实验3 胶束电动毛细管色谱法测定葛根中葛根素的含量
一、实验目的
1. 掌握胶束电动毛细管色谱法的基本原理。
2. 学会用甲醇作溶剂超声提取葛根中葛根素的方法。
3. 掌握毛细管电泳法测定葛根中葛根素含量的实验方法。
二、实验原理
胶束电动毛细管色谱(MEKC)是在电泳缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，常用的是十二烷基硫酸钠(SDS），当其浓度超过临界胶束浓度时，就形成一疏水内核、外部带负电的胶束，在电场作用下，带负电的胶束以较低速度向阴极移动（准固定相）。样品各组分因其疏水性不同，则在水相和胶束相之间的分配系数不同，依据各组分之间淌度和在两相中分配系数的差异实现分离。该法既能分离中性化合物也能分离带电物质。
中药葛根为豆科植物野葛的干燥根，其主要活性成分葛根素具有改善血液循环、抗血小板聚集、降低心脑血管疾病发生、提高人体免疫力、抑制癌细胞和治疗突发性耳聋等作用，测定葛根中葛根素的含量有重要意义。
葛根素易溶于甲醇，略溶于乙醇，微溶于水，不溶于氯仿或乙醚。
三、仪器与试剂
仪器：美国Beckman P/ACETM MDQ 型高效毛细管电泳仪（压力进样，二极管阵列检测器）；未涂层石英毛细管(60cm×75μm，有效长度50cm) ；pHS-3C 型pH 计；数控超声波快速清洗器；电子天平；电热恒温鼓风干燥箱。
试剂：葛根素标准品；野葛根（用植物粉碎机粉碎，过60目筛，于烘箱中60℃干燥5h 后置于干燥器中冷却备用）；色谱纯甲醇；优级纯硼砂；优级纯硼酸。实验用水为石英亚沸蒸馏水。
四、实验步骤
1. 检查冷却液在黑线以上，接通电源，打开主机电源开关预热30min 以上，打开仪器操作软件，设置冲洗方法和分离方法。
3. 将0.1mmol/LNaOH、水、缓冲溶液、标准工作液和样品溶液，经0.45μm的微孔滤膜过滤后注入小试剂瓶中，盖好瓶盖，脱气，放入仪器内托盘的适当位置上，记录好瓶子的位置。
4. 按照冲洗条件，对毛细管进行实验前的冲洗。石英毛细管柱每天使用前
依次用0.1mmol/L氢氧化钠、水、缓冲溶液分别冲洗10min 、2min 、10min 。
5. 设置电泳分离条件
电泳条件：30mmol/LNa2B 4O 7- 30mmol/LH3BO 3 - 15mmol/LSDS (pH=8.65) 电泳缓冲液，进样压力为0.5psi ，进样时间5s ，分离温度25℃，分离电压25KV ，检测波长254nm 。每分析一个样品前，依次用0.1mmol/L氢氧化钠、水、缓冲溶液冲洗3min 、2min 、3min 。实验结束后, 依次用0.1mmol/L氢氧化钠、水冲洗5min 、5min ，以保持峰面积和迁移时间有良好的重现性。
在碱性溶液中硼酸能与葛根素中的邻二醇羟基形成络阴离子，增加溶解度，减少因吸附而造成的峰拖尾影响。
6. 配制葛根素标准溶液
1.00mg/mL葛根素标准储备液：称取葛根素标准品0.01000g ，用甲醇溶解并定容至10mL 。
将储备液用甲醇逐级稀释成300、200、100、60、40mg/L的标准工作液。
7. 制备葛根样品溶液
准确称取葛根粉末0.10000g 置于25mL 具塞碘量瓶中，加入25.00mL 甲醇，称量碘量瓶及其中溶液的总质量。在50℃、160W 功率时超声50min ，取出，冷却至室温，再次称量，用甲醇补足失去的质量。
8. 将葛根素标准溶液经0.45μm 的微孔滤膜过滤后，按浓度从低到高的顺序进样分析，再将葛根样品溶液经微孔滤膜过滤后进样分析。
9. 实验结束后，先关氘灯。通过控制界面，依次用0.1mmol /L氢氧化钠、水冲洗5min 、5min 。
点击直接控制界面中的Load ，使托盘回到原始位置，打开仪器盖子，让冷却液回流后，取出所有小试剂瓶并清洗干净。
10. 关闭控制界面和毛细管电泳仪主机电源开关，关闭计算机，切断电源。
五、数据记录与处理
1. 制作标准曲线
根据葛根素各标准工作溶液的峰面积与浓度的大小，计算标准曲线方程。
2. 计算葛根药材中葛根素的含量
打印相关实验数据，根据葛根提取液中葛根素的峰面积，通过标准曲线方程计算葛根素的浓度，再根据所称取的葛根药材质量，计算葛根药材中葛根素的含量。并对数据作分析讨论，得出合理的实验结论。
六、注意事项
1. 所用缓冲溶液、冲洗液、标准溶液和样品溶液，使用前都要先经0.45μm的微孔滤膜过滤。
2. 托盘要安放牢固，样品瓶帽不要盖倾斜，以防折断毛细管。
3. 仪器运行过程中产生高压，严禁打开仪器盖门。
4. 不要频繁的开关氘灯，否则影响寿命。
七、思考题
1. 毛细管电泳常用的分离模式有哪些？各有什么应用？
2. 在超声法提取中，如何提高葛根药材中葛根素的提取效率？
3. 影响毛细管电泳分离效率的因素有哪些？
实验3 胶束电动毛细管色谱法测定葛根中葛根素的含量
一、实验目的
1. 掌握胶束电动毛细管色谱法的基本原理。
2. 学会用甲醇作溶剂超声提取葛根中葛根素的方法。
3. 掌握毛细管电泳法测定葛根中葛根素含量的实验方法。
二、实验原理
胶束电动毛细管色谱(MEKC)是在电泳缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，常用的是十二烷基硫酸钠(SDS），当其浓度超过临界胶束浓度时，就形成一疏水内核、外部带负电的胶束，在电场作用下，带负电的胶束以较低速度向阴极移动（准固定相）。样品各组分因其疏水性不同，则在水相和胶束相之间的分配系数不同，依据各组分之间淌度和在两相中分配系数的差异实现分离。该法既能分离中性化合物也能分离带电物质。
中药葛根为豆科植物野葛的干燥根，其主要活性成分葛根素具有改善血液循环、抗血小板聚集、降低心脑血管疾病发生、提高人体免疫力、抑制癌细胞和治疗突发性耳聋等作用，测定葛根中葛根素的含量有重要意义。
葛根素易溶于甲醇，略溶于乙醇，微溶于水，不溶于氯仿或乙醚。
三、仪器与试剂
仪器：美国Beckman P/ACETM MDQ 型高效毛细管电泳仪（压力进样，二极管阵列检测器）；未涂层石英毛细管(60cm×75μm，有效长度50cm) ；pHS-3C 型pH 计；数控超声波快速清洗器；电子天平；电热恒温鼓风干燥箱。
试剂：葛根素标准品；野葛根（用植物粉碎机粉碎，过60目筛，于烘箱中60℃干燥5h 后置于干燥器中冷却备用）；色谱纯甲醇；优级纯硼砂；优级纯硼酸。实验用水为石英亚沸蒸馏水。
四、实验步骤
1. 检查冷却液在黑线以上，接通电源，打开主机电源开关预热30min 以上，打开仪器操作软件，设置冲洗方法和分离方法。
3. 将0.1mmol/LNaOH、水、缓冲溶液、标准工作液和样品溶液，经0.45μm的微孔滤膜过滤后注入小试剂瓶中，盖好瓶盖，脱气，放入仪器内托盘的适当位置上，记录好瓶子的位置。
4. 按照冲洗条件，对毛细管进行实验前的冲洗。石英毛细管柱每天使用前
依次用0.1mmol/L氢氧化钠、水、缓冲溶液分别冲洗10min 、2min 、10min 。
5. 设置电泳分离条件
电泳条件：30mmol/LNa2B 4O 7- 30mmol/LH3BO 3 - 15mmol/LSDS (pH=8.65) 电泳缓冲液，进样压力为0.5psi ，进样时间5s ，分离温度25℃，分离电压25KV ，检测波长254nm 。每分析一个样品前，依次用0.1mmol/L氢氧化钠、水、缓冲溶液冲洗3min 、2min 、3min 。实验结束后, 依次用0.1mmol/L氢氧化钠、水冲洗5min 、5min ，以保持峰面积和迁移时间有良好的重现性。
在碱性溶液中硼酸能与葛根素中的邻二醇羟基形成络阴离子，增加溶解度，减少因吸附而造成的峰拖尾影响。
6. 配制葛根素标准溶液
1.00mg/mL葛根素标准储备液：称取葛根素标准品0.01000g ，用甲醇溶解并定容至10mL 。
将储备液用甲醇逐级稀释成300、200、100、60、40mg/L的标准工作液。
7. 制备葛根样品溶液
准确称取葛根粉末0.10000g 置于25mL 具塞碘量瓶中，加入25.00mL 甲醇，称量碘量瓶及其中溶液的总质量。在50℃、160W 功率时超声50min ，取出，冷却至室温，再次称量，用甲醇补足失去的质量。
8. 将葛根素标准溶液经0.45μm 的微孔滤膜过滤后，按浓度从低到高的顺序进样分析，再将葛根样品溶液经微孔滤膜过滤后进样分析。
9. 实验结束后，先关氘灯。通过控制界面，依次用0.1mmol /L氢氧化钠、水冲洗5min 、5min 。
点击直接控制界面中的Load ，使托盘回到原始位置，打开仪器盖子，让冷却液回流后，取出所有小试剂瓶并清洗干净。
10. 关闭控制界面和毛细管电泳仪主机电源开关，关闭计算机，切断电源。
五、数据记录与处理
1. 制作标准曲线
根据葛根素各标准工作溶液的峰面积与浓度的大小，计算标准曲线方程。
2. 计算葛根药材中葛根素的含量
打印相关实验数据，根据葛根提取液中葛根素的峰面积，通过标准曲线方程计算葛根素的浓度，再根据所称取的葛根药材质量，计算葛根药材中葛根素的含量。并对数据作分析讨论，得出合理的实验结论。
六、注意事项
1. 所用缓冲溶液、冲洗液、标准溶液和样品溶液，使用前都要先经0.45μm的微孔滤膜过滤。
2. 托盘要安放牢固，样品瓶帽不要盖倾斜，以防折断毛细管。
3. 仪器运行过程中产生高压，严禁打开仪器盖门。
4. 不要频繁的开关氘灯，否则影响寿命。
七、思考题
1. 毛细管电泳常用的分离模式有哪些？各有什么应用？
2. 在超声法提取中，如何提高葛根药材中葛根素的提取效率？
3. 影响毛细管电泳分离效率的因素有哪些？