第３５卷第９期
太阳能学报
Ｖ０１．３５．Ｎｏ．９
２０１４年９月
ＡＣＴＡＥＮＥＲＧＩＡＥＳＯＬＡＲＩＳＳＩＮＩＣＡ
Ｓｅｐ．，２０１４
文章编号：０２５４．００９６（２０１４）０９．１７０８．０７
脂肪酶产生菌种的筛选鉴定及产酶条件优化
苗长林１，罗
文１，吕鹏梅１，李惠文１，杨玲梅１，袁振宏１，蒋剑春２
（１．中国科学院广州能源研究所，中国科学院可再生能源与天然气水合物重点实验室，广州５１０６４０；
２．中国林业科学研究院林产化学工业研究所，南京２１００４２）
摘要：从富油土壤中分离筛选到一株脂肪酶产生菌Ｍ－４，通过对Ｍ．４进行形态和ｒＤＮＡＩＴＳ序列鉴定，确定其属于酵母菌Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ
ｓｔｒａｉｎ。通过正交试验设计对该菌株进行产酶条件探索，得出其摇瓶培养最适产酶
条件为：种子培养时间为９０ｈ，最佳发酵培养基碳源为葡萄糖２％＋橄榄油３％，氮源为５％酵母膏，初始ｐＨ值为７．０，发酵温度为３０℃，在此条件下的产酶可达１２．２
Ｕ／ｍＬ。
关键词：脂肪酶；筛选；鉴定；培养条件；正交试验中图分类号：Ｑ９３—３３１
文献标识码：Ａ
０
引
言
脂肪酶产生菌的筛选及应用，国内外已有大量相关
研究，舒正玉等ｎ叫从ＣＮＫＩ、ＮＣＢＩ、ＡＣＳ、Ｂｌａｅｋｗｅｌｌ、
脂肪酶（Ｌｉｐａｓｅ）又名三酰甘油酯水解酶，能在
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｋｌｕｗｅｒ、ＳｐｒｉｎｇｅｒＬｉｎｋ、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ等
油水界面催化三酰甘油酯水解，在有机相中催化酯
文献数据库，共检索出８７篇脂肪酶催化生产生物化及转酯等反应。脂肪酶广泛存在于动物组织和
柴油工艺的研究文献，比较分析发现，Ｃａｎｄｉｄａ微生物中，工业上主要采用微生物发酵制备和提取ａｎｔａｒｃｔｉｃａ脂肪酶Ｂ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ脂肪酶、
脂肪酶…，并将其应用于食品加工、油脂水解、皮革Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ脂肪酶、Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ脂肪酶和
绢纺原料脱脂、医药、化妆品、洗涤剂、生物柴油等
Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ
ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ脂肪酶等在生物柴油生产
领域㈨。
中具有广泛应用，其脂肪酶活性在１００Ｕ／ｍＬ以
生物柴油是由动、植物油脂与甲醇（或乙醇）经上ｎ“川。但这些具有高催化活性的脂肪酶大多被国酯化或酯交换反应而得到的长链脂肪酸甲（乙）酯，
外如丹麦诺维信公司、美国杰能科国际、日本天野
是一种可替代普通柴油的清洁燃料ｂ＇“。它基本不酶制品株式会社、美国Ｓｉｇｍａ公司、德国Ｍｅｒｃｋ公司
含硫和芳烃，可被生物降解，无毒、对环境无害，作等所垄断，且价格昂贵［１…。而国内目前有文献报道
为可再生清洁能源１３益受到广泛关注。目前，生产
仅有北京化工大学ｎ５｜、清华大学ｎ引等利用自制的脂生物柴油的主要生产方法包括酶促合成法、固体酸
肪酶催化生产生物柴油，市场上尚无专门用于生物
碱法、离子液体法、离子交换树脂法和超临界甲醇柴油生产的国产脂肪酶商品，国内需要的脂肪酶仍法等ｂ“３。其中酶促合成法合成生物柴油具有条件依赖进口ｎ“。因此，寻找适于工业化生产的高产菌温和、醇用量小，无污染物排放等优点，成为生物柴
株，开发出满足我国生物柴油生产用脂肪酶，对解
油研究工作者关注的焦点。但由于生物柴油生产决制约我国酶法生产生物柴油产业发展具有重要中所需脂肪酶价格昂贵，且低碳醇对酶有毒性，致
意义。
使酶失活严重等原因而使其工业化应用受到较大
本研究从富含油脂的土壤中筛选得到４株产影响。
脂肪酶菌种，其中活性较高的菌株Ｍ一４经分类鉴定因此，筛选活性高、稳定性好的脂肪酶产生菌，成发现其为Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ
ｓｔｒａｉｎ。以菜籽
为促进酶法生产生物柴油产业发展的研究热点阳１。
油为原料进行初步研究，发现其能催化生产生物柴
收稿日期：２０１２．０７．０３
基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题（２０１１ＢＡＤ２２８０５）
通信作者：吕鹏梅（１９７３一），女，博士、研究员、博士生导师，主要从事生物质能方面的研究。ｌｖｐｍ＠ｍｓ．ｇｉｅｃ．ａｃ．ｃｎ
万方数据
９期苗长林等：脂肪酶产生菌种的筛选鉴定及产酶条件优化
油。在本研究中同时对该菌的产酶条件进行优化，发现其脂肪酶活性较高、培养成本低。该研究为进一步菌种遗传改良及酶法制备生物柴油奠定基础。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１实验材料
土样：采自屠宰场含油脂较丰富的土壤，共１５份。
１．１．２试剂
罗丹明Ｂ，天津大茂精细化学品公司，分析纯。
橄榄油，上海润捷化学试剂有限公司，化学纯。菜籽油，金龙鱼食用油。聚乙烯醇，天津大茂化学试剂有限公司。其余试剂均为分析纯。
１．１．３仪器
摇床、培养箱、精密水浴锅等均由上海智诚实验设备公司生产。
１．１．４培养基
固体培养基：ＮａＮＯ，２．０
ｇ／Ｌ、Ｋ：ＨＰＯ。１．０ｇ／Ｌ、
ＭｇＳＯ。・７Ｈ：Ｏ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ。・７ＨｚＯ０．０１ｇ／Ｌ、葡萄糖
３０
ｇ／Ｌ、蛋白胨２０ｇ／Ｌ、琼脂２０ｇ／Ｌ，自然ｐＨ值。种子培养基：在固体培养基中不加琼脂。发酵液培养基：葡萄糖２０ｇ／Ｌ、橄榄油３０
ｇ／Ｌ、
Ｋ２ＨＰ０４１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ。・７Ｈ：Ｏ０．５
ｇ，Ｌ，自然ｐＨ值。
１．２实验方法１．２．１菌种筛选
初筛：采用稀释平板分离法进行初筛。取ｌ
ｇ
土样装于有玻璃珠的４９ｍＬ无菌水三角瓶中，以
１６０
ｒ／ｍｉｎ的转速振摇３０ｍｉｎ，用滤纸过滤到无菌空
三角瓶中，制得悬液。然后依次梯度稀释至１０～，在无菌条件下，取０．５ｍＬ稀释液涂布于固体培养基平板上，倒置于２９℃培养箱中培养４８
ｈ。
在固体培养基中加入０．０３ｇ／ｍＬ的橄榄油，灭菌后冷却至５０℃，加人０．０１ｇ／Ｌ灭菌的罗丹明Ｂ指示剂溶液，制成平板。用牙签将平板培养长出的单菌落分别转移至平板上，于２９℃条件下培养７２
ｈ，
依据产生变色圈的先后和变色圈直径与菌落直径比值的大小分离筛选出脂肪酶活性高且产酶周期短的菌株，将这些单菌落接种于斜面培养基中培
养，用于复筛。
复筛：挑取斜面孢子接种到种子培养基中，于
万方数据
２９℃、１６０
ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ｈ，再将种子液按２％接
种量接种到发酵培养基中（２５０ｍＬ三角瓶中发酵液装液量为５０ｍＬ），经２９℃、１６０ｒ／ｍｉｎ培养７２ｈ，离
心，测上清液的酶活，根据酶活大小确定出发高产
菌株。
１．２．２脂肪酶活力测定
采用橄榄油乳化法测定。在试管中加入５ｍＬ
橄榄油乳化液和４
ｍＬ
ｐＨ值７．５磷酸缓冲液，于
４０℃恒温水浴振荡器中预热５ｍｉｎ，然后加人１
ｍＬ
脂肪酶液，并立即计时，保温反应１０ｍｉｎ后立即加入１５
ｍＬ
９５％乙醇终止反应，以１０ｇ，Ｌ酚酞为指示
剂，用经标定的０．０５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＯＨ溶液滴定水解产
生的游离脂肪酸，滴定至微红为终点。记录消耗的ＮａＯＨ体积。同时做空白实验，对照样品的乙醇应在酶液之前加入，即在预热后先加人９５％乙醇终止剂再加入脂肪酶液，其他操作同测试液。在测定条
件下，每分钟催化脂肪水解产生１Ｉ山ｍｏｌ脂肪酸的脂肪酶量定义为１个脂肪酶酶活单位（ｕ）。酶活计算
公式为：
式中，卜滴定样液所消耗ＮａＯＨ溶液体积，ｍＬ；
酶活力（Ｕ／ｍＬｌ＝∥一ｖ０）×Ｍ×ｎ／ｔ
ｒ反应时间，ｍｉｎ；凡——酶液体积，ｍＬ；胁一滴
¨一滴定空白样所消耗ＮａＯＨ溶液体积，ｍＬ；
定用ＮａＯＨ溶液浓度，ｍｍｏｌ／Ｌ。１．２．３菌株的鉴定
１．２．３．１
菌落形态特征鉴定
将菌株分别接种于液体和固体平板ＰＤＡ培养
基上，２９℃连续培养。观察液体状况；固体培养基上长出的菌落色泽、质地、形态；取少量菌体细胞在
显微镜下观察测量孢子的颜色形状、大小和无性繁殖方式等。
１．２．３．２菌株的分子生物学鉴定
采用ＤＮＡ提取试剂盒（英骏生物技术有限公
司）提取ＤＮＡ，以提取的菌株ＤＮＡ为模板，ＩＴＳｌ、ＩＴＳ４为引物，ＰＣＲ扩增ｒＤＮＡＩＴＳ序列，ＰＣＲ扩增体系：ＰＣＲＰｒｅｍｉｘ
２５汕，ＩＴＳＦｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（２０ｐｍｏＵ汕）
０．５斗Ｌ，ＩＴＳＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（２０
ｐｍｏｌ／斗Ｌ）０．５斗Ｌ，模
板ＤＮＡ１ｔＬＬ，ｄＨ２０２３
ＩＬＬ。ＰＣＲ条件：９４℃２
ｍｉｎ，
（９４℃３０ｓ，５５ｏＣ３０Ｓ，７２ｏＣ１ｍｉｎ）×３０个循环，
７２℃延长５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物直接测序（引物合成与
序列测定均由英骏生物技术有限公司完成）。将序列与ＮＣＢＩ数据库中已有序列进行相似性比较分
１７１０
太阳能学报３５卷
析。选取与供试菌株相似度高的序列，利用软件
ＣｌｕｓｔａｌＸｌ．８３、ＭＥＧＡ３．１建立系统进化树ｎ８Ｉ。
１．２．４产酶条件优化１．２．４．１碳源
以蔗糖、葡萄糖、淀粉、橄榄油等单一或复合成分为碳源，碳源质量分数为５％，取种子液１ｍＬ分别接种于装有上述碳源的培养基中，培养基装量为
１０ｍＬ／５０
ｍＬ摇瓶，２９℃，１６０ｒ／ｍｉｎ培养９０ｈ，离心，
取上清，测酶活。１．２．４．２氮源
以蛋白胨、牛肉膏、豆饼粉等为氮源，氮源质量分数为４％，取种子液１ｍＬ分别接种于装有上述氮源的培养基中，培养基装量为１０
ｍＬ／５０
ｍＬ摇瓶，
２９℃，１６０
ｒ／ｍｉｎ培养９０ｈ，离心，取上清，测酶活。
１．２．４．３初始ｐＨ值
以４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０为初始ｐＨ值，
取种子液１ｍＬ分别接种于上述培养基中，培养基装量为１０
ｍＬ／５０
ｍＬ摇瓶，２９
ｏＣ，１６０
ｒ／ｍｉｎ培养
９０
ｈ，离心，取上清，测酶活。
１．２．４．４最佳培养温度
以２７、２９、３０、３２、３４、３７和４０℃为初始培养温
度，取种子液１ｍＬ分别接种于上述培养基中，培养基装量为１０
ｍＬ／５０
ｍＬ摇瓶，２９℃，１６０ｒ／ｍｉｎ培养
９０
ｈ，离心，取上清，测酶活。
２结果与讨论
２．１脂肪酶产生茵的筛选
２．１．１
菌种筛选
通过筛选，共得到２１株菌株，从中挑选透明圈
直径与菌落直径比值大的４个菌落，分别对其进行
振荡培养７２ｈ，测定酶活，进行复筛，结果见表ｌ。从表１中选出酶活最高的菌株Ｍ一４作为出发菌株，
经实验发现该菌可催化菜籽油合成生物柴油，故选
Ｍ．４为实验用菌，对该菌株进行鉴定和产酶条件优化研究。
表１罗丹明Ｂ平板筛选结果
Ｔａｂｌｅ１
ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＲｈｏｄａｍｉｎｅＢｐｌａｔｅ
ｓｃｒｅｅｎ
ｍｅｔｈｏｄ
序号
酶活／ｕ・ｍＬ＿Ｉ
序号
酶活／Ｕ・ｍＬ。
Ｍ．１３．２５Ｍ．３
５．３５Ｍ．２
２．５５
Ｍ４
６．９０
２．１．２生长曲线的绘制
将Ｍ一４菌活化培养２４ｈ，挑取两环，接种于发
万方数据
酵液中，于２９℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，定时取样测定其生物量（０Ｄ。）。
由图１可见，Ｍ一４菌的生长可分为４个阶段：０～
４２ｈ为生长延迟期；４２。９６ｈ为对数生长期；９６。１２０
ｈ为生长稳定期；１３０．２００ｈ为生长衰亡期。本
研究选择９０ｈ左右的Ｍ一４培养液作为种子培养时间，因为在对数生长后期，细胞平衡生长，菌体内各种成分均匀整个群体的生理特性较一致，细胞中的
成分平衡发展和生长速率恒定，较适宜作为代谢、生理等研究的材料¨…。
飞
８
画
蜊米登
时间／ｈ
图１
Ｍ－４菌株生长曲线
Ｆｉｇ．１
Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ
ｃｕｒｖｅｓ
ｏｆＭ＿４ｓｔｒａｉｎ
２．２菌种的鉴定２．２．１形态特征
Ｍ一４在ＰＤＡ液体培养基２９℃静置培养７２
ｈ
后，培养液呈现红色，液面上形成一层醭膜。在平板培养基上２９ｑＣ培养７２ｈ，菌落呈灰白色，表面光滑，呈小米粒状菌落，７ｄ后菌落颜色呈淡棕色，１５
ｄ
后菌落长满平板，菌落呈淡红色。显微镜下观察菌株形态，孢子呈圆形、卵圆形或长圆形，直径为４～
９
Ｉｘｍ，可见芽生孢子，为多边芽殖，有掷孢子，无子
囊及子囊孢子产生。由以上特征，据《酵母菌分类学》（Ｙｅａｓｔｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ））∞］，初
步鉴定为酵母属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）。
２．２．２遗传学特征
将ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳，结果显示，Ｍ．４菌株可扩增出一条６００ｂｐ的特异条带（图２）。
由Ｍ．４菌株的ＩＴＳ基因序列与Ｇｅｎｂａｎｋ中相似性
较高序列的系统发育树（图３），可知Ｍ．４与模式菌
株Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ
ｓｔｒａｉｎ
ＣＢＳ２６３４、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒｓｔｒａｉｎ
ＮＩＯＣＣ
Ｙ４、
ＳｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒｓｔｒａｉｎＡＴＣＣＭＹＡ一４５５０的
亲缘关系最近，因此将Ｍ．４菌株初步鉴定为
Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒｓｔｒａｉｎ
ｏ
９期
苗长林等：脂肪酶产生菌种的筛选鉴定及产酶条件优化
１７ｌｌ
２．３产酶条件优化结果２．３．１碳源种类对产酶的影响
分别选用葡萄糖、蔗糖、淀粉、橄榄油作为单一或复合碳源进行产酶实验，碳源质量分数为５％，测
定酶液活力，结果见表２。
表２碳源对产酶的影响
Ｔａｂｌｅ２
Ｍ：１）１．２，０００１）、，、：１：Ｉ”：Ｉ｛产物：
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｎ
ｓｏｕｒｃｅｓｏｎ
ｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
＋：正对照；一：负对照
图２
Ｆｉｇ．２
Ｍ一４菌株浓度３％琼脂糖凝胶电泳
酶活，Ｕ・ｍＬ－１
７．８
Ｔｈｅ３％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＭ－４ｓｔｒａｉｎ
图３
Ｆｉｇ．３
Ｍ．４系统进化树
ＴｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＭ－４
由表２可见，复合碳源较单一碳源产酶效果好，且葡萄糖２％＋橄榄油３％作为碳源更有利于产酶。
２．３．２氮源种类对产酶的影响
见图４。由图４可见初始ｐＨ值为７．Ｏ时酶活最高。
以葡萄糖２％＋橄榄油３％为碳源，在培养基中分别加人酵母膏４％、蛋白胨４％、豆饼粉４％、
＠Ｈ。）：ＳＯ。４％作为氮源进行产酶实验，结果见表３。由表３可见在原培养基中加入酵母膏４％作为氮源有利于产酶。
表３氮源对产酶的影响
Ｔａｂｌｅ
３
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｓｏｕｒｃｅｓｏｎ
二
三
篆
４５６７８９１０
ｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｐＨ位
图４初始ｐＨ值对产酶的影响
Ｆｉｇ．４
ＥｆｆｅｃｔｏｆｉｍｔｉＭｐＨｏｆｍｅｄｉａ
ｏｎ
ｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２．３．３
初始ｐＨ值对产酶的影响
２．３．４培养温度对产酶的影响
以葡萄糖２％＋橄榄油３％为碳源，酵母膏４％为氮源，发酵温度２９℃及不同初始ｐＨ值的培养条件下进行产酶实验，并测定发酵液中脂肪酶的活力，结果
以葡萄糖２％＋橄榄油３％为碳源，４％酵母膏为氮源，初始ｐＨ值为７．ｏ时，不同培养温度的培养条
件下进行产酶实验，并测定发酵液中脂肪酶的活
万方数据
太阳能学报３５卷
力，结果见图５。由图５可见培养温度为３０℃时酶活最高。■
皇
ｊ
童
龌
温度／ｏｆ
图５温度对产酶的影响
Ｆｉｇ．５
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｏｎ
ｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２．３．５正交实验设计
依据单因素实验结果，设计正交试验，选取了
温度、氮源、碳源、初始ｐＨ４个因子，每个因子均取
３个水平。各因素水平的具体条件见表４，选用正
交表Ｌ９（３４）进行试验（见表４、表５）。
表４因素水平
Ｔａｂｌｅ４
Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓ
表５
Ｌ＇（３４）培养基正交实验
Ｔａｂｌｅ５
Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｆｏｒｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ
根据表３中极差尺值的大小可知，因子的显著万方数据
性顺序为：温度＞ｐＨ值＞氮源＞碳源，根据均差ｋ值大小可知，各因子的最优组合为Ａ２８２Ｃ３Ｄ２，即碳源质量浓度为５％，氮源浓度为５％，ｐＨ值为７．０，温度
为３０℃。菌株在此最优发酵条件下发酵测得最高的脂肪酶酶活为１２．２
Ｕ／ｍＬ。
３
结论
以屠宰场含油脂较丰富的土样为原材料，通过
筛选得到１株产脂肪酶活力较强的菌株Ｍ．４，经鉴
定为Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ
ｓｔｒａｉｎ。其最佳产酶
条件为：碳源质量浓度为５％，氮源为５％，初始ｐＨ值为７．０，温度为３０℃，此条件下脂肪酶酶活为
１２．２
Ｕ／ｍＬ。该酶能催化菜籽油合成生物柴油，培养
条件简单，具有很好的工业应用前景，但相对其他工业用的产脂肪酶菌株，该菌株的产酶量相对较
低，还有待通过相关的诱变手段、基因重组等操作进一步提高产酶量。
［参考文献］
【ｌｊ
ＷａｎｇＸｉａｏｆｅｎｇ，ＷａｎｇＪｕｎ，ＹａｎｇＪｉａｎｇｋｅ．Ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇ－
ｒｅｓｓｏｎ
ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅｂｙｍｉｃｒｏｂｉａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ，２００８，（４）：４７—５３．［２］
张开平，惠明，田青，等．微生物脂肪酶的应用领域及研究进展［Ｊ］．河南工业大学学报（自然科学
版），２０１２，３３（１）：９卜９４．
【２Ｊ
ＺｈａｎｇＫａｉｐｉｎｇ，ＨｕｉＭｉｎｇ，Ｔｉａｎ
Ｑｉｎｇ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｐｒｏｇ－
ｒｅｓｓ
ａｎｄ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｉｅｌｄｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｉｐａｓｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒ－
ｈａｌｏｆＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ
Ｅｄｉｔｉｏｎ），２０１２，３３（１）：９ｍ一９４．
［３］
王成，刘忠义，陈于陇，等．生物柴油制备技术研
究进展ＥＪ］．广东农业科学，２０１２，３９（１）：１０７一１１２．
［３］
ＷａｎｇＣｈｅｎｇ，ＬｉｕＺｈｏｎｇｙｉ，ＣｈｅｎＹｕｌｏｎｇ，ｅｔａ１．Ｔｈｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｌＪＪ．Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，３９（１）：１０７—１１２．
［４］金付强，李岩，王建梅，等．生物柴油绿色生产工艺研究进展［Ｊ］．山东科学，２０１１，２４（２）：６１—６４，７７．
【４ＪＪｉｎ
Ｆｕｑｉａｎｇ，ＬｉＹａｎ，Ｗａｎｇ
Ｊｉａｎｍｅｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ａｄｖａｎｃｅｓｏｆｂｉｏｄｉｅｓｅｌｇｒｅｅｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］．
Ｓｈａｎｄｏｎｇ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，２４（２）：６１卅，７７．
［５］
ＡｎａＲｉｔａ
Ｒｏｄｒｉｇｎｅｓ，Ａｌｅｘａｎｄｒｅ
Ｐａｉｖａ，ＭａｒｃｏＧｏｍｅｓｄａ
Ｓｉｌｖａ，ｅｔａ１．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
ｂｉｏｄｉｅ—
ｓｅｌｆｒｏｍｖｉｒｇｉｎａｎｄｗａｓｔｅｓｕｎｆｌｏｗｅｒｏｉｌｉｎｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｃａｒｂｏｎ
ｄｉｏｘｉｄｅ
ｌＪＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ
Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｅａｌ
Ｆｌｕｉｄｓ，
２０１１．５６（３）：２５９．一２６４．
９期苗长林等：脂肪酶产生菌种的筛选鉴定及产酶条件优化
１７１３
［６］
黄一波，王芳．脂肪酶法制备生物柴油进展［Ｊ］．安徽农业科学，２０１ｌ，３９（１０）：６０４８－－６０４９，６０５２．
［６］
ＨｕａｎｇＹｉｂｏ，ＷａｎｇＦａｎｇ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｏｆｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌｂｙｌｉｐａｓｅ
ｃａｔａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉ
Ａ画－
ｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１１，３９（１０）：６０４８－－６０４９，６０５２．
［７］ＬｉＬｉａｎｈｕａ，ＬｖＰｅｎｇｍｅｉ，ＬｕｏＷｅｎ，ｅｔａ１．Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｈｉｇｈＦＦＡｔｕｎｇｏｉｌｗｉｔｈｓｏｌｉｄａｃｉｄｃａｔａｌｙｓｔｉｎｆｉｘｅｄｂｅｄ
ｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｓｓ
ａｎｄＢｉｏｅｎｅｒｇｙ，２０１０，３４：４９昏一
４９９．
［８］
Ｂａｊａｊ
Ａｋｈｉｌ，Ｌｏｈａｎ
Ｐｕｒｖａ，ＪｈａＰｒａｂｈａｔ
Ｎ，ｅｔａ１．
Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｔｈｒｏｕｇｈｌｉｐａｓｅ
ｃａｔａｌｙｚｅｄ
ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａｎ
ｏｖｅｒｖｉｅｗ
ｌＪＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｔａｌｙｓｉｓ
Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６２（１）：９一１４．
［９］张振乾．脂肪酶产生菌的筛选及固定化脂肪酶在生产生物柴油中的应用研究［Ｄ］．长沙：湖南农业大学，
２００９．
［９］
ＺｈａｎｇＺｈｅｎｑｉａｎ．Ｓｃｒｅｅｎｏｆｓｔｒａｉｎｓｗｈｉｃｈｐｒｏｄｕｃｅｌｉｐａｓｅａｎｄｔｈｅ
ｓｔｕｄｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｉｐａｓｅｓｕｓｅｄ
ｏｎ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
［Ｄ］．Ｃｈａｎｇｓｈａ：Ｈｕｎａｎ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００９．
［１０］
舒正玉，杨江科，黄瑛，等．生物柴油生产用脂肪酶资源及研发现状［Ｊ］．湖北农业科学，２００７，４６（６）：
１０２７一１０３１．
［１０］
ＳｈｕＺｈｅｎｇｙｕ，Ｙａｎｇ
Ｊｉａｎｇｋｅ，Ｈｕａｎｇ
Ｙｉｎｇ．Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ
ａｎｄ
ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｅ
ｏｆｌｉｐａｓｅｓｕｓｅｄｉｎｂｉｏｄｉｅｓｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
［Ｊ］．Ｈｕｂｅｉ
Ａｇｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７，４６（６）：
１０２７—１０３１．
Ｌｕ
Ｊｉｋｅ，ＤｅｎｇＬｉ，Ｚｈａｏ
Ｒｕｉ，ｅｔ
ａ１．Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
Ｃａｎｄｉｄａｓｐ．９９・１２５ｌｉｐａｓｅｔｏｉｍｐｒｏｖｅｉｔｓ
ｍｅｔｈａｎｏｌ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅｆｏｒｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｔａｌｙｓｉｓＢ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６２（１）：
１５一１８．
［１２］
ＪｉＱｉｎｇｃｈｕｎ，ＸｉａｏＳｕｊｉｎｇ，ＨｅＢｉｎｇｆａｎｇ，ｅｔａ１．Ｐｕｒｉｆｉ－
ｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎ
ｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔ．ｔｏｌｅｒａｎｔ
ｌｉｐａｓｅｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅ／＇ｕｇ／／ｌｏｓａＬＸＩａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉ－
ｃａｔｉｏｎｆｏｒｂｉｏｄｉｅｓｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃａｔａｌｙｓｉｓ
Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６６（３／４）：２６４－一２６９．
［１３］ＡｎａＡｕｒｅｌｉａＣｈｉｒｖａｓｅ，Ｃｈａｍｅｕａ
Ｕｎｇｕｒｅａｎｕ，Ｌｕｍｉｎｉｔａ
Ｔｃａｃｅｎｃ，ｅｔａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｓｃｈａｒａｃｔｅｒ－ｉｓｔｉｃｓａｓ
ｌｉｐａｓｅｐｒｏｖｉｄｅｒｓｆｏｒｅｎｚｙｍａｔｉｃｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａ－
ｔｉｏｎｔｏ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ［Ｊ］．Ｒｅｖｉｓｔａｄｅ
Ｃｈｉｍｉｅ，２０１０，６１（９）：
８６６－一８６８．［１４］
Ｒｉｓａ
Ｋｏｄａ，Ｔａｋａｏ
Ｎｕｍａｔａ，Ｓｈｉｎｊｉ
Ｈａｍａ，ｅｔ
ａ１．Ｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ
ｏｆｒａｐｅｓｅｅｄ
ｏｉｌ
ｔｏ
ｐｒｏｄｕｃｅ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｆｕｅｌ
万方数据
ｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙ
Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ
ｌｉｐａｓｅ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ｆｕｎｇｕｓｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｔａｌｙｓｉｓＢ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６６（１／２）：
ｌＯｌ—１０４．
［１５］
谭天伟，鲁吉珂，聂开立，等．酶法合成生物柴油工业化研究进展［Ｊ］．生物工程学报，２０１０，２６（７）：９０３—９０６．
［１５］
ＴａｎＴｉａｎｗｅｉ，ＬｕＪｉｋｅ，ＮｉｅＫａｉｌｉ，ｅｔ
ａ１．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｏｎ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗｉｔｈｅｎｚｙｍａｔｉｃｃａｔａｌｙｓｉｓ
ｉｎＣｈｉｎａ
［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ
ｏｆ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２６（７）：
９０３——９０６．
［１６］
里伟，杜伟，刘德华，等．固定化Ｒ．ｏｒｙｚａｅ细胞
发酵产胞内脂肪酶及其催化制备生物柴油［Ｊ］．高校
化学工程学报，２００８，２２（５）：８２２—８２７．
［１６］
ＬｉＷｅｉ，ＤｕＷｅｉ，ＬｉｕＤｅｈｕａ，ｅｔａ１．ＩｎｔｒａｃｅｉｌｕｌａｒｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＲ．ｏｒｙｚａｅｃｅｌｌ
ａｎｄ
ｉｔｓｕｔｉｌｉｚｉｎｇ
ｆｏｒｗｈｏｌｅｃｅｌｌｃａｔａｌｙｚｅｄｂｉｏｄｉｅｓｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＣｈｉｎｅｓｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ，２００８，
２２（５）：８２２＿一８２７．
［１７］
李军红，姜绍通，童洋洋．产脂肪酶真菌的筛选及产酶条件优化［Ｊ］．安徽农业科学，２０１１，３９（２６）：
１５８４０—１５８４２．
［１７］ＬｉＪｕｎｈｏｎｇ，ＪｉａｎｇＳｈａｏｔｏｎｇ，ＴｏｎｇＹａｎｇｙａｎｇ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｏｆ
ｆｕｎｇｉ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｌｉｐａｓｅ
ａｎｄ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｌｉｐａｓｅ－
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ。２０１ｌ，３９（２６）：１５８４０－－－１５８４２．
［１８］阎金勇．白地霉Ｙ１６２Ｊ指肪酶基因克隆与表达［Ｄ］．武汉：华中科技大学，２００７．
［１８］
ＹａｎＪｉｎｙｏｎｇ．Ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅｇｅｎｅ
ｆｒｏｍ
Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｃａｎｄｉｄｕｍ
Ｙ１６２【ＤＪ．
Ｗｕｈａｎ：
ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７．
［１９］
张云波，刘其友，贾惠平，等．一株脂肪酶的筛选和产酶条件及其酶性质的研究［Ｊ］．广西大学学报（自然科学版），２００７，３２（３）：２７０一２７３，２７７．
［１９］
ＺｈａｎｇＹｕｎｂｅ，ＬｉｕＱｉｙｏｕ，Ｊｉａ
Ｈｕｉｐｉｎｇ，ｅｔａ１．Ａｓｔｒａｉｎｏｆ
ｌｉｐａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ：
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ａｎｄ
ｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ【ＪＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ
ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ），２００７，３２（３）：２７ｍ一２７３，２７７．
［２０］
Ｂａｒｎｅｔｔ
Ｊ
Ａ，Ｐａｙｎｅ
ＲＷ，Ｙａｒｒｏｗ
Ｄ．
Ｙｅａｓｔｓ：
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
【Ｍ］．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：
ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９９０，６８３－－－－６８４．
１７１４
太阳能学报
３５卷
ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ，ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＴＨＥＬＩＰＡＳＥ—ＰＲＯＤＵＣＩＮＧＳＴＲＡＩＮＳＡＮＤ
ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩｏＮｏＦＴＨＥＬＩＰＡＳＥＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ
ＭｉａｏＣｈａｎｇｌｉｎｌ，ＬｕｏＷｅｎｌ，ＬｖＰｅｎｇｍｅｉｌ，ＬｉＨｕｉｗｅｎｌ，ＹａｎｇＬｉｎｇｍｅｉｌ，
Ｙｕａｎ
（Ｉ．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲｅｎｅｗａｂｌｅ
Ｅｎｅｒｇｙ
Ｚｈｅｎｈｏｎ９１，ＪｉａｎｇＪｉａｎｃｈｕｎ２
ｏｆＥｎｅｒｇｙ
Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ，ＣＡＳ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ；
ａｎｄＧａｓＨｙｄｒａｔｅ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙｏｆＦｏｒｅｓｔＰｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡＦ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００４２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅＭ．４ｓｔｒａｉｎ
ｗａｓ
ａｃｈｉｅｖｅｄｂｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｒｏｍｔｈｅｓｏｉｌ
ｎｅａｒ
ＧｕａｎｇｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｅｒｇｙＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
ｏｎ
（ＧＩＥＣ）．Ｔｈｉｓ
ｓｔｒａｉｎＷａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＳｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｗｏｆｏｒｓｔｒａｉｎｂａｓｅｄ
ｗｅｒｅ
ｉｔｓ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｒＤＮＡＩＴＳ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｌｉｐａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＭ一４ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ａｒｅ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ．Ｔｈｅｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｓｏｕｒｃｅ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｓ：ｃａｒｂｏｎ
ｓｏｕｒｃｅ
ｉｓｓｌｕｃｏｓｅ２％＋ｏｌｉｖｅｏｉｌ３％；ｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｉｓｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ５％；ｔｈｅｐＨ
ｖａｌｕｅｉｓ７．Ｏ：ｔｈｅｔｉｍｅｏｆｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｉｓ９０ｈ；ｏｐｔｉｍａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｓ３０ｏＣ．Ａｔｔｈｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ
ｃａｎ
ｒｅａｃｈ１２．２Ｕ／ｍＬ．
ｔｅｓｔ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｉｐａｓｅ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
万方数据
第３５卷第９期
太阳能学报
Ｖ０１．３５．Ｎｏ．９
２０１４年９月
ＡＣＴＡＥＮＥＲＧＩＡＥＳＯＬＡＲＩＳＳＩＮＩＣＡ
Ｓｅｐ．，２０１４
文章编号：０２５４．００９６（２０１４）０９．１７０８．０７
脂肪酶产生菌种的筛选鉴定及产酶条件优化
苗长林１，罗
文１，吕鹏梅１，李惠文１，杨玲梅１，袁振宏１，蒋剑春２
（１．中国科学院广州能源研究所，中国科学院可再生能源与天然气水合物重点实验室，广州５１０６４０；
２．中国林业科学研究院林产化学工业研究所，南京２１００４２）
摘要：从富油土壤中分离筛选到一株脂肪酶产生菌Ｍ－４，通过对Ｍ．４进行形态和ｒＤＮＡＩＴＳ序列鉴定，确定其属于酵母菌Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ
ｓｔｒａｉｎ。通过正交试验设计对该菌株进行产酶条件探索，得出其摇瓶培养最适产酶
条件为：种子培养时间为９０ｈ，最佳发酵培养基碳源为葡萄糖２％＋橄榄油３％，氮源为５％酵母膏，初始ｐＨ值为７．０，发酵温度为３０℃，在此条件下的产酶可达１２．２
Ｕ／ｍＬ。
关键词：脂肪酶；筛选；鉴定；培养条件；正交试验中图分类号：Ｑ９３—３３１
文献标识码：Ａ
０
引
言
脂肪酶产生菌的筛选及应用，国内外已有大量相关
研究，舒正玉等ｎ叫从ＣＮＫＩ、ＮＣＢＩ、ＡＣＳ、Ｂｌａｅｋｗｅｌｌ、
脂肪酶（Ｌｉｐａｓｅ）又名三酰甘油酯水解酶，能在
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｋｌｕｗｅｒ、ＳｐｒｉｎｇｅｒＬｉｎｋ、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ等
油水界面催化三酰甘油酯水解，在有机相中催化酯
文献数据库，共检索出８７篇脂肪酶催化生产生物化及转酯等反应。脂肪酶广泛存在于动物组织和
柴油工艺的研究文献，比较分析发现，Ｃａｎｄｉｄａ微生物中，工业上主要采用微生物发酵制备和提取ａｎｔａｒｃｔｉｃａ脂肪酶Ｂ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ脂肪酶、
脂肪酶…，并将其应用于食品加工、油脂水解、皮革Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ脂肪酶、Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ脂肪酶和
绢纺原料脱脂、医药、化妆品、洗涤剂、生物柴油等
Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ
ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ脂肪酶等在生物柴油生产
领域㈨。
中具有广泛应用，其脂肪酶活性在１００Ｕ／ｍＬ以
生物柴油是由动、植物油脂与甲醇（或乙醇）经上ｎ“川。但这些具有高催化活性的脂肪酶大多被国酯化或酯交换反应而得到的长链脂肪酸甲（乙）酯，
外如丹麦诺维信公司、美国杰能科国际、日本天野
是一种可替代普通柴油的清洁燃料ｂ＇“。它基本不酶制品株式会社、美国Ｓｉｇｍａ公司、德国Ｍｅｒｃｋ公司
含硫和芳烃，可被生物降解，无毒、对环境无害，作等所垄断，且价格昂贵［１…。而国内目前有文献报道
为可再生清洁能源１３益受到广泛关注。目前，生产
仅有北京化工大学ｎ５｜、清华大学ｎ引等利用自制的脂生物柴油的主要生产方法包括酶促合成法、固体酸
肪酶催化生产生物柴油，市场上尚无专门用于生物
碱法、离子液体法、离子交换树脂法和超临界甲醇柴油生产的国产脂肪酶商品，国内需要的脂肪酶仍法等ｂ“３。其中酶促合成法合成生物柴油具有条件依赖进口ｎ“。因此，寻找适于工业化生产的高产菌温和、醇用量小，无污染物排放等优点，成为生物柴
株，开发出满足我国生物柴油生产用脂肪酶，对解
油研究工作者关注的焦点。但由于生物柴油生产决制约我国酶法生产生物柴油产业发展具有重要中所需脂肪酶价格昂贵，且低碳醇对酶有毒性，致
意义。
使酶失活严重等原因而使其工业化应用受到较大
本研究从富含油脂的土壤中筛选得到４株产影响。
脂肪酶菌种，其中活性较高的菌株Ｍ一４经分类鉴定因此，筛选活性高、稳定性好的脂肪酶产生菌，成发现其为Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ
ｓｔｒａｉｎ。以菜籽
为促进酶法生产生物柴油产业发展的研究热点阳１。
油为原料进行初步研究，发现其能催化生产生物柴
收稿日期：２０１２．０７．０３
基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题（２０１１ＢＡＤ２２８０５）
通信作者：吕鹏梅（１９７３一），女，博士、研究员、博士生导师，主要从事生物质能方面的研究。ｌｖｐｍ＠ｍｓ．ｇｉｅｃ．ａｃ．ｃｎ
万方数据
９期苗长林等：脂肪酶产生菌种的筛选鉴定及产酶条件优化
油。在本研究中同时对该菌的产酶条件进行优化，发现其脂肪酶活性较高、培养成本低。该研究为进一步菌种遗传改良及酶法制备生物柴油奠定基础。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１实验材料
土样：采自屠宰场含油脂较丰富的土壤，共１５份。
１．１．２试剂
罗丹明Ｂ，天津大茂精细化学品公司，分析纯。
橄榄油，上海润捷化学试剂有限公司，化学纯。菜籽油，金龙鱼食用油。聚乙烯醇，天津大茂化学试剂有限公司。其余试剂均为分析纯。
１．１．３仪器
摇床、培养箱、精密水浴锅等均由上海智诚实验设备公司生产。
１．１．４培养基
固体培养基：ＮａＮＯ，２．０
ｇ／Ｌ、Ｋ：ＨＰＯ。１．０ｇ／Ｌ、
ＭｇＳＯ。・７Ｈ：Ｏ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ。・７ＨｚＯ０．０１ｇ／Ｌ、葡萄糖
３０
ｇ／Ｌ、蛋白胨２０ｇ／Ｌ、琼脂２０ｇ／Ｌ，自然ｐＨ值。种子培养基：在固体培养基中不加琼脂。发酵液培养基：葡萄糖２０ｇ／Ｌ、橄榄油３０
ｇ／Ｌ、
Ｋ２ＨＰ０４１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ。・７Ｈ：Ｏ０．５
ｇ，Ｌ，自然ｐＨ值。
１．２实验方法１．２．１菌种筛选
初筛：采用稀释平板分离法进行初筛。取ｌ
ｇ
土样装于有玻璃珠的４９ｍＬ无菌水三角瓶中，以
１６０
ｒ／ｍｉｎ的转速振摇３０ｍｉｎ，用滤纸过滤到无菌空
三角瓶中，制得悬液。然后依次梯度稀释至１０～，在无菌条件下，取０．５ｍＬ稀释液涂布于固体培养基平板上，倒置于２９℃培养箱中培养４８
ｈ。
在固体培养基中加入０．０３ｇ／ｍＬ的橄榄油，灭菌后冷却至５０℃，加人０．０１ｇ／Ｌ灭菌的罗丹明Ｂ指示剂溶液，制成平板。用牙签将平板培养长出的单菌落分别转移至平板上，于２９℃条件下培养７２
ｈ，
依据产生变色圈的先后和变色圈直径与菌落直径比值的大小分离筛选出脂肪酶活性高且产酶周期短的菌株，将这些单菌落接种于斜面培养基中培
养，用于复筛。
复筛：挑取斜面孢子接种到种子培养基中，于
万方数据
２９℃、１６０
ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ｈ，再将种子液按２％接
种量接种到发酵培养基中（２５０ｍＬ三角瓶中发酵液装液量为５０ｍＬ），经２９℃、１６０ｒ／ｍｉｎ培养７２ｈ，离
心，测上清液的酶活，根据酶活大小确定出发高产
菌株。
１．２．２脂肪酶活力测定
采用橄榄油乳化法测定。在试管中加入５ｍＬ
橄榄油乳化液和４
ｍＬ
ｐＨ值７．５磷酸缓冲液，于
４０℃恒温水浴振荡器中预热５ｍｉｎ，然后加人１
ｍＬ
脂肪酶液，并立即计时，保温反应１０ｍｉｎ后立即加入１５
ｍＬ
９５％乙醇终止反应，以１０ｇ，Ｌ酚酞为指示
剂，用经标定的０．０５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＯＨ溶液滴定水解产
生的游离脂肪酸，滴定至微红为终点。记录消耗的ＮａＯＨ体积。同时做空白实验，对照样品的乙醇应在酶液之前加入，即在预热后先加人９５％乙醇终止剂再加入脂肪酶液，其他操作同测试液。在测定条
件下，每分钟催化脂肪水解产生１Ｉ山ｍｏｌ脂肪酸的脂肪酶量定义为１个脂肪酶酶活单位（ｕ）。酶活计算
公式为：
式中，卜滴定样液所消耗ＮａＯＨ溶液体积，ｍＬ；
酶活力（Ｕ／ｍＬｌ＝∥一ｖ０）×Ｍ×ｎ／ｔ
ｒ反应时间，ｍｉｎ；凡——酶液体积，ｍＬ；胁一滴
¨一滴定空白样所消耗ＮａＯＨ溶液体积，ｍＬ；
定用ＮａＯＨ溶液浓度，ｍｍｏｌ／Ｌ。１．２．３菌株的鉴定
１．２．３．１
菌落形态特征鉴定
将菌株分别接种于液体和固体平板ＰＤＡ培养
基上，２９℃连续培养。观察液体状况；固体培养基上长出的菌落色泽、质地、形态；取少量菌体细胞在
显微镜下观察测量孢子的颜色形状、大小和无性繁殖方式等。
１．２．３．２菌株的分子生物学鉴定
采用ＤＮＡ提取试剂盒（英骏生物技术有限公
司）提取ＤＮＡ，以提取的菌株ＤＮＡ为模板，ＩＴＳｌ、ＩＴＳ４为引物，ＰＣＲ扩增ｒＤＮＡＩＴＳ序列，ＰＣＲ扩增体系：ＰＣＲＰｒｅｍｉｘ
２５汕，ＩＴＳＦｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（２０ｐｍｏＵ汕）
０．５斗Ｌ，ＩＴＳＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（２０
ｐｍｏｌ／斗Ｌ）０．５斗Ｌ，模
板ＤＮＡ１ｔＬＬ，ｄＨ２０２３
ＩＬＬ。ＰＣＲ条件：９４℃２
ｍｉｎ，
（９４℃３０ｓ，５５ｏＣ３０Ｓ，７２ｏＣ１ｍｉｎ）×３０个循环，
７２℃延长５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物直接测序（引物合成与
序列测定均由英骏生物技术有限公司完成）。将序列与ＮＣＢＩ数据库中已有序列进行相似性比较分
１７１０
太阳能学报３５卷
析。选取与供试菌株相似度高的序列，利用软件
ＣｌｕｓｔａｌＸｌ．８３、ＭＥＧＡ３．１建立系统进化树ｎ８Ｉ。
１．２．４产酶条件优化１．２．４．１碳源
以蔗糖、葡萄糖、淀粉、橄榄油等单一或复合成分为碳源，碳源质量分数为５％，取种子液１ｍＬ分别接种于装有上述碳源的培养基中，培养基装量为
１０ｍＬ／５０
ｍＬ摇瓶，２９℃，１６０ｒ／ｍｉｎ培养９０ｈ，离心，
取上清，测酶活。１．２．４．２氮源
以蛋白胨、牛肉膏、豆饼粉等为氮源，氮源质量分数为４％，取种子液１ｍＬ分别接种于装有上述氮源的培养基中，培养基装量为１０
ｍＬ／５０
ｍＬ摇瓶，
２９℃，１６０
ｒ／ｍｉｎ培养９０ｈ，离心，取上清，测酶活。
１．２．４．３初始ｐＨ值
以４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０为初始ｐＨ值，
取种子液１ｍＬ分别接种于上述培养基中，培养基装量为１０
ｍＬ／５０
ｍＬ摇瓶，２９
ｏＣ，１６０
ｒ／ｍｉｎ培养
９０
ｈ，离心，取上清，测酶活。
１．２．４．４最佳培养温度
以２７、２９、３０、３２、３４、３７和４０℃为初始培养温
度，取种子液１ｍＬ分别接种于上述培养基中，培养基装量为１０
ｍＬ／５０
ｍＬ摇瓶，２９℃，１６０ｒ／ｍｉｎ培养
９０
ｈ，离心，取上清，测酶活。
２结果与讨论
２．１脂肪酶产生茵的筛选
２．１．１
菌种筛选
通过筛选，共得到２１株菌株，从中挑选透明圈
直径与菌落直径比值大的４个菌落，分别对其进行
振荡培养７２ｈ，测定酶活，进行复筛，结果见表ｌ。从表１中选出酶活最高的菌株Ｍ一４作为出发菌株，
经实验发现该菌可催化菜籽油合成生物柴油，故选
Ｍ．４为实验用菌，对该菌株进行鉴定和产酶条件优化研究。
表１罗丹明Ｂ平板筛选结果
Ｔａｂｌｅ１
ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＲｈｏｄａｍｉｎｅＢｐｌａｔｅ
ｓｃｒｅｅｎ
ｍｅｔｈｏｄ
序号
酶活／ｕ・ｍＬ＿Ｉ
序号
酶活／Ｕ・ｍＬ。
Ｍ．１３．２５Ｍ．３
５．３５Ｍ．２
２．５５
Ｍ４
６．９０
２．１．２生长曲线的绘制
将Ｍ一４菌活化培养２４ｈ，挑取两环，接种于发
万方数据
酵液中，于２９℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，定时取样测定其生物量（０Ｄ。）。
由图１可见，Ｍ一４菌的生长可分为４个阶段：０～
４２ｈ为生长延迟期；４２。９６ｈ为对数生长期；９６。１２０
ｈ为生长稳定期；１３０．２００ｈ为生长衰亡期。本
研究选择９０ｈ左右的Ｍ一４培养液作为种子培养时间，因为在对数生长后期，细胞平衡生长，菌体内各种成分均匀整个群体的生理特性较一致，细胞中的
成分平衡发展和生长速率恒定，较适宜作为代谢、生理等研究的材料¨…。
飞
８
画
蜊米登
时间／ｈ
图１
Ｍ－４菌株生长曲线
Ｆｉｇ．１
Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ
ｃｕｒｖｅｓ
ｏｆＭ＿４ｓｔｒａｉｎ
２．２菌种的鉴定２．２．１形态特征
Ｍ一４在ＰＤＡ液体培养基２９℃静置培养７２
ｈ
后，培养液呈现红色，液面上形成一层醭膜。在平板培养基上２９ｑＣ培养７２ｈ，菌落呈灰白色，表面光滑，呈小米粒状菌落，７ｄ后菌落颜色呈淡棕色，１５
ｄ
后菌落长满平板，菌落呈淡红色。显微镜下观察菌株形态，孢子呈圆形、卵圆形或长圆形，直径为４～
９
Ｉｘｍ，可见芽生孢子，为多边芽殖，有掷孢子，无子
囊及子囊孢子产生。由以上特征，据《酵母菌分类学》（Ｙｅａｓｔｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ））∞］，初
步鉴定为酵母属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）。
２．２．２遗传学特征
将ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳，结果显示，Ｍ．４菌株可扩增出一条６００ｂｐ的特异条带（图２）。
由Ｍ．４菌株的ＩＴＳ基因序列与Ｇｅｎｂａｎｋ中相似性
较高序列的系统发育树（图３），可知Ｍ．４与模式菌
株Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ
ｓｔｒａｉｎ
ＣＢＳ２６３４、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒｓｔｒａｉｎ
ＮＩＯＣＣ
Ｙ４、
ＳｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒｓｔｒａｉｎＡＴＣＣＭＹＡ一４５５０的
亲缘关系最近，因此将Ｍ．４菌株初步鉴定为
Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒｓｔｒａｉｎ
ｏ
９期
苗长林等：脂肪酶产生菌种的筛选鉴定及产酶条件优化
１７ｌｌ
２．３产酶条件优化结果２．３．１碳源种类对产酶的影响
分别选用葡萄糖、蔗糖、淀粉、橄榄油作为单一或复合碳源进行产酶实验，碳源质量分数为５％，测
定酶液活力，结果见表２。
表２碳源对产酶的影响
Ｔａｂｌｅ２
Ｍ：１）１．２，０００１）、，、：１：Ｉ”：Ｉ｛产物：
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｎ
ｓｏｕｒｃｅｓｏｎ
ｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
＋：正对照；一：负对照
图２
Ｆｉｇ．２
Ｍ一４菌株浓度３％琼脂糖凝胶电泳
酶活，Ｕ・ｍＬ－１
７．８
Ｔｈｅ３％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＭ－４ｓｔｒａｉｎ
图３
Ｆｉｇ．３
Ｍ．４系统进化树
ＴｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＭ－４
由表２可见，复合碳源较单一碳源产酶效果好，且葡萄糖２％＋橄榄油３％作为碳源更有利于产酶。
２．３．２氮源种类对产酶的影响
见图４。由图４可见初始ｐＨ值为７．Ｏ时酶活最高。
以葡萄糖２％＋橄榄油３％为碳源，在培养基中分别加人酵母膏４％、蛋白胨４％、豆饼粉４％、
＠Ｈ。）：ＳＯ。４％作为氮源进行产酶实验，结果见表３。由表３可见在原培养基中加入酵母膏４％作为氮源有利于产酶。
表３氮源对产酶的影响
Ｔａｂｌｅ
３
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｓｏｕｒｃｅｓｏｎ
二
三
篆
４５６７８９１０
ｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｐＨ位
图４初始ｐＨ值对产酶的影响
Ｆｉｇ．４
ＥｆｆｅｃｔｏｆｉｍｔｉＭｐＨｏｆｍｅｄｉａ
ｏｎ
ｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２．３．３
初始ｐＨ值对产酶的影响
２．３．４培养温度对产酶的影响
以葡萄糖２％＋橄榄油３％为碳源，酵母膏４％为氮源，发酵温度２９℃及不同初始ｐＨ值的培养条件下进行产酶实验，并测定发酵液中脂肪酶的活力，结果
以葡萄糖２％＋橄榄油３％为碳源，４％酵母膏为氮源，初始ｐＨ值为７．ｏ时，不同培养温度的培养条
件下进行产酶实验，并测定发酵液中脂肪酶的活
万方数据
太阳能学报３５卷
力，结果见图５。由图５可见培养温度为３０℃时酶活最高。■
皇
ｊ
童
龌
温度／ｏｆ
图５温度对产酶的影响
Ｆｉｇ．５
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｏｎ
ｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２．３．５正交实验设计
依据单因素实验结果，设计正交试验，选取了
温度、氮源、碳源、初始ｐＨ４个因子，每个因子均取
３个水平。各因素水平的具体条件见表４，选用正
交表Ｌ９（３４）进行试验（见表４、表５）。
表４因素水平
Ｔａｂｌｅ４
Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓ
表５
Ｌ＇（３４）培养基正交实验
Ｔａｂｌｅ５
Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｆｏｒｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ
根据表３中极差尺值的大小可知，因子的显著万方数据
性顺序为：温度＞ｐＨ值＞氮源＞碳源，根据均差ｋ值大小可知，各因子的最优组合为Ａ２８２Ｃ３Ｄ２，即碳源质量浓度为５％，氮源浓度为５％，ｐＨ值为７．０，温度
为３０℃。菌株在此最优发酵条件下发酵测得最高的脂肪酶酶活为１２．２
Ｕ／ｍＬ。
３
结论
以屠宰场含油脂较丰富的土样为原材料，通过
筛选得到１株产脂肪酶活力较强的菌株Ｍ．４，经鉴
定为Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ
ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ
ｓｔｒａｉｎ。其最佳产酶
条件为：碳源质量浓度为５％，氮源为５％，初始ｐＨ值为７．０，温度为３０℃，此条件下脂肪酶酶活为
１２．２
Ｕ／ｍＬ。该酶能催化菜籽油合成生物柴油，培养
条件简单，具有很好的工业应用前景，但相对其他工业用的产脂肪酶菌株，该菌株的产酶量相对较
低，还有待通过相关的诱变手段、基因重组等操作进一步提高产酶量。
［参考文献］
【ｌｊ
ＷａｎｇＸｉａｏｆｅｎｇ，ＷａｎｇＪｕｎ，ＹａｎｇＪｉａｎｇｋｅ．Ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇ－
ｒｅｓｓｏｎ
ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅｂｙｍｉｃｒｏｂｉａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ，２００８，（４）：４７—５３．［２］
张开平，惠明，田青，等．微生物脂肪酶的应用领域及研究进展［Ｊ］．河南工业大学学报（自然科学
版），２０１２，３３（１）：９卜９４．
【２Ｊ
ＺｈａｎｇＫａｉｐｉｎｇ，ＨｕｉＭｉｎｇ，Ｔｉａｎ
Ｑｉｎｇ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｐｒｏｇ－
ｒｅｓｓ
ａｎｄ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｉｅｌｄｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｉｐａｓｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒ－
ｈａｌｏｆＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ
Ｅｄｉｔｉｏｎ），２０１２，３３（１）：９ｍ一９４．
［３］
王成，刘忠义，陈于陇，等．生物柴油制备技术研
究进展ＥＪ］．广东农业科学，２０１２，３９（１）：１０７一１１２．
［３］
ＷａｎｇＣｈｅｎｇ，ＬｉｕＺｈｏｎｇｙｉ，ＣｈｅｎＹｕｌｏｎｇ，ｅｔａ１．Ｔｈｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｌＪＪ．Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，３９（１）：１０７—１１２．
［４］金付强，李岩，王建梅，等．生物柴油绿色生产工艺研究进展［Ｊ］．山东科学，２０１１，２４（２）：６１—６４，７７．
【４ＪＪｉｎ
Ｆｕｑｉａｎｇ，ＬｉＹａｎ，Ｗａｎｇ
Ｊｉａｎｍｅｉ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ａｄｖａｎｃｅｓｏｆｂｉｏｄｉｅｓｅｌｇｒｅｅｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］．
Ｓｈａｎｄｏｎｇ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，２４（２）：６１卅，７７．
［５］
ＡｎａＲｉｔａ
Ｒｏｄｒｉｇｎｅｓ，Ａｌｅｘａｎｄｒｅ
Ｐａｉｖａ，ＭａｒｃｏＧｏｍｅｓｄａ
Ｓｉｌｖａ，ｅｔａ１．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
ｂｉｏｄｉｅ—
ｓｅｌｆｒｏｍｖｉｒｇｉｎａｎｄｗａｓｔｅｓｕｎｆｌｏｗｅｒｏｉｌｉｎｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｃａｒｂｏｎ
ｄｉｏｘｉｄｅ
ｌＪＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ
Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｅａｌ
Ｆｌｕｉｄｓ，
２０１１．５６（３）：２５９．一２６４．
９期苗长林等：脂肪酶产生菌种的筛选鉴定及产酶条件优化
１７１３
［６］
黄一波，王芳．脂肪酶法制备生物柴油进展［Ｊ］．安徽农业科学，２０１ｌ，３９（１０）：６０４８－－６０４９，６０５２．
［６］
ＨｕａｎｇＹｉｂｏ，ＷａｎｇＦａｎｇ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｏｆｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌｂｙｌｉｐａｓｅ
ｃａｔａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉ
Ａ画－
ｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１１，３９（１０）：６０４８－－６０４９，６０５２．
［７］ＬｉＬｉａｎｈｕａ，ＬｖＰｅｎｇｍｅｉ，ＬｕｏＷｅｎ，ｅｔａ１．Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｈｉｇｈＦＦＡｔｕｎｇｏｉｌｗｉｔｈｓｏｌｉｄａｃｉｄｃａｔａｌｙｓｔｉｎｆｉｘｅｄｂｅｄ
ｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｓｓ
ａｎｄＢｉｏｅｎｅｒｇｙ，２０１０，３４：４９昏一
４９９．
［８］
Ｂａｊａｊ
Ａｋｈｉｌ，Ｌｏｈａｎ
Ｐｕｒｖａ，ＪｈａＰｒａｂｈａｔ
Ｎ，ｅｔａ１．
Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｔｈｒｏｕｇｈｌｉｐａｓｅ
ｃａｔａｌｙｚｅｄ
ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａｎ
ｏｖｅｒｖｉｅｗ
ｌＪＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｔａｌｙｓｉｓ
Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６２（１）：９一１４．
［９］张振乾．脂肪酶产生菌的筛选及固定化脂肪酶在生产生物柴油中的应用研究［Ｄ］．长沙：湖南农业大学，
２００９．
［９］
ＺｈａｎｇＺｈｅｎｑｉａｎ．Ｓｃｒｅｅｎｏｆｓｔｒａｉｎｓｗｈｉｃｈｐｒｏｄｕｃｅｌｉｐａｓｅａｎｄｔｈｅ
ｓｔｕｄｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｉｐａｓｅｓｕｓｅｄ
ｏｎ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
［Ｄ］．Ｃｈａｎｇｓｈａ：Ｈｕｎａｎ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００９．
［１０］
舒正玉，杨江科，黄瑛，等．生物柴油生产用脂肪酶资源及研发现状［Ｊ］．湖北农业科学，２００７，４６（６）：
１０２７一１０３１．
［１０］
ＳｈｕＺｈｅｎｇｙｕ，Ｙａｎｇ
Ｊｉａｎｇｋｅ，Ｈｕａｎｇ
Ｙｉｎｇ．Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ
ａｎｄ
ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｅ
ｏｆｌｉｐａｓｅｓｕｓｅｄｉｎｂｉｏｄｉｅｓｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
［Ｊ］．Ｈｕｂｅｉ
Ａｇｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００７，４６（６）：
１０２７—１０３１．
Ｌｕ
Ｊｉｋｅ，ＤｅｎｇＬｉ，Ｚｈａｏ
Ｒｕｉ，ｅｔ
ａ１．Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
Ｃａｎｄｉｄａｓｐ．９９・１２５ｌｉｐａｓｅｔｏｉｍｐｒｏｖｅｉｔｓ
ｍｅｔｈａｎｏｌ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅｆｏｒｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｔａｌｙｓｉｓＢ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６２（１）：
１５一１８．
［１２］
ＪｉＱｉｎｇｃｈｕｎ，ＸｉａｏＳｕｊｉｎｇ，ＨｅＢｉｎｇｆａｎｇ，ｅｔａ１．Ｐｕｒｉｆｉ－
ｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎ
ｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔ．ｔｏｌｅｒａｎｔ
ｌｉｐａｓｅｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅ／＇ｕｇ／／ｌｏｓａＬＸＩａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉ－
ｃａｔｉｏｎｆｏｒｂｉｏｄｉｅｓｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃａｔａｌｙｓｉｓ
Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６６（３／４）：２６４－一２６９．
［１３］ＡｎａＡｕｒｅｌｉａＣｈｉｒｖａｓｅ，Ｃｈａｍｅｕａ
Ｕｎｇｕｒｅａｎｕ，Ｌｕｍｉｎｉｔａ
Ｔｃａｃｅｎｃ，ｅｔａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｓｃｈａｒａｃｔｅｒ－ｉｓｔｉｃｓａｓ
ｌｉｐａｓｅｐｒｏｖｉｄｅｒｓｆｏｒｅｎｚｙｍａｔｉｃｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａ－
ｔｉｏｎｔｏ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ［Ｊ］．Ｒｅｖｉｓｔａｄｅ
Ｃｈｉｍｉｅ，２０１０，６１（９）：
８６６－一８６８．［１４］
Ｒｉｓａ
Ｋｏｄａ，Ｔａｋａｏ
Ｎｕｍａｔａ，Ｓｈｉｎｊｉ
Ｈａｍａ，ｅｔ
ａ１．Ｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ
ｏｆｒａｐｅｓｅｅｄ
ｏｉｌ
ｔｏ
ｐｒｏｄｕｃｅ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｆｕｅｌ
万方数据
ｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙ
Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ
ｌｉｐａｓｅ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ｆｕｎｇｕｓｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｔａｌｙｓｉｓＢ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６６（１／２）：
ｌＯｌ—１０４．
［１５］
谭天伟，鲁吉珂，聂开立，等．酶法合成生物柴油工业化研究进展［Ｊ］．生物工程学报，２０１０，２６（７）：９０３—９０６．
［１５］
ＴａｎＴｉａｎｗｅｉ，ＬｕＪｉｋｅ，ＮｉｅＫａｉｌｉ，ｅｔ
ａ１．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｏｎ
ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗｉｔｈｅｎｚｙｍａｔｉｃｃａｔａｌｙｓｉｓ
ｉｎＣｈｉｎａ
［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ
ｏｆ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２６（７）：
９０３——９０６．
［１６］
里伟，杜伟，刘德华，等．固定化Ｒ．ｏｒｙｚａｅ细胞
发酵产胞内脂肪酶及其催化制备生物柴油［Ｊ］．高校
化学工程学报，２００８，２２（５）：８２２—８２７．
［１６］
ＬｉＷｅｉ，ＤｕＷｅｉ，ＬｉｕＤｅｈｕａ，ｅｔａ１．ＩｎｔｒａｃｅｉｌｕｌａｒｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＲ．ｏｒｙｚａｅｃｅｌｌ
ａｎｄ
ｉｔｓｕｔｉｌｉｚｉｎｇ
ｆｏｒｗｈｏｌｅｃｅｌｌｃａｔａｌｙｚｅｄｂｉｏｄｉｅｓｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＣｈｉｎｅｓｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ，２００８，
２２（５）：８２２＿一８２７．
［１７］
李军红，姜绍通，童洋洋．产脂肪酶真菌的筛选及产酶条件优化［Ｊ］．安徽农业科学，２０１１，３９（２６）：
１５８４０—１５８４２．
［１７］ＬｉＪｕｎｈｏｎｇ，ＪｉａｎｇＳｈａｏｔｏｎｇ，ＴｏｎｇＹａｎｇｙａｎｇ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｏｆ
ｆｕｎｇｉ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｌｉｐａｓｅ
ａｎｄ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｌｉｐａｓｅ－
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ。２０１ｌ，３９（２６）：１５８４０－－－１５８４２．
［１８］阎金勇．白地霉Ｙ１６２Ｊ指肪酶基因克隆与表达［Ｄ］．武汉：华中科技大学，２００７．
［１８］
ＹａｎＪｉｎｙｏｎｇ．Ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅｇｅｎｅ
ｆｒｏｍ
Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｃａｎｄｉｄｕｍ
Ｙ１６２【ＤＪ．
Ｗｕｈａｎ：
ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７．
［１９］
张云波，刘其友，贾惠平，等．一株脂肪酶的筛选和产酶条件及其酶性质的研究［Ｊ］．广西大学学报（自然科学版），２００７，３２（３）：２７０一２７３，２７７．
［１９］
ＺｈａｎｇＹｕｎｂｅ，ＬｉｕＱｉｙｏｕ，Ｊｉａ
Ｈｕｉｐｉｎｇ，ｅｔａ１．Ａｓｔｒａｉｎｏｆ
ｌｉｐａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ：
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ａｎｄ
ｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ【ＪＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ
ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ），２００７，３２（３）：２７ｍ一２７３，２７７．
［２０］
Ｂａｒｎｅｔｔ
Ｊ
Ａ，Ｐａｙｎｅ
ＲＷ，Ｙａｒｒｏｗ
Ｄ．
Ｙｅａｓｔｓ：
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
【Ｍ］．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：
ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９９０，６８３－－－－６８４．
１７１４
太阳能学报
３５卷
ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ，ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＴＨＥＬＩＰＡＳＥ—ＰＲＯＤＵＣＩＮＧＳＴＲＡＩＮＳＡＮＤ
ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩｏＮｏＦＴＨＥＬＩＰＡＳＥＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ
ＭｉａｏＣｈａｎｇｌｉｎｌ，ＬｕｏＷｅｎｌ，ＬｖＰｅｎｇｍｅｉｌ，ＬｉＨｕｉｗｅｎｌ，ＹａｎｇＬｉｎｇｍｅｉｌ，
Ｙｕａｎ
（Ｉ．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲｅｎｅｗａｂｌｅ
Ｅｎｅｒｇｙ
Ｚｈｅｎｈｏｎ９１，ＪｉａｎｇＪｉａｎｃｈｕｎ２
ｏｆＥｎｅｒｇｙ
Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ，ＣＡＳ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ；
ａｎｄＧａｓＨｙｄｒａｔｅ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙｏｆＦｏｒｅｓｔＰｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡＦ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００４２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅＭ．４ｓｔｒａｉｎ
ｗａｓ
ａｃｈｉｅｖｅｄｂｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｒｏｍｔｈｅｓｏｉｌ
ｎｅａｒ
ＧｕａｎｇｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｅｒｇｙＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
ｏｎ
（ＧＩＥＣ）．Ｔｈｉｓ
ｓｔｒａｉｎＷａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＳｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｗｏｆｏｒｓｔｒａｉｎｂａｓｅｄ
ｗｅｒｅ
ｉｔｓ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｒＤＮＡＩＴＳ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｌｉｐａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＭ一４ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ａｒｅ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ．Ｔｈｅｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｓｏｕｒｃｅ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｓ：ｃａｒｂｏｎ
ｓｏｕｒｃｅ
ｉｓｓｌｕｃｏｓｅ２％＋ｏｌｉｖｅｏｉｌ３％；ｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｉｓｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ５％；ｔｈｅｐＨ
ｖａｌｕｅｉｓ７．Ｏ：ｔｈｅｔｉｍｅｏｆｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｉｓ９０ｈ；ｏｐｔｉｍａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｓ３０ｏＣ．Ａｔｔｈｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｌｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ
ｃａｎ
ｒｅａｃｈ１２．２Ｕ／ｍＬ．
ｔｅｓｔ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｉｐａｓｅ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
万方数据