荧光探针定量PCR技术原理及应用
PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR（FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名) ”。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术。
1.原理
FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’ → 3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→ 3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测(图2)，为新的PCR定量原理创造了条件。
图1.TaqMan PCR反应模式
（A）聚合反应：（B）链置换；（C）裂解；
（D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA；FP：上游引物；RP：下游引物）
图2.FQ-PCR实时动力学曲线
ABI公司首先根据上述原理研制了ABI 7700 等系列定量PCR仪，在PCR反应中设置标准模板系列（一般5~7个标准浓度）反应管和空白对照管。通过实时检测反应管中的荧光信号，计算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表样品管荧光报告基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ = RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量。当荧光信号增强到某一阈值（根据荧光信号基线的平均值和标准差，计算出以99.7%的置信度大于平均值作为阈值）时，标准模板反应管所用的循环次数（Ct值）就被记录下来。Ct值与标准模板数量的对数值之间有严格的线性关系[3]，利用系列标准模板的Ct值，制成标准曲线(图3)，根据待测样品的Ct值，就可在标准曲线中确定待测样品起始的DNA数量。根据数据处理，即可得出定量结果。探针设计一般应符合以下条件[2]：①探针长度应在20~40个碱基左右，以保证结合的特异性。②GC碱基含量在40%~60%，避免单核苷酸序列的重复。③避免与引物发生杂交或重叠。④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。
图3.FQ-PCR 标准曲线
2. 技术特点
2.1 封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性
传统PCR于反应结束后取出反应液，通过电泳染色和紫外仪观察结果。扩增产物在开放状态下分析，对实险室的污染是不可避免的。因污染而导致假阳性，成为PCR临床实验诊断技术应用一个难以逾越的障碍。FQ-PCR在全封闭状态下实现PCR扩增和产物分析，完全杜绝了扩增产物污染而导致的假阳性。至于样品间的污染，无论从目的基因的数量、浓度还是颗粒大小分析，都比较容易控制。我国PCR临床应用出现问题，产物污染所致假阳性是主要原因之一。
2.2 基因的定量检测，扩展了临床应用空间
传统PCR对基因的检测只能定性，不能定量主要是由扩增产物积累的动力学所决定的：①PCR产物在扩增过程中呈指数积累，当产物增加到一定程度，产物就停止了指数积累。不同起始模板，其指数增长期所用的循环是不同的，因此，不同数量基因的样品在同一循环次数中积累的产物不能作为样品基因定量的依据；②PCR产物积累到一定程度就不能再增加，再进入平台期。为了扩大PCR检出的灵敏度通常要增加循环次数，循环次数增加使得样品目的基因含量高的反应管已进入平台期，终产物量并不代表样品目的基因含量；③PCR反应的管间扩增效率差异总是存在的，既然PCR产物呈指数增长，由扩增效率差异引起的产物扩增差异也呈指数积累，增加循环次数势必增加终产物的差异，而减少循环次数又降低了检测的灵敏度。FQ-PCR采用实时检测，使所有含有不同数量的目的基因均在同一条件（达到荧光阈值）下进行分析，因而更具有可比性。而且，这一条件处于扩增产物指数积累初期，合成产物所需的dNTP、酶、离子均处于饱和的最佳状态，所以FQ-PCR循环参数与起始模板间有良好的线性关系（相关系数＞0.95），实现了极为精确的基因定量检测。
2.3 光谱技术进一步提高了灵敏度
FQ-PCR 技术已用于单细胞基因诊断，灵敏度已达到极限水平，即检测单拷贝基因，而传统PCR是不易做到的。灵敏度提高得益于光谱技术。
2.4 荧光探针杂交，进一步提高了特异性
PCR 扩增中常会出现非特异性扩增和引物二聚体，从而影响了对特异电泳带的判断。FQ-PCR通过特异性探针杂交信号检测PCR扩增产物，相当于PCR反应过程中自动完成了Southern杂交，进一步提高目的基因检测的特异性。
2.5 扩增与自动分析一体化，检测更加简便和快速
FQ-PCR通过计算机和分析软件，使PCR扩增、产物检测和定量分析一体化，比传统定性PCR更为简便和快速，同时也避免了传统PCR产物分析中有害物质对人体的影响，计算和数据处理也有利于科研和临床资料的保存和分析。
3. 临床应用概要
科学研究已经证明，人类疾病大都直接或间接与基因有关，临床实验医学正进入基因诊断时代。但对于许多疾病的发生和发展来说，相关基因不是有无问题，而是一个从量变到质变的过程，基因定量检测更具有临床意义。
3.1 感染性疾病
PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~102基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。
定量PCR研究资料已表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。许多研究表明，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关；有也研究表明，HIV病毒载量低于一定值时，没有传染性。
在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现，病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如，干扰素治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感，低拷贝者敏感；而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作
用。
3.2 肿瘤
尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚，但相关的基因的遗传学改变的积累，是致癌性转变的根本原因已被普遍接受。
癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。
几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技术可通过检测BCR/ABL融合基因的表达确定微量残余恶性细胞存在的数量，以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。
肿瘤标记物质也是肿瘤诊断的热门研究领域。目前临床对此多用免疫学方法检测，灵敏度低，一般需要达到108个分子数。用定量逆转录(RT)-PCR方法，一般条件下可检出10-102某种标志物的mRNA，可大大提高检出率。
一些病毒致癌作用也与病毒载量有关，EB病毒载量的FQ-PCR检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和随访。
3.3 遗传病
PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。
总之，除与疾病直接相关的基因检测外，各种与疾病相关的细胞因子、激素、受体，用FQ-PCR方法检测其基因表达水平具有更高的灵敏性，更有利于疾病诊断。
参考文献
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一 荧光探针定量PCR定量检测的意义
定量检测与定性检测的最大区别就在于，定性只是检测病原体核酸的“有”或“无”，而定量可以检测病原体核酸量的“多”或“少”。
定量检测的意义：
1. 体现病原体含量与复制水平、感染程度之间的关系。
2. 评价和考核治疗效果。
3. 用于传染病发病的监控、预测与预防。
4. 作为新的愈后指标。
5. 建立新的病原体分子诊断标准。
6. 新的药物及疗法的研究与开发。
二 荧光定量PCR报告结果的读取：
荧光定量PCR是直接扩增病原体的特异性DNA或cDNA，其结果反映了标本中DNA或RNA存在的多少，结果通常用数字表示，
报告为“copies/ml”、“2U/ml”或“copies”, copy即“拷贝”，表示病原体基因组的个数，该数据越大，表明病原体在体内复制得越厉害，传染性越强。
例：HBV-DNA 定量结果报告：3.637×104 IU/ml（如果采用科学记数法表示为：3.637E+04），代表每ml血液中含有36,370国际单位乙肝病毒分子。
如果待检标本能够定量，如血液等，结果报告为多少copies/ml或2U/ml。
如果待检标本不易定量，如分泌物、痰液等，结果只报告为多少copies。
乙型肝炎病毒（HBV）
一 乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染
HBV感染是全球性公共卫生问题，世界卫生组织统计，全世界乙肝病毒携带者有3.5亿人之多。我国人群HBV携带率约为10%，有近1.3亿人感染HBV，是世界上最大的“肝炎大国”。
HBV感染后临床表现呈多样性，可表现为重症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者，其中部分慢性肝炎可演变成肝硬化或肝癌。HBV携带者因无症状，不易被察觉，其作为传染源的危害性比患者更甚。 HBV病毒颗粒呈球形，具有双层的衣壳，HBsAg镶嵌于脂质双层的外衣壳中。HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染的主要标志，可刺激机体产生保护性抗体即HBsAb。
HBcAg位于内衣壳部分，其外被HBsAg所覆盖，不易在血循环中检出。其抗原性较强，能刺激机体产生HBcAb。HBcAb lgG在血中持续时间较长，为非保护性抗体。HBcAb lgM提示HBV处于复制状态。 HBeAg是Pre C基因（前核基因）的编码产物，是一种非结构性蛋白，为可溶性蛋白质，自肝细胞分泌入血中。HBeAg的消长与病毒体的DNA聚合酶的消长一致，故可作为HBV复制及强感染性的指标。其刺激机体产生HBeAb，对HBV感染有一定的保护作用，通常认为HbeAb的出现是预后良好的征象。
在这三对抗原、抗体系统中，核心抗原较难检测到，一般不作为临床常规检查，故称为“两对半”。其中HBsAg、HBeAg、HBcAb三项阳性称为“大三阳”， HBsAg、HBeAb、HBcAb三项阳性称为“小三阳”。
二 “两对半”检测与HBV-DNA定量
“两对半”是从免疫学水平来检测HBV感染机体后引起免疫应答，产生相应抗原抗体的含量（这个“含量”还不是定量，而只是抗原抗体的“有”或“无”），它实际上测定的是机体感染HBV后免疫应答结果的反映。由于个体反应的差异，不同的人在感染HBV后会出现不同的免疫应答，从而得到不同的“两对半”结果模式。如产生抗体、表现为“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等等。但是所有这些免疫学指标不能反映患者或病人体内病毒的复复水平及传染程度，不能提示其与乙型肝炎的发生和发展过程之间的联系。 荧光探针定量PCR技术则是从分子生物学水平直接检测HBV病毒自身的遗传物质DNA，是病毒存在和
复制的最可靠、最直接的指标。
HBsAg虽然是HBV的感染标志，但在感染的早期，或由于S基因（编码HBsAg）的低水平表达或变异，常规方法难以检出，会导致漏检。HBV-DNA检测比免疫学检测更早期、更灵敏。免疫学方法检测为HBsAg(—)的病人中，约有3%以上检测出HBV-DNA(+),健康供血者用PCR方法检测HBV-DNA，也有一定比例的阳性。HBsAg阴性的慢性肝炎中，仍有部分是HBV感染引起的。所以单凭HBsAg阳性与否来判断肝脏中HBV的复制及有无传染性是远远不够的，易造成部分慢性型病毒性肝炎的漏诊。对于HBsAg阴性或有HBV感染后的任何血清学依据都应进一步进行HBV-DNA荧光定量检测。也有时出现HBeAg(—)而HBV-DNA(+)的结果，这是因为编码e抗原的Pre C区基因极易出现变异，在Pre C区出现终止密码子，使Pre C区基因与C区基因不能转译出完整的e抗原，导致HBeAg表达缺失，机体感染HBV不表达HBeAg，当然血清学方法也不能检测出HBeAg的存在。
HBsAg(+)患者中大约有1-10%检测不出HBV-DNA，这种情况在世界各国都有报道。一方面，由于HBV-DNA整合于宿主细胞基因组，或基因变异，与常用的PCR引物、探针不匹配，PCR扩增不出相应的基因序列，因而未能检出。此外，由于HBV的复制有反转录过程，S基因（编码表面抗原）可以以2.1Kb RNA为mRNA转译成HBsAg，故在部分HBV感染中虽无病毒复制，但可长期产生HbsAg。5～10% HBV感染者表现为单项HBcAb阳性。有许多报道证明，单项HBcAb阳性的血液可以引起HBV的输血后感染。如果同时检查HBV-DNA，可以减少漏检，预防输血后肝炎的发生。
应用PCR检测发现，大多数“大三阳”病人血中能够检出HBV-DAN（检出率约为96%左右），有相当一部分人e抗原转化e抗体后，即“大三阳”转化为“小三阳”后，其血清中仍有DNA存在(检出率约为30%)，说明病毒仍未消失和停止复制。“小三阳”病人血清中HBV-DNA转阴率约为60-70%，这与病毒遗传物质突变或与宿主基因组整合、用药后复制暂停、以及血清HBV病毒炎症清除使血清中的HBV-DNA消失或下降至极低浓度（低于检测下限）有关，这种情况下并不表示病人恢复，应随访并复查血清HBV-DNA以免误症。
要特别指出的是，近年来由于抑制病毒复制的核苷类药物药物（如拉咪呋啶）在临床的大量使用，使得HBV-DNA复制水平可能会在短时期内迅速降低至不可检测水平（这时候免疫学检测指标可不发生改变），但是随着患者出现药物耐受或产生基因突变，HBV-DNA复制水平又可能呈现一种上升趋势，从而使HBV-DNA定量检测出现相对复杂的动态变化结果。
三 荧光探针PCR定量检测HBV-DNA的意义
（一）HBV-DNA定量检测，临床上以＜103 copies/ml为检测临界值，可作为乙肝病毒无复制状态或低水平复制的指标。慢性乙肝患者血清中HBV-DNA＞105 copies/ml的患者，如果体内丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平异常，应考虑接受抗病治疗。
（二）HBV-DNA定量检测是直接对HBV的遗传物质DNA进行基因扩增，是病毒复制和存在的最早期、最灵敏也是最可靠的指标，可对HBV感染作出早期诊断。乙肝病人传染性与其血清中HBV-DNA含量高低呈正相关，病人血清中HBV-DNA复制水平越高，其传染性越强。
（三）乙肝的治疗目前尚无特效方法，常用的有干扰素和拉咪呋啶。临床上一般认为用药后HBV-DNA下降到105 copies/ml以下为对药物完全应答；定量下降大于2个数量级(102)为对药物部分应
答；未达上述标准为低应答或无应答。研究表明，对于干扰素治疗：(1)治疗前HBV低水平复制者对 干扰素的反应性明显优于高水平复制者。HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV-DNA含量较低者，而治疗前HBV-DNA含量特别高者大多疗效不佳；(2)治疗中病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。相反，治疗
期间HBV-DNA水平下降较慢，或下降幅度较小，或变化不明显者，大多治疗无效；(3)治疗结束后，采用PCR定量法监测，HBV-DNA完全转阴一年以上者，可能不再复发，而终止治疗后HBV-DNA仍保持较低水平者，反跳的可能性较大。核苷类药物拉咪呋啶有显著降低高病毒载量作用，近期疗效颇有优势，但是长期使用可导致HBV基因突变，患者易产生耐受性，且易出现停药后反弹。
（四）肝移植前患者血清HBV-DNA水平的高低决定移植后肝脏是否再感染HBV。因为HBV主要侵犯肝脏，建议移植前使用抗HBV药物，最大限度降低血清HBV-DNA浓度，有助于防止HBV侵犯移植后肝脏，提高肝脏移植的效果。
（五）乙肝妇女怀孕前进行定量PCR测定，有助于选择有利的怀孕时机，要选择低病毒载量时受孕。乙肝孕妇怀孕期间定期进行定量PCR检查，有助于使部分病人得到及时、正确的诊断，减少宫内感染的风险；母—婴传播多发生于胎儿期和围生期。尤其是HBsAg和HBeAg双阳性的母亲，体内HBV-DNA复制水平相对较高，发生胎内传播和围生期感染的机率均较高。因HBV可通过乳汁直接传染给婴儿，哺乳期妇女，除血液检测外，还应进行乳汁HBV-DNA检测，以决定是否母乳喂养。
丙型肝炎病毒(HCV)
一 丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)感染
丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3%，估计约1.7亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。
丙肝病毒呈球形，有包膜，是一种单正链RNA病毒，主要在肝细胞内复制。基因组由9个基因区组成，编码糖基化包膜蛋白E1区和E2区基因极易出现变异。丙肝病毒体外培养至今尚不成功。
HCV感染引起的临床过程轻重不一，可表现为急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。HCV感染的重要特征是易于慢性化，急性期后易于发展成慢性肝炎，部分病人可进一步发展为肝硬化或肝癌。40%~50%的丙肝患者可转变成慢性肝炎。多数慢性肝炎患者的临床表现不明显，发病时已呈慢性过程，约20%慢性肝炎可发展成肝硬化。HCV感染与肝癌的发生有密切关系，在意大利、希腊、日本等国肝癌患者血中，50%~70%抗-HCV阳性，我国肝癌患者血中约10%存在抗-HCV阳性。用RT-PCR技术可从约10%的肝癌组织中检出HCR-RNA。
HCV主要通过输血传播，是输血后肝炎致病因子。免疫学标志仅有抗-HCV一项，为非中和抗体。 全国血清流行病学调查资料显示，我国一般人群抗-HCV阳性率为3.2%。各地抗-HCV阳性率有一定差异。
HCV在体内呈低水平复制，病毒血症水平较低，不易诱导高水平的免疫应答；HCV亦可存在于肝外组织或外周血单核细胞中，使病毒感染不易清除。因为E1区和E 2区基因具有高度变异性，导致丙肝病毒包膜蛋白的抗原性快速变异，这种变异引起的免疫逃避作用，是病毒在体内持续存在，感染易于慢性化的主要原因，也是丙肝病毒疫苗研制的最大障碍。不同地区的不同个体、同一个体的不同时期、同一样品的不同克隆之间，丙型肝炎病毒的基因序列都存在着差异性。
二 荧光探针PCR定量检测HCV-RNA的意义
（一）HCV-RNA荧光定量PCR检测，临床上以＜80 copies/ml为检测临界值，可作为丙肝病毒无复制状态或低水平复制的指标。慢性丙肝患血清中HCV-RNA＞103copies/ml的患者应接受抗病毒治疗。血清HCV-RNA＜107copies/ml的患者抗病毒治疗的疗效常优于HCV-RNA含量更高者。
（二）荧光探针PCR定量检测HCV-RNA可以大大提高检测的窗口期。暴露于HCV后1～3w，在外周血可检
测到HCV-RNA。丙肝的免疫学指标只有抗-HCV抗体一项，血清学筛查HCV抗体的“窗口期”约达三个月之久。在急性HCV感染者出现临床症状时，仅50%～70%患者抗-HCV阳性，3个月后约90%患者抗-HCV转 阳，少数人感染HCV后不产生抗-HCV。故在免疫学检测的“窗口期”或一部分不产生抗体的丙肝病毒携带者，都可出现HCV-RNA(+)，抗-HCV(-)的检测结果。
（三）慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这只表示曾经感染了丙肝病毒并出现了相应的免疫应答，并不代表体内仍有丙肝病毒的存在或复制，这时只能通过HCV-RNA定量检测鉴别丙肝病毒的活动性和复制程度。有些人抗-HCV阳性，但可表现为ALT水平正常，HCV-RNA(-)。当然也不排除由于HCV基因变异，或是PCR抑制效应而导致的假阴性结果。
（四）HCV-RNA病毒载量与抗-HCV滴度以及ALT水平呈正相关，抗-HCV滴度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。HCV-RNA常在ALT恢复正常前转阴，但也有ALT恢复正常而HCV RNA持续阳性者。
（五）HCV-RNA病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可作为抗病毒疗效评估的观察指标。丙型肝炎治疗有一定疗效，治疗后血清HCV-RNA转阴率可高达50%～80%，但停药后约半数HCV-RNA又转阳，复发时间多在治疗后6～12个月，若治后12个月ALT持续正常，血清HCV-RNA阴性，则可能治愈。抗-HCV阴转与否不能作为抗病毒疗效的指标。
（六）HCV主要在肝脏内进行复制，肝移植后丙型肝炎复发与移植时HCR-RNA水平及移植后免疫抑制程度有关。
（七）HCV 主要通过输血和血制品传播，同时，未经严格消毒的手术器械、注射器等也是其经破损的皮肤和黏膜传播的重要途径。医疗纠纷呈倍增长的年代，面对医疗纠纷中的“举证倒置”，更有必要对病人，尤其是手术和接受输血的病人进行入院前后HCV-RNA定量检测。
结核分枝杆菌（TB）
一 结核分枝杆菌(tubercle bacilli，TB)感染
结核杆菌属分枝杆菌属，因繁殖时有分枝生长趋势而得名。由于菌体含大量分枝菌酸，故不易着色，但在加温或延长染色时间着色后能抵抗盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌。
结核杆菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生状况的改善，世界各国结核的发病率和死亡率曾大幅度下降。20世纪80年代以后，由于艾滋病流行以及结核分枝杆菌耐药菌株的出现，结核病的发病率又有不断上升的趋势WHO最新统计，全球每年新发病例800万左右，其中发展中国家占95%。
我国2000年第四次全国结核病流行病学调查结果表明，我国有4～5亿人已受结核分枝杆菌感染，估计全国有活动性肺结核患者451万。全国结核病死亡率为44.5%，每年死于结核病者达13万人，
为各种其它传染病和寄生虫病死亡总和的2倍。青壮年结核病死亡占结核病死亡的48%。目前，我国结核病流行形势仍十分严峻，结核病尚未得到有效控制，为全球结核病高负担国家之一。其特点为高感染率，高患病率，高死亡率，高耐药率，低递降率，农村疫情高于城市，青壮年结核病患病和死亡比例高。 结核杆菌侵入肺泡后被巨噬细胞吞噬，由于菌体含有大量的脂质，能抵抗巨噬细胞的杀菌作用而大量繁殖，导致巨噬细胞裂解，释放出大量细菌而引起肺泡渗出性炎症，形成原发性结核。原发性肺结核多见于儿童。
继发感染多见于成年人。当人体抵抗能力下降时，残存于原发灶的结核分枝杆菌会再度大量繁殖而发病，且容易发生肺部干酪样坏死和空洞形成，菌可随痰排出，称为开放性结核。
部分患者，结核杆菌可经血液、淋巴液扩散侵入肺外组织器官，引起相应的脏器结核，如脑、肾、骨、关节、生殖器官等结核。艾滋病等免疫力极度低下者，严重时可造成全身播散性结核。痰菌被咽入消化道也可引起肠结核、结核性腹膜炎等。结核杆菌的肺外感染在临床上更容易误诊。近年来有许多报道，肺外结核标本中结核分枝L型的检出率比较高，应引起足够的重视。
二 结核杆菌检测的方法学讨论及荧光定量PCR检测TB-DNA的意义
结核病是一种感染性疾病，病因很明确，实验室诊断是确诊的主要依据。
（一）最简单、快速、经济也是最常用的诊断方法是通过涂片染色直接观察抗酸杆菌，但是这种方法的灵敏性很差，对于结核杆菌感染者，其检出率只有30%左右。60%以上的肺结核病人以及75
%的肺外结核病人都不能通过这种传统的方法检测出来。抗酸染色的另一局限是特异性的问题，它只能做到分枝杆菌属的鉴定，而无法将结核杆菌和基他分枝杆菌区分开来。涂片阳性只表明存在抗酸杆菌，包括约85%的结核分枝杆菌和15%的非结核分枝杆菌都可以抗酸染色阳性。
（二）作为结核病诊断“金标准”的细胞培养法，一般要4—8w的时间最快者也要2w才能出阴性/阳性结果，费时费事，延误诊断，有悖于结核杆菌的快速诊断要求。
（三）结核菌素试验作为结核的辅助诊断已经存在数十年之久了，但是却没有很好的说服力，因为非结核分枝杆菌也有致敏作用而导致假阳性。结核杆菌一直没有找到病原性的特异单一抗原或是保护性特异单一抗原。人们做了无数次的尝试，希望能够成功开发出在临床上应用的诊断结核的血清学试剂盒，但都以失败而告终。在开发这种检测试剂的一次次探索中，大量的蛋白和非蛋白抗原（如酰基海藻糖，苯酚糖酯）被发掘出来，但都没有太大的临床价值。由于结核分枝杆菌跟其他一些可能致病或根本不致病的微生物具有大量相同的抗原蛋白，所以想在临床上寻找一种适合于ELISA方法的抗原十分困难。
（三）随着分子生物学技术的发展，尤其是在核酸扩增和杂交领域取得的重大进展，有助于改正现存结核诊断方法中存在的缺陷。采用荧光探针定量PCR方法检测临床标本中结核杆菌的DNA是快速诊断结核杆菌感染的一种非常有前途的方法，尤其是对于因菌量少，或细菌发生L型变异而不易分离培养成功的标本更有实用价值。目前，荧光探针PCR方法检测结核杆菌已经得到了国家药品监督管理局(sFDA)的批准，在全国推广使用。
（四）荧光定量PCR法能稳定检测10 copies结核杆菌基因组DNA，灵敏度高，特异性强。一定比例涂片或培养阴性的病人，PCR检测可为阳性。该法检测活动性肺结核患者的痰和外周血阳性率分别为49.0%和51.6%、结核性胸膜炎患者的胸腔积液和外周血阳性率分别为45.4%和38.5%，以及结核性脑膜炎患者的脑脊液和外周血阳性率分别为50.8%和42.6%，检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。
（五）若有出现涂片阳性，而PCR检测结果为阴性，首要考虑非结核分枝杆菌的感染。其次考虑操作原因，在痰液标本处理过程中，如果痰液化不够，细菌在离心过程中不能沉淀到试管底部而随上清一起去掉，会导致PCR结果的假阴性。
（六）荧光定量PCR法能反映抗结核治疗过程中痰标本中的结核杆菌的数量变化，对抗结核药物疗效有一定的监控效果。但是PCR并不能区分死菌与活菌，所以对于某些已经治愈的结核病患者，肺内若有死的结核杆菌的残留，仍可抽提到DNA，PCR检测仍可为阳性结果。
（七）对不同感染部位的标本进行TB-DNA的扩增和检测，即可诊断相应部位是否存在结核杆菌的感染。
1．痰或支气管灌洗液TB-DNA检测可辅助诊断肺结核病。
2．血液（白细胞）TB-DNA检测可辅助诊断播散性肺结核和各脏器的肺结核病。
3．脑脊液TB-DNA检测可辅助诊断中枢神经系统结核病。
4．宫颈拭子或尿液TB-DNA检测可辅助诊断泌尿生殖道结核病。
5．胸腹水TB-DNA检测可以辅助诊断结核性胸膜炎。
肺炎衣原体(CP)
一 肺炎衣原体(chlamydia pneumonia，CP)感染
肺炎衣原体主要寄生于人类的呼吸道，是引起呼吸道感染的重要病原体之一。人类是肺炎衣原体的惟一宿主。
肺炎衣原体系人与人之间经飞沫或呼吸道分泌物传播，在密切接触的家庭或在人群密集的医院等公共场所更易传播。其感染扩散速度较为缓慢，具有散发和流行交替出现的特点，在人群中流行可持续6个月左右。
CP主要引起青少年急性呼吸道感染，尤其引起儿童的咽炎、鼻窦炎、支气管炎和肺炎等。潜伏期平均30d左右，起病缓慢，临床表现为咽痛、声音嘶哑、发热、咳嗽和气促等症状，还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎。CP感染所引起的肺炎患者1～2w上呼吸道感染症状消失，而咳嗽加重，可持续1至2个月。老年患者的临床表现不易与其他原因引起的肺炎相区别，持续性咳嗽是本病的主要特点。半数肺炎患者常伴有结膜炎，也可引起肺外症状如红斑结节、甲状腺炎、格林-巴利综合征等。
近年来发现CP与冠状动脉硬化性心脏病的发生有关。采用免疫组化、分子生物学和病理学的研究结果证实在冠状动脉粥样硬化病灶中存在肺炎衣原体。不仅有肺炎衣原体的梨形结构，而且病理切片用抗肺炎衣原体特异单克隆抗体处理后呈阳性。也有资料表明肺炎衣原体的慢性感染及其所形成的免疫复合物对冠状动脉的损害，可能是引起冠状动脉硬化性心脏病病理改变的一个重要因素之一，但尚需进一步证实。 肺炎衣原体在激发哮喘中亦可能发挥作用。
在肺癌、支气管扩张患者中CP的检出率也相对较高。
CP感染的患者外周血白细胞计数大多正常，胸片无特异性，多为单侧下叶浸润，表现为节段性肺炎，严重者呈广泛双侧肺炎。
二 肺炎衣原体检测的方法学讨论及荧光探针PCR检测CP-DNA
的意义
肺炎衣原体是严格的细胞内寄生，必需在活的细胞内才能生长，所以培养条件要求更高也更不容易，一般采用HEp-2t和Hela细胞株进行培养，再用荧光特异性单克隆抗体来鉴定细胞培养中的肺炎衣原体，但是这种方法周期长，检出率低，并不适应于临床检测。
血清学方法检测肺炎衣原体特异性抗体，微量免疫荧光（MIF）试验检测肺炎衣原体较为敏感。凡双份血清抗体滴度增高4倍或以上；或单位血清特异性IgM抗体≥ 1：16或IgG抗体≥1：512，有一定的诊断价值。
分子生物学检测，采用限限制性内切酶Pst I 对肺炎衣原体的DNA进行酶切后，可获得一条474bp的DNA片段，而沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体却没有这种DNA片段。实际上由于标本中病原体的数目很少，酶切的方法往往是在细胞培养或PCR扩增后进行。但是酶切方法由于成本较高且操作复杂，并不适用于临床检测。
近年来发展起来的荧光探针PCR方法，直接扩增患者痰液、鼻洗液、咽拭子或支气管洗液等标本中（取材用深部痰液，小儿用吸痰器吸取深部痰液效果最好，用鼻咽拭子需要在上腭悬雍垂后部涂擦取分泌物拭子）肺炎衣原体的特异性核酸片段，操作简单、灵敏度高、特异性强，同时避免了常规PCR技术操作复杂
和扩增产物污染带来的假阳性等问题，被迅速应用于肺炎衣原体感染的临床检测。
同样荧光探针PCR检测还可用于观察肺炎衣原体感染的治疗效果，有效治疗后，标本中CP-DNA的拷贝数会相应地下降或转阴。
肺炎支原体(MP)
一 肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)感染
在正常人和动物的上呼吸道分泌物中可分离出多种支原体，说明绝大多数支原体构成人和动物的正常菌群。而目前所能确定引起人类呼吸道感染性疾病的也只有肺炎支原体，主要引起人类支原体肺炎。 MP主要引起呼吸道外源性感染，一般通过飞沫传播，一个四季均可发病，但多发生在夏末秋初季节，以1～15岁人群发病率较高，占小儿肺炎的20%左右，在人口密集场所或区域可达50%。婴幼儿发病率最高，占25～69%，病情严重者可发生死亡。
MP感染主要引起支原体肺炎，其病变为同质性肺炎，亦可合并支气管肺炎，故曾称为原发性非典型性肺炎。潜伏期约为2～3w，临床症状有不规则发烧，体温可达39℃，热程在1～3w左右。临床症状轻重不一，主要表现为头痛，刺激性咳嗽。婴幼儿病情较重，发病急，病程长，以呼吸困难为主，主要症状一般在10d后减轻，由于局部炎症导致的咳嗽持续时间较长，并引起支气管壁肥厚。
支原体肺炎约占非细菌性肺炎的1/3以上，或各种原因引起的肺炎的10%。MP感染与小儿支气管炎哮喘密切相关。
除支原体肺炎外，尚可引起肺外感染，咽喉炎、鼻炎、中耳炎、气管炎和支气管炎等。
实验室检查周围血白细胞一般正常或有轻度增多。
胸部X线改变多种多样，最常见的是两肺下叶片状支气管肺炎。
二 肺炎支原体检测的方法学讨论及荧光探针PCR检测MP-DNA的意义
肺炎支原体可从咳痰或咽拭子中培养出来，培养条件要求较高，分离和鉴定需1～2w，许多医院的实验室无法做此项检查，且周期太长，阳性率低，因此对临床帮助不大。
普通染色法不易着色。由于没有细胞壁，具有较大的可塑性,呈现高度的多态性，形态学方法难以鉴别。
冷凝集试验，仅有50%左右患者出现阳性，且此反应为非特异性，呼吸道合胞病毒感染、腮腺炎、流感等也可出现冷疑集素效价的升高，故只能做为辅助诊断。
酶联免疫吸附试验(ELISA)，免疫荧光法、金标免疫斑点法等都是用血清学水平检测抗体，IgG(+)不能区分既往感染与现症感染，IgM(+)的出现是急性近期感染的标志，有一定的诊断价值，有报道显示IgM的阳性率不过30%，IgM(-)并不能排除MP感染。
近年来有应用单克隆抗体采用ELISA双抗体夹心法检测支原体肺炎患者的痰、鼻洗液和支气管洗液中的42kDa多肽或190kDa P1蛋白抗原的报道。实际上，这些标本中病原体抗原的含量极微，不易检出，使得直接检测蛋白抗原的方法应用受限。
荧光探针PCR通过直接扩增痰液、鼻洗液、咽拭子或支气管洗液等标本中（取材用深部痰液，小儿用吸痰器吸取深部痰液效果最好,用鼻咽拭子需要在上腭悬雍垂后部涂擦取分泌物拭子） 肺炎支原体核酸，具有快速、敏感度高、特异性强等特点，为支原体的检测和实验研究开辟了一个广阔的前景。
荧光探针PCR检测还可用于观察肺炎支原体感染的治疗效果，据报道，有效治疗2～3w后，PCR检测可全部转阴。
淋病奈瑟菌(NG)
一 淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae，NG)感染
淋病奈瑟菌俗称淋球菌，是人类淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一宿主。
淋球菌主要通过性接触传播，侵入尿道和生殖道，其潜伏期为2～5d，引起人类泌尿生殖系统黏膜的急性或慢性化脓性感染，是我国目前流行的发病率最高的性传播病症，也是导致不育原因之一。
成人感染初期，一般引起男性前尿道炎，女性尿道炎与子宫颈炎。患者症状为：尿痛、尿频、尿道流脓、宫颈可见脓性分泌物等。如进一步扩散到生殖系统，引起慢性感染，如男性发生前列腺炎，精囊，精索炎和附睾炎；女性出现前庭大腺炎和盆腔炎等。母亲患有淋球性阴道炎时或子宫颈炎时，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎。
人对淋球菌感染无天然抵抗力，多数患者可以自愈，并出现特异IgG、IgM、IgA，但是免疫不持久，再感染和慢性患者普遍存在。
目前，淋病的发病趋势为高收入阶层发病下降，普通收入阶层发病率增加，大城市人口感染逐渐下降，中小城市人口感染增加，淋病从城市走向农村，农村病人增多。
由于病人多隐瞒病史(接触史)，给诊断带来困难，延误治疗。
二 淋球菌感染的实验室诊断及荧光探针定量检测NG-DNA的意义
（一）涂片：将患者脓性分泌物涂片，革兰氏染色后镜检，如在中性粒细胞内发现有革兰氏阴性双球菌时，结合临床症状和病史（接触史），有诊断价值。涂片法对于典型的男性淋病患者，检出率较高，但是对于女性患者，由于其分泌物中脱落细胞和抗酸杆菌等间杂其中，使得背景难以辨认，检出率很低，容易出现假阴性的结果。
（二）培养：标本在选择性培养基上培养，可出现典型菌落。氧化酶试验阳性。取典型菌落作细菌涂片可见到革兰阴性双球菌，即可诊断。但是淋球菌抵抗力极弱，离开宿主后很容易死亡，不容易分离培养成功。
（三）荧光探针PCR技术直接对可疑患者分泌物中的淋球菌DNA进行基因扩增，可在短时间内快速、准确地直接从临床各种标本中检出含量极低的病原菌。对女性疑似淋球菌引起的各种炎症的诊断及鉴别诊断起决定性作用；对男性疑似淋球菌引起的各种炎症的诊断和鉴别诊断有着重要意义。
（四）在淋球菌的传播中，症状轻者或无症状的淋球菌感染者是更重要的传染源，荧光探针PCR检测的优势还在于可对这一部分患者做到早期诊断和鉴别诊断，对预防和治疗性病意义重大。
（五）同样，淋球菌DNA检测也可用于疗效考核。有效的抗菌治疗后，标本中淋球菌DNA拷贝数会相应下降，在治愈后转阴。
解脲脲原体(UU)
一 解脲脲原体（ureaplasma urealyticum，UU）感染
解脲脲原体又叫解脲支原体、溶脲脲原体，是支原体的一种，因为能够合成尿素酶分解尿素而命名。现已明确解脲脲原体是引起性传播疾病的病原体之一。解脲脲原体的主要致病原因是掠夺宿主细胞膜固醇等脂类营养，分解尿素，产生大量毒性代谢产物氨类，损害细胞，并可促进局部形成结石。
在非淋球菌性尿道炎中，除衣原体外，解脲脲原体的感染占第二位，有30～40%的男性尿道炎是由解脲脲原体感染所致。解脲脲原体可形成继发感染，在淋球菌尿道炎患者中解脲脲原体的检出率高于非淋球菌性尿道炎的2.16倍，也是一些淋病患者治愈后仍有后遗症的原因之一。
大量的研究证明解脲脲原体与自然流产、先天缺陷、死胎和不孕症有关。自然流产1～8次妇女的宫颈分泌物或流产胎儿组织解脲脲原体的检出率为68%，其中流产超过4次以上者检出率高达80%，而正常妇
女检出率仅为10.5%。国内对2181例不孕患者研究报道，解脲脲原体检出率明显高于对照组。阳性患者经强力霉素治疗后转阴者为83.7%，其中恢复妊娠者为38.7%，说明不孕症与解脲脲原体感染高度相关。 解脲脲原体感染除引起男性非淋性尿道炎、前列腺炎、附睾炎外，还被认为与男性不育相关，男性不育患者精液中，脲原体检出率高达66.6%。检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高。
有研究证明解脲脲原体引起不孕症的原因可能是：①吸附于精子表面，阻碍精子运动；②产生神经氨酸酶样物质，干扰卵子与精子的结合；③解脲脲原体与精子有共同抗原，刺激机体产生的抗体对精子造成损伤。
二 荧光探针定量PCR方法检测UU-DNA的意义
对UU感染的病原学诊断通常可用简便的培养法和免疫荧光抗体来检测，但阳性率偏低，而且费时。培养法检测是利用脲原体能合成尿素酶分解尿素产生氨，使液体培养基pH值增高，酚红指示剂变色。一些非致病的脲原体或培养过程中的污染都可能导致假阳性的结果。荧光探针定量PCR方法通过直接检测可疑患者生殖道分泌物或尿液中的UU-DNA，具有高度的敏感性和特异性，提高了阳阳性检出率。
病原体的诊断只是为临床提供某种依据，而病原体感染后的发病时间和病情轻重均与病原体数量有关，这就要求定量结果。荧光探针定量PCR不仅可以对病原体的感染进行诊断，还可以通过检测用药前后病人UU-DNA拷贝数的变化监控病情发展。有报道显示，对解脲脲原体感染患者治疗2w后复查，阳性患者UU-DNA水平拷贝数有明显下降，其转阴率为44.7%，治疗3w后复查，则转阴率达76%，提示UU对目前临床常用于治疗性病的抗生素有一定的耐药性，应持续治疗3w以上。采用荧光探针定量PCR检测UU-DNA，具有快速、特异性高、定量准确等优点，避免盲目用药，即减少病人痛苦，缩短病程，又减轻了病人的经济负担，可以为临床评价疗效提供依据。
沙眼衣原体(CT)
一 沙眼衣原体(chlamydia trachomatis, CT)感染
沙眼衣原体严格寄生在细胞内，具有独特的发育周期。不仅可致眼部和肺部的感染，也是性传播疾病的主要病原体。近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害性，已超过淋球菌而居性传播疾病之首。在我国，在非淋球菌性尿道炎中，沙眼衣原体的感染居首位。
沙眼衣原体侵入机体后主要在粘膜上皮细胞内繁殖，且抑制宿主细胞代谢。衣原体在繁殖过程中产生的毒性代谢产物可引起细胞毒性反应及变态反应，造成病理损伤。
沙眼衣原体感染后机体免疫反应不强，维持时间短，易形成隐匿性感染，往往可反复感染。所引起的泌尿生殖系感染对男性来说主要是尿道炎，未经治疗的男性患者多数转变成慢性感染，周期性加重，或合并附睾炎和前列腺炎。在女性，可引起尿道炎、宫颈炎、严重者可并发输卵管炎及盆腔炎，妨碍妊娠并可导致生殖能力的损害。围产期母儿传播可致新生儿肺炎，沙眼衣原体母儿传播率高达30%—70%。
CT引起的泌尿生殖道感染常合并淋球菌的混合感染，淋球菌对衣原体的繁殖有激活和刺激作用。
二 沙眼衣原体检测的方法学讨论及荧光探针PCR检测CT-DNA的意义
目前沙眼衣原体的诊断由于受经济等因素的影响限制，大部分医院实验室多采用金标法或ELISA法检测沙眼衣原体的相应抗体，虽然具有快速简便和较好的特异性，但它实际上检测的是人体对沙眼衣原体的免疫反应状态。免疫学检测有个“窗口期”时间，另外，抗体检测不能判定是现症感染还是既往感染。如CT-IgM阳性，但不能确定CT在人体内一定存在，如CT-IgM阴性，也不能排除CT
的感染。
而荧光探针定量PCR能真实地反映CT的存在和繁殖情况，更重要的是可提高标本中CT检测率。从理
论上讲，只要标本中有一个病原体存在，荧光探针定量PCR就可以检测到，一般实验室也能检出10个CT-DNA基因拷贝。
有临床资料显示，荧光探针定量PCR检测疑似沙眼衣原体感染的男性尿道炎患者尿道分泌物，沙眼衣原体阳性率为25%，女性宫颈炎患者宫颈分泌物沙眼衣原体阳性率高达40%，平均拷贝数达105数量级。荧光探针定量PCR提高了CT的阳性检出率，实现了CT的快速、早期和特异（其特异性可达100%）诊断，同时又可作为疗效观察的可靠指标。
单纯疱疹病毒(HSV)
一 单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）感染
单纯疱疹病毒是疱疹病毒的典型代表，由于在感染急性期发生水疱性皮疹即所谓单纯疱疹而得名。本病毒以引起多种类型感染和疾病而日益受到重视。
HSV感染80～90%为隐性感染，大多无临床症状或呈亚临床表现，显性感染只占少数，最常见的是黏膜或皮肤局部出现疱疹。HSV-I感染主要引起口唇疱疹，疱疹性结膜炎、脑炎和皮肤性疱疹，6个月～2岁婴幼儿容易发生HSV-I原发感染。HSV-II主要引起生殖器疱疹，原发性生殖器疱疹中80%由HSV-II引起，少数由HSV-I所致，可通过性行为传播。
人体的HSV原发感染后很快产生特异性免疫，能将大部分病毒清除，但少数病毒可长期存留于神经细胞内，病毒在细胞内并不大量增殖破坏细胞，此时称为潜伏感染。只有当人体受到各种非特异的刺激，如发热、寒战、日晒、月经来潮、情绪紧张或在某些细菌、病毒感染或用肾上腺皮质等影响下，病毒基因被激活，病毒又重新沿着神经纤维轴突移行至神经末稍支配的上皮细胞内增殖，再次产生疱疹，称为复发。HSV的复发往往在同一部位。
HSV原发感染后1w左右，血中出现中和抗体，3～4w达高峰，可持续多年。这些抗体可中和游离病毒，阻止病毒在体内扩散，但不能消除潜伏于神经节中的病毒和阻止复发。
妊娠期妇女因HSV-I原发感染或潜伏感染的病毒被激活，HSV可通过胎盘感染胎儿，可引起胎儿畸形、智力低下、流产等。分娩时胎儿通过有HSV感染的产道也可感染而发生新生儿疱疹。新生儿疱疹多发生在头皮等暴露部位，严重时累及内脏，死亡率高达50%以上。
人们通过广泛研究和实验，认为HSV-II感染与子宫颈癌的发生有密切关系。患过生殖器疱疹的妇女，宫颈癌的发病率高，且好发部位相似，都在鳞状上皮和柱状上皮交界处；宫颈癌患者HSV-II抗体的阳性率和效价均高；分子杂交试验证明宫颈癌细胞中有HSV-II的基因片段并有特异性mRNA存在。
HSV常与HIV-I同时感染，并能促进病情发展，引起严重的局部和播散性感染。目前认为HSV是一种调节因素，能激活HIV复制。
二 荧光探针定量PCR技术检测HSV-DNA的意义
（一）虽然分离培养法是检测HSV的金标法，但其有费时、繁琐的缺点。临床上常用的ELISA和间接免疫荧光法(IFA)来检测HSV特异性抗体，但在在疾病早期（即病毒“窗口期”），血液中不易检测到病毒抗体，此时，宜首选荧光探针定量PCR法进行检测。研究证实，在生殖器溃疡愈合过程中，荧光探针定量PCR检测无症状排毒更为敏感。因此，对于疱疹已结痂者，或无痂状排毒的患者，用荧光探针定量PCR法检测单纯疱疹病毒可作为首选方法。
（二）对处于育龄期的女性患者来说，HSV的感染应引起高度重视，以免因HSV感染而导致胎儿畸形的可能性发生。由于HSV感染与宫颈癌关系密切，曾经感染或已经感染有生殖器疱疹的妇女，应特别警惕生殖器疱疹感染引发的宫颈癌变。因此，荧光探针定量PCR检测对早期筛查HSV感染、预防宫颈癌的发生有十
分重要的意义。
（三）对临床上由HSV-I型或HSV-II型感染所致的疱疹性角膜炎、咽炎、脑膜炎、生殖器各类疱疹、宫颈癌、先天性及新生儿感染、胎儿畸形等各种疾病，特异、敏感、快速、方便的PCR技术对其原发感染或潜伏感染，可先于免疫学抗体出现前做出HSV感染的早期诊断。
（四）可以用于分型，通用型可以检测HSV-I或HSV-II的感染，HSV-II检测单独HSV-II引起的感染。
（五）可以用于考核疗效与预后，并可进行HSV分子病毒学及流行病学研究。HSV感染经治愈后，其荧光探针PCR法检测HSV-DNA呈阴性，而这时抗体检测仍可为阳性结果。
梅毒螺旋体(TP)
一 梅毒螺旋体感染
梅毒螺旋体又称苍白螺(Treponema pallidum，TP)又称苍白螺旋体，是引起人类梅毒的病原体，属于性传播疾病中较危害的一种。
我国现阶段，梅毒发病率呈逐渐上升趋势.
在自然情况下，梅毒螺旋体只感染人类，人是梅毒的惟一传染源。梅毒可分为后天性和先天性两种，前者通过性接触传染，后者从母体通过胎盘传染给胎儿。
后天性病毒要分为三期，表现为反复、潜伏和再发现象。
第一期梅毒：梅毒螺旋体经外生殖器皮肤粘膜感染，约在感染后3w左右局部出现无痛性硬性下疳，其溃疡渗出物中含大量的梅毒螺旋体，传染性极强。约1个月，下疳常自然愈合。梅毒螺旋体进入血液中，经2～3个月无症状的潜伏期后进入第二期。
第二期梅毒：全身皮肤粘膜出现梅毒疹，周身淋巴结肿大。在梅毒疹和淋巴结中，有大量的梅毒螺旋体，如不治疗，一般3周～3个月后体征可消退。
从硬性下疳至梅毒疹消失后一年，这段时间称早期梅毒（即一、二期梅毒），此期传染性强，但是破坏性小。
第三期梅毒：亦称晚期梅毒。此期不仅出现皮肤粘膜溃疡性坏死病灶，并侵犯内脏器官或组织，严重者10～15年后，引起心血管及中枢神经系统病变。此期病灶中不易找到梅毒螺旋体，传染性小、病程长，但破坏性大，可危及生命。
先天性梅毒是梅毒孕妇患者的梅毒螺旋体通过胎盘进胎儿血流，并扩散至肝、脾、肾上腺等内脏中大量繁殖，引起胎儿的全身性感染，导致流产、早产或死胎；或出生活的梅毒儿，呈现锯齿形牙、间质性角膜炎、先天性耳聋等症状。
在感染的所有阶段，梅毒患者都能产生两类抗体。一类是抗梅毒螺旋体抗体，在补体存在时，可通过ADCC作用而将梅毒螺旋体杀死或溶解。另一类是抗心磷脂抗体，称为反应素(regain)，能与生物组织中的脂质发生反应。反应素无保护作用，仅可用于梅毒的血清学诊断。
梅毒螺旋体的抵抗力极弱，对温度和干燥特别别敏感。血液中4℃放置3d可死亡，故血库4℃冰箱储存3d以上的血液无传染梅毒的危险。
二 梅毒螺旋体检测的方法学讨论和荧光探针定量PCR检测TP-DNA的意义
（一）显微镜检查：从下疳渗出液、梅毒疹渗出液或局部淋巴结抽出液中直接用暗视野显微镜观察运动活泼的梅毒螺旋体；活体组织检查常用镀银染色法，但易与类似梅毒螺旋体的其他物质易混淆。适应于早期梅毒的论断，阳性结果可确诊，但是此法检出率低，阴性结果不能排除患病可能。
（二）非梅毒螺旋体抗原血清试验：包括性病研究实验室试验（VDRL）、不加热血清反应素试验（USR）、快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）和甲苯胺红不加热血清反应素试验（TRUST）。目前，我国大多数实验室采用是USR和RPR，作为梅毒诊断的常规试验和大量人群的初筛试验。这类方法的原理是采用正常牛心脂质作为抗原，测定清中的反应素（抗脂质抗体）。由于其抗原为非特异性，一些非梅毒疾病如高脂血症、红斑性狼疮、类风湿性关节炎、孕妇等均可出现假阳性。当抗体含量过高时，易出现假阴性反应，即前带现象。
（三）梅毒螺旋体抗原血清试验：1. 荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS），本法为间接免疫荧光法，特异性强，敏感性也高，尤其适应于早期梅毒的诊断。但该法操作繁琐，需使用荧光显微镜，且病人经药物治疗后，仍持续数年甚至终生出现阳性反应，故不宜用于疗效监测。2. 梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA），是一种间接凝集试验，检测血清中特异性梅毒螺旋体抗体，其效价在1:80以上为阳性，日目前国内许多医院常用的梅毒血清确认试验。TPHA的敏感性和特异性较高，缺点是试剂成本较高，操作较麻烦，且易发生自凝现象和假阳性。3. 梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA），简便易行，但同样存在病人经药物治疗后，抗体仍持续数年甚至终生出现阳性反应，故不宜用于疗效监测。
（四）梅毒螺旋体不能进行体外培养。检测临床标本中梅毒螺旋体最敏感、可靠的方法是兔感染试验（RIT），RIT能证实活的梅毒螺旋体存在，是检测梅毒螺旋全常用的标准方法，然而由于操作的繁琐，该方法并不能作为临床检测中常规的诊断方法。
（五）荧光探针定量PCR检测TP-DNA的意义
1．荧光探针PCR直接检测梅毒螺旋体DNA，其敏感性、特异性均优于血清学方法（理论上，PCR检测梅毒螺旋体的敏感性和家兔感染试验相同），是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。
2. 针对梅毒的不同时期存在和繁殖的不同部位，采取相应的标本，局部分泌物（一期）、皮疹/淋巴结穿刺液（二期）、溃疡部位刮片（三期）、血液（各期），可以快速准确的诊断梅毒螺旋体的感染。因梅毒螺旋体常可引起中枢神经系统的病变，而早期常不表现出临床症状，因此，脑脊液标本的PCR检测，有助于快速准确地诊断神经性梅毒。梅毒孕妇患者的羊水亦可检测到TP-DNA的存在，这对于预防新生儿的先天性梅毒感染，有着积极意义。
3. 对新生儿梅毒螺旋体感染的高危人群，血清学试验无法将无症状感染婴儿同非感染婴儿区别开来，因为母亲的IgG可传递给胎儿，在此种情况下，PCR检测血液或脑脊液是确诊梅毒螺旋体感染的最好方法。
4. 梅毒并不是个非常可怕的疾病，是可以根治的，关键在于早期的诊断和早期的治疗，由于梅毒在一期、二期的时候，有一定的隐匿性，容易造成漏诊和误诊。对于早期梅毒，荧光探针定量PCR检测TP-DNA比血清学方法要敏感得多。另外由于IgG终身存在，所以很难评价治疗效果，荧光探针定量PCR检测为考核疗效提供了最客观的依据。
人类免疫缺陷病毒（HIV）
1. 艾滋病病毒感染
艾滋病病毒简称HIV，是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而破坏人的免疫系统，最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对各种疾病的抵抗能力而发病并死亡。
病毒广泛存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物、唾液、 尿液、乳汁、脑脊液、有神经症状的脑组织液，其中以血液、 精液、阴道分泌物中浓度最高，感染者潜伏期长，死亡率高。
现已证实HIV是嗜T4淋巴细胞和嗜神经细胞的病毒。HIV由皮肤破口或粘膜进入人体血液，主要攻击和破
坏的靶细胞T4淋巴细胞（T4淋巴细胞在细胞 免疫系统中起着中心调节作用，它能促进B细胞产生抗体），便得T4细胞失去原有的正常免疫功能。当激活免疫反应的T4细胞几乎全部被HIV消除，T4细胞抑制细胞在数量上巨增，相反病人体内T4细胞在数量上骤减，从而导致病人的免疫功能全部衰竭，为条件性感染创造了极为有利的条件。
HIV对神经细胞有亲合力，能侵犯神经系统，引起脑组织的破坏，或者继发条件性感染而致各种中枢神经系统的病变。
HIV和其它逆转录病毒一样，当逆转录酶使病毒的RNA作为模板合成DNA而成前病毒DNA整合到宿主细胞的DNA中时，HIV带有的致癌基因可使细胞发生癌性转化，特别是在细胞免疫遭到破坏，丧失免疫监视作用的情况下，细胞癌变更易发生。
2. 艾滋病毒检测的方法学讨论及荧光探针PCR检测
HIV-DNA的意义
目前检测HIV的方法有100多种，总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、p24抗原检测和病毒核酸检测。细胞培养的方法检测HIV专一性强，不会出现假阳性，对于确认那些抗原/抗体检测不确定的个体和阳性母亲新生儿是否感染HIV有着重要的意义。但是须要有一定数量的感染细胞存在才能培养和分离出病毒来，因而敏感性差、操作时间长、操作复杂，必须在特定的P3实验室中才能进行，且费用较高（每次培养需要约200～500美元），不适用于临床。p24抗原检测能够在病毒开始复制后检测到血液中的可溶性p24抗原，但易出现假阳性。因此，阳性结果必须经中和试验确认，该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据。HIV 1p24抗原检测阴性，只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。
病毒核酸检测通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，具有很高的灵敏度，使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT-PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸，减少病人痛苦，缩短病程，减轻病人经济负担，可以为临床评价治疗提供依据。
人乳头瘤病毒(HPV)
一 人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染
人乳头瘤病毒属于DNA肿瘤病毒，具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，导致不同程度的增生性病变，人类是HPV的惟一自然宿主。
目前HPV尚不能在组织细胞中培养。HPV的增殖复制与上皮细胞的分化阶段相关，完整的HPV病毒体仅在终未分化的角质层细胞中产生，分化成熟的角质层细胞很快脱落，故HPV抗原接触免疫系统的机会较少，这也是导致HPV免疫原性低，易形成持续感染的重要因素之一。
HPV的传播主要通过直接接触感染者的病损部位或间接接触被病毒污染的物品。生殖器感染主要由性接触传播，新生儿可在通过产道时受感染。HPV的病毒感染仅停留于局部皮肤和黏膜中，不产生病毒血症。 现已发现HPV有100多个型，不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不相同。其中HPV6、11型可引起尖锐湿疣、喉乳头瘤等良性病变，称为低危型HPV，而HPV16、18、33等型别与宫颈癌、宫颈上皮内瘤等恶性肿瘤的发生有关，称高危型HPV。
宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤之一，也是目前唯一发病原因清楚的肿瘤，HPV感染是宫颈癌的主要致
病原因之一，根据美国2001年癌症统计学资料，2000年全美约有12900例新发病人，死亡约4400例。我国每年新发宫颈癌病例约计13万，占全世界宫颈癌新发病例的28%。因此，宫颈癌的病因与其发病机制的研究受到国内外学者的高度重视。宫颈癌的致病因素是很复杂的，是多种因素作用的结果。许多研究表明，HPV是宫颈癌的致癌主要因素，但HPV感染并非唯一的致癌因素，HSV以及HCMV等也与宫颈癌存在密切关系。
二 荧光探针PCR检HPV-DNA的意义
（一）高危型HPV感染与宫颈癌关系密切，98%宫颈癌患者可以检出HPV。常规的组织学与细胞学方法只能对临床和病理表现典型的病例做出诊断，新发展的薄层液基细胞学检测技术采用超薄涂片技术，背景干净清晰，有利于明确诊断，但这归根结底是从细胞学水平来观察细胞的形态学改变，其中80%的患者确诊时已是宫颈癌晚期。
（二）荧光探针定量PCR方法直接检测HPV-DNA，比核酸分子杂交技术更具敏感性、特异性，快速、准确。该方法简便，能达到较为理想的结果，大大提高了HPV的检测水平，是宫颈癌预防、诊治的突破性进展。
（三）荧光探针定量PCR可以准确判断体内HPV的感染，不仅可以对组织病理改变典型的病例做出诊断，对不典型鳞状上皮细胞增生的患者同样可以做出诊断，同时还可以对亚临床和隐性HPV感染做出诊断。HPV-DNA是美国FDA规定的妇女宫颈癌筛查的必检项目。
（四）可对其进行分型（高危型HPV16、18型和低危型HPV6、11型）。
（五）可以估计病毒载量与患癌症风险，有报道显示，持续性HPV-DNA高病毒载量的妇女患宫颈癌的相关风险是HPV-DNA阴性妇女的30倍。
（六）可以考核疗效与预后。HPV-DNA载量的下降水平或消失可以判断治疗是否有效，其DNA水平的高低也是估计预后的一个重要指标。
感染性疾病的荧光探针定量PCR检测和诊断，其方法学的依据是基于直接检测和扩增病原体的遗传物质核酸(DNA或RNA)，是“现症感染”的最直接和最客观的依据，这也是它与免疫学方法的根本区别，所以标本的正确留取尤为重要，一定要对病原体感染和存在的相应部位进行正确取材，才能提高检测的阳性率和准确率。
比如肺部结核杆菌的感染，一定要取深部的痰液或肺泡灌洗液。如果只是简单地取咽拭子，其阳性率
一 荧光探针定量PCR定量检测的意义
定量检测与定性检测的最大区别就在于，定性只是检测病原体核酸的“有”或“无”，而定量可以检测病原体核酸量的“多”或“少”。
定量检测的意义：
1. 体现病原体含量与复制水平、感染程度之间的关系。
2. 评价和考核治疗效果。
3. 用于传染病发病的监控、预测与预防。
4. 作为新的愈后指标。
5. 建立新的病原体分子诊断标准。
6. 新的药物及疗法的研究与开发。
二 荧光定量PCR报告结果的读取：
荧光定量PCR是直接扩增病原体的特异性DNA或cDNA，其结果反映了标本中DNA或RNA存在的多少，结果通常用数字表示，
报告为“copies/ml”、“2U/ml”或“copies”, copy即“拷贝”，表示病原体基因组的个数，该数据越大，表明病原体在体内复制得越厉害，传染性越强。
例：HBV-DNA 定量结果报告：3.637×104 IU/ml（如果采用科学记数法表示为：3.637E+04），代表每ml血液中含有36,370国际单位乙肝病毒分子。
如果待检标本能够定量，如血液等，结果报告为多少copies/ml或2U/ml。
如果待检标本不易定量，如分泌物、痰液等，结果只报告为多少copies。
PCR检测标本的留取
感染性疾病的荧光探针定量PCR检测和诊断，其方法学的依据是基于直接检测和扩增病原体的遗传物质核酸(DNA或RNA)，是“现症感染”的最直接和最客观的依据，这也是它与免疫学方法的根本区别，所以标本的正确留取尤为重要，一定要对病原体感染和存在的相应部位进行正确取材，才能提高检测的阳性率和准确率。
比如肺部结核杆菌的感染，一定要取深部的痰液或肺泡灌洗液。如果只是简单地取咽拭子，其阳性率
荧光探针定量PCR技术原理及应用
PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR（FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名) ”。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术。
1.原理
FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’ → 3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→ 3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测(图2)，为新的PCR定量原理创造了条件。
图1.TaqMan PCR反应模式
（A）聚合反应：（B）链置换；（C）裂解；
（D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA；FP：上游引物；RP：下游引物）
图2.FQ-PCR实时动力学曲线
ABI公司首先根据上述原理研制了ABI 7700 等系列定量PCR仪，在PCR反应中设置标准模板系列（一般5~7个标准浓度）反应管和空白对照管。通过实时检测反应管中的荧光信号，计算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表样品管荧光报告基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ = RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量。当荧光信号增强到某一阈值（根据荧光信号基线的平均值和标准差，计算出以99.7%的置信度大于平均值作为阈值）时，标准模板反应管所用的循环次数（Ct值）就被记录下来。Ct值与标准模板数量的对数值之间有严格的线性关系[3]，利用系列标准模板的Ct值，制成标准曲线(图3)，根据待测样品的Ct值，就可在标准曲线中确定待测样品起始的DNA数量。根据数据处理，即可得出定量结果。探针设计一般应符合以下条件[2]：①探针长度应在20~40个碱基左右，以保证结合的特异性。②GC碱基含量在40%~60%，避免单核苷酸序列的重复。③避免与引物发生杂交或重叠。④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。
图3.FQ-PCR 标准曲线
2. 技术特点
2.1 封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性
传统PCR于反应结束后取出反应液，通过电泳染色和紫外仪观察结果。扩增产物在开放状态下分析，对实险室的污染是不可避免的。因污染而导致假阳性，成为PCR临床实验诊断技术应用一个难以逾越的障碍。FQ-PCR在全封闭状态下实现PCR扩增和产物分析，完全杜绝了扩增产物污染而导致的假阳性。至于样品间的污染，无论从目的基因的数量、浓度还是颗粒大小分析，都比较容易控制。我国PCR临床应用出现问题，产物污染所致假阳性是主要原因之一。
2.2 基因的定量检测，扩展了临床应用空间
传统PCR对基因的检测只能定性，不能定量主要是由扩增产物积累的动力学所决定的：①PCR产物在扩增过程中呈指数积累，当产物增加到一定程度，产物就停止了指数积累。不同起始模板，其指数增长期所用的循环是不同的，因此，不同数量基因的样品在同一循环次数中积累的产物不能作为样品基因定量的依据；②PCR产物积累到一定程度就不能再增加，再进入平台期。为了扩大PCR检出的灵敏度通常要增加循环次数，循环次数增加使得样品目的基因含量高的反应管已进入平台期，终产物量并不代表样品目的基因含量；③PCR反应的管间扩增效率差异总是存在的，既然PCR产物呈指数增长，由扩增效率差异引起的产物扩增差异也呈指数积累，增加循环次数势必增加终产物的差异，而减少循环次数又降低了检测的灵敏度。FQ-PCR采用实时检测，使所有含有不同数量的目的基因均在同一条件（达到荧光阈值）下进行分析，因而更具有可比性。而且，这一条件处于扩增产物指数积累初期，合成产物所需的dNTP、酶、离子均处于饱和的最佳状态，所以FQ-PCR循环参数与起始模板间有良好的线性关系（相关系数＞0.95），实现了极为精确的基因定量检测。
2.3 光谱技术进一步提高了灵敏度
FQ-PCR 技术已用于单细胞基因诊断，灵敏度已达到极限水平，即检测单拷贝基因，而传统PCR是不易做到的。灵敏度提高得益于光谱技术。
2.4 荧光探针杂交，进一步提高了特异性
PCR 扩增中常会出现非特异性扩增和引物二聚体，从而影响了对特异电泳带的判断。FQ-PCR通过特异性探针杂交信号检测PCR扩增产物，相当于PCR反应过程中自动完成了Southern杂交，进一步提高目的基因检测的特异性。
2.5 扩增与自动分析一体化，检测更加简便和快速
FQ-PCR通过计算机和分析软件，使PCR扩增、产物检测和定量分析一体化，比传统定性PCR更为简便和快速，同时也避免了传统PCR产物分析中有害物质对人体的影响，计算和数据处理也有利于科研和临床资料的保存和分析。
3. 临床应用概要
科学研究已经证明，人类疾病大都直接或间接与基因有关，临床实验医学正进入基因诊断时代。但对于许多疾病的发生和发展来说，相关基因不是有无问题，而是一个从量变到质变的过程，基因定量检测更具有临床意义。
3.1 感染性疾病
PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~102基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。
定量PCR研究资料已表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。许多研究表明，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关；有也研究表明，HIV病毒载量低于一定值时，没有传染性。
在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现，病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如，干扰素治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感，低拷贝者敏感；而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作
用。
3.2 肿瘤
尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚，但相关的基因的遗传学改变的积累，是致癌性转变的根本原因已被普遍接受。
癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。
几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技术可通过检测BCR/ABL融合基因的表达确定微量残余恶性细胞存在的数量，以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。
肿瘤标记物质也是肿瘤诊断的热门研究领域。目前临床对此多用免疫学方法检测，灵敏度低，一般需要达到108个分子数。用定量逆转录(RT)-PCR方法，一般条件下可检出10-102某种标志物的mRNA，可大大提高检出率。
一些病毒致癌作用也与病毒载量有关，EB病毒载量的FQ-PCR检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和随访。
3.3 遗传病
PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。
总之，除与疾病直接相关的基因检测外，各种与疾病相关的细胞因子、激素、受体，用FQ-PCR方法检测其基因表达水平具有更高的灵敏性，更有利于疾病诊断。
参考文献
[1] Liva K J, Flood SJA, Marmaro J, et al. Oligonucletides with fluorescent dyes at
opposite ends provide a quenched prode system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Applic, 1995,4:357-362.
[2] Holland PM, Abramson RD, Waston R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5′to 3′exonuclease activity of the
themus aquaticus DNA polymerase. Proc Nat Aca Sci USA,1991,88:7276-7280
[3] Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, et al. Stimutaneous amplification and
detection of specific DNA sequences. Biotechnology, 1992, 10:413-417.
一 荧光探针定量PCR定量检测的意义
定量检测与定性检测的最大区别就在于，定性只是检测病原体核酸的“有”或“无”，而定量可以检测病原体核酸量的“多”或“少”。
定量检测的意义：
1. 体现病原体含量与复制水平、感染程度之间的关系。
2. 评价和考核治疗效果。
3. 用于传染病发病的监控、预测与预防。
4. 作为新的愈后指标。
5. 建立新的病原体分子诊断标准。
6. 新的药物及疗法的研究与开发。
二 荧光定量PCR报告结果的读取：
荧光定量PCR是直接扩增病原体的特异性DNA或cDNA，其结果反映了标本中DNA或RNA存在的多少，结果通常用数字表示，
报告为“copies/ml”、“2U/ml”或“copies”, copy即“拷贝”，表示病原体基因组的个数，该数据越大，表明病原体在体内复制得越厉害，传染性越强。
例：HBV-DNA 定量结果报告：3.637×104 IU/ml（如果采用科学记数法表示为：3.637E+04），代表每ml血液中含有36,370国际单位乙肝病毒分子。
如果待检标本能够定量，如血液等，结果报告为多少copies/ml或2U/ml。
如果待检标本不易定量，如分泌物、痰液等，结果只报告为多少copies。
乙型肝炎病毒（HBV）
一 乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染
HBV感染是全球性公共卫生问题，世界卫生组织统计，全世界乙肝病毒携带者有3.5亿人之多。我国人群HBV携带率约为10%，有近1.3亿人感染HBV，是世界上最大的“肝炎大国”。
HBV感染后临床表现呈多样性，可表现为重症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者，其中部分慢性肝炎可演变成肝硬化或肝癌。HBV携带者因无症状，不易被察觉，其作为传染源的危害性比患者更甚。 HBV病毒颗粒呈球形，具有双层的衣壳，HBsAg镶嵌于脂质双层的外衣壳中。HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染的主要标志，可刺激机体产生保护性抗体即HBsAb。
HBcAg位于内衣壳部分，其外被HBsAg所覆盖，不易在血循环中检出。其抗原性较强，能刺激机体产生HBcAb。HBcAb lgG在血中持续时间较长，为非保护性抗体。HBcAb lgM提示HBV处于复制状态。 HBeAg是Pre C基因（前核基因）的编码产物，是一种非结构性蛋白，为可溶性蛋白质，自肝细胞分泌入血中。HBeAg的消长与病毒体的DNA聚合酶的消长一致，故可作为HBV复制及强感染性的指标。其刺激机体产生HBeAb，对HBV感染有一定的保护作用，通常认为HbeAb的出现是预后良好的征象。
在这三对抗原、抗体系统中，核心抗原较难检测到，一般不作为临床常规检查，故称为“两对半”。其中HBsAg、HBeAg、HBcAb三项阳性称为“大三阳”， HBsAg、HBeAb、HBcAb三项阳性称为“小三阳”。
二 “两对半”检测与HBV-DNA定量
“两对半”是从免疫学水平来检测HBV感染机体后引起免疫应答，产生相应抗原抗体的含量（这个“含量”还不是定量，而只是抗原抗体的“有”或“无”），它实际上测定的是机体感染HBV后免疫应答结果的反映。由于个体反应的差异，不同的人在感染HBV后会出现不同的免疫应答，从而得到不同的“两对半”结果模式。如产生抗体、表现为“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等等。但是所有这些免疫学指标不能反映患者或病人体内病毒的复复水平及传染程度，不能提示其与乙型肝炎的发生和发展过程之间的联系。 荧光探针定量PCR技术则是从分子生物学水平直接检测HBV病毒自身的遗传物质DNA，是病毒存在和
复制的最可靠、最直接的指标。
HBsAg虽然是HBV的感染标志，但在感染的早期，或由于S基因（编码HBsAg）的低水平表达或变异，常规方法难以检出，会导致漏检。HBV-DNA检测比免疫学检测更早期、更灵敏。免疫学方法检测为HBsAg(—)的病人中，约有3%以上检测出HBV-DNA(+),健康供血者用PCR方法检测HBV-DNA，也有一定比例的阳性。HBsAg阴性的慢性肝炎中，仍有部分是HBV感染引起的。所以单凭HBsAg阳性与否来判断肝脏中HBV的复制及有无传染性是远远不够的，易造成部分慢性型病毒性肝炎的漏诊。对于HBsAg阴性或有HBV感染后的任何血清学依据都应进一步进行HBV-DNA荧光定量检测。也有时出现HBeAg(—)而HBV-DNA(+)的结果，这是因为编码e抗原的Pre C区基因极易出现变异，在Pre C区出现终止密码子，使Pre C区基因与C区基因不能转译出完整的e抗原，导致HBeAg表达缺失，机体感染HBV不表达HBeAg，当然血清学方法也不能检测出HBeAg的存在。
HBsAg(+)患者中大约有1-10%检测不出HBV-DNA，这种情况在世界各国都有报道。一方面，由于HBV-DNA整合于宿主细胞基因组，或基因变异，与常用的PCR引物、探针不匹配，PCR扩增不出相应的基因序列，因而未能检出。此外，由于HBV的复制有反转录过程，S基因（编码表面抗原）可以以2.1Kb RNA为mRNA转译成HBsAg，故在部分HBV感染中虽无病毒复制，但可长期产生HbsAg。5～10% HBV感染者表现为单项HBcAb阳性。有许多报道证明，单项HBcAb阳性的血液可以引起HBV的输血后感染。如果同时检查HBV-DNA，可以减少漏检，预防输血后肝炎的发生。
应用PCR检测发现，大多数“大三阳”病人血中能够检出HBV-DAN（检出率约为96%左右），有相当一部分人e抗原转化e抗体后，即“大三阳”转化为“小三阳”后，其血清中仍有DNA存在(检出率约为30%)，说明病毒仍未消失和停止复制。“小三阳”病人血清中HBV-DNA转阴率约为60-70%，这与病毒遗传物质突变或与宿主基因组整合、用药后复制暂停、以及血清HBV病毒炎症清除使血清中的HBV-DNA消失或下降至极低浓度（低于检测下限）有关，这种情况下并不表示病人恢复，应随访并复查血清HBV-DNA以免误症。
要特别指出的是，近年来由于抑制病毒复制的核苷类药物药物（如拉咪呋啶）在临床的大量使用，使得HBV-DNA复制水平可能会在短时期内迅速降低至不可检测水平（这时候免疫学检测指标可不发生改变），但是随着患者出现药物耐受或产生基因突变，HBV-DNA复制水平又可能呈现一种上升趋势，从而使HBV-DNA定量检测出现相对复杂的动态变化结果。
三 荧光探针PCR定量检测HBV-DNA的意义
（一）HBV-DNA定量检测，临床上以＜103 copies/ml为检测临界值，可作为乙肝病毒无复制状态或低水平复制的指标。慢性乙肝患者血清中HBV-DNA＞105 copies/ml的患者，如果体内丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平异常，应考虑接受抗病治疗。
（二）HBV-DNA定量检测是直接对HBV的遗传物质DNA进行基因扩增，是病毒复制和存在的最早期、最灵敏也是最可靠的指标，可对HBV感染作出早期诊断。乙肝病人传染性与其血清中HBV-DNA含量高低呈正相关，病人血清中HBV-DNA复制水平越高，其传染性越强。
（三）乙肝的治疗目前尚无特效方法，常用的有干扰素和拉咪呋啶。临床上一般认为用药后HBV-DNA下降到105 copies/ml以下为对药物完全应答；定量下降大于2个数量级(102)为对药物部分应
答；未达上述标准为低应答或无应答。研究表明，对于干扰素治疗：(1)治疗前HBV低水平复制者对 干扰素的反应性明显优于高水平复制者。HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV-DNA含量较低者，而治疗前HBV-DNA含量特别高者大多疗效不佳；(2)治疗中病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。相反，治疗
期间HBV-DNA水平下降较慢，或下降幅度较小，或变化不明显者，大多治疗无效；(3)治疗结束后，采用PCR定量法监测，HBV-DNA完全转阴一年以上者，可能不再复发，而终止治疗后HBV-DNA仍保持较低水平者，反跳的可能性较大。核苷类药物拉咪呋啶有显著降低高病毒载量作用，近期疗效颇有优势，但是长期使用可导致HBV基因突变，患者易产生耐受性，且易出现停药后反弹。
（四）肝移植前患者血清HBV-DNA水平的高低决定移植后肝脏是否再感染HBV。因为HBV主要侵犯肝脏，建议移植前使用抗HBV药物，最大限度降低血清HBV-DNA浓度，有助于防止HBV侵犯移植后肝脏，提高肝脏移植的效果。
（五）乙肝妇女怀孕前进行定量PCR测定，有助于选择有利的怀孕时机，要选择低病毒载量时受孕。乙肝孕妇怀孕期间定期进行定量PCR检查，有助于使部分病人得到及时、正确的诊断，减少宫内感染的风险；母—婴传播多发生于胎儿期和围生期。尤其是HBsAg和HBeAg双阳性的母亲，体内HBV-DNA复制水平相对较高，发生胎内传播和围生期感染的机率均较高。因HBV可通过乳汁直接传染给婴儿，哺乳期妇女，除血液检测外，还应进行乳汁HBV-DNA检测，以决定是否母乳喂养。
丙型肝炎病毒(HCV)
一 丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)感染
丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3%，估计约1.7亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。
丙肝病毒呈球形，有包膜，是一种单正链RNA病毒，主要在肝细胞内复制。基因组由9个基因区组成，编码糖基化包膜蛋白E1区和E2区基因极易出现变异。丙肝病毒体外培养至今尚不成功。
HCV感染引起的临床过程轻重不一，可表现为急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。HCV感染的重要特征是易于慢性化，急性期后易于发展成慢性肝炎，部分病人可进一步发展为肝硬化或肝癌。40%~50%的丙肝患者可转变成慢性肝炎。多数慢性肝炎患者的临床表现不明显，发病时已呈慢性过程，约20%慢性肝炎可发展成肝硬化。HCV感染与肝癌的发生有密切关系，在意大利、希腊、日本等国肝癌患者血中，50%~70%抗-HCV阳性，我国肝癌患者血中约10%存在抗-HCV阳性。用RT-PCR技术可从约10%的肝癌组织中检出HCR-RNA。
HCV主要通过输血传播，是输血后肝炎致病因子。免疫学标志仅有抗-HCV一项，为非中和抗体。 全国血清流行病学调查资料显示，我国一般人群抗-HCV阳性率为3.2%。各地抗-HCV阳性率有一定差异。
HCV在体内呈低水平复制，病毒血症水平较低，不易诱导高水平的免疫应答；HCV亦可存在于肝外组织或外周血单核细胞中，使病毒感染不易清除。因为E1区和E 2区基因具有高度变异性，导致丙肝病毒包膜蛋白的抗原性快速变异，这种变异引起的免疫逃避作用，是病毒在体内持续存在，感染易于慢性化的主要原因，也是丙肝病毒疫苗研制的最大障碍。不同地区的不同个体、同一个体的不同时期、同一样品的不同克隆之间，丙型肝炎病毒的基因序列都存在着差异性。
二 荧光探针PCR定量检测HCV-RNA的意义
（一）HCV-RNA荧光定量PCR检测，临床上以＜80 copies/ml为检测临界值，可作为丙肝病毒无复制状态或低水平复制的指标。慢性丙肝患血清中HCV-RNA＞103copies/ml的患者应接受抗病毒治疗。血清HCV-RNA＜107copies/ml的患者抗病毒治疗的疗效常优于HCV-RNA含量更高者。
（二）荧光探针PCR定量检测HCV-RNA可以大大提高检测的窗口期。暴露于HCV后1～3w，在外周血可检
测到HCV-RNA。丙肝的免疫学指标只有抗-HCV抗体一项，血清学筛查HCV抗体的“窗口期”约达三个月之久。在急性HCV感染者出现临床症状时，仅50%～70%患者抗-HCV阳性，3个月后约90%患者抗-HCV转 阳，少数人感染HCV后不产生抗-HCV。故在免疫学检测的“窗口期”或一部分不产生抗体的丙肝病毒携带者，都可出现HCV-RNA(+)，抗-HCV(-)的检测结果。
（三）慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这只表示曾经感染了丙肝病毒并出现了相应的免疫应答，并不代表体内仍有丙肝病毒的存在或复制，这时只能通过HCV-RNA定量检测鉴别丙肝病毒的活动性和复制程度。有些人抗-HCV阳性，但可表现为ALT水平正常，HCV-RNA(-)。当然也不排除由于HCV基因变异，或是PCR抑制效应而导致的假阴性结果。
（四）HCV-RNA病毒载量与抗-HCV滴度以及ALT水平呈正相关，抗-HCV滴度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。HCV-RNA常在ALT恢复正常前转阴，但也有ALT恢复正常而HCV RNA持续阳性者。
（五）HCV-RNA病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可作为抗病毒疗效评估的观察指标。丙型肝炎治疗有一定疗效，治疗后血清HCV-RNA转阴率可高达50%～80%，但停药后约半数HCV-RNA又转阳，复发时间多在治疗后6～12个月，若治后12个月ALT持续正常，血清HCV-RNA阴性，则可能治愈。抗-HCV阴转与否不能作为抗病毒疗效的指标。
（六）HCV主要在肝脏内进行复制，肝移植后丙型肝炎复发与移植时HCR-RNA水平及移植后免疫抑制程度有关。
（七）HCV 主要通过输血和血制品传播，同时，未经严格消毒的手术器械、注射器等也是其经破损的皮肤和黏膜传播的重要途径。医疗纠纷呈倍增长的年代，面对医疗纠纷中的“举证倒置”，更有必要对病人，尤其是手术和接受输血的病人进行入院前后HCV-RNA定量检测。
结核分枝杆菌（TB）
一 结核分枝杆菌(tubercle bacilli，TB)感染
结核杆菌属分枝杆菌属，因繁殖时有分枝生长趋势而得名。由于菌体含大量分枝菌酸，故不易着色，但在加温或延长染色时间着色后能抵抗盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌。
结核杆菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生状况的改善，世界各国结核的发病率和死亡率曾大幅度下降。20世纪80年代以后，由于艾滋病流行以及结核分枝杆菌耐药菌株的出现，结核病的发病率又有不断上升的趋势WHO最新统计，全球每年新发病例800万左右，其中发展中国家占95%。
我国2000年第四次全国结核病流行病学调查结果表明，我国有4～5亿人已受结核分枝杆菌感染，估计全国有活动性肺结核患者451万。全国结核病死亡率为44.5%，每年死于结核病者达13万人，
为各种其它传染病和寄生虫病死亡总和的2倍。青壮年结核病死亡占结核病死亡的48%。目前，我国结核病流行形势仍十分严峻，结核病尚未得到有效控制，为全球结核病高负担国家之一。其特点为高感染率，高患病率，高死亡率，高耐药率，低递降率，农村疫情高于城市，青壮年结核病患病和死亡比例高。 结核杆菌侵入肺泡后被巨噬细胞吞噬，由于菌体含有大量的脂质，能抵抗巨噬细胞的杀菌作用而大量繁殖，导致巨噬细胞裂解，释放出大量细菌而引起肺泡渗出性炎症，形成原发性结核。原发性肺结核多见于儿童。
继发感染多见于成年人。当人体抵抗能力下降时，残存于原发灶的结核分枝杆菌会再度大量繁殖而发病，且容易发生肺部干酪样坏死和空洞形成，菌可随痰排出，称为开放性结核。
部分患者，结核杆菌可经血液、淋巴液扩散侵入肺外组织器官，引起相应的脏器结核，如脑、肾、骨、关节、生殖器官等结核。艾滋病等免疫力极度低下者，严重时可造成全身播散性结核。痰菌被咽入消化道也可引起肠结核、结核性腹膜炎等。结核杆菌的肺外感染在临床上更容易误诊。近年来有许多报道，肺外结核标本中结核分枝L型的检出率比较高，应引起足够的重视。
二 结核杆菌检测的方法学讨论及荧光定量PCR检测TB-DNA的意义
结核病是一种感染性疾病，病因很明确，实验室诊断是确诊的主要依据。
（一）最简单、快速、经济也是最常用的诊断方法是通过涂片染色直接观察抗酸杆菌，但是这种方法的灵敏性很差，对于结核杆菌感染者，其检出率只有30%左右。60%以上的肺结核病人以及75
%的肺外结核病人都不能通过这种传统的方法检测出来。抗酸染色的另一局限是特异性的问题，它只能做到分枝杆菌属的鉴定，而无法将结核杆菌和基他分枝杆菌区分开来。涂片阳性只表明存在抗酸杆菌，包括约85%的结核分枝杆菌和15%的非结核分枝杆菌都可以抗酸染色阳性。
（二）作为结核病诊断“金标准”的细胞培养法，一般要4—8w的时间最快者也要2w才能出阴性/阳性结果，费时费事，延误诊断，有悖于结核杆菌的快速诊断要求。
（三）结核菌素试验作为结核的辅助诊断已经存在数十年之久了，但是却没有很好的说服力，因为非结核分枝杆菌也有致敏作用而导致假阳性。结核杆菌一直没有找到病原性的特异单一抗原或是保护性特异单一抗原。人们做了无数次的尝试，希望能够成功开发出在临床上应用的诊断结核的血清学试剂盒，但都以失败而告终。在开发这种检测试剂的一次次探索中，大量的蛋白和非蛋白抗原（如酰基海藻糖，苯酚糖酯）被发掘出来，但都没有太大的临床价值。由于结核分枝杆菌跟其他一些可能致病或根本不致病的微生物具有大量相同的抗原蛋白，所以想在临床上寻找一种适合于ELISA方法的抗原十分困难。
（三）随着分子生物学技术的发展，尤其是在核酸扩增和杂交领域取得的重大进展，有助于改正现存结核诊断方法中存在的缺陷。采用荧光探针定量PCR方法检测临床标本中结核杆菌的DNA是快速诊断结核杆菌感染的一种非常有前途的方法，尤其是对于因菌量少，或细菌发生L型变异而不易分离培养成功的标本更有实用价值。目前，荧光探针PCR方法检测结核杆菌已经得到了国家药品监督管理局(sFDA)的批准，在全国推广使用。
（四）荧光定量PCR法能稳定检测10 copies结核杆菌基因组DNA，灵敏度高，特异性强。一定比例涂片或培养阴性的病人，PCR检测可为阳性。该法检测活动性肺结核患者的痰和外周血阳性率分别为49.0%和51.6%、结核性胸膜炎患者的胸腔积液和外周血阳性率分别为45.4%和38.5%，以及结核性脑膜炎患者的脑脊液和外周血阳性率分别为50.8%和42.6%，检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。
（五）若有出现涂片阳性，而PCR检测结果为阴性，首要考虑非结核分枝杆菌的感染。其次考虑操作原因，在痰液标本处理过程中，如果痰液化不够，细菌在离心过程中不能沉淀到试管底部而随上清一起去掉，会导致PCR结果的假阴性。
（六）荧光定量PCR法能反映抗结核治疗过程中痰标本中的结核杆菌的数量变化，对抗结核药物疗效有一定的监控效果。但是PCR并不能区分死菌与活菌，所以对于某些已经治愈的结核病患者，肺内若有死的结核杆菌的残留，仍可抽提到DNA，PCR检测仍可为阳性结果。
（七）对不同感染部位的标本进行TB-DNA的扩增和检测，即可诊断相应部位是否存在结核杆菌的感染。
1．痰或支气管灌洗液TB-DNA检测可辅助诊断肺结核病。
2．血液（白细胞）TB-DNA检测可辅助诊断播散性肺结核和各脏器的肺结核病。
3．脑脊液TB-DNA检测可辅助诊断中枢神经系统结核病。
4．宫颈拭子或尿液TB-DNA检测可辅助诊断泌尿生殖道结核病。
5．胸腹水TB-DNA检测可以辅助诊断结核性胸膜炎。
肺炎衣原体(CP)
一 肺炎衣原体(chlamydia pneumonia，CP)感染
肺炎衣原体主要寄生于人类的呼吸道，是引起呼吸道感染的重要病原体之一。人类是肺炎衣原体的惟一宿主。
肺炎衣原体系人与人之间经飞沫或呼吸道分泌物传播，在密切接触的家庭或在人群密集的医院等公共场所更易传播。其感染扩散速度较为缓慢，具有散发和流行交替出现的特点，在人群中流行可持续6个月左右。
CP主要引起青少年急性呼吸道感染，尤其引起儿童的咽炎、鼻窦炎、支气管炎和肺炎等。潜伏期平均30d左右，起病缓慢，临床表现为咽痛、声音嘶哑、发热、咳嗽和气促等症状，还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎。CP感染所引起的肺炎患者1～2w上呼吸道感染症状消失，而咳嗽加重，可持续1至2个月。老年患者的临床表现不易与其他原因引起的肺炎相区别，持续性咳嗽是本病的主要特点。半数肺炎患者常伴有结膜炎，也可引起肺外症状如红斑结节、甲状腺炎、格林-巴利综合征等。
近年来发现CP与冠状动脉硬化性心脏病的发生有关。采用免疫组化、分子生物学和病理学的研究结果证实在冠状动脉粥样硬化病灶中存在肺炎衣原体。不仅有肺炎衣原体的梨形结构，而且病理切片用抗肺炎衣原体特异单克隆抗体处理后呈阳性。也有资料表明肺炎衣原体的慢性感染及其所形成的免疫复合物对冠状动脉的损害，可能是引起冠状动脉硬化性心脏病病理改变的一个重要因素之一，但尚需进一步证实。 肺炎衣原体在激发哮喘中亦可能发挥作用。
在肺癌、支气管扩张患者中CP的检出率也相对较高。
CP感染的患者外周血白细胞计数大多正常，胸片无特异性，多为单侧下叶浸润，表现为节段性肺炎，严重者呈广泛双侧肺炎。
二 肺炎衣原体检测的方法学讨论及荧光探针PCR检测CP-DNA
的意义
肺炎衣原体是严格的细胞内寄生，必需在活的细胞内才能生长，所以培养条件要求更高也更不容易，一般采用HEp-2t和Hela细胞株进行培养，再用荧光特异性单克隆抗体来鉴定细胞培养中的肺炎衣原体，但是这种方法周期长，检出率低，并不适应于临床检测。
血清学方法检测肺炎衣原体特异性抗体，微量免疫荧光（MIF）试验检测肺炎衣原体较为敏感。凡双份血清抗体滴度增高4倍或以上；或单位血清特异性IgM抗体≥ 1：16或IgG抗体≥1：512，有一定的诊断价值。
分子生物学检测，采用限限制性内切酶Pst I 对肺炎衣原体的DNA进行酶切后，可获得一条474bp的DNA片段，而沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体却没有这种DNA片段。实际上由于标本中病原体的数目很少，酶切的方法往往是在细胞培养或PCR扩增后进行。但是酶切方法由于成本较高且操作复杂，并不适用于临床检测。
近年来发展起来的荧光探针PCR方法，直接扩增患者痰液、鼻洗液、咽拭子或支气管洗液等标本中（取材用深部痰液，小儿用吸痰器吸取深部痰液效果最好，用鼻咽拭子需要在上腭悬雍垂后部涂擦取分泌物拭子）肺炎衣原体的特异性核酸片段，操作简单、灵敏度高、特异性强，同时避免了常规PCR技术操作复杂
和扩增产物污染带来的假阳性等问题，被迅速应用于肺炎衣原体感染的临床检测。
同样荧光探针PCR检测还可用于观察肺炎衣原体感染的治疗效果，有效治疗后，标本中CP-DNA的拷贝数会相应地下降或转阴。
肺炎支原体(MP)
一 肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)感染
在正常人和动物的上呼吸道分泌物中可分离出多种支原体，说明绝大多数支原体构成人和动物的正常菌群。而目前所能确定引起人类呼吸道感染性疾病的也只有肺炎支原体，主要引起人类支原体肺炎。 MP主要引起呼吸道外源性感染，一般通过飞沫传播，一个四季均可发病，但多发生在夏末秋初季节，以1～15岁人群发病率较高，占小儿肺炎的20%左右，在人口密集场所或区域可达50%。婴幼儿发病率最高，占25～69%，病情严重者可发生死亡。
MP感染主要引起支原体肺炎，其病变为同质性肺炎，亦可合并支气管肺炎，故曾称为原发性非典型性肺炎。潜伏期约为2～3w，临床症状有不规则发烧，体温可达39℃，热程在1～3w左右。临床症状轻重不一，主要表现为头痛，刺激性咳嗽。婴幼儿病情较重，发病急，病程长，以呼吸困难为主，主要症状一般在10d后减轻，由于局部炎症导致的咳嗽持续时间较长，并引起支气管壁肥厚。
支原体肺炎约占非细菌性肺炎的1/3以上，或各种原因引起的肺炎的10%。MP感染与小儿支气管炎哮喘密切相关。
除支原体肺炎外，尚可引起肺外感染，咽喉炎、鼻炎、中耳炎、气管炎和支气管炎等。
实验室检查周围血白细胞一般正常或有轻度增多。
胸部X线改变多种多样，最常见的是两肺下叶片状支气管肺炎。
二 肺炎支原体检测的方法学讨论及荧光探针PCR检测MP-DNA的意义
肺炎支原体可从咳痰或咽拭子中培养出来，培养条件要求较高，分离和鉴定需1～2w，许多医院的实验室无法做此项检查，且周期太长，阳性率低，因此对临床帮助不大。
普通染色法不易着色。由于没有细胞壁，具有较大的可塑性,呈现高度的多态性，形态学方法难以鉴别。
冷凝集试验，仅有50%左右患者出现阳性，且此反应为非特异性，呼吸道合胞病毒感染、腮腺炎、流感等也可出现冷疑集素效价的升高，故只能做为辅助诊断。
酶联免疫吸附试验(ELISA)，免疫荧光法、金标免疫斑点法等都是用血清学水平检测抗体，IgG(+)不能区分既往感染与现症感染，IgM(+)的出现是急性近期感染的标志，有一定的诊断价值，有报道显示IgM的阳性率不过30%，IgM(-)并不能排除MP感染。
近年来有应用单克隆抗体采用ELISA双抗体夹心法检测支原体肺炎患者的痰、鼻洗液和支气管洗液中的42kDa多肽或190kDa P1蛋白抗原的报道。实际上，这些标本中病原体抗原的含量极微，不易检出，使得直接检测蛋白抗原的方法应用受限。
荧光探针PCR通过直接扩增痰液、鼻洗液、咽拭子或支气管洗液等标本中（取材用深部痰液，小儿用吸痰器吸取深部痰液效果最好,用鼻咽拭子需要在上腭悬雍垂后部涂擦取分泌物拭子） 肺炎支原体核酸，具有快速、敏感度高、特异性强等特点，为支原体的检测和实验研究开辟了一个广阔的前景。
荧光探针PCR检测还可用于观察肺炎支原体感染的治疗效果，据报道，有效治疗2～3w后，PCR检测可全部转阴。
淋病奈瑟菌(NG)
一 淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae，NG)感染
淋病奈瑟菌俗称淋球菌，是人类淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一宿主。
淋球菌主要通过性接触传播，侵入尿道和生殖道，其潜伏期为2～5d，引起人类泌尿生殖系统黏膜的急性或慢性化脓性感染，是我国目前流行的发病率最高的性传播病症，也是导致不育原因之一。
成人感染初期，一般引起男性前尿道炎，女性尿道炎与子宫颈炎。患者症状为：尿痛、尿频、尿道流脓、宫颈可见脓性分泌物等。如进一步扩散到生殖系统，引起慢性感染，如男性发生前列腺炎，精囊，精索炎和附睾炎；女性出现前庭大腺炎和盆腔炎等。母亲患有淋球性阴道炎时或子宫颈炎时，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎。
人对淋球菌感染无天然抵抗力，多数患者可以自愈，并出现特异IgG、IgM、IgA，但是免疫不持久，再感染和慢性患者普遍存在。
目前，淋病的发病趋势为高收入阶层发病下降，普通收入阶层发病率增加，大城市人口感染逐渐下降，中小城市人口感染增加，淋病从城市走向农村，农村病人增多。
由于病人多隐瞒病史(接触史)，给诊断带来困难，延误治疗。
二 淋球菌感染的实验室诊断及荧光探针定量检测NG-DNA的意义
（一）涂片：将患者脓性分泌物涂片，革兰氏染色后镜检，如在中性粒细胞内发现有革兰氏阴性双球菌时，结合临床症状和病史（接触史），有诊断价值。涂片法对于典型的男性淋病患者，检出率较高，但是对于女性患者，由于其分泌物中脱落细胞和抗酸杆菌等间杂其中，使得背景难以辨认，检出率很低，容易出现假阴性的结果。
（二）培养：标本在选择性培养基上培养，可出现典型菌落。氧化酶试验阳性。取典型菌落作细菌涂片可见到革兰阴性双球菌，即可诊断。但是淋球菌抵抗力极弱，离开宿主后很容易死亡，不容易分离培养成功。
（三）荧光探针PCR技术直接对可疑患者分泌物中的淋球菌DNA进行基因扩增，可在短时间内快速、准确地直接从临床各种标本中检出含量极低的病原菌。对女性疑似淋球菌引起的各种炎症的诊断及鉴别诊断起决定性作用；对男性疑似淋球菌引起的各种炎症的诊断和鉴别诊断有着重要意义。
（四）在淋球菌的传播中，症状轻者或无症状的淋球菌感染者是更重要的传染源，荧光探针PCR检测的优势还在于可对这一部分患者做到早期诊断和鉴别诊断，对预防和治疗性病意义重大。
（五）同样，淋球菌DNA检测也可用于疗效考核。有效的抗菌治疗后，标本中淋球菌DNA拷贝数会相应下降，在治愈后转阴。
解脲脲原体(UU)
一 解脲脲原体（ureaplasma urealyticum，UU）感染
解脲脲原体又叫解脲支原体、溶脲脲原体，是支原体的一种，因为能够合成尿素酶分解尿素而命名。现已明确解脲脲原体是引起性传播疾病的病原体之一。解脲脲原体的主要致病原因是掠夺宿主细胞膜固醇等脂类营养，分解尿素，产生大量毒性代谢产物氨类，损害细胞，并可促进局部形成结石。
在非淋球菌性尿道炎中，除衣原体外，解脲脲原体的感染占第二位，有30～40%的男性尿道炎是由解脲脲原体感染所致。解脲脲原体可形成继发感染，在淋球菌尿道炎患者中解脲脲原体的检出率高于非淋球菌性尿道炎的2.16倍，也是一些淋病患者治愈后仍有后遗症的原因之一。
大量的研究证明解脲脲原体与自然流产、先天缺陷、死胎和不孕症有关。自然流产1～8次妇女的宫颈分泌物或流产胎儿组织解脲脲原体的检出率为68%，其中流产超过4次以上者检出率高达80%，而正常妇
女检出率仅为10.5%。国内对2181例不孕患者研究报道，解脲脲原体检出率明显高于对照组。阳性患者经强力霉素治疗后转阴者为83.7%，其中恢复妊娠者为38.7%，说明不孕症与解脲脲原体感染高度相关。 解脲脲原体感染除引起男性非淋性尿道炎、前列腺炎、附睾炎外，还被认为与男性不育相关，男性不育患者精液中，脲原体检出率高达66.6%。检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高。
有研究证明解脲脲原体引起不孕症的原因可能是：①吸附于精子表面，阻碍精子运动；②产生神经氨酸酶样物质，干扰卵子与精子的结合；③解脲脲原体与精子有共同抗原，刺激机体产生的抗体对精子造成损伤。
二 荧光探针定量PCR方法检测UU-DNA的意义
对UU感染的病原学诊断通常可用简便的培养法和免疫荧光抗体来检测，但阳性率偏低，而且费时。培养法检测是利用脲原体能合成尿素酶分解尿素产生氨，使液体培养基pH值增高，酚红指示剂变色。一些非致病的脲原体或培养过程中的污染都可能导致假阳性的结果。荧光探针定量PCR方法通过直接检测可疑患者生殖道分泌物或尿液中的UU-DNA，具有高度的敏感性和特异性，提高了阳阳性检出率。
病原体的诊断只是为临床提供某种依据，而病原体感染后的发病时间和病情轻重均与病原体数量有关，这就要求定量结果。荧光探针定量PCR不仅可以对病原体的感染进行诊断，还可以通过检测用药前后病人UU-DNA拷贝数的变化监控病情发展。有报道显示，对解脲脲原体感染患者治疗2w后复查，阳性患者UU-DNA水平拷贝数有明显下降，其转阴率为44.7%，治疗3w后复查，则转阴率达76%，提示UU对目前临床常用于治疗性病的抗生素有一定的耐药性，应持续治疗3w以上。采用荧光探针定量PCR检测UU-DNA，具有快速、特异性高、定量准确等优点，避免盲目用药，即减少病人痛苦，缩短病程，又减轻了病人的经济负担，可以为临床评价疗效提供依据。
沙眼衣原体(CT)
一 沙眼衣原体(chlamydia trachomatis, CT)感染
沙眼衣原体严格寄生在细胞内，具有独特的发育周期。不仅可致眼部和肺部的感染，也是性传播疾病的主要病原体。近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害性，已超过淋球菌而居性传播疾病之首。在我国，在非淋球菌性尿道炎中，沙眼衣原体的感染居首位。
沙眼衣原体侵入机体后主要在粘膜上皮细胞内繁殖，且抑制宿主细胞代谢。衣原体在繁殖过程中产生的毒性代谢产物可引起细胞毒性反应及变态反应，造成病理损伤。
沙眼衣原体感染后机体免疫反应不强，维持时间短，易形成隐匿性感染，往往可反复感染。所引起的泌尿生殖系感染对男性来说主要是尿道炎，未经治疗的男性患者多数转变成慢性感染，周期性加重，或合并附睾炎和前列腺炎。在女性，可引起尿道炎、宫颈炎、严重者可并发输卵管炎及盆腔炎，妨碍妊娠并可导致生殖能力的损害。围产期母儿传播可致新生儿肺炎，沙眼衣原体母儿传播率高达30%—70%。
CT引起的泌尿生殖道感染常合并淋球菌的混合感染，淋球菌对衣原体的繁殖有激活和刺激作用。
二 沙眼衣原体检测的方法学讨论及荧光探针PCR检测CT-DNA的意义
目前沙眼衣原体的诊断由于受经济等因素的影响限制，大部分医院实验室多采用金标法或ELISA法检测沙眼衣原体的相应抗体，虽然具有快速简便和较好的特异性，但它实际上检测的是人体对沙眼衣原体的免疫反应状态。免疫学检测有个“窗口期”时间，另外，抗体检测不能判定是现症感染还是既往感染。如CT-IgM阳性，但不能确定CT在人体内一定存在，如CT-IgM阴性，也不能排除CT
的感染。
而荧光探针定量PCR能真实地反映CT的存在和繁殖情况，更重要的是可提高标本中CT检测率。从理
论上讲，只要标本中有一个病原体存在，荧光探针定量PCR就可以检测到，一般实验室也能检出10个CT-DNA基因拷贝。
有临床资料显示，荧光探针定量PCR检测疑似沙眼衣原体感染的男性尿道炎患者尿道分泌物，沙眼衣原体阳性率为25%，女性宫颈炎患者宫颈分泌物沙眼衣原体阳性率高达40%，平均拷贝数达105数量级。荧光探针定量PCR提高了CT的阳性检出率，实现了CT的快速、早期和特异（其特异性可达100%）诊断，同时又可作为疗效观察的可靠指标。
单纯疱疹病毒(HSV)
一 单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）感染
单纯疱疹病毒是疱疹病毒的典型代表，由于在感染急性期发生水疱性皮疹即所谓单纯疱疹而得名。本病毒以引起多种类型感染和疾病而日益受到重视。
HSV感染80～90%为隐性感染，大多无临床症状或呈亚临床表现，显性感染只占少数，最常见的是黏膜或皮肤局部出现疱疹。HSV-I感染主要引起口唇疱疹，疱疹性结膜炎、脑炎和皮肤性疱疹，6个月～2岁婴幼儿容易发生HSV-I原发感染。HSV-II主要引起生殖器疱疹，原发性生殖器疱疹中80%由HSV-II引起，少数由HSV-I所致，可通过性行为传播。
人体的HSV原发感染后很快产生特异性免疫，能将大部分病毒清除，但少数病毒可长期存留于神经细胞内，病毒在细胞内并不大量增殖破坏细胞，此时称为潜伏感染。只有当人体受到各种非特异的刺激，如发热、寒战、日晒、月经来潮、情绪紧张或在某些细菌、病毒感染或用肾上腺皮质等影响下，病毒基因被激活，病毒又重新沿着神经纤维轴突移行至神经末稍支配的上皮细胞内增殖，再次产生疱疹，称为复发。HSV的复发往往在同一部位。
HSV原发感染后1w左右，血中出现中和抗体，3～4w达高峰，可持续多年。这些抗体可中和游离病毒，阻止病毒在体内扩散，但不能消除潜伏于神经节中的病毒和阻止复发。
妊娠期妇女因HSV-I原发感染或潜伏感染的病毒被激活，HSV可通过胎盘感染胎儿，可引起胎儿畸形、智力低下、流产等。分娩时胎儿通过有HSV感染的产道也可感染而发生新生儿疱疹。新生儿疱疹多发生在头皮等暴露部位，严重时累及内脏，死亡率高达50%以上。
人们通过广泛研究和实验，认为HSV-II感染与子宫颈癌的发生有密切关系。患过生殖器疱疹的妇女，宫颈癌的发病率高，且好发部位相似，都在鳞状上皮和柱状上皮交界处；宫颈癌患者HSV-II抗体的阳性率和效价均高；分子杂交试验证明宫颈癌细胞中有HSV-II的基因片段并有特异性mRNA存在。
HSV常与HIV-I同时感染，并能促进病情发展，引起严重的局部和播散性感染。目前认为HSV是一种调节因素，能激活HIV复制。
二 荧光探针定量PCR技术检测HSV-DNA的意义
（一）虽然分离培养法是检测HSV的金标法，但其有费时、繁琐的缺点。临床上常用的ELISA和间接免疫荧光法(IFA)来检测HSV特异性抗体，但在在疾病早期（即病毒“窗口期”），血液中不易检测到病毒抗体，此时，宜首选荧光探针定量PCR法进行检测。研究证实，在生殖器溃疡愈合过程中，荧光探针定量PCR检测无症状排毒更为敏感。因此，对于疱疹已结痂者，或无痂状排毒的患者，用荧光探针定量PCR法检测单纯疱疹病毒可作为首选方法。
（二）对处于育龄期的女性患者来说，HSV的感染应引起高度重视，以免因HSV感染而导致胎儿畸形的可能性发生。由于HSV感染与宫颈癌关系密切，曾经感染或已经感染有生殖器疱疹的妇女，应特别警惕生殖器疱疹感染引发的宫颈癌变。因此，荧光探针定量PCR检测对早期筛查HSV感染、预防宫颈癌的发生有十
分重要的意义。
（三）对临床上由HSV-I型或HSV-II型感染所致的疱疹性角膜炎、咽炎、脑膜炎、生殖器各类疱疹、宫颈癌、先天性及新生儿感染、胎儿畸形等各种疾病，特异、敏感、快速、方便的PCR技术对其原发感染或潜伏感染，可先于免疫学抗体出现前做出HSV感染的早期诊断。
（四）可以用于分型，通用型可以检测HSV-I或HSV-II的感染，HSV-II检测单独HSV-II引起的感染。
（五）可以用于考核疗效与预后，并可进行HSV分子病毒学及流行病学研究。HSV感染经治愈后，其荧光探针PCR法检测HSV-DNA呈阴性，而这时抗体检测仍可为阳性结果。
梅毒螺旋体(TP)
一 梅毒螺旋体感染
梅毒螺旋体又称苍白螺(Treponema pallidum，TP)又称苍白螺旋体，是引起人类梅毒的病原体，属于性传播疾病中较危害的一种。
我国现阶段，梅毒发病率呈逐渐上升趋势.
在自然情况下，梅毒螺旋体只感染人类，人是梅毒的惟一传染源。梅毒可分为后天性和先天性两种，前者通过性接触传染，后者从母体通过胎盘传染给胎儿。
后天性病毒要分为三期，表现为反复、潜伏和再发现象。
第一期梅毒：梅毒螺旋体经外生殖器皮肤粘膜感染，约在感染后3w左右局部出现无痛性硬性下疳，其溃疡渗出物中含大量的梅毒螺旋体，传染性极强。约1个月，下疳常自然愈合。梅毒螺旋体进入血液中，经2～3个月无症状的潜伏期后进入第二期。
第二期梅毒：全身皮肤粘膜出现梅毒疹，周身淋巴结肿大。在梅毒疹和淋巴结中，有大量的梅毒螺旋体，如不治疗，一般3周～3个月后体征可消退。
从硬性下疳至梅毒疹消失后一年，这段时间称早期梅毒（即一、二期梅毒），此期传染性强，但是破坏性小。
第三期梅毒：亦称晚期梅毒。此期不仅出现皮肤粘膜溃疡性坏死病灶，并侵犯内脏器官或组织，严重者10～15年后，引起心血管及中枢神经系统病变。此期病灶中不易找到梅毒螺旋体，传染性小、病程长，但破坏性大，可危及生命。
先天性梅毒是梅毒孕妇患者的梅毒螺旋体通过胎盘进胎儿血流，并扩散至肝、脾、肾上腺等内脏中大量繁殖，引起胎儿的全身性感染，导致流产、早产或死胎；或出生活的梅毒儿，呈现锯齿形牙、间质性角膜炎、先天性耳聋等症状。
在感染的所有阶段，梅毒患者都能产生两类抗体。一类是抗梅毒螺旋体抗体，在补体存在时，可通过ADCC作用而将梅毒螺旋体杀死或溶解。另一类是抗心磷脂抗体，称为反应素(regain)，能与生物组织中的脂质发生反应。反应素无保护作用，仅可用于梅毒的血清学诊断。
梅毒螺旋体的抵抗力极弱，对温度和干燥特别别敏感。血液中4℃放置3d可死亡，故血库4℃冰箱储存3d以上的血液无传染梅毒的危险。
二 梅毒螺旋体检测的方法学讨论和荧光探针定量PCR检测TP-DNA的意义
（一）显微镜检查：从下疳渗出液、梅毒疹渗出液或局部淋巴结抽出液中直接用暗视野显微镜观察运动活泼的梅毒螺旋体；活体组织检查常用镀银染色法，但易与类似梅毒螺旋体的其他物质易混淆。适应于早期梅毒的论断，阳性结果可确诊，但是此法检出率低，阴性结果不能排除患病可能。
（二）非梅毒螺旋体抗原血清试验：包括性病研究实验室试验（VDRL）、不加热血清反应素试验（USR）、快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）和甲苯胺红不加热血清反应素试验（TRUST）。目前，我国大多数实验室采用是USR和RPR，作为梅毒诊断的常规试验和大量人群的初筛试验。这类方法的原理是采用正常牛心脂质作为抗原，测定清中的反应素（抗脂质抗体）。由于其抗原为非特异性，一些非梅毒疾病如高脂血症、红斑性狼疮、类风湿性关节炎、孕妇等均可出现假阳性。当抗体含量过高时，易出现假阴性反应，即前带现象。
（三）梅毒螺旋体抗原血清试验：1. 荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS），本法为间接免疫荧光法，特异性强，敏感性也高，尤其适应于早期梅毒的诊断。但该法操作繁琐，需使用荧光显微镜，且病人经药物治疗后，仍持续数年甚至终生出现阳性反应，故不宜用于疗效监测。2. 梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA），是一种间接凝集试验，检测血清中特异性梅毒螺旋体抗体，其效价在1:80以上为阳性，日目前国内许多医院常用的梅毒血清确认试验。TPHA的敏感性和特异性较高，缺点是试剂成本较高，操作较麻烦，且易发生自凝现象和假阳性。3. 梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA），简便易行，但同样存在病人经药物治疗后，抗体仍持续数年甚至终生出现阳性反应，故不宜用于疗效监测。
（四）梅毒螺旋体不能进行体外培养。检测临床标本中梅毒螺旋体最敏感、可靠的方法是兔感染试验（RIT），RIT能证实活的梅毒螺旋体存在，是检测梅毒螺旋全常用的标准方法，然而由于操作的繁琐，该方法并不能作为临床检测中常规的诊断方法。
（五）荧光探针定量PCR检测TP-DNA的意义
1．荧光探针PCR直接检测梅毒螺旋体DNA，其敏感性、特异性均优于血清学方法（理论上，PCR检测梅毒螺旋体的敏感性和家兔感染试验相同），是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。
2. 针对梅毒的不同时期存在和繁殖的不同部位，采取相应的标本，局部分泌物（一期）、皮疹/淋巴结穿刺液（二期）、溃疡部位刮片（三期）、血液（各期），可以快速准确的诊断梅毒螺旋体的感染。因梅毒螺旋体常可引起中枢神经系统的病变，而早期常不表现出临床症状，因此，脑脊液标本的PCR检测，有助于快速准确地诊断神经性梅毒。梅毒孕妇患者的羊水亦可检测到TP-DNA的存在，这对于预防新生儿的先天性梅毒感染，有着积极意义。
3. 对新生儿梅毒螺旋体感染的高危人群，血清学试验无法将无症状感染婴儿同非感染婴儿区别开来，因为母亲的IgG可传递给胎儿，在此种情况下，PCR检测血液或脑脊液是确诊梅毒螺旋体感染的最好方法。
4. 梅毒并不是个非常可怕的疾病，是可以根治的，关键在于早期的诊断和早期的治疗，由于梅毒在一期、二期的时候，有一定的隐匿性，容易造成漏诊和误诊。对于早期梅毒，荧光探针定量PCR检测TP-DNA比血清学方法要敏感得多。另外由于IgG终身存在，所以很难评价治疗效果，荧光探针定量PCR检测为考核疗效提供了最客观的依据。
人类免疫缺陷病毒（HIV）
1. 艾滋病病毒感染
艾滋病病毒简称HIV，是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而破坏人的免疫系统，最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对各种疾病的抵抗能力而发病并死亡。
病毒广泛存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物、唾液、 尿液、乳汁、脑脊液、有神经症状的脑组织液，其中以血液、 精液、阴道分泌物中浓度最高，感染者潜伏期长，死亡率高。
现已证实HIV是嗜T4淋巴细胞和嗜神经细胞的病毒。HIV由皮肤破口或粘膜进入人体血液，主要攻击和破
坏的靶细胞T4淋巴细胞（T4淋巴细胞在细胞 免疫系统中起着中心调节作用，它能促进B细胞产生抗体），便得T4细胞失去原有的正常免疫功能。当激活免疫反应的T4细胞几乎全部被HIV消除，T4细胞抑制细胞在数量上巨增，相反病人体内T4细胞在数量上骤减，从而导致病人的免疫功能全部衰竭，为条件性感染创造了极为有利的条件。
HIV对神经细胞有亲合力，能侵犯神经系统，引起脑组织的破坏，或者继发条件性感染而致各种中枢神经系统的病变。
HIV和其它逆转录病毒一样，当逆转录酶使病毒的RNA作为模板合成DNA而成前病毒DNA整合到宿主细胞的DNA中时，HIV带有的致癌基因可使细胞发生癌性转化，特别是在细胞免疫遭到破坏，丧失免疫监视作用的情况下，细胞癌变更易发生。
2. 艾滋病毒检测的方法学讨论及荧光探针PCR检测
HIV-DNA的意义
目前检测HIV的方法有100多种，总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、p24抗原检测和病毒核酸检测。细胞培养的方法检测HIV专一性强，不会出现假阳性，对于确认那些抗原/抗体检测不确定的个体和阳性母亲新生儿是否感染HIV有着重要的意义。但是须要有一定数量的感染细胞存在才能培养和分离出病毒来，因而敏感性差、操作时间长、操作复杂，必须在特定的P3实验室中才能进行，且费用较高（每次培养需要约200～500美元），不适用于临床。p24抗原检测能够在病毒开始复制后检测到血液中的可溶性p24抗原，但易出现假阳性。因此，阳性结果必须经中和试验确认，该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据。HIV 1p24抗原检测阴性，只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。
病毒核酸检测通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，具有很高的灵敏度，使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT-PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸，减少病人痛苦，缩短病程，减轻病人经济负担，可以为临床评价治疗提供依据。
人乳头瘤病毒(HPV)
一 人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染
人乳头瘤病毒属于DNA肿瘤病毒，具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，导致不同程度的增生性病变，人类是HPV的惟一自然宿主。
目前HPV尚不能在组织细胞中培养。HPV的增殖复制与上皮细胞的分化阶段相关，完整的HPV病毒体仅在终未分化的角质层细胞中产生，分化成熟的角质层细胞很快脱落，故HPV抗原接触免疫系统的机会较少，这也是导致HPV免疫原性低，易形成持续感染的重要因素之一。
HPV的传播主要通过直接接触感染者的病损部位或间接接触被病毒污染的物品。生殖器感染主要由性接触传播，新生儿可在通过产道时受感染。HPV的病毒感染仅停留于局部皮肤和黏膜中，不产生病毒血症。 现已发现HPV有100多个型，不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不相同。其中HPV6、11型可引起尖锐湿疣、喉乳头瘤等良性病变，称为低危型HPV，而HPV16、18、33等型别与宫颈癌、宫颈上皮内瘤等恶性肿瘤的发生有关，称高危型HPV。
宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤之一，也是目前唯一发病原因清楚的肿瘤，HPV感染是宫颈癌的主要致
病原因之一，根据美国2001年癌症统计学资料，2000年全美约有12900例新发病人，死亡约4400例。我国每年新发宫颈癌病例约计13万，占全世界宫颈癌新发病例的28%。因此，宫颈癌的病因与其发病机制的研究受到国内外学者的高度重视。宫颈癌的致病因素是很复杂的，是多种因素作用的结果。许多研究表明，HPV是宫颈癌的致癌主要因素，但HPV感染并非唯一的致癌因素，HSV以及HCMV等也与宫颈癌存在密切关系。
二 荧光探针PCR检HPV-DNA的意义
（一）高危型HPV感染与宫颈癌关系密切，98%宫颈癌患者可以检出HPV。常规的组织学与细胞学方法只能对临床和病理表现典型的病例做出诊断，新发展的薄层液基细胞学检测技术采用超薄涂片技术，背景干净清晰，有利于明确诊断，但这归根结底是从细胞学水平来观察细胞的形态学改变，其中80%的患者确诊时已是宫颈癌晚期。
（二）荧光探针定量PCR方法直接检测HPV-DNA，比核酸分子杂交技术更具敏感性、特异性，快速、准确。该方法简便，能达到较为理想的结果，大大提高了HPV的检测水平，是宫颈癌预防、诊治的突破性进展。
（三）荧光探针定量PCR可以准确判断体内HPV的感染，不仅可以对组织病理改变典型的病例做出诊断，对不典型鳞状上皮细胞增生的患者同样可以做出诊断，同时还可以对亚临床和隐性HPV感染做出诊断。HPV-DNA是美国FDA规定的妇女宫颈癌筛查的必检项目。
（四）可对其进行分型（高危型HPV16、18型和低危型HPV6、11型）。
（五）可以估计病毒载量与患癌症风险，有报道显示，持续性HPV-DNA高病毒载量的妇女患宫颈癌的相关风险是HPV-DNA阴性妇女的30倍。
（六）可以考核疗效与预后。HPV-DNA载量的下降水平或消失可以判断治疗是否有效，其DNA水平的高低也是估计预后的一个重要指标。
感染性疾病的荧光探针定量PCR检测和诊断，其方法学的依据是基于直接检测和扩增病原体的遗传物质核酸(DNA或RNA)，是“现症感染”的最直接和最客观的依据，这也是它与免疫学方法的根本区别，所以标本的正确留取尤为重要，一定要对病原体感染和存在的相应部位进行正确取材，才能提高检测的阳性率和准确率。
比如肺部结核杆菌的感染，一定要取深部的痰液或肺泡灌洗液。如果只是简单地取咽拭子，其阳性率
一 荧光探针定量PCR定量检测的意义
定量检测与定性检测的最大区别就在于，定性只是检测病原体核酸的“有”或“无”，而定量可以检测病原体核酸量的“多”或“少”。
定量检测的意义：
1. 体现病原体含量与复制水平、感染程度之间的关系。
2. 评价和考核治疗效果。
3. 用于传染病发病的监控、预测与预防。
4. 作为新的愈后指标。
5. 建立新的病原体分子诊断标准。
6. 新的药物及疗法的研究与开发。
二 荧光定量PCR报告结果的读取：
荧光定量PCR是直接扩增病原体的特异性DNA或cDNA，其结果反映了标本中DNA或RNA存在的多少，结果通常用数字表示，
报告为“copies/ml”、“2U/ml”或“copies”, copy即“拷贝”，表示病原体基因组的个数，该数据越大，表明病原体在体内复制得越厉害，传染性越强。
例：HBV-DNA 定量结果报告：3.637×104 IU/ml（如果采用科学记数法表示为：3.637E+04），代表每ml血液中含有36,370国际单位乙肝病毒分子。
如果待检标本能够定量，如血液等，结果报告为多少copies/ml或2U/ml。
如果待检标本不易定量，如分泌物、痰液等，结果只报告为多少copies。
PCR检测标本的留取
感染性疾病的荧光探针定量PCR检测和诊断，其方法学的依据是基于直接检测和扩增病原体的遗传物质核酸(DNA或RNA)，是“现症感染”的最直接和最客观的依据，这也是它与免疫学方法的根本区别，所以标本的正确留取尤为重要，一定要对病原体感染和存在的相应部位进行正确取材，才能提高检测的阳性率和准确率。
比如肺部结核杆菌的感染，一定要取深部的痰液或肺泡灌洗液。如果只是简单地取咽拭子，其阳性率