分子系统学
学 院： 生命科学学院
年 级： 2011级
专 业： 生物学基地 学 号： 01111159
姓 名： 袁冠华
指导教师： 赵东平
2014年6月21日
蝶类分子系统学研究进展
摘要：目前，线粒体基因与核基因、多基因联合分析已成为当前蝶类分类和系统关系研究的主要手段，未来更多的基因片段将被用于蝶类分子系统学研究，更多的蝶类线粒体基因组全序列将被测序。本文主要从线粒体基因及线粒体基因组、核基因和多基因联合3个方面，结合国内外最新研究成果对蝶类的不同分类阶元系统发育研究进展进行阐述。 关键词：蝶类；线粒体基因；核基因；多基因联合
Advances in Molecular Systematics of Butterflies
Abstract Now, the application of mtDNA genes combining with nuclear genes has become the major method to address the problems of taxonomiy and phylogenetic relationships of
butterflies. More gene sequences will be utilized in molecular systematics of butterflies and more complete mitochondrial genome of butterflies will be determined in the future. Combined with the lasted studies, the recent progresses in phylogeny of butterflies both in China and abroad are reviewed from three aspects in paper, including the mtDNA and the complete mitochondrial genome, nuclear genes and a combination of sequences analyses.
Key words Butterfly; mtDNA; Nuclear gene; a combination of sequences analyses
鳞翅目是昆虫纲中仅次于鞘翅目的第二大目，包括蛾（moths ）、蝶（butterflies ）两类，在昆虫系统学研究领域中占有重要地位。其中蝴蝶种类繁多，全球记载的蝶类约有18000种，一直被视为遗传、分子生物学和进化学等领域的模式系统并进行了广泛的研究。蝴蝶是一种具有观赏性的昆虫类群，它越来越多的受到国内外众多学者的重视并加以研究。前人主要根据蝴蝶的外型与色斑、附器（眼、触角、须、喙、足等）、翅脉及雄性外生殖器特征，幼态特征和生活习性进行分类学研究。随着聚合酶链式反应（PCR ）技术和DNA 测序技术的发展和日益成熟，应用DNA 序列研究昆虫的系统发育和进化规律已成为当今分子系统学研究的热点[1]。
1. 线粒体基因应用
昆虫线粒体DNA （mtDNA ）是共价闭合的环状双链超螺旋结构，根据氯化铯密度梯度的不同，可分为重链（H 链）和轻链（L 链），分子量为15.4~16.3kb[2]，具有母性遗传、结构简单、缺乏重组和进化速度快等特点，是研究鳞翅目昆虫系统学常用的分子标记。
mtDNA 现已被广泛用于研究昆虫系统发育、行为进化、种群遗传变异和分化，以及难以从形态学角度区分的亲缘种（姊妹种，Sibling species，又称隐存种Cryptic species）、种下分类单元的鉴定等方面[3]。目前，主要运用的线粒体基因包括16S rDNA、Cyt b 、CO Ⅰ、CO Ⅱ、ND 5，其中16S rDNA 和Cyt b 基因相对比较保守，CO Ⅰ、CO Ⅱ及ND 5基因进化速度比较快，同时CO Ⅰ在种间表现较大的变异，CO Ⅰ基因要比CO Ⅱ保守，CO Ⅱ基因在亚种、种级水平的系统分析中应用广泛。
16S rDNA
16S rDNA基因不同区段具有不同的进化速率，适合研究的分类阶元跨度较大，能够用来探讨目级、科级、属级以及种级分类阶元间的系统发育关系。
国内外学者利用16S rDNA基因及其他线粒体基因序列对蝶类分子系统进化进行了大量的研究。时号利用16S rDNA片段序列探讨了凤蝶总科的系统发育关系，认为凤蝶总科的种类明显不同于弄蝶总科，凤蝶科与蛱蝶科均不是单系群。陈娜等测定了蛱蝶科7亚科27种蛱蝶和班蝶科2种蝴蝶的线粒体16S rDNA基因部分序列，并从GenBank 中下载了6种蛱蝶的同源序列，探讨了蛱蝶科主要类群间的系统发育关系，表明蛱蝶亚科并非单系群，蛱蝶族中眼蛱蝶属应移入斑蛱蝶族，闪蛱蝶和蕊蛱蝶亚科与蛱蝶亚科具有较近的系统关系，支持豹蛱蝶和釉蛱蝶合为一亚科即釉蛱蝶亚科，支持将秀蛱蝶和蕊蛱蝶亚科从线蛱蝶亚科中分离出来。Sobti 等基于16S rDNA序列对印度北部的粉蝶科6种粉蝶的系统分化进行了研究，结果显示被分成两大支的6种印度粉蝶，每支由同一属的2个种组成，经与其他国家的粉蝶以及黄粉蝶亚科Coliadinae 的序列比较分析后发现，印度粉蝶之间的聚类关系稳定。
1.2 Cyt b 基因序列
细胞色素b （Cyt b ）基因全长约1100~1200bp在物种间序列长度没有明显的差异。是mtDNA13个蛋白质编码基因中结构和功能被了解得最为清楚的基因。其进化速率适中，一个较小的基因片断就包含着从种内到种间乃至科间的遗传进化信息, Cyt b 序列在解决亲缘关系很近的分类阶元间的系统关系方面很有用, 是探讨种间和种内遗传分化程度及系统进化研究的良好指标。Cyt b 基因被广泛的用于系统学研究，目前认为它是探讨种间和种内遗传分化程度及系统进化研究的良好的分子标记[4]。
Torres 等利用Cyt b 基因系统研究眼蝶亚科眉眼蝶族的单系性。陈永久等对鳞翅目蝶类的5种绢蝶的Cyt b 基因部分DNA 序列进行了测定并进行了系统进化的分析，在433 bp的DNA 序列中没有发现任何碱基的缺失和插入，其中40个碱基（约9.24%）发生变异。
秦峰、付文博等基于CO Ⅰ和Cyt b 基因序列的凤蝶科六属分子系统学研究，对凤蝶科6属25种CO Ⅰ基因和20种Cyt b 基因的部分序列进行测定和分析，探讨了它们之间的系统发育关系，结果表明凤蝶属Papilio 、斑凤蝶属Chilasa 、尾凤蝶属Bhutanitis 、珠凤蝶属Pachliopta 和喙凤蝶属Teinopalpus 为单系性，与传统形态分类结果相一致，但青凤蝶属Graphium 单系性不够明确[5]。
1.3 COⅠ、CO Ⅱ、CO Ⅳ基因
细胞色素氧化酶Ⅰ基因（CO Ⅰ基因）进化速度快，较其它的线粒体基因保守，在鳞翅类昆虫的分子系统研究中能有效地解决一些争议。Hebert 等把CO Ⅰ基因序列的一个约640bp 的片段作为标准基因区域，称为DNA 条形码，可以用来帮助解决有关种的鉴定问题。细胞色素氧化酶Ⅱ基因（CO Ⅱ基因）是线粒体蛋白质编码基因，进化速率较快，是昆虫分子系统学研究中理想的分子标记，已被广泛应用于解决蝴蝶种、属、亚科间的关系。
Vodolazhsky 和Stradomsky [6]利用CO Ⅰ基因序列分析眼灰蝶亚属Polyommatus 36个亚属和种级单元的系统发育，明确了P. icarus 、P. ciloius 、P. amorata 等９种的分类地位。Dinca 等[7]利用DNA barcoding 技术对罗马尼亚180种超过1300个体进行条形码序列的测定和研究，鉴定种的准确率可达90％。他们认为，DNA barcoding技术比外部形态，甚至雄性外生殖器鉴定种更为有效。罗马尼亚也成为第一个建立全国蝶类DNA barcoding数据库的国家。国内，林昶东等[8]通过对凤蝶亚科Papilioninae 11属27种的线粒体细胞色素c 氧化酶Ⅰ基因（CO Ⅰ）序列测定，初步探讨其系统发育关系，结果显示凤蝶亚科11属27个物种分为4个主要分支，与传统分类学观点一致，其中燕凤蝶族构成凤蝶亚科系统发育树基部的一个独立分支，且为单系发生，凤蝶属Papilio 中美凤蝶亚属Menelaides 和翠粉蝶亚属Princeps 首先相聚，华凤蝶亚属Sinoprinceps 和凤蝶亚属Papilio 亲缘关系较劲，随后两分支再聚为一支，构成凤蝶属。倪艳等[9]基于CO Ⅰ、CO Ⅱ和Cyt b 基因部分序列研究斑粉蝶属（鳞翅目，粉蝶科）分子系统关系，对中国产6种斑粉蝶21只标本的细胞色素氧化酶Ⅰ（CO Ⅰ）基因（约653bp ）、细胞色素氧化酶Ⅱ（CO Ⅱ）基因（约677bp ）和细胞色素b （Cyt b ）基因（419bp ）部分序列进行了分析（共1749bp ），探讨了斑粉蝶属D . elias 的系统发生关系，结果表明报喜斑粉蝶D. pasithoe和优越斑粉蝶D. hyparete关系较近，隐条斑粉蝶D. subnubila 、艳妇斑粉蝶D. belladonna 关系较近，支持了基于形态学分类的geraldina 、cuningputi 、dorinene 、hyparete 种组，支持将D. harpalyce从belisana 种组移到nigrina 种组，将D. messalina从nigrina 种组移到kummeri 种组。
另外，许丽等测定了粉蝶科的粉蝶亚科和黄粉蝶亚科14属24种线粒体CO Ⅳ和Cyt b 基因部分序列，并从GenBank 中下载了2种粉蝶的同源序列，表明黄粉蝶亚科不是单系群，但其中迁粉蝶属和豆粉蝶属在不同的分析方法中均聚合在一起，粉蝶亚科形成一个独立的支系，其中，襟粉蝶族为并系群，粉蝶族的粉蝶属、飞龙粉蝶属和云粉蝶属具有较近的亲缘关系。
1.4 ND1、ND 5基因
ND 1和ND 5存在于NADH 氧化还原酶基因中，其中ND 5基因是mtDNA 中最大的编码基因，已成为种群系统发育研究最有用的基因之一，而ND 1应用相对较少。
汪江等[10]测定中国迁粉蝶属Catopsilia 3种4亚种及迁粉蝶指名亚种C. pomona pomona 5个生态型的线粒体CO Ⅰ基因和ND 1基因序列，明确迁粉蝶指名亚种5个生态型的亲缘关系。殷先兵等基于线粒体ND 1和CO Ⅰ基因序列探讨锯眼蝶亚科主要类群的系统发生关系，测定了分布于中国的锯眼蝶亚科4族10属共20个种的线粒体ND 1和CO Ⅰ基因的部分序列，结合从GenBank 中获得的4个国外种类的同源序列，得出帻眼蝶族和锯眼蝶族具有较近的亲缘关系，黛眼蝶族不是单系群，该族中的黛眼蝶属、荫眼蝶属与眉眼蝶族具有较近的亲缘关系，带眼蝶属、藏眼蝶属、毛眼蝶属和帕眼蝶属聚合为一个独立的支系，其中带眼蝶属和藏眼蝶属在所有的分析方法中均以100%的置信度（BP=100%，PP=1.00）相聚合，建议将它们合并为一属。日本学者Yagi 等对日本凤蝶ND 5基因的783个核苷酸序列进行聚类分析，结果表明凤蝶总科的代表种和其他科形成鲜明的集群，绢蝶科形成一族，凤蝶亚科的裳凤蝶族Troidini 和燕凤蝶族Graphiini 形成一亚分支，而凤蝶族Papilionini 为另一亚分支。
1.5线粒体基因组
近年来，随着PCR 以及LPC R 技术的迅速发展，线粒体基因组全序列不断地被测出，其已成为研究不同动物类群的起源、进化、系统发育及群体遗传学的理想材料。截止到2013年８月已测出的线粒体基因组全序列的蝴蝶已达36种。
季刘伟等[11]采用PCR 和long PCR 技术测定了属于锯凤蝶类的丝带凤蝶Sericinus montelus 线粒体基因组全序列，结合已有的其他凤蝶科物种的相应序列数据，基于13个蛋白质编码基因重建了凤蝶科主要类群的系统发生树，探讨了它们之间的系统发生关系。结果显示，丝带凤蝶和中华虎凤蝶Luehdorfia chinensis 先构成一个支系，再和冰清绢蝶Parnassius bremeri构成姊妹群，而且锯凤蝶类应作为族级分类单元归于凤蝶科下的绢蝶亚
科。陈梅等[12]对柳紫闪蛱蝶Apatura ilia（鳞翅目，蛱蝶科）的线粒体基因组全序列进行了测定，同时结合其它已知蛱蝶类的相应序列进行了比较分析。结果显示：柳紫闪蛱蝶与其它已测的10种蛱蝶在基因定位和排列顺序方面几乎相同，只是在非编码序列上存在细微的差异，其核苷酸的构成及密码子使用频率都处于鳞翅目昆虫的范围之内。王晓灿等[13]对斐豹蛱蝶（Argyreus hyperbius）（鳞翅目，蛱蝶科）线粒体基因组全序列进行了测定和初步分析，结果表明斐豹蛱蝶线粒体基因全序列全长为15156bp, 基因排列顺序与其它鳞翅目种类一致, 线粒体全序列核苷酸组成和密码子使用显示出明显的A+T偏好（80.8%）和轻微的AT 偏移（AT skew, −0.019）。夏靖等[14]利用long PCR和引物步移法得到大卫绢蛱蝶Calinaga davidis 的线粒体基因组全序列，同时就其基因组成和结构特点作了初步分析，结果显示：其基因组全长为15267bp ，与其他鳞翅目昆虫相一致，其基因组未出现基因重排现象，为探讨绢蛱蝶亚科在蛱蝶科中的系统学地位及其与其他亚科间的系统发生关系等问题提供了重要的分子生物学数据。田丽丽等[15]对残锷线蛱蝶（Parathyma sulpitia ）（鳞翅目，蛱蝶科）线粒体基因组全序列进行了测定，得出残锷线蛱蝶线粒体基因组全序列全长为15268bp ，除了在trnS1（AGN ）和trnE , 基因之间有一段121bp 长的基因间隔外，其基因的排列顺序及排列方向与大多数已测鳞翅目物种基本一致，此研究结果与前人的分子系统学研究结论基本吻合（其中，线蛱蝶亚科和釉蛱蝶亚科互为姐妹群），而与形态学的研究结论不一致。毛增辉[16]以菜粉蝶东方亚种为粉蝶科的代表性材料之一，通过长PCR 技术和引物步移法扩增线粒体全基因组序列，并对其全序列进行测定和分析，结果表明凤蝶类（包括凤蝶和绢蝶）为一大支系，粉蝶类、灰蝶类与蛱蝶类（包括蛱蝶、珍蝶）构成另一大支系。胡静[17]利用long PCR 和分子克隆相结合的方法测定苎麻珍蝶和大卫绢蛱蝶的线粒体基因组全序列，认为珍蝶类应归入釉蛱蝶亚科珍蝶族，珍蝶族与釉蛱蝶族的亲缘关系较豹蛱蝶族近，绢蛱蝶科与螯蛱蝶科构成姊妹类群。孙倩倩[18]利用long PCR 和walking-primer 测得梳翅弄蝶、绿弄蝶和直纹稻弄蝶的线粒体基因组全序列，结果显示所研究的3种蝶类聚为一支，弄蝶支先与蛱蝶科（包括苎麻珍蝶、斐豹蛱蝶、大卫绢蛱蝶、大紫蛱蝶、仁眼蝶、残锷线蛱蝶、柳紫闪蛱蝶）和粉蝶科（菜粉蝶、黑纹粉蝶、优越斑粉蝶）灰蝶科（朝灰蝶）聚成的一支聚合，再与凤蝶科（包括宽尾凤蝶、金斑喙凤蝶、红珠绢蝶）聚在一起，弄蝶科位于凤蝶总科内部，与（（粉蝶科+灰蝶科）+蛱蝶科）形成姊妹群。
2. 核基因应用
由于线粒体基因是母系遗传，其中所含的进化信息并不能完全代表双亲进化的历史，
核基因中含有更加丰富的生物学信息，用适当的核基因研究昆虫的系统发育，其结果更有可能比较真实地反映出昆虫的进化历史。核基因的种类很多，运用于蝶类分子系统学研究的基因有28S rDNA、视蛋白（OPS1）基因、周期（Period ）基因、丙糖磷酸异构酶（Tpi ）和甘露糖磷酸异构酶（Mpi ）基因、延长因子（EF-1α）基因、无翅基因（Wingless ）等。
2.1 28S rDNA
28S rDNA 是真核生物的染色体上编码核糖体大亚基的基因，由于其重要的生物学功能，在进化过程中比较保守，但与18S rDNA 相比，变异性较大，也是研究生物高级阶元系统发育较好的分子标记。在28S rDNA保守的序列中含有12个高变区（D1～D12），因此可用来解决从种到科水平上的系统发生关系。Weller 等联合28S rDNA和线粒体ND 1基因，重新构建凤蝶总科Papilionoidea 的系统发育关系，得出蚬蝶类与灰蝶类构成一支，和蛱蝶类形成的另外一支构成姊妹群，凤蝶科和粉蝶科Pieridea 没有形成姊妹群，蛱蝶科的多个亚科，喙蝶亚科Libytheinae 和绢斑蝶亚科Ithomiinae 的位置在系统树中都不明确。
2.2视蛋白（OPS1）基因
视蛋白是具有7个跨膜α螺旋域特征的与感受器相关的G 蛋白家庭成员。Hsu 等用视蛋白基因研究袖蝶属Heliconius 8个种的系统发育，结果与其他学者构建的系统发育一致。Hsu 等同时发现视蛋白基因和Ｇ蛋白是协同进化的。
2.3周期（Period ）基因
Period 基因最早在果蝇中发现，此基因的突变会造成果蝇化蛹和昼夜活动节律异常。虽然许多人猜测Period 基因的功能高度保守，但序列分析结果表明Period 基因进化速率较快，因此主要利用Period 基因分析低阶元的系统发育问题。PAS 域和Thr-Gly 重复区段，特别是PAS 区段，是Period 基因用于系统学研究的两个主要区段，前者与后者相比相对较为保守，而Thr-Gly 区段在种内和种间都存在丰富的变异。Regier 等认为将Period 基因和其它基因相结合仍是解决鳞翅目科间及亚科间关系的一条合适的途径。
2.4丙糖磷酸异构酶（Tpi ）和甘露糖磷酸异构酶（Mpi ）基因
Beltrán 等研究分析了袖蝶属Heliconius 25个种及相关属37个个体的Tpi 、Mpi 、CO Ⅰ和CO Ⅱ4个基因片段，结果表明，虽然核内含子序列和线粒体基因的进化速度接近，但内含子序列在对亲缘关系比较近的地理种群系统发育的研究中受限制，对不同姊妹种间，测得的基因片段长度差异较大。在mtDNA 和Tpi 基因中，他们未发现任何一个物种相关的姐妹种存在相互单系还是并系的关系；相比之下, Mpi 基因的第3个座位的等位基因在上述
的两个姐妹种中都显示了清晰的系统发育关系；此外，Mpi 和Tpi 两个基因中不协调的谱系与正在进行基因流适应的物种形成模型是相一致的，这就可以论证运用多个基因来研究系统发生关系的必要性。
2.5延长因子（EF-1α）基因
EF-1α是一种编码蛋白的核基因，涉及到依赖GTP 氨tRNA 和核糖体受位的结合。由于氨基酸序列的保守性，EF-1α被看作是一个有潜力的研究高级阶元系统发育，特别是昆虫的高级阶元系统发育的基因。EF-1α基因中存在一些进化速度比较快的内元，因此它也可以分析低阶元的系统发育问题。鉴于昆虫的EF-1α和CO Ⅰ、16S RNA 、18S RNA 基因在较广的分歧范围内都有信息位点，并且在分子系统学中也得到了广泛的应用，Caterino 等主张将它们作为昆虫分子系统学研究中的标准分子标记。杨邦和等基于CO Ⅱ和EF-1α基因部分序列的中国蝶类科间系统发生关系，结果表明弄蝶科、凤蝶科、粉蝶科、灰蝶科能够单独成一支，其中弄蝶科位于系统树的基部，分化较早， 是较原始的类群，与传统的形态分类结果是相一致的，粉蝶科与凤蝶科的亲缘关系较近，蚬蝶科倾向与灰蝶科有较近的亲缘关系，且蚬蝶科种群始终聚为一支，显示了该科是一个单系群，从单系性方面来看，支持将蚬蝶科作为一个独立的科，同时表明中国分布的蛱蝶总科是一单系群，并且它与灰蝶科和蚬蝶科聚成的一支是姐妹群关系。
2.6无翅基因（Wingless ）
Wingless 基因是一个单拷贝的核基因，对翅膀样式的形成起重要的作用。由于翅膀的样式是昆虫鉴定中的一个重要标准，因此Wingless 基因有望成为研究昆虫系统发育的一个重要的候选基因。Brower 等对蛱蝶科的22个物种的Wingless 和CO Ⅱ基因测序，系统发育分析2树的结构基本一致，他们认为Wingless 基因将成为研究蝴蝶、也可能是研究其它在6000万年前分歧的昆虫系统发育的一个有用的基因。因此，联合运用Wingless 和CO Ⅱ基因对蝶类的系统发育研究具有重要的意义。
3. 多基因联合分析
无论是线粒体基因还是核基因，任何单一基因应用于系统发育研究都有一定的局限性。随着各种基因联合分析，特别是联合核基因与线粒体基因研究昆虫的系统发育已成为分子系统学发展的必然趋势。目前，国内外已有许多学者联合运用多基因联合进行系统学与进化生物学的研究。
袁向群[19]基于线粒体Cyt b 、ND 1、CO Ⅰ和16S rDNA，对中国弄蝶科Hesperiidae 进
行序列分析，为该科的系统发育关系提供大量分子生物学证据，提出以分子系统学为基础的中国弄蝶科分类系统。Price 等[20]基于33个成虫和幼虫的形态和生态特征与CO Ⅰ、EF-1α、Wingless 基因研究非洲Dirini 族的系统发育，结果支持Dirini 族是单系群，Aeropetes 和Tarsocera 属为姊妹群，明确该族的两种扩散途径。Müller 等[21]利用线粒体CO Ⅰ、ND 5和Wingless 基因首次揭示印度太平洋区螯蛱蝶属Charaxes 31种的进化历史及系统发育关系。Dincǎ等[22]利用线粒体CO Ⅰ基因片段和核基因ITS2联合几何测量学数据, 表明眼灰蝶属Polyommatus 两个种复杂的地理系统关系。Yago 等[23]利用CO Ⅰ、ND 5、EF-1α和Tpi 对E. phemius、E. ipona和E. euphemia 3个种进行分析，结果表明这3个种在遗传距离上没有显著差异，E. phemius 复合种是单一种，E. ipona 是E. phemius 的异名，E. euphemia 只是E. phemius的一个亚种。Gillespie 等[24]基于外部形态特征、线粒体基因（CO Ⅰ、ND 5）与核基因（28S rDNA、ITS2、Wingless ）明确了新西兰Zizina 当地特有种Z. oxleyi和外来种Z. labradus的杂交区域。Nazari 等[25]对16S rDNA、CO Ⅰ、Wingless 和EF-1α基因进行分析，研究粉蝶科Colotis 属和8个相关属的基因多样性和系统发育关系。Willmott [26]则基于线粒体基因（CO Ⅰ、CO Ⅱ）和核基因（EF-1α）对Preponini 族22种的系统发育关系进行分析。Thomas 等[27]基于94个形态特征、5个线粒体基因（16S rDNA、CO Ⅰ、CO Ⅱ、ND 1、ND 5）、2个核基因（EF-1α、Wingless ）对凤蝶亚科Papilioninae 的18属，绢蝶亚科Parnassiinae 的4属，以及Baroniinae 亚科的系统发育进行分析。
4. 结语
通过系统学的研究，我们可以解决蝴蝶各分类阶元之间的进化关系和一些有争议物种的分类地位的确立以及相关物种的系统地理探讨等。目前中国的分类体系是基于传统的形态学分类，分子上的证据还很匮乏。综上所述，近十几年来，使用ＤＮＡ基因序列是解决蝶类系统学研究中存在问题的主要手段[28]，其中应用最多的分子标记是线粒体CO Ⅰ、CO Ⅱ基因以及核基因EF-1α、Wingless 等，随着分子技术的快速发展，越来越多的基因片段被用于蝶类分子系统学研究[29]。当然，对于多基因联合分析可以增加系统分析的置信度，因此，选取多个基因联合，尤其是多个线粒体基因与核基因的联合作为探讨蝶类不同阶元系统发育关系的分子标记将会受到更多国内外学者的关注。此外，对蝶类线粒体全基因组的测序也越来越多，也有更多的学者利用线粒体全基因组序列进行蝶类系统学的研究[30]。
虽然，利用DNA 基因序列进行蝶类系统发育关系的研究可以为传统意义上的系统学研究提供分子依据，解决一些在分类和系统发生存在的争议。但是这并不意味着忽视基于形
态学研究的传统系统学分析，毕竟一些线粒体基因用于系统发育研究仍受到质疑。因此，通过将分子数据与传统形态、行为、生态等数据结合进行分析研究，将会使结果更加可靠
[31]。
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分子系统学
学 院： 生命科学学院
年 级： 2011级
专 业： 生物学基地 学 号： 01111159
姓 名： 袁冠华
指导教师： 赵东平
2014年6月21日
蝶类分子系统学研究进展
摘要：目前，线粒体基因与核基因、多基因联合分析已成为当前蝶类分类和系统关系研究的主要手段，未来更多的基因片段将被用于蝶类分子系统学研究，更多的蝶类线粒体基因组全序列将被测序。本文主要从线粒体基因及线粒体基因组、核基因和多基因联合3个方面，结合国内外最新研究成果对蝶类的不同分类阶元系统发育研究进展进行阐述。 关键词：蝶类；线粒体基因；核基因；多基因联合
Advances in Molecular Systematics of Butterflies
Abstract Now, the application of mtDNA genes combining with nuclear genes has become the major method to address the problems of taxonomiy and phylogenetic relationships of
butterflies. More gene sequences will be utilized in molecular systematics of butterflies and more complete mitochondrial genome of butterflies will be determined in the future. Combined with the lasted studies, the recent progresses in phylogeny of butterflies both in China and abroad are reviewed from three aspects in paper, including the mtDNA and the complete mitochondrial genome, nuclear genes and a combination of sequences analyses.
Key words Butterfly; mtDNA; Nuclear gene; a combination of sequences analyses
鳞翅目是昆虫纲中仅次于鞘翅目的第二大目，包括蛾（moths ）、蝶（butterflies ）两类，在昆虫系统学研究领域中占有重要地位。其中蝴蝶种类繁多，全球记载的蝶类约有18000种，一直被视为遗传、分子生物学和进化学等领域的模式系统并进行了广泛的研究。蝴蝶是一种具有观赏性的昆虫类群，它越来越多的受到国内外众多学者的重视并加以研究。前人主要根据蝴蝶的外型与色斑、附器（眼、触角、须、喙、足等）、翅脉及雄性外生殖器特征，幼态特征和生活习性进行分类学研究。随着聚合酶链式反应（PCR ）技术和DNA 测序技术的发展和日益成熟，应用DNA 序列研究昆虫的系统发育和进化规律已成为当今分子系统学研究的热点[1]。
1. 线粒体基因应用
昆虫线粒体DNA （mtDNA ）是共价闭合的环状双链超螺旋结构，根据氯化铯密度梯度的不同，可分为重链（H 链）和轻链（L 链），分子量为15.4~16.3kb[2]，具有母性遗传、结构简单、缺乏重组和进化速度快等特点，是研究鳞翅目昆虫系统学常用的分子标记。
mtDNA 现已被广泛用于研究昆虫系统发育、行为进化、种群遗传变异和分化，以及难以从形态学角度区分的亲缘种（姊妹种，Sibling species，又称隐存种Cryptic species）、种下分类单元的鉴定等方面[3]。目前，主要运用的线粒体基因包括16S rDNA、Cyt b 、CO Ⅰ、CO Ⅱ、ND 5，其中16S rDNA 和Cyt b 基因相对比较保守，CO Ⅰ、CO Ⅱ及ND 5基因进化速度比较快，同时CO Ⅰ在种间表现较大的变异，CO Ⅰ基因要比CO Ⅱ保守，CO Ⅱ基因在亚种、种级水平的系统分析中应用广泛。
16S rDNA
16S rDNA基因不同区段具有不同的进化速率，适合研究的分类阶元跨度较大，能够用来探讨目级、科级、属级以及种级分类阶元间的系统发育关系。
国内外学者利用16S rDNA基因及其他线粒体基因序列对蝶类分子系统进化进行了大量的研究。时号利用16S rDNA片段序列探讨了凤蝶总科的系统发育关系，认为凤蝶总科的种类明显不同于弄蝶总科，凤蝶科与蛱蝶科均不是单系群。陈娜等测定了蛱蝶科7亚科27种蛱蝶和班蝶科2种蝴蝶的线粒体16S rDNA基因部分序列，并从GenBank 中下载了6种蛱蝶的同源序列，探讨了蛱蝶科主要类群间的系统发育关系，表明蛱蝶亚科并非单系群，蛱蝶族中眼蛱蝶属应移入斑蛱蝶族，闪蛱蝶和蕊蛱蝶亚科与蛱蝶亚科具有较近的系统关系，支持豹蛱蝶和釉蛱蝶合为一亚科即釉蛱蝶亚科，支持将秀蛱蝶和蕊蛱蝶亚科从线蛱蝶亚科中分离出来。Sobti 等基于16S rDNA序列对印度北部的粉蝶科6种粉蝶的系统分化进行了研究，结果显示被分成两大支的6种印度粉蝶，每支由同一属的2个种组成，经与其他国家的粉蝶以及黄粉蝶亚科Coliadinae 的序列比较分析后发现，印度粉蝶之间的聚类关系稳定。
1.2 Cyt b 基因序列
细胞色素b （Cyt b ）基因全长约1100~1200bp在物种间序列长度没有明显的差异。是mtDNA13个蛋白质编码基因中结构和功能被了解得最为清楚的基因。其进化速率适中，一个较小的基因片断就包含着从种内到种间乃至科间的遗传进化信息, Cyt b 序列在解决亲缘关系很近的分类阶元间的系统关系方面很有用, 是探讨种间和种内遗传分化程度及系统进化研究的良好指标。Cyt b 基因被广泛的用于系统学研究，目前认为它是探讨种间和种内遗传分化程度及系统进化研究的良好的分子标记[4]。
Torres 等利用Cyt b 基因系统研究眼蝶亚科眉眼蝶族的单系性。陈永久等对鳞翅目蝶类的5种绢蝶的Cyt b 基因部分DNA 序列进行了测定并进行了系统进化的分析，在433 bp的DNA 序列中没有发现任何碱基的缺失和插入，其中40个碱基（约9.24%）发生变异。
秦峰、付文博等基于CO Ⅰ和Cyt b 基因序列的凤蝶科六属分子系统学研究，对凤蝶科6属25种CO Ⅰ基因和20种Cyt b 基因的部分序列进行测定和分析，探讨了它们之间的系统发育关系，结果表明凤蝶属Papilio 、斑凤蝶属Chilasa 、尾凤蝶属Bhutanitis 、珠凤蝶属Pachliopta 和喙凤蝶属Teinopalpus 为单系性，与传统形态分类结果相一致，但青凤蝶属Graphium 单系性不够明确[5]。
1.3 COⅠ、CO Ⅱ、CO Ⅳ基因
细胞色素氧化酶Ⅰ基因（CO Ⅰ基因）进化速度快，较其它的线粒体基因保守，在鳞翅类昆虫的分子系统研究中能有效地解决一些争议。Hebert 等把CO Ⅰ基因序列的一个约640bp 的片段作为标准基因区域，称为DNA 条形码，可以用来帮助解决有关种的鉴定问题。细胞色素氧化酶Ⅱ基因（CO Ⅱ基因）是线粒体蛋白质编码基因，进化速率较快，是昆虫分子系统学研究中理想的分子标记，已被广泛应用于解决蝴蝶种、属、亚科间的关系。
Vodolazhsky 和Stradomsky [6]利用CO Ⅰ基因序列分析眼灰蝶亚属Polyommatus 36个亚属和种级单元的系统发育，明确了P. icarus 、P. ciloius 、P. amorata 等９种的分类地位。Dinca 等[7]利用DNA barcoding 技术对罗马尼亚180种超过1300个体进行条形码序列的测定和研究，鉴定种的准确率可达90％。他们认为，DNA barcoding技术比外部形态，甚至雄性外生殖器鉴定种更为有效。罗马尼亚也成为第一个建立全国蝶类DNA barcoding数据库的国家。国内，林昶东等[8]通过对凤蝶亚科Papilioninae 11属27种的线粒体细胞色素c 氧化酶Ⅰ基因（CO Ⅰ）序列测定，初步探讨其系统发育关系，结果显示凤蝶亚科11属27个物种分为4个主要分支，与传统分类学观点一致，其中燕凤蝶族构成凤蝶亚科系统发育树基部的一个独立分支，且为单系发生，凤蝶属Papilio 中美凤蝶亚属Menelaides 和翠粉蝶亚属Princeps 首先相聚，华凤蝶亚属Sinoprinceps 和凤蝶亚属Papilio 亲缘关系较劲，随后两分支再聚为一支，构成凤蝶属。倪艳等[9]基于CO Ⅰ、CO Ⅱ和Cyt b 基因部分序列研究斑粉蝶属（鳞翅目，粉蝶科）分子系统关系，对中国产6种斑粉蝶21只标本的细胞色素氧化酶Ⅰ（CO Ⅰ）基因（约653bp ）、细胞色素氧化酶Ⅱ（CO Ⅱ）基因（约677bp ）和细胞色素b （Cyt b ）基因（419bp ）部分序列进行了分析（共1749bp ），探讨了斑粉蝶属D . elias 的系统发生关系，结果表明报喜斑粉蝶D. pasithoe和优越斑粉蝶D. hyparete关系较近，隐条斑粉蝶D. subnubila 、艳妇斑粉蝶D. belladonna 关系较近，支持了基于形态学分类的geraldina 、cuningputi 、dorinene 、hyparete 种组，支持将D. harpalyce从belisana 种组移到nigrina 种组，将D. messalina从nigrina 种组移到kummeri 种组。
另外，许丽等测定了粉蝶科的粉蝶亚科和黄粉蝶亚科14属24种线粒体CO Ⅳ和Cyt b 基因部分序列，并从GenBank 中下载了2种粉蝶的同源序列，表明黄粉蝶亚科不是单系群，但其中迁粉蝶属和豆粉蝶属在不同的分析方法中均聚合在一起，粉蝶亚科形成一个独立的支系，其中，襟粉蝶族为并系群，粉蝶族的粉蝶属、飞龙粉蝶属和云粉蝶属具有较近的亲缘关系。
1.4 ND1、ND 5基因
ND 1和ND 5存在于NADH 氧化还原酶基因中，其中ND 5基因是mtDNA 中最大的编码基因，已成为种群系统发育研究最有用的基因之一，而ND 1应用相对较少。
汪江等[10]测定中国迁粉蝶属Catopsilia 3种4亚种及迁粉蝶指名亚种C. pomona pomona 5个生态型的线粒体CO Ⅰ基因和ND 1基因序列，明确迁粉蝶指名亚种5个生态型的亲缘关系。殷先兵等基于线粒体ND 1和CO Ⅰ基因序列探讨锯眼蝶亚科主要类群的系统发生关系，测定了分布于中国的锯眼蝶亚科4族10属共20个种的线粒体ND 1和CO Ⅰ基因的部分序列，结合从GenBank 中获得的4个国外种类的同源序列，得出帻眼蝶族和锯眼蝶族具有较近的亲缘关系，黛眼蝶族不是单系群，该族中的黛眼蝶属、荫眼蝶属与眉眼蝶族具有较近的亲缘关系，带眼蝶属、藏眼蝶属、毛眼蝶属和帕眼蝶属聚合为一个独立的支系，其中带眼蝶属和藏眼蝶属在所有的分析方法中均以100%的置信度（BP=100%，PP=1.00）相聚合，建议将它们合并为一属。日本学者Yagi 等对日本凤蝶ND 5基因的783个核苷酸序列进行聚类分析，结果表明凤蝶总科的代表种和其他科形成鲜明的集群，绢蝶科形成一族，凤蝶亚科的裳凤蝶族Troidini 和燕凤蝶族Graphiini 形成一亚分支，而凤蝶族Papilionini 为另一亚分支。
1.5线粒体基因组
近年来，随着PCR 以及LPC R 技术的迅速发展，线粒体基因组全序列不断地被测出，其已成为研究不同动物类群的起源、进化、系统发育及群体遗传学的理想材料。截止到2013年８月已测出的线粒体基因组全序列的蝴蝶已达36种。
季刘伟等[11]采用PCR 和long PCR 技术测定了属于锯凤蝶类的丝带凤蝶Sericinus montelus 线粒体基因组全序列，结合已有的其他凤蝶科物种的相应序列数据，基于13个蛋白质编码基因重建了凤蝶科主要类群的系统发生树，探讨了它们之间的系统发生关系。结果显示，丝带凤蝶和中华虎凤蝶Luehdorfia chinensis 先构成一个支系，再和冰清绢蝶Parnassius bremeri构成姊妹群，而且锯凤蝶类应作为族级分类单元归于凤蝶科下的绢蝶亚
科。陈梅等[12]对柳紫闪蛱蝶Apatura ilia（鳞翅目，蛱蝶科）的线粒体基因组全序列进行了测定，同时结合其它已知蛱蝶类的相应序列进行了比较分析。结果显示：柳紫闪蛱蝶与其它已测的10种蛱蝶在基因定位和排列顺序方面几乎相同，只是在非编码序列上存在细微的差异，其核苷酸的构成及密码子使用频率都处于鳞翅目昆虫的范围之内。王晓灿等[13]对斐豹蛱蝶（Argyreus hyperbius）（鳞翅目，蛱蝶科）线粒体基因组全序列进行了测定和初步分析，结果表明斐豹蛱蝶线粒体基因全序列全长为15156bp, 基因排列顺序与其它鳞翅目种类一致, 线粒体全序列核苷酸组成和密码子使用显示出明显的A+T偏好（80.8%）和轻微的AT 偏移（AT skew, −0.019）。夏靖等[14]利用long PCR和引物步移法得到大卫绢蛱蝶Calinaga davidis 的线粒体基因组全序列，同时就其基因组成和结构特点作了初步分析，结果显示：其基因组全长为15267bp ，与其他鳞翅目昆虫相一致，其基因组未出现基因重排现象，为探讨绢蛱蝶亚科在蛱蝶科中的系统学地位及其与其他亚科间的系统发生关系等问题提供了重要的分子生物学数据。田丽丽等[15]对残锷线蛱蝶（Parathyma sulpitia ）（鳞翅目，蛱蝶科）线粒体基因组全序列进行了测定，得出残锷线蛱蝶线粒体基因组全序列全长为15268bp ，除了在trnS1（AGN ）和trnE , 基因之间有一段121bp 长的基因间隔外，其基因的排列顺序及排列方向与大多数已测鳞翅目物种基本一致，此研究结果与前人的分子系统学研究结论基本吻合（其中，线蛱蝶亚科和釉蛱蝶亚科互为姐妹群），而与形态学的研究结论不一致。毛增辉[16]以菜粉蝶东方亚种为粉蝶科的代表性材料之一，通过长PCR 技术和引物步移法扩增线粒体全基因组序列，并对其全序列进行测定和分析，结果表明凤蝶类（包括凤蝶和绢蝶）为一大支系，粉蝶类、灰蝶类与蛱蝶类（包括蛱蝶、珍蝶）构成另一大支系。胡静[17]利用long PCR 和分子克隆相结合的方法测定苎麻珍蝶和大卫绢蛱蝶的线粒体基因组全序列，认为珍蝶类应归入釉蛱蝶亚科珍蝶族，珍蝶族与釉蛱蝶族的亲缘关系较豹蛱蝶族近，绢蛱蝶科与螯蛱蝶科构成姊妹类群。孙倩倩[18]利用long PCR 和walking-primer 测得梳翅弄蝶、绿弄蝶和直纹稻弄蝶的线粒体基因组全序列，结果显示所研究的3种蝶类聚为一支，弄蝶支先与蛱蝶科（包括苎麻珍蝶、斐豹蛱蝶、大卫绢蛱蝶、大紫蛱蝶、仁眼蝶、残锷线蛱蝶、柳紫闪蛱蝶）和粉蝶科（菜粉蝶、黑纹粉蝶、优越斑粉蝶）灰蝶科（朝灰蝶）聚成的一支聚合，再与凤蝶科（包括宽尾凤蝶、金斑喙凤蝶、红珠绢蝶）聚在一起，弄蝶科位于凤蝶总科内部，与（（粉蝶科+灰蝶科）+蛱蝶科）形成姊妹群。
2. 核基因应用
由于线粒体基因是母系遗传，其中所含的进化信息并不能完全代表双亲进化的历史，
核基因中含有更加丰富的生物学信息，用适当的核基因研究昆虫的系统发育，其结果更有可能比较真实地反映出昆虫的进化历史。核基因的种类很多，运用于蝶类分子系统学研究的基因有28S rDNA、视蛋白（OPS1）基因、周期（Period ）基因、丙糖磷酸异构酶（Tpi ）和甘露糖磷酸异构酶（Mpi ）基因、延长因子（EF-1α）基因、无翅基因（Wingless ）等。
2.1 28S rDNA
28S rDNA 是真核生物的染色体上编码核糖体大亚基的基因，由于其重要的生物学功能，在进化过程中比较保守，但与18S rDNA 相比，变异性较大，也是研究生物高级阶元系统发育较好的分子标记。在28S rDNA保守的序列中含有12个高变区（D1～D12），因此可用来解决从种到科水平上的系统发生关系。Weller 等联合28S rDNA和线粒体ND 1基因，重新构建凤蝶总科Papilionoidea 的系统发育关系，得出蚬蝶类与灰蝶类构成一支，和蛱蝶类形成的另外一支构成姊妹群，凤蝶科和粉蝶科Pieridea 没有形成姊妹群，蛱蝶科的多个亚科，喙蝶亚科Libytheinae 和绢斑蝶亚科Ithomiinae 的位置在系统树中都不明确。
2.2视蛋白（OPS1）基因
视蛋白是具有7个跨膜α螺旋域特征的与感受器相关的G 蛋白家庭成员。Hsu 等用视蛋白基因研究袖蝶属Heliconius 8个种的系统发育，结果与其他学者构建的系统发育一致。Hsu 等同时发现视蛋白基因和Ｇ蛋白是协同进化的。
2.3周期（Period ）基因
Period 基因最早在果蝇中发现，此基因的突变会造成果蝇化蛹和昼夜活动节律异常。虽然许多人猜测Period 基因的功能高度保守，但序列分析结果表明Period 基因进化速率较快，因此主要利用Period 基因分析低阶元的系统发育问题。PAS 域和Thr-Gly 重复区段，特别是PAS 区段，是Period 基因用于系统学研究的两个主要区段，前者与后者相比相对较为保守，而Thr-Gly 区段在种内和种间都存在丰富的变异。Regier 等认为将Period 基因和其它基因相结合仍是解决鳞翅目科间及亚科间关系的一条合适的途径。
2.4丙糖磷酸异构酶（Tpi ）和甘露糖磷酸异构酶（Mpi ）基因
Beltrán 等研究分析了袖蝶属Heliconius 25个种及相关属37个个体的Tpi 、Mpi 、CO Ⅰ和CO Ⅱ4个基因片段，结果表明，虽然核内含子序列和线粒体基因的进化速度接近，但内含子序列在对亲缘关系比较近的地理种群系统发育的研究中受限制，对不同姊妹种间，测得的基因片段长度差异较大。在mtDNA 和Tpi 基因中，他们未发现任何一个物种相关的姐妹种存在相互单系还是并系的关系；相比之下, Mpi 基因的第3个座位的等位基因在上述
的两个姐妹种中都显示了清晰的系统发育关系；此外，Mpi 和Tpi 两个基因中不协调的谱系与正在进行基因流适应的物种形成模型是相一致的，这就可以论证运用多个基因来研究系统发生关系的必要性。
2.5延长因子（EF-1α）基因
EF-1α是一种编码蛋白的核基因，涉及到依赖GTP 氨tRNA 和核糖体受位的结合。由于氨基酸序列的保守性，EF-1α被看作是一个有潜力的研究高级阶元系统发育，特别是昆虫的高级阶元系统发育的基因。EF-1α基因中存在一些进化速度比较快的内元，因此它也可以分析低阶元的系统发育问题。鉴于昆虫的EF-1α和CO Ⅰ、16S RNA 、18S RNA 基因在较广的分歧范围内都有信息位点，并且在分子系统学中也得到了广泛的应用，Caterino 等主张将它们作为昆虫分子系统学研究中的标准分子标记。杨邦和等基于CO Ⅱ和EF-1α基因部分序列的中国蝶类科间系统发生关系，结果表明弄蝶科、凤蝶科、粉蝶科、灰蝶科能够单独成一支，其中弄蝶科位于系统树的基部，分化较早， 是较原始的类群，与传统的形态分类结果是相一致的，粉蝶科与凤蝶科的亲缘关系较近，蚬蝶科倾向与灰蝶科有较近的亲缘关系，且蚬蝶科种群始终聚为一支，显示了该科是一个单系群，从单系性方面来看，支持将蚬蝶科作为一个独立的科，同时表明中国分布的蛱蝶总科是一单系群，并且它与灰蝶科和蚬蝶科聚成的一支是姐妹群关系。
2.6无翅基因（Wingless ）
Wingless 基因是一个单拷贝的核基因，对翅膀样式的形成起重要的作用。由于翅膀的样式是昆虫鉴定中的一个重要标准，因此Wingless 基因有望成为研究昆虫系统发育的一个重要的候选基因。Brower 等对蛱蝶科的22个物种的Wingless 和CO Ⅱ基因测序，系统发育分析2树的结构基本一致，他们认为Wingless 基因将成为研究蝴蝶、也可能是研究其它在6000万年前分歧的昆虫系统发育的一个有用的基因。因此，联合运用Wingless 和CO Ⅱ基因对蝶类的系统发育研究具有重要的意义。
3. 多基因联合分析
无论是线粒体基因还是核基因，任何单一基因应用于系统发育研究都有一定的局限性。随着各种基因联合分析，特别是联合核基因与线粒体基因研究昆虫的系统发育已成为分子系统学发展的必然趋势。目前，国内外已有许多学者联合运用多基因联合进行系统学与进化生物学的研究。
袁向群[19]基于线粒体Cyt b 、ND 1、CO Ⅰ和16S rDNA，对中国弄蝶科Hesperiidae 进
行序列分析，为该科的系统发育关系提供大量分子生物学证据，提出以分子系统学为基础的中国弄蝶科分类系统。Price 等[20]基于33个成虫和幼虫的形态和生态特征与CO Ⅰ、EF-1α、Wingless 基因研究非洲Dirini 族的系统发育，结果支持Dirini 族是单系群，Aeropetes 和Tarsocera 属为姊妹群，明确该族的两种扩散途径。Müller 等[21]利用线粒体CO Ⅰ、ND 5和Wingless 基因首次揭示印度太平洋区螯蛱蝶属Charaxes 31种的进化历史及系统发育关系。Dincǎ等[22]利用线粒体CO Ⅰ基因片段和核基因ITS2联合几何测量学数据, 表明眼灰蝶属Polyommatus 两个种复杂的地理系统关系。Yago 等[23]利用CO Ⅰ、ND 5、EF-1α和Tpi 对E. phemius、E. ipona和E. euphemia 3个种进行分析，结果表明这3个种在遗传距离上没有显著差异，E. phemius 复合种是单一种，E. ipona 是E. phemius 的异名，E. euphemia 只是E. phemius的一个亚种。Gillespie 等[24]基于外部形态特征、线粒体基因（CO Ⅰ、ND 5）与核基因（28S rDNA、ITS2、Wingless ）明确了新西兰Zizina 当地特有种Z. oxleyi和外来种Z. labradus的杂交区域。Nazari 等[25]对16S rDNA、CO Ⅰ、Wingless 和EF-1α基因进行分析，研究粉蝶科Colotis 属和8个相关属的基因多样性和系统发育关系。Willmott [26]则基于线粒体基因（CO Ⅰ、CO Ⅱ）和核基因（EF-1α）对Preponini 族22种的系统发育关系进行分析。Thomas 等[27]基于94个形态特征、5个线粒体基因（16S rDNA、CO Ⅰ、CO Ⅱ、ND 1、ND 5）、2个核基因（EF-1α、Wingless ）对凤蝶亚科Papilioninae 的18属，绢蝶亚科Parnassiinae 的4属，以及Baroniinae 亚科的系统发育进行分析。
4. 结语
通过系统学的研究，我们可以解决蝴蝶各分类阶元之间的进化关系和一些有争议物种的分类地位的确立以及相关物种的系统地理探讨等。目前中国的分类体系是基于传统的形态学分类，分子上的证据还很匮乏。综上所述，近十几年来，使用ＤＮＡ基因序列是解决蝶类系统学研究中存在问题的主要手段[28]，其中应用最多的分子标记是线粒体CO Ⅰ、CO Ⅱ基因以及核基因EF-1α、Wingless 等，随着分子技术的快速发展，越来越多的基因片段被用于蝶类分子系统学研究[29]。当然，对于多基因联合分析可以增加系统分析的置信度，因此，选取多个基因联合，尤其是多个线粒体基因与核基因的联合作为探讨蝶类不同阶元系统发育关系的分子标记将会受到更多国内外学者的关注。此外，对蝶类线粒体全基因组的测序也越来越多，也有更多的学者利用线粒体全基因组序列进行蝶类系统学的研究[30]。
虽然，利用DNA 基因序列进行蝶类系统发育关系的研究可以为传统意义上的系统学研究提供分子依据，解决一些在分类和系统发生存在的争议。但是这并不意味着忽视基于形
态学研究的传统系统学分析，毕竟一些线粒体基因用于系统发育研究仍受到质疑。因此，通过将分子数据与传统形态、行为、生态等数据结合进行分析研究，将会使结果更加可靠
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