓度，并且通过毒理实验表明该蛋白多糖对大鼠没有毒副作用。
谭艾娟和立琨[4] 等报道蝉花发酵液中含有丰富的透明质酸（Hyaluronic acid，HA），达11.35 mg/mL。透明质酸是由乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸为结构单元的高分子非蛋白酸性粘多糖，由于保湿型强、生物相容性好，在高档化妆品中应用广泛，还常作为粘弹性保护剂用于眼科如眼球晶体移植手术、视网膜剥离手术、开放性玻璃体切除手术及青光眼手术等，也用于治疗类风湿性关节炎和骨性关节炎等疾病；此外，HA具有抗癌作用，可有效刺激免疫系统、阻止癌细胞扩散[5]。HA为蝉花的次级代谢产物，从蝉花发酵液中提取可以克服从动物组织中提取HA受原料限制的不足，又有利于蝉花的综合利用开发。
1.2 含氮类化合物
1.2.1 核苷类
蝉花中核苷类成分包括腺苷、虫草素、鸟苷、尿苷、腺嘌呤、鸟嘌呤等。 腺苷是一种嘌呤核苷，其含量是评价各种虫草内在质量的主要指标，结构见图2A。温鲁和唐玉玲[6]报道蝉花菌丝体中的腺苷含量为1.90 mg/g，约为冬虫夏草的4倍。腺苷涉及到中枢神经系统中不同生理过程的调节，能抑制中枢神经元的兴奋性，可以扩张冠状及周围血管、增加冠状动脉血流量、降低血压、减慢心率等作用，腺苷还具有抗血小板聚集、抗辐射和抗肿瘤等作用[7]。
虫草素作为第一个从真菌中分离出来的核苷类成分，为一种细胞毒性物质，结构见图2B。李瑞雪和胡飞[8]从蝉花菌丝体中测得虫草素的含量可达2.77 mg/g，远高于冬虫夏草，与蛹虫草含量相当。研究表明，虫草素有抗肿瘤、抗白血病、抗菌、免疫调节、清除体内自由基等多方面的药理作用。虫草素对膀胱癌、肾癌、结肠癌以及纤维胚胎细胞瘤具有抗癌活性，对鼠艾氏腹水癌、人鼻咽癌KB细胞、人表皮样疣、人宫颈癌Hela细胞、Lewis肺癌等具有明显的控制作用，对多种实体恶性肿瘤有很强的抑制作用[9-13]。虫草素可引起白血病细胞的凋亡和有丝分裂细胞S、G2期的延长[14]。美国1997年将虫草素用于I期临床实验，治疗急性前B和前T淋巴细胞白血病患者[15]。上海国宝生物工程研究所同交通大学附属儿
童医院合作，对用虫草素、多糖合剂白血病患者的治疗效果进行了观察研究。结果证实，虫草素能显著增强细胞免功能和巨噬细胞吞噬能力，刺激血液中补体和抗体的生成，增加血中免疫球蛋白数量，促进强化疗后受损的细胞免疫恢复，提高机体的抗感染能力，从而增强疗效[9]。虫草素能抑制病毒的RNA合成，对枯草杆菌、鸟结核杆菌、牛型结核分枝杆菌、梭菌、链球菌、鼻疽杆菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌及石膏样小芽饱癣菌等均有一定抑制作用，还现出一定的抗真菌、抗HIV-I型病毒活性，但以对枯草杆菌的抑制作用最强[9, 16, 17]。作为一种新型的广谱抗菌素，虫草素以其特有的抗菌、抗病毒活性，引起全球科技发达国家的高度重视。体外试验证实，虫草素能明显促进人外周血单核细胞释放IL-10，同时抑制IL-2产生，从而对人体自身免疫性疾病、炎性疾病发挥潜在的治疗作用，使机体免受过度的免疫病理损伤[18]。还有研究表明，虫草素能诱导机体成熟树突状细胞调节性T细胞增殖，因而能增强自身免疫性疾病的治疗效果[19, 20]。
柴一秋和韦忠民[21,22]从蝉花的人工固体或液体发酵培养物中提取得到N6-(2-羟乙基)腺苷[N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine]，该化合物也是一种腺苷衍生物，是虫草的特有成分，已用它作为虫草制品的质量控制指标之一。N6-(2-羟乙基)腺苷通过与α受体结合抑制了神经递质释放而产生镇痛作用，其镇痛机理不同于目前常用的阿片类镇痛剂，不具有成瘾性，安全，用小鼠扭体法测定有99%的镇痛率。另外，Furuya和Hirotani[23]研究显示N6-(2-羟乙基)腺苷具有Ca2+拮抗作用和肌肉收缩活性，可能对心率失常、心肌缺血、心绞痛、高血压、血栓等心血管系统疾病有作用。
A. Cordycepin B. Adenosine
图2. 虫草素和腺苷的结构式
1.2.2 环肽化合物
Duarte N等[24]从蝉花中分离得五种环肽化合物，分别为白僵菌酮（Bassiatin）、
白僵菌酮甲（Bassiatin A）、白僵菌素（Beauvericin）、白僵菌素甲（Beauvericin A）、白僵菌素乙（Beauvericin B），结构见图3。白僵菌酮和白僵菌酮甲具有相似的药理作用，为一种新型的血小板凝聚抑制剂，均对ADP诱导的兔血小板凝聚有明显的抑制作用(IC50=1.9×10-4 mol/L)[25]。药理实验结果显示白僵菌素类成分具有抗肿瘤、抗惊厥、抗心律失常、镇静等作用[26]。
A.白僵菌酮 B. 白僵菌酮甲 C.白僵菌素类化合物
（白僵菌素，R1及R2均为CH3；白僵菌素甲，R1为CH3，R2为CH2CH3；
白僵菌素乙，R1及R2均为CH2CH3）
图3. 环肽化合物的结构式
1.3 甾醇类化合物
Kuo和Lin[27]从蝉花菌丝体中分离出麦角固醇（Ergosterol）和麦角固醇过氧化物（Ergosterol peroxide），结构见图4。麦角固醇是真菌类细胞膜上重要的固醇类，在虫草类真菌中含量相对稳定，通常作为质量控制指标之一，具有抗氧化能力，且为维生素D2的前驱物，具有重要的药理作用。Kuo和Weng[28]报道麦角固醇过氧化物具有抑制肿瘤生长及抗炎的活性以及抗动脉粥样硬化的作用，可抑制植物血球凝聚素（PHA）活化的人T细胞分化与增殖。
图4. 麦角固醇过氧化物
1.4 多球壳菌素
Fujita等[29]通过免疫抑制细胞模型从蝉花培养滤液中筛选获得活性成分多球
壳菌素（ISP-1），即(2S,3R, 4R) - 2 - amino - 3, 4 - dihydroxy -2- hydroxymethyl -14- oxoeicos -6- enoic acid，myriocin / thermozymocidin，结构式见图5。药理研究表明，多球壳菌素具有显著的双向免疫调节作用，能阻断白介素-2受体以下的途径，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）活性，从而特异性抑制T细胞的增殖；多球壳菌素对同种细胞障碍性T细胞的诱导均有很强的抑制活性，在这些方面比环孢菌素A强10~100倍；Miyake[30]也报道了在同种混合淋巴球混合反应方面，多球壳菌素也比临床广泛应用的环孢菌素显示更强的活性。付德才和郑汝娜[31]对多球壳菌素进行构效关系的研究及结构改造与优化后获得FTY720，具有独特的化学结构和药理作用机制、毒副作用小等特点，显示了良好的临床应用前景，有望成为新一代的免疫抑制剂而广泛用于器官移植和自身免疫性疾病的治疗等。
另外，Hojjati和Li[32]报道多球壳菌素可抑制动脉粥样硬化形成，利用多球壳菌素抑制鞘脂类合成的关键酶——丝氨酸棕榈酰转移酶的机理，连续60天对8周龄的动脉粥样硬化的大鼠每隔一天注射浓度为0.3 mg/kg多球壳菌素，结果显示多球壳菌素对鞘脂类的合成有明显的抑制作用，该大鼠动脉硬化损伤面积明显减少，因此，多球壳菌素抑制SPT活性可能作为治疗动脉粥样硬化的一个选择。肖朝华和周建华[33]利用高糖模拟糖尿病病人体内的高糖环境，探讨多球壳菌素在糖尿病肾病肾脏肥大和早起肾硬化过程中所起的作用，结果表明多球壳菌素不但可有效抑制肾小球系膜细胞系肥大，并能明显减少细胞外基质分泌，因此有望将其用于包括糖尿病肾病在内的肾小球硬化的治疗[34]。
图5 . 多球壳菌素（ISP-1）的结构式
1.5虫草酸
蝉花中含有较高浓度的虫草酸（甘露醇），温鲁和唐玉玲[35]检测出蝉花中的虫草酸含量达78.57 mg/g，高于冬虫夏草和蛹虫草。据药理研究及临床试验表明，虫草酸具有平喘祛痰、利尿、提高血浆渗透压、抗氧化等作用，对多种疾病有一定疗效。2006年10月，Pharmaxis制药公司在澳大利亚注册上市了慢性肺部疾
病治疗药Bronchitol，该药有效成分就为虫草酸。近年，人们还逐渐认识到虫草酸的一些独特生理功能，如食用后不引起血糖水平波动，不引起牙齿龋变及具有低热值等特性，虫草酸作为甜味剂和食品添加剂的用量在世界范围内迅速增加虫草酸的含量与蝉花内在质量存在一定关系，值得进一步研究和开发利用。
1.6 其它
除以上所述之外，蝉花还具有其他的药用价值，对其相应的活性成分值得进一步研究。宋捷民和忻家础[36]实验表明蝉花具有明显的抗失血性贫血和抗盐酸苯肼贫血作用，对于失血性贫血的RBC、Hb和盐酸苯肼贫血的RBC高剂量组效果优于低剂量组，呈现明显的量效关系，且高剂量组的作用与阿胶组相似。周金慧和陈以平[37]报道，以蝉花菌丝体进行临床研究，表明其具有降低血、尿肌酐，提高内生肌酐清除率，改善血清蛋白含量，减少尿蛋白的排出等功能。因此，对早、中期慢性肾功能不全患者疗效确切。经进一步研究证实：蝉花对肾间质小管病变有较好疗效，能保护肾小管细胞Na+-K+-ATP酶，减轻细胞溶酶体和细胞脂质过氧化损伤，改善肾血流动力学，减轻内皮细胞损伤和血液凝固性。
二、多糖及虫草素的化学研究
综合文献，现将国内研究最多的多糖、虫草素和多球壳菌素的研究成果做一简要介绍。
2.1 虫草素
早在1951年，德国的Cunningham等就从我国传统中药蛹虫草（Cordyceps militaris (L.) Link）的培养滤液中分离发现虫草素（Cordycepin）[38]。虫草素为腺苷（Adenosine）的类似物，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，为一种细胞毒性物质。随后，在20世纪70年代国外就发现虫草素有抑制肿瘤作用，但虫草素在体内的快速代谢和虫草素昂贵的生产成本限制了其进一步的研究和开发利用[39]。20世纪90年代，国外研究发现添加腺苷脱氨酶（ADA）抑制剂对虫草素抗肿瘤活性的表达起着重要作用；同时，国内外在虫草素生产技术方面取得了一定的进步从而使虫草素的研究获得突破性进展。
2.1.1 虫草素的提取
虫草素在蛹虫草中含量比在蝉花及冬虫夏草中含量高得多，因此虫草素一般从蛹虫草子实体中提取。温鲁、凌建亚和申小兵等认为，用水作溶剂，在超声波
振荡器中震荡提取，效果最好[40-42]。鞠建明等认为，用50%甲醇为提取溶剂，超声提取30min效果最好[43]。张嘉等选择的最佳提起方法为用75%乙醇超声波提取3次，每次提取40min，料液比为1:20[44]。王英娟等采用水热回流法提取虫草多糖和虫草素，方法为：用10倍量的水于80℃热回流提取3次，每次90min[45]。
2.1.2 虫草素的纯化工艺
报道的从蛹虫草子实体中提取纯化虫草素的方法有多种。车振明等的提取纯化工艺为：先用水进行加温震荡提取，将提取液用乙醇沉淀去除蛋白质，用活性炭吸附除去色素等杂质，然后上732-阳离子交换色谱柱进行柱层析，洗脱液进行结晶得到虫草素纯品[46]。汪宇等的提取纯化工艺为：50%乙醇80℃水浴恒温浸提，浓缩，用二氯甲烷萃取，上硅胶柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，最后用甲醇和乙醇结晶得到产品[47]。潘中华等的提取纯化工艺为：先将原料用石油醚脱脂、80℃水浴提取10小时、调节等电点沉淀除去蛋白质、732-NH4离子交换树脂分离、浓缩结晶得到产品[48]。
2.1.3 虫草素的检测方法
虫草菌素的检测方法比较多，HPLC是使用最普遍的方法。一般均采用反相色谱法，多数以十八烷基键合硅胶为固定相，有的用甲醇-水（85:15）、甲醇-pH6.5的磷酸盐缓冲液（17:3）、或乙腈-水（90:10）作为流动相进行等度洗脱[49-52]，有的用甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（10:90）、或甲醇-pH=6.86（加1%四氢呋喃）磷酸缓冲溶液（15:85）作流动相进行等度洗脱，也有的用水和乙腈作流动相进行梯度洗脱[53,47]。以上各不同方法流动相的流量一般均控制在0.8-lmL/min，检测波长260nm，进样量一般控制在5-10μL。
此外，也有研究者用紫外分光光度法和毛细管电泳法来测定虫草索的含量。但虫草样品中多数都同时含有虫草素和腺苷，此二者的分子结构相近(仅在戊糖上有微小差异)，具有相同的紫外吸收基团-腺嘌呤，它们的UVλmax均在260nm左右。如果以260nm作为检测波长来测定虫草素含量，就无法排除腺苷等分子结构相近的其它核苷酸的干扰，从而导致检测值比实际值偏大。因此用紫外分光光度法来测定分析生物样品中虫草素含量是不可行的。而毛细管电泳法与HPLC比较，虽然毛细管电泳法具有分辨率高、操作简便、不需要昂贵的有机试剂和预装柱等优点，但其在进样准确性、迁移时间的重现性、检测灵敏度等方面都不如
HPLC。因此，检测生物样品中的微量虫草素含量还是以用HPLC法为佳。
2.2 多糖
多糖是存在于自然界的醛糖和（或）酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物，也是一切有生命的有机体必不可少的成分，它与维持生命的种种生理机能有着密切的联系。近年来，来源于菌类的多糖成分已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，它们所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相继被发现。多糖具有复杂的结构，这是因为它们具有许多不同的单糖残基、不同的连接位置和不同类型的糖苷键，能形成具有不同的构象、不同的相对分子质量，以及链内和链间氢键的二级结构。由于多糖的生物活性与其纯度和化学结构即糖苷键的不同连接方式以及高级结构密切相关，高级结构在活性方面比一级结构起更大作用，因此对多糖的研究开发包含了分离、纯化、结构分析、活性测定及结构修饰。
2.2.1 多糖的提取、分离与纯化
2.2.1.1预处理
在提取之前先以石油醚、乙醚等有机溶剂除去脂溶性杂质，再用85-95%乙醇除去单糖、低聚糖及苷类等干扰性成分，这样处理至少三次及以上方可除尽杂质。
2.2.1.2提取
多糖通常以水作溶剂来提取，可以用水煮提取，也可以用冷水浸提。水提取的多数是中性多糖，而用弱碱性水溶液可以提取含有糖醛酸的多糖，应注意的是在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，提取时应尽量避免酸性条件。对于糖蛋白，可利用加酶提取法，如在提取液中加入胶酶等单酶或双酶；或者用复合酶法，在水溶液中先加入中性链蛋白酶、果胶酶和纤维素酶酶解后提取多糖。根据多糖的溶解性可以用超滤离心分离法提取多糖；或利用多糖不溶于高浓度的乙醇的性质，以沉淀提纯多糖，但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组份的分级分离。
2.2.1.3除蛋白
用醇析所获得的粗多糖常含有较多的蛋白质，需要除蛋白。除蛋白的方法传统上有Sevag法、三氟三氯乙烷法及三氯乙酸-正丁醇法等。Sevag法是用得最多
的方法，该方法是将多糖的水溶液与氯仿混合，并震摇成乳化液，此时蛋白质变性成胶状，离心后蛋白层存在于有机相和水相之间。为了加速蛋白质的变性，最好用pH=4~5的缓冲溶液代替水，并加少量正丁醇或正戊醇，或将氯仿与正丁醇按体积比5:1加入糖液1份中振摇后离心去蛋白质。另外，也可以利用蛋白酶可水解蛋白质的特性，在多糖的水提液中加入中性蛋白酶和糜蛋白酶，与Sevag法结合进行脱蛋白；或将蛋白酶与三氯乙酸法结合除蛋白。有机溶剂与蛋白酶结合的方法效率要高得多，节省许多试剂和资金。但是应该要注意的是，蛋白酶的加入量要适当，否则会增加除蛋白的难度。除蛋白的效果可以用茚三酮反应检测，结果呈阴性；同时在200~280nm处测定除蛋白后样品的紫外吸收曲线来检测效果，除掉蛋白质的多糖溶液一般在260~280nm的紫外吸收峰会消失，说明多糖不含有蛋白质。
2.2.1.4除色素
在多糖提取过程中，由于氧化作用会有色素生成，色素的存在会影响多糖的色谱分析和性质测定。可以用食品级粉末状活性炭吸附，也可以用H2O2对色素的有色基团产生破坏而除去色素，还可以用大孔吸附或阴离子交换树脂柱层析脱去色素，同时这个方法还可以使多糖混合组分初步分离。
2.2.1.5分离与纯化
样品中一般会存在多种多糖，因此要获取均一多糖需要对多糖混合物进行分级并纯化。最简单有效的方法是利用多糖在乙醇中的溶解度的不同进行分离。向粗多糖饱和水溶液中加入乙醇，使乙醇的最终浓度依次达到40%、60%、70%和80%，离心每次所得沉淀，可将粗多糖分成五个等级。但是，乙醇沉淀不一定得到纯的多糖，要得到均一多糖还需要用更加精细的方法，例如色谱、电泳、超滤等技术进行分离纯化。最常用的纯化多糖的方法是色谱法，包括离子交换色谱和凝胶色谱等。色谱法是利用填料对不同种类的糖如不同构型的吡喃糖苷及呋喃糖苷在吸附作用上的差异，使混合物中各糖分达到彼此分离的目的。根据不同的多糖特性选用不同的色谱柱。其中，离子交换色谱要注意树脂类型和粒度、洗脱剂种类、pH值和洗脱速率、分离温度和分离柱的径高比等，洗脱剂的选择可以根据多糖的酸碱性进行调节。凝胶色谱中用的比较多的是交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，主要是利用了分子筛的原理。影响凝胶分离的因素主要是凝胶类型和
粒度、洗脱剂种类、pH值和洗脱速率、分离温度和分离柱的径高比等。实验中对多糖进行分级时，常将粗多糖经色谱柱洗脱，按洗脱曲线的不同峰收集不同的组份，从而分级得到各个均一多糖组份。
2.2.2多糖的理化性质测定
2.2.2.1多糖的含量测定
多糖含量是利用糖的还原性进行测定。测定还原性多糖的方法有3,5-二硝基水杨酸盐（DNS）比色法和Somogyi-Nelson法。另一类测定方法是利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质这一性质进行测定，这类方法有地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。苯酚-硫酸法是用得较多的方法，苯酚-硫酸试剂可与游离的单糖或寡糖、多糖中的己糖、戊糖及糖醛酸起显色反应，己糖在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。此法是先用标准糖制作标准曲线后，再通过多糖的显色反应测定吸光度，然后根据其在曲线上的位置推算出其含量。此法操作简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅需制作一条标准曲线。蒽酮-硫酸法是另一种常用的方法，其原理是利用糖类遇浓硫酸脱水后生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色深度与多糖的含量呈线性关系。
2.2.2.2纯度鉴定
将粗多糖各组份分离后，还要测定所得的各组份是否均一。多糖纯度标准不能用通常化合物的标准来衡量，因为即使多糖为纯品其微观也并不均一。测定多糖纯度方法有功能团分析、比旋光度、纸色谱和高效液相色谱、高压电泳、超滤离心分析法等，其中色谱法和电泳法较常用，并需用三种或以上的纯度鉴定方法证明才能保证为纯品。其中色谱法常用的有柱色谱和HPLC等；电泳鉴定纯度的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳和醋酸纤维膜电泳等。若为纯品，则在色谱柱中洗脱后得单一对称峰，电泳后会得单一斑点。
2.2.2.3相对分子质量测定
多糖的相对分子质量测定是研究多糖性质的一项较为重要的工作，因为多糖的性质往往与它的相对分子质量大小有关。常用于多糖相对分子质量测定的方法有凝胶色谱法、蒸汽压渗透计法、端基法、粘度法、光散射法、渗透压法和超滤
法等。凝胶色谱法是比较常用的方法。以Sephadex G-200、G-150或G-75装柱，以一定离子强度的氯化钠水溶液进行平衡，然后将各种不同的已知相对分子质量的多糖分别相继上柱，同一离子强度的氯化钠水溶液洗脱，分步收集，苯酚-硫酸法检测，分别求得洗脱体积（Ve），再将蓝色葡聚糖（Mr>200万）上同一根色谱柱，求出柱的空体积（Vo），根据Ve/Vo。与相对分子质量的对数之间存在着线性关系，可绘制标准曲线。最后，将待测样品按上述不变的条件上柱，求得待测多糖的Ve。通过标准曲线上的Ve/Vo，查得待测多糖的相对分子质量对数，便可求出相对分子质量；聚丙酰胺凝胶电泳也可用于多糖相对分子质量的测定。在测定过程中要注意标准品的选择，尽量使用与被测多糖结构相似的标准品，因为不同结构的标准品虽然其绝对分子质量相同，但在一定的条件下所表现的相对分子质量则有所不同。多糖相对分子质量的测定没有一种绝对的方法，其相对分子质量只代表相似链长的平均而不是确切的分子大小，往往用不同的方法会得到不同的相对分子质量。
2.2.2.4结构分析
由于分子生物学和分析技术的高速发展，多糖的分离和结构测定也取得了很大进展，糖化学家们利用化学、物理和生物学手段对多糖分子的结构和功能进行研究，而高新技术的发展使分析手段更快速、高效和灵敏，但化学分析法仍然是经典的方法。经典的化学分析方法主要有酸水解法、碱降解法、甲基化法、碘酸盐氧化法、、酶水解法等等。物理分析法主要有HPLC法、MS法、NMR法和红外光谱法等。生物学方法主要是酶学方法，即利用各种特异性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片段，再与其他定性、定量方法联用推测多糖的结构。目前，较为先进的酶学方法是试剂阵列分析方法（RAAM），由Edge等创立。它是利用一系列特定的外切糖苷酶的混合物对多糖或寡糖进行酶解，将酶解所得的片段分离，并通过其流体力学体积与计算机数据库中的数据进行比较，从而大大提高了多糖结构分析的速度和精度。另外，还有一种类似固相蛋白测序的技术，它首先将多糖或寡糖固定在一个固定载体上，再依次用糖苷酶作用，对每一种外切酶酶解下来的单糖进行定性、定量分析。
2.3多球壳菌素
多球壳菌素（ISP-1）具有显著的免疫抑制活性和抗动脉粥样硬化活性。杨
明静和徐红娟等[54,55]对蝉花中免疫抑制剂活性成分ISP-1进行了分离纯化研究，依次采用NKA大孔吸附树脂吸附、硅胶柱色谱系统，确定了蝉花ISP分离纯化的工艺为：选用NKA型非极性大孔吸附树脂进行纯化，上柱样品以1BV/h的速度流过树脂，待吸附平衡后，用4BV的水以2BV/h的速度淋洗树脂，再用4BV的50%乙醇以2BV/h的速度淋洗树脂，流出液弃之。然后用95%的乙醇溶液以1BV/h的流速进行洗脱，收集4BV的洗脱液。60℃减压浓缩至干，甲醇溶解，即得ISP类次生代谢产物甲醇溶液。经正丁醇萃取后，ISP的含量由35%上升到54.98%，达到蝉花免疫抑制有效部位的标准，再进一步通过硅胶柱色谱纯化得到单一活性成分。
三、蝉花生物活性物质的分离纯化
根据现有的资料，目前国内外对蝉花活性成分分离纯化的报道相对较少，并且主要集中在多糖、虫草素以及多球壳菌素（ISP-1）这几种活性成分上。温鲁等对蝉花活性成分进行了检测，测得蝉花中含多糖94.88mg/g，虫草素0.02mg/g，腺苷1.90mg/g，虫草酸78.57mg/g。Kuo等从9.7Kg的蝉花中纯化出15mg麦角固醇单体（纯度93.98%）。可见蝉花中具有较强生物活性的物质含量都很少，多则百分之几，少则百万分之几，甚至更少，所以在进行提取分离时尽量设法使蛋白质、色素等杂质不被提取出来，或在处理过程中尽可能的除去杂质，最后获得有效成分。
3.1 提取
由于还未确定蝉花的有效成分，所以应在药理或临床试验的配合下，先经不同溶剂提取，以确定有效部位，然后在逐步划分，追踪有效成分最集中的部位，最后分得有效活性单体。关于活性物质的粗提，我们通常采用不同极性的溶剂，由低极性到高极性按如下顺序分步提取：（1）石油醚，用来提取脂溶性大的化合物；（2）氯仿或乙酸乙酯，提取生物碱及中性成分；（3）丙酮、乙醇或甲醇，提取极性化合物，如生物碱的盐、苷类等；（4）水，提取水溶性化合物，如糖类、氨基酸等，进一步还可分为冷水、热水、酸水、碱水等步骤。这样，除了一些不溶性成分外，原料中的各类成分都能被提取出来。通过生物活性筛选，确定哪一部位有效以后，再进一步分离。
根据目前的研究，中药蝉花活性成分中有中等极性成分（如甾醇类等），也
有极性成分（如多糖、苷类等），所以总体来说极性溶剂（乙醇和水）的提取率应高于低极性溶剂（石油醚和乙酸乙酯）。所有提取物中都会含有较多的糖和蛋白质杂志。糖的含量随溶剂极性的变大而增高，石油醚提取物中含量最低，水提取物中含量最高。蛋白质的含量与溶剂的极性没有明显的关系。中等极性化合物应集中于乙酸乙酯提取物中，核苷类物质（腺苷和虫草素等）在乙醇提取物中含量丰富，多糖类活性物质在水提取物中。
3.2 分离纯化
确定有效部位后，对得到的活性物粗品需进一步的分离纯化。主要是借助色谱技术：（1）经典色谱技术，如吸附色谱（薄层色谱和柱色谱）、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱等，均可广泛地用于各类活性物的制备；（2）高效液相色谱（HPLC），用来分离微量的活性成分。
3.3提取、分离和纯化步骤
根据文献以及天然产物基本分离方法，初步拟定蝉花的分离提取流程见图6，称取干燥样品1Kg，机械粉碎，95%乙醇浸提3次，得到的固体残留物于通风处晾干备用。将乙醇提取液，浓缩成浸膏，溶于蒸馏水中，依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯各萃取三次，分别浓缩抽干，得到石油醚提取物（PE），氯仿提取物（CE）、乙酸乙酯提取物（EAE），剩余的水层也浓缩抽干得乙醇提取物（EE）。各个极性的提取物再经硅胶层析、凝胶层析和反相ODS柱进一步分离纯化。另外，晾干后的固体残留物，加蒸馏水，于75℃超声水浴中振荡，再重复提取两次，合并提取液，减压浓缩，离心，弃去残渣，上清液在不断搅拌下，缓缓加入三倍体积的95%乙醇，离心，弃去上清液，收集沉淀，沉淀以丙酮洗涤三次，真空干燥。产物加水溶解，乙醇沉淀，离心，丙酮洗涤，此复溶复沉过程重复三次，即得糖蛋白（GP）。取GP，用中性酶+Sevag法除蛋白6次得粗多糖CP，CP对交联葡聚糖凝胶Sephadex G-100进行层析分离。G系交联葡聚糖凝胶亲水性强，只能在水中溶胀（仅有极少数的有机溶剂可使之溶胀），有机溶剂或含有机溶剂较多的水溶液会改变其孔隙，使之收缩失去或降低凝胶的分离能力。在水中溶胀时，室温则需要较长的时间才能达到充分溶胀的程度，然而煮沸到100℃，可缩短其溶胀时间。交联葡聚糖凝胶Sephadex G-100根据其材料的性质，沸水浴中溶胀5小时即可使用。所得各分离组分，根据药理实验结果再确定进一步分离。
图6. 分离提取流程图
四、小结
确定和分析蝉花的特定生物活性成分及其药理作用，对蝉花的进一步开发是非常必要的。蝉花具有多种生物活性成分，药理作用广泛，是一种应用前景广阔的药食两用资源，并有与冬虫夏草相似的组分和功效，因此有人在临床上用蝉花代替冬虫夏草并积累了一些实践经验，有望将其开发为冬虫夏草的替代品。但是，目前大多数有关蝉花的研究是以原材料为主的药理方面的研究，而对其相关有效成分的实验研究尚少，应用方面的研究就更少，例如关于蝉花的发明专利能查到的仅有几篇，如“蝉花菌丝体胶囊剂及制备方法”（刘海全，上海医药工业研究院，2002年），“蝉花在制备治疗慢性肾功能衰竭的药物中的应用”（陈以平，上海中医药大学附属龙华医院，2002年）和“蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取物的提取分离方法”（毛先兵等，重庆市中药研究院，2008年），更无人工培养的高科技产品面世。所以我们对于蝉花的有效成分特别是生物活性物质的了解仍然有限， 因此很有必要对这些有效成分及其作用机理进行系统而深入的研究，从而有效的开发和利用我们丰富的蝉花资源，深入挖掘这一宝贵资源的潜力。
附：实验仪器、材料和试剂
1. 旋转蒸发仪
进口品牌：
德国 IKA，德国海道夫Heidolph
规格：0.25~3.0L 价格：2~3万元
国产品牌：
上海沪西，上海豫康，上海亚荣
规格：2L 价格：3000~4000元
规格：5L 价格：1~2万元
规格：10L 价格：2万元
规格：20L 价格：3万元
2. 真空泵
循环水式真空水泵： SHB-Ⅲ型 郑州长城科工贸有限公司 1000~2000元
隔膜真空泵： 瑞士BUCHI 2~3万
3. 低温冷却循环泵
品牌: 上海比朗
规格：可选
-20℃ 5L 价格：7000元
-20℃ 10L 价格：17000元
-40℃ 5L 价格：16000元
-40℃ 20L 价格：34000元
4. 中低压制备色谱仪
进口品牌：瑞士BUCHI 公司
适用于所有有机溶剂，耐酸碱
可选配：泵（单泵，双泵）、各规格色谱柱、紫外/可见检测器、自动馏分收集器 价格：10~30万
5. 自动部分收集器
品牌：上海沪西，上海嘉鹏，上海琪特
规格：收集试管100mL×16支， 12mL×100支，5mL×160支，30支无限量（外接容
器）
价格：4500元
6. 三用紫外分析仪
品牌：上海嘉鹏
规格：ZF-7型 价格：1600元
7. 超声波清洗仪
昆山市超声仪器有限公司
规格：可选
3L 价格：2500~3000元
6L 价格：4000~5000元
10L 价格：5500~6000元
8. 干燥箱
上海精宏实验设备有限公司
规格：+10~200℃ 400×400×450 价格：2000~3000元
+10~200℃ 500×600×750 价格：4000~5000元
9. 其他需要使用的仪器
HPLC：美国Waters公司，美国Agilent Technology
紫外/可见光分光光度计
IR：Avatar TM 360. E.S.P TM傅立叶转换分光光度计
NMR：Mercury plus 400型和AV 500型核磁共振光谱仪
ESI-MS：Micromass公司 Quatrro 质谱仪
10. 材料与试剂
柱层析：
青岛海洋化工厂柱层析硅胶（200～300目，300~ 400目）
Pharmacia公司Sephadex LH-20葡聚糖凝胶
Fuji公司ODS反相硅胶（20-45μm）
TLC硅胶板：
Merk公司RP-18F254s高效薄层层析板
Merk公司高效制备板
烟台江友硅胶开发有限公司薄层层析硅胶板
TLC显色剂：
10%硫酸乙醇溶液
生物碱试验试剂：Dragendorff试剂（碘化铋钾试剂）
试剂：除HPLC用色谱纯外，所用试剂均为是市售AR级试剂。
参考文献：
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