监测水体重金属污染的分子生物标志物研究进展

生态环境学报 2010, 19(2): 453-458 http://www.jeesci.com Ecology and Environmental Sciences E-mail: [email protected]

赵顺顺，孟范平，王震宇，肖静，付海防

中国海洋大学环境科学与工程学院，山东青岛 266100

摘要：水体重金属污染具有持久性、高度危害性和难治理性，如何快速、准确监测并对其进行科学评价，成为当今环境科学关心的热点问题。大量研究表明，水生生物体内某些生理指标的变化可以反映水体重金属的污染程度。综述了乙酰胆碱酯酶、抗氧化防御系统、腺苷三磷酸、DNA 损伤以及金属硫蛋白等几种分子水平上的生物标志物监测重金属污染的原理、国内外研究进展以及应用现状。认为分子生物标志物具有特异性、敏感性等优势，可以较快指示水体重金属污染对生物体的影响，在实际应用中需注意各种干扰因素。在进行野外研究时，要注重混合重金属与多途径暴露下，分子生物标志物的变化规律。生物体之间差异性会导致标志物在同样暴露条件下产生不同的变化规律，需要加强“离体”标志物和“标准化”标志物的研究，确保监测结果的可靠性和可重复性。生物标志物较为敏感，容易受到外界环境及体内生理因素影响，可考虑综合运用多种生物标志物指示重金属污染。目前，有关重金属对水生生物毒性效应的研究较多，但重金属对生物体的致毒机理方面研究并不深入，这将是今后研究的重点问题之一。关键词：水体；重金属；分子生物标志物

中图分类号：X835 文献标识码：A 文章编号：1674-5906（2010）02-0453-06

随着工农业的发展，排污量逐渐增加，大量的金属离子污染物进入水体，成为主要的环境污染物之一。美国EPA 公布的129种优先监测的污染物中，重金属及其化合物就有12种。大量研究表明，重金属具有亲脂性、高富集性和难降解性，进入水体后容易在水生生物体内积累，并随着生物营养级的升高而增大[1-2]，增加重金属的潜在危害；水体中的

为了能够重金属还能对生物产生显著毒性作用[3-6]。

早期诊断水环境重金属污染状况，控制重金属对水生生态的危害，必须对水体重金属进行快速、灵敏和准确的监测。

对水体中重金属污染的监测，用化学分析的方法往往很难评估其潜在毒性。采用生物标志物作为敏感的生物效应“早期预警”工具，在环境质量评估中具有非常重要的意义[7-8]。Goksoyr 等[9]提出：生物标志物是生物体暴露于亚致死剂量的有毒化合物时，在分子、细胞等水平上发生异常变化的信号指标。如果这些异常变化先于严重的结构损伤，标志物就有助于确定生物体所处的污染状态及其潜在危害，为严重毒性伤害提供早期警报[10]。在众多监测水体重金属污染的生物标志物中，有一些已被国内外专家学者广泛关注，如乙酰胆碱酯酶(AChE)、抗氧化防御系统、腺苷三磷酸(ATPase)、DNA 损伤、金属硫蛋白(MTs)诱导等。这些分子生物标志物具有怎样的特殊结构和功能，它们与重金属接触（或结合）后会产生什么样的响应，如何运

基金项目：中国海洋大学引进人才科研启动经费资助项目(HD19990016)

用这些分子生物标志物来指示水体重金属污染，以及在实际监测中的干扰因素等均是需要重点关注的问题。本文基于这几种分子生物标志物的结构特点及其对重金属的响应特征，总结了水环境重金属的生物标志物研究现状，并提出目前存在的问题及进一步的研究方向。

1 乙酰胆碱酯酶（AChE,acetylcholinesterase）

乙酰胆碱酯酶(AChE)是一个经典的毒理指标。50年代末，Weiss 就提出对自然水环境中极低浓度的有机磷杀虫剂，可用鱼脑或无脊椎动物的AChE 活力受抑制程度来检测。AChE 较早用于评价水体中有机磷农药的毒性，国内外在这方面展开大量的研究[11-12]。而选用AChE 指示重金属离子污染的研究目前只有少量报道。AChE 的活性中心由酯解部位、阴离子部位和疏水性区域3个主要区域组成，其中酯解部位含有丝氨酸和组氨酸[13]。有研究表明，重金属暴露引起有机体AChE 活性降低的一个原因就是重金属共价结合乙酰胆碱酯酶活性位点的丝氨酸，直接导致酶的活性丧失，另一方面可能是由于酶中大量巯基与重金属结合引起空间构想变化，从而间接引起酶活性降低[14]。

Lionetto [15]等发现工业区和港区紫贻贝(Mytilus galloprovincialis ) 和红山羊鱼(Mullus barbatus) 体内AChE 活性减少，以此推测除杀虫剂外，水中重金属抑制了AChE 活性。贾秀英[16]等研究Cd 2+、Cr 6+单一及其复合污染对鲫鱼脑组织AChE 活性的影

作者简介：赵顺顺（1982年生），女，博士，海洋环境生态学。E-mail:[email protected] 收稿日期：2009-12-25

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响，随着重金属胁迫浓度的增加以及染毒时间的延长，鲫鱼脑组织AChE 活性下降，复合污染的毒性效应明显大于单一污染。在离体情况下，Cd 对鲫鱼脑的AChE 活性有直接影响，而Cr 6+对鲫鱼脑的AChE 活性无直接影响。王晶[17]等将沙蚕(Perinereis aibuhitensis Grube) 暴露于不同浓度的重金属Cu 2+、Cd 2+中，发现在Cu 2+、Cd 2+污染暴露条件下，AChE 的活性随着污染物浓度的增加也有所下降，但这一变化并不显著，2种重金属对沙蚕体内AChE 的最大抑制率低于50%。重金属对AChE 的抑制效果不明显，可能是在重金属污染物的胁迫下，沙蚕体内可诱导更多的金属硫蛋白与重金属离子相结合，降低了对AChE 的抑制效果[18-19]。

现有的研究结果表明，重金属会抑制暴露有机体的AChE 活性，但多数是在水体重金属浓度较高或者长期暴露下才会产生，低浓度重金属或短期暴露条件对AChE 活性的抑制不明显。与其它标志物相比，AChE 在敏感性和专一性方面均有差距，多种重金属对AChE 联合毒性效应是今后的研究方向。

2 抗氧化防御系统

抗氧化防御系统，又称活性氧（ROS ）清除系统，是一类分子生态毒理指标。ROS 在生物体能量生产、吞噬作用、细胞生长和细胞信号控制等方面发挥重要作用；另一方面，ROS 也可能会攻击生物大分子（如脂类、蛋白质和DNA ），对其产生氧化作用，导致膜损伤、酶失活和DNA 损伤[20]。当细胞内ROS 水平超过细胞抗氧化能力，细胞内氧化还原状态发生改变，进而产生氧化压力，机体主要通过抗氧化防御系统抵御活性氧的伤害。抗氧化防御系统主要由抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD 、过氧化氢酶CAT 、谷胱甘肽过氧化酶GPX 等）和抗氧化非酶物质（如谷胱甘肽GSH 、维生素C 和维生素E 等）组成[21-22]。另外，脂质过氧化物、总氧自由基的清除能力、DNA 的氧化和氧化还原状态等也可作为氧化损伤的生化指标。有研究表明，金属暴露可导致氧自由基或活性氧（ROS ）产物的增加[23]，从而引起抗氧化酶活力变化或非酶物质含量的变化，可作为监测重金属污染胁迫的指示指标，间接或直接反映环境中重金属污染的存在。

Almeida [24]等将贻贝(Perna perna) 暴露在多种重金属中，发现暴露结束时所有暴露组贻贝GST 活性均未发生显著变化，而CAT 活性均有所升高；磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx ）酶活性与丙二醛（MDA ）水平呈负相关，建议将PHGPx 作为重金属暴露的生物标志物。王丽平[25]等研究了Cu 对中肋骨条藻(Skeletonema costatum) 和三角褐指

藻(Phaeodactylum triconutum) 生长的影响和对藻细胞内SOD 、POD 活力以及MDA 含量的影响，发现

在72 h EC50分别对相应藻种的胁迫下，

SOD 和POD 活力表现为前期诱导后期抑制，MDA 含量则随着胁迫时间的延长逐渐升高。两种海洋微藻的SOD 、POD 活力和MDA 含量的改变与添加的Cu 2+浓度具一定的相关性。张海波[26]研究了重金属离子对条斑紫菜(Porphyra yezoensis) 丝状体过氧化物酶(POD)活性的影响，发现当重金属离子胁迫较轻时，藻体抗氧化防御系统产生了适应性诱导反应；但当重金属离子的处理浓度增加到一定程度后，所有酶的合成均受到阻碍，POD 的抗氧化能力呈现急剧的下降趋势；重金属离子胁迫与藻体POD 活性存在明显的时间效应和浓度效应关系。

Van der Oost等[27]提出海洋生物体内的抗氧化防御系统可以作为监测海洋污染状况的生物标志物，现在抗氧化参数已开始应用到野外环境监测中。但是抗氧化防御酶的活性能够随季节而发生变

化[28]，

还会对环境中其它污染物质（如多环芳烃等）产生响应，获得重金属胁迫与抗氧化酶活性改变之间的剂量—效应关系仍然比较困难，这些均限制了抗氧化防御酶在环境监测中的应用。

3 腺苷三磷酸酶(ATPase)

腺苷三磷酸酶(ATPase)是生物体内重要的酶，几乎存在于所有生物的细胞膜上，负责细胞内外的离子转运与交换，在细胞的供能活动（如离子平衡等）中起着重要作用。已有较多研究表明，水生生物体内多种ATPase 对重金属离子的暴露非常敏感。体外暴露，重金属能够降低ATPase 活性，而体内暴露可能涉及各种补偿机制或稳态机制，影响较为复杂。

生物体Na/K ATPase活性与重金属暴露浓度或体内重金属含量之间不仅具有良好的剂量—效应关系和时间—效应关系，而且还具有组织差异性。周新文[29]等将鲫鱼暴露在6种浓度的混合重金属离子溶液中，7 d后鱼鳃、鱼脑和肝脏的Na/K ATPase活性与混合重金属的浓度呈显著的负线性相关关系，3种组织酶活性的敏感顺序为鱼脑>鱼鳃>肝脏；建议应用鱼鳃和鱼脑的Na/K ATPase活性变化作为混合重金属离子污染的生物指示酶。Ay [30]等的研究中同样发现鱼鳃Na/K ATPase的活性与单一重金属Cu 、Pb 的暴露浓度成负相关关系。高春生[31]等采用不同浓度铜对黄河鲤(Cyprinus Carpio) 的鳃、肝、胰脏和肾组织Na/K ATPase活性影响时发现，低浓

度Cu 2+对酶活性有促进作用，

而高浓度Cu 2+对酶活性有抑制作用，且随着浓度的增加和暴露时间的延长，促进（或抑制）作用也越明显(P

（如金属硫蛋白）

赵顺顺等：监测水体重金属污染的分子生物标志物研究进展 455

敏的是鳃组织Na/K ATPase活性。Thaker [32]等发现硬骨鱼(Periophthalmus dipes) 的鱼鳃、内脏、肾脏Na/K ATPase活性与重金属Cr(VI)在其组织中的积累浓度相关，Cr(VI)可以通过改变ATPase 的活性来改变肠上皮细胞膜以及其它细胞层的渗透性，导致吸收营养盐、离子和代谢物的主动运输机制减弱。

另外，Ca 2+-ATPase 也能对水环境中重金属胁迫产生响应。不同金属离子对Ca 2+-ATPase 活性的

Zn 2+和Cd 2+抑制效应不同，Hg 2+和Cu 2+影响最显著，

次之。这种抑制效应差异可能是由于金属离子与酶上特定的巯基（-SH ）亲和力不同所导致，Hg 2+(Cu2+) 与Zn 2+(Cd2+) 相比有较高的巯基亲和力，因此对酶的抑制效果显著[33]。

DNA 断裂，DNA 修复过程中掺入大量标记过的3H-胸腺嘧啶核苷，浓度低时掺入量明显高于对照组，而高浓度时掺入量反而降低；肝脏DNA 总甲基化水平升高也表明鱼组织细胞DNA 的断裂。

5 金属硫蛋白(Metallothioneine，MT)

金属硫蛋白(Metallothionein，MT) 是一种富含金属(Ag、Au 、Bi 、Cd 、Hg 、Zn 等) 和半胱氨酸的低分子质量的蛋白质，MT 在体内被金属和其它因素诱导而合成，具有重要的生物学功能，如清除体内自由基、防止机体衰老[40-41]；重金属调节和解毒功能[42]；参与体内微量元素的代谢[43]；增强机体对应激的适应能力[44]等。MT 分子中含有大量巯基(-SH)，而巯基与金属离子具有很强的亲和力，因此MT 分子对金属尤其是有毒的重金属如Ag 、Cd 、Cu 、Hg 和Zn 等有很强的结合力。生物体调节必需金属元素已具有一定的MT 基础水平，当周围环境中和生物体内的金属含量超过一定浓度时，才能诱导合成新的MT ，且这种诱导水平与环境中的金属浓度有直接相关性。根据这一特性，有研究者提出利用水生生物MT 水平作为水生生物受重金属胁迫的分子生态毒理学诊断指标，凭此进行水环境的监测、管理和保护。

通过野外实验，发现生物体内MT 水平对水环境中重金属具有指示作用。Linde [45]等从污染区和对照区分别采集的生物样品中发现，污染区褐鳟鱼(Salmo trutta) 和欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla) 肝脏MT 含量均高于未污染区，并且两个区褐鳟鱼肝脏MT 水平具有显著的统计学差异，从而提出褐鳟鱼肝脏MT 适合作为指示重金属污染的生物标志物。Smaoui-Damak [46]等通过分析证实了污染区雄性蛤仔消化腺内MT 与体内Cd 含量具有一定的相关性，并且发现选择雄性生物体MT 作为标志物要优于雌性个体。可见在野外实验中，选择MT 作为标志物需要注意物种、性别以及组织部位的选择。室内实验同样发现亚致死剂量的重金属即可引发MT 的诱导合成。Ghedira [47]等在黑鲷(Sparus aurata) 体内注射一定浓度的Cd 2+和Cu 2+，2 d后发现肝脏、鳃和

4 DNA 损伤

脱氧核糖核酸(DNA)存在于所有活的有机体中，携带遗传信息。任何非程序的DNA 分子结构改变都会导致严重的生物学上的突变。一些环境化学物质和物理因子被分类定为遗传毒性物质，这些物质能够损伤DNA 分子结构，通常伴随着不利于生物完整性的影响[34]。因此特殊类型的DNA 结构损伤可以视为污染暴露的生物标志物。一些常见的由遗传毒物引起的DNA 结构修饰总结见表1[35]。另外，检测DNA 结构损伤也是分子生物标志物的重要研究内容。目前主要的检测手段有：DNA 断链检测（彗星试验、碱性解链实验、非程序DNA 合成试验）、微核试验(PCE)、DNA 加合物试验（32P 后标记法）、DNA 甲基化水平等[36-37]。Garman [38]等将海胆胚胎分别暴露于3种重金属溶液(As5+、Ni 5+、Cr 6+) 中，48 h后，畸变和DNA 蛋白质交联(DPCs)率增加。3种重金属致畸的最低可观察效应浓度分别是As 5+(0.011 mg·L-1) 、Ni 5+(0.40 mg·L-1) 、

导致DPCs 反应的最低可观察浓度Cr 6+(2.5 mg·L-1) ；

分别是As 5+(0.023 mg·L-1) 、Ni 5+(8.0 mg·L-1) 、Cr 6+(10.0 mg·L-1) ；海胆胚胎受金属暴露后DPCs 水平均显著增加，其中As 和Ni 两种金属与DPCs 之间存在剂量—效应关系。朱国念[39]等发现混合重金离子的毒性作用会引发鲫鱼鳃和肝脏组织细胞

表1 由遗传毒物引起的DNA 结构修饰

Table 1 DNA structural modifications caused by genotoxicants

遗传毒物

物理因子

化学因子

紫外线电离辐射烷化剂

碱基类似物、修饰剂

修饰类型胸腺嘧啶二聚体

链断裂加合物碱基改变脱碱基位点

断链甲基化的DNA

突变

机制

紫外线UV-B 照射引起的嘧啶二聚作用

电离辐射形成-OH 自由基遗传毒物共价连接至DNA 链上

现有碱基化学修饰

化学性质不稳定加合物或损坏碱基的脱落自由基和脱碱基位点的形成导致磷酸二酯键的断裂

干扰DNA 复制干扰DNA 修复

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肾中MT 水平均显著升高，尤其肝脏MT 含量最高，分别是对照组的3.56倍(Cu)和3.3倍(Cd)。李春娣[48]等发现Cu 2+暴露下翡翠贻贝(Perna viridis) 消化腺内MT 含量变化具有一定规律性。低浓度时，MT 含量随时间逐渐增加，而Cu 浓度较高时，MT 含量先迅速升高，而后基本保持不变；同时还发现贻贝消化腺MT 指标与生物体内Cu 含量呈负指数增长关系，这种相关性可以反映水体环境的重金属污染变化。由于MT 一个显著特点是可在转录水平上被环境中的金属所诱导[49]，所以在重金属暴露情况下，MT mRNA水平会显著升高。利用MT mRNA作为重金属暴露生物标志物，目前已有较多报道[50-52]。

但是，MT 对重金属暴露的响应可能会受到多方面因素干扰。例如，生物体接触的金属浓度过高，暴露时间过长，金属结合蛋白的合成过程会被严重干扰[53]。另外，MT 在生物体内的诱导具有组织差异性，肝脏是MT 合成的主要器官，诱导效果优于其它部位。Lecoeur 等[54]研究Cd/Cu暴露对双壳类斑马贻贝(Dreissena polymorpha ) 的影响，发现该生物体的MT 指标与Cu 的相关性并不显著，认为测定的是生物全部组织样品，掩盖了特征器官的一些

显著反应。除此之外，水体盐度[55]、

季节变化[56-57]、生物种类等内外因素均可影响MT 的含量，从而导致MT 研究经常出现试验结果不一致性的情况，可见利用生物体内MT 作为接触重金属污染的生物标志物仍需进行广泛而深入的研究。

6 未来研究方向展望

细胞或分子水平上的生物标志物，由于具有特异性、预警性和广泛性等特点，在污染物暴露和毒性效应的早期指示方面显示了其优越性并取得了很大进展，但是仍然存在一些问题有待解决。具体表现为以下几个方面。

（1）在野外环境中，水生生物体往往受到来自多种途径、多种重金属的综合影响，目前国内研究多为标志物在单一重金属和单一暴露途径下的响应规律，这与实际情况不符。今后应注重总结混合重金属与多途径暴露下，生物标志物的变化规律。

（2）生物有个体差异和种间差异性。选择不同生物体内分子标志物监测水体重金属污染，发现同样暴露条件下的标志物变化规律并不相同，各实验室之间的数据无法横向比较，甚至得到相反的结论。为了监测规范化和监测结果的可重复性，离体生物标志物以及“标准化”生物标志物将会成为今后研究的热点。

（3）生物标志物对重金属响应过程容易受到外界环境因素如温度、盐度、pH 以及体内因素如年龄、性别等的影响。因此可考虑综合应用多种生物

标志物诊断重金属对水生生态系统产生的影响。

（4）加强重金属对水生生物致毒机理方面的研究。水体中重金属可在生物体内积累并随着生物营养级的升高而放大，某些重金属还能在生物体内发生转化，毒性增强。研究重金属的致毒机理有助于解释生物体受重金属胁迫后体内各种标志物的变化规律，以便完整地评价重金属的生态风险性。

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Progress in molecular biomarkers for monitoring heavy metal pollution

of water system

ZHAO Shunshun, MENG Fanping, WANG Zhenyu, XIAO Jing, FU Haifang

College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China

Abstract: Great concerns are focused on monitoring and evaluating heavy metal pollution in water due to its characteristics, such as persistent, harmful and difficult to control. A large number of studies have shown that changes of certain physiological indexes in aquatic organisms can reflect the degree of heavy metal pollution in water. In this paper, we overview principle, research and applica-tion status of several molecular biomarkers for evaluating heavy metal pollution, such as acetylcholinesterase, antioxidant enzyme, adenosine triphosphate, DNA damage and metallothionein etc. Results show that molecular biomarkers can indicate effects of heavy metal on aquatic organisms for their specificity and sensitivity. However, various interference factors need to be taken into account. Mixed heavy metals and various exposure ways can be designed in field experiments to observe changes of molecular biomarkers. Moreover, researches on “in vitro” markers and “standard” markers should be strengthened. Additionally, the integrated use of mul-tiple biomarkers needs to be considered to monitor heavy metal pollution. Recently, most studies are associated with toxic effects of heavy metals while neglecting mechanism which will be one of the key issues for future research. Key words: water system; heavy metal; molecular biomarkers