DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2002.04.024
检测技术
#$%&%’
食品科技
())*+,-.#,./*#0.,1#)2)34
检测技术
5,6技术在食品沙门氏菌检测中的应用
李莉
蒋作明
重庆・&
（西南农业大学食品学院
J
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIJ
II摘要：介绍了5,6技术的原理及其在食品沙门III氏菌检测中的应用，同时提出了尚存在的问题，并III对其应用前景作了展望。III关键词：5,6；沙门氏菌；检测J
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIJ
中图分类号：0+’
文献标识码：/
文章编号：8
!
)*+,-%.#(5,6RPKMO$CAMMKRFADAHDB$C
沙门氏菌病是公共卫生学上有重要意义的人畜共
患病之一，其病原沙门氏菌属肠杆菌科，蛋、家畜和肉制品是主要传播媒介。传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生长化及血清学鉴定很费力、耗时，需&U7F才能完成，其它如抗体检测法，虽然快速，但其高假阳性使之不适于常规检测V?W。此外，低水平的病原菌污染，食品加工后导致沙门氏菌的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素，使得沙门氏菌的检测受到一些限制。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。分子生物学技术的发展使得许多食品微生物学者寻求如5,6技术来检测病原菌，以期增加敏感性和显著地减少检测时间。8::?年
+$CQV&W
等人利用5,6技术成功地检测到血液中的伤寒
沙门氏菌*#/，8::&年卢强等V
参考6KIC设计的引
物，扩增了BCS/基因’;&XL的特异片断。由于该法的快速、特异、敏感等优点，使之在沙门氏菌的检测中得以广泛的应用V8，’W。
8
5,6的原理及技术发展
聚合酶链反应=L$MJOAEKPAHIKBCEAKHDB$C>简称5,6，是一种体外酶促合成，扩增特定*#/片断的
收稿日期：’
方法。该技术于8:;
模板、引物、*#05、适当缓冲液=ZQ’[>的反应混合物中，在热稳定*#/聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的*#/片断进行扩增。这种扩增是通过模板*#/、引物之间的变性、退火=复性>、延伸等三步反应为一个周期，循环进行，使目标*#/片段得以扩增。由于每一周期产生的*#/片断均能成为下一次循环的模板，故5,6产物以指数形式增加。
目前，5,6技术本身获得长足进步，可靠性不断提高，以5,6技术为基础的相关技术得到了很大的发展。如反相5,6=-CSAEPA95,6>、反转5,6=609
5,6>、随机扩增多态性*#/技术=6/5*>，免疫
5,6=MOOGC$95,6>，
不对称5,6=/PJOOADEBH5,6>、多重5,6=ZGMDBLMALEBOAE5,6>、固相5,6等。在关键技术上也有所进步，如热循环仪在质量和技术上的发展；引物的设计可通过计算机和网络来实现；已发展出多种具有各种不同特性的聚合酶体系和酶反应体系；目前已开发出了一系列的*#/聚合酶试剂盒，简化了5,6操作，提高了实验的重现性V!U;W。
’5,6技术在食品沙门氏菌检测中的应用’%8
模板的制备
5,6检测方法的可靠性一部分依赖于目标模板的纯度和足够的目标分子数量，大多数5,6检测仍要求富集步骤V:，8
道用于食品体系中细菌的浓缩V:，88，8’W
。2BPK/2GH$EAV:W
等研究了金属氢氧化物固定技术对乳品中肠炎沙门氏菌细胞的浓缩。用锆氢氧化物与细胞固定后，样品体积减少
08
!
食品科技
#$%&%’((’
检测技术
)**+,-./#-/0+#1/-2#*3*45
问题。6789:03;?
’%’引物设计
根据所选沙门氏菌靶序列的不同，目前常在下面
几种序列内进行引物设计?
’%’%
细菌中，鞭毛都是重要的毒力因子，不仅鞭毛所提供的动力可能是细菌侵入细胞的重要因素，鞭毛可以作为粘附素，决定了细菌在细胞表面的吸附，以及其后的侵入和定居过程。,$DE?&@等根据该序列设计内、外引物进行套式A-B，除伤寒沙门氏菌能扩增出特异性
+#0片断外，其余沙门氏菌和其它菌群均无特异性扩增，且能与副伤寒沙门氏菌区别开。
’%’%’编码菌毛的F8
表面的附属器官如菌毛，纤毛介导与上皮表面的特异受体相结合。鼠伤寒沙门氏菌和其它肠道菌科的其它病原菌产生形态、抗原相关的侵袭性!型菌毛。在沙门氏菌株中，!型菌毛表型的表达由一系列基因编码，F8
’%’%C与沙门氏菌质粒毒力相关的,AH基因序列
对许多有重要医学意义的细菌来说，质粒不仅编码毒力因子，还编码某种调控蛋白，控制毒力因子的产生。含有致病性质粒的细菌是致病性的，丢失了致病性质粒的细菌，对人或动物不再致病，或致病力下降。I;:$D?
’%’%&编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的8DJ基因序列
沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌等许多肠
道病原性细菌具有侵袭宿主上皮细胞的能力。侵袭是病原菌导致慢性感染的原因之一。8DJ基因序列是一组基因，包括8DJ0、8DJK、8DJ-、8DJ+、8DJ/等。B;:D?
’%’%G沙门氏菌侵袭基因正调节蛋白:8>0
在沙门
!
氏菌中已发现了G个毒力岛，分别命名为,A.
,A.’、,A.C、,A.&、,A.G。其中,A.
4N$?
’%’%!编码沙门氏菌3A,*抗原的QFT基因脂多糖U3A,V作为革兰氏阴性菌外膜主要成分，其多糖部分U含*W特异性多糖和核心多糖V参与了细菌对宿主细胞的粘附、侵袭和在细胞间扩散的过程，是细菌主要的致病因子之一。3NX?
’%’%L编码与蛋白质结合的+#0的:DP基因
Z$D7P%+%+%?C@
根据该序列设计了上游引物32#,WGC
和下游引物B2#,W!O’及一条’G个核苷酸的探针
2#,WA，对牡蛎中污染的沙门氏菌进行A-BW基因探针检测，该方法可以[&(个细胞的敏感性检测沙门氏菌属中的多个种。
设计一对适宜的引物是应用A-B技术检测沙门氏菌的关键。除上述几种引物设计，还可根据其它保守序列来设计引物，但要注意种特异性、属特异性的区别，应根据检测目的的不同来选用。
’%CA-B检测方法
近年来，用A-B技术检测沙门氏菌得到了迅速
发展，产生了许多种A-B法。如常规A-B、套式A-B、多重A-B。也可几种方法结合使用，如李君文?’(@等将常规A-B与半套式A-B相结合，根据沙门氏菌中保守的
冲蛋白胨水UKA]V中非选择性增菌!:，然后进细胞破碎和A-B，可在接受食品样品后
C
存在的问题及应用展望
A-B技术已成为调查食品源疾病暴发及鉴定相应
检测技术
病原菌的有用工具。它可提高灵敏性、缩短操作时间、提高检出率，并可有效检测致伤的沙门氏菌67，7’8。然而，A,B技术的广泛运用特别受限于6=，
但由于其快速、特异、敏感的特点，A,B技术作为一种检测手段仍有巨大的运用价值。而且随着研究的不断深入，A,B检测方法也会得以发展和完善，并将在食品沙门氏菌及其它致病菌的检测中得到更多的应用。
参考文献：
678彭丽萍，等%食品沙门氏菌检测方法进展%中
国人兽共患病杂志，7===，75C5D：;=F=76
6>8
H$?IJG**GIKLM%*IKINKO$?$P+LMQ$?IMMLJR%SJO?TKUIR$MVQIWLJINULO?WILNKO$?CA,BDL?XTIY?IRW$ZIJ%H($$X+NOG7==>G5;[77=7F77=@6&8
+$?TH1GIKLM%*IKINKO$?$P+LMQ$?IMMLKVROO?KUI:M$$X$PRLKOI?KJ\OKU0VRU$OX(I]IWZVR$MVYQIWLJINULO?WILNKO$?%H,MO?^ONW$ZO$MG7==>G>7C!D[7&>=F7&&>
658卢强，等%A,B扩增O?]/基因特异性检测沙门氏菌%中国兽医学报，7==&，7&C>D：
6@8陶生策，等%A,B技术研究进展%生物工程进展，
6;8李平兰%A,B技术及其在食品微生物检测中的应用%食品科学，7==;，7=C@D：>F5
6=8
2OJL/G2SN$WIGIKLM%-QQ$ZOMO‘LKO$?\OKU^IKLM1VXW$aOXIJLJL^IL?J0$,$?NI?KWLKI($$XY:W$?I:LNKIWOLP$W*IKINKO$?ZVNSMKSWLML?X^$MINSMLW
^IKU$XJ%/RRM.?]OW$?^ONWIZO$MG
67’8bIOKU/G2LQRIMGIKLM%-QRW$]IX0IQRMLKIAWIYRLWLKO$?P$WA,B
6778(IW?L?XI‘
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食品科技
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57!
67
^SWLQLKJS4GIKLM%*IKINKO$?$PM$aOIMMLZSQIKYKOO?N$\’JQOMcZVA,B[
67&8徐建国%分子医学细菌学_科学出版社，
6758
,$UI?1HGIKLM%A,B/QRMOPONLKO$?$PKUIPOQ/3I?IJIdSI?NI$PJLMQ$?IMMLKVRUOQSWOSQGLJRIYNOPONQIKU$XP$W*IKINKO$?$P+LMQ$?IMMLJRR%/RYRM.?]OW$?^ONW$ZO$M，7==!G!
67!8^LU$?HG2La/H/%dSL?KOKLKO]IR$MVQIWLJINUYLO?WILNKO$?QIKU$XP$WKUIXIKINKO$?O?L]OL?PLYINIJ$P+LMQ$?IMMLJ,LWWVO?TKUIJR]BTI?I%.ROXYIQO$M-?PINK，7==>G777[&55F&!5
67@8BLU?b，IKLM%/QRMOPONLKO$?$PL?O?]/TI?IJIdYSI?NI$P+LMQ$?IMMLKVRUOQSWOSQZVR$MVQIWLJINULO?WILNKO$?LJLJRINOPONQIKU$X$PXIKINKO$?$P+LMQ$?IMML_^$M,IMMAW$ZIJ，7==
67;8eSL?3S$GIKLM%A,B*INKINKO$?$P+LMQ$?IMMLI?KIWONL+IW$KVRI^$?KI]OXI$O?L?X$?BL\0$YQLK$IJfJO?TAWOQIJ*IWO]IXPW$QUOM/%/RRM.?Y]OW$?^ONW$ZO$M，
67=8
2ScH^,GIKLM%+IMINKO]I/QRMOPONLKO$?$P/ZYIdS$JIL?XALWLK$JI+V?KULJI3I?IJCWPZ）ZVA$MYVQIWLJI,ULO?BILNKO$?P$W-XI?KOPONLKO$?$P+LMYQ$?IMML^Lg$W+IW$TW$SRJC/G:G,
6
F
6
B(IWWIKKOGIKLM%0\IM]I
6
曹泽虹，等%用A,B法快速测定食物中毒病原菌%微生物学报，
（上接第!5页）
参考文献：
678浙江药用植物志编写组%浙江药用植物志%浙江科学技术出版社
6
沈钟，王果庭%胶体与表面化学%化学工业出版社，7==@%@!
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DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2002.04.024
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5,6技术在食品沙门氏菌检测中的应用
李莉
蒋作明
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II摘要：介绍了5,6技术的原理及其在食品沙门III氏菌检测中的应用，同时提出了尚存在的问题，并III对其应用前景作了展望。III关键词：5,6；沙门氏菌；检测J
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文章编号：8
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沙门氏菌病是公共卫生学上有重要意义的人畜共
患病之一，其病原沙门氏菌属肠杆菌科，蛋、家畜和肉制品是主要传播媒介。传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生长化及血清学鉴定很费力、耗时，需&U7F才能完成，其它如抗体检测法，虽然快速，但其高假阳性使之不适于常规检测V?W。此外，低水平的病原菌污染，食品加工后导致沙门氏菌的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素，使得沙门氏菌的检测受到一些限制。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。分子生物学技术的发展使得许多食品微生物学者寻求如5,6技术来检测病原菌，以期增加敏感性和显著地减少检测时间。8::?年
+$CQV&W
等人利用5,6技术成功地检测到血液中的伤寒
沙门氏菌*#/，8::&年卢强等V
参考6KIC设计的引
物，扩增了BCS/基因’;&XL的特异片断。由于该法的快速、特异、敏感等优点，使之在沙门氏菌的检测中得以广泛的应用V8，’W。
8
5,6的原理及技术发展
聚合酶链反应=L$MJOAEKPAHIKBCEAKHDB$C>简称5,6，是一种体外酶促合成，扩增特定*#/片断的
收稿日期：’
方法。该技术于8:;
模板、引物、*#05、适当缓冲液=ZQ’[>的反应混合物中，在热稳定*#/聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的*#/片断进行扩增。这种扩增是通过模板*#/、引物之间的变性、退火=复性>、延伸等三步反应为一个周期，循环进行，使目标*#/片段得以扩增。由于每一周期产生的*#/片断均能成为下一次循环的模板，故5,6产物以指数形式增加。
目前，5,6技术本身获得长足进步，可靠性不断提高，以5,6技术为基础的相关技术得到了很大的发展。如反相5,6=-CSAEPA95,6>、反转5,6=609
5,6>、随机扩增多态性*#/技术=6/5*>，免疫
5,6=MOOGC$95,6>，
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’5,6技术在食品沙门氏菌检测中的应用’%8
模板的制备
5,6检测方法的可靠性一部分依赖于目标模板的纯度和足够的目标分子数量，大多数5,6检测仍要求富集步骤V:，8
道用于食品体系中细菌的浓缩V:，88，8’W
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食品科技
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检测技术
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’%’引物设计
根据所选沙门氏菌靶序列的不同，目前常在下面
几种序列内进行引物设计?
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细菌中，鞭毛都是重要的毒力因子，不仅鞭毛所提供的动力可能是细菌侵入细胞的重要因素，鞭毛可以作为粘附素，决定了细菌在细胞表面的吸附，以及其后的侵入和定居过程。,$DE?&@等根据该序列设计内、外引物进行套式A-B，除伤寒沙门氏菌能扩增出特异性
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表面的附属器官如菌毛，纤毛介导与上皮表面的特异受体相结合。鼠伤寒沙门氏菌和其它肠道菌科的其它病原菌产生形态、抗原相关的侵袭性!型菌毛。在沙门氏菌株中，!型菌毛表型的表达由一系列基因编码，F8
’%’%C与沙门氏菌质粒毒力相关的,AH基因序列
对许多有重要医学意义的细菌来说，质粒不仅编码毒力因子，还编码某种调控蛋白，控制毒力因子的产生。含有致病性质粒的细菌是致病性的，丢失了致病性质粒的细菌，对人或动物不再致病，或致病力下降。I;:$D?
’%’%&编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的8DJ基因序列
沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌等许多肠
道病原性细菌具有侵袭宿主上皮细胞的能力。侵袭是病原菌导致慢性感染的原因之一。8DJ基因序列是一组基因，包括8DJ0、8DJK、8DJ-、8DJ+、8DJ/等。B;:D?
’%’%G沙门氏菌侵袭基因正调节蛋白:8>0
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氏菌中已发现了G个毒力岛，分别命名为,A.
,A.’、,A.C、,A.&、,A.G。其中,A.
4N$?
’%’%!编码沙门氏菌3A,*抗原的QFT基因脂多糖U3A,V作为革兰氏阴性菌外膜主要成分，其多糖部分U含*W特异性多糖和核心多糖V参与了细菌对宿主细胞的粘附、侵袭和在细胞间扩散的过程，是细菌主要的致病因子之一。3NX?
’%’%L编码与蛋白质结合的+#0的:DP基因
Z$D7P%+%+%?C@
根据该序列设计了上游引物32#,WGC
和下游引物B2#,W!O’及一条’G个核苷酸的探针
2#,WA，对牡蛎中污染的沙门氏菌进行A-BW基因探针检测，该方法可以[&(个细胞的敏感性检测沙门氏菌属中的多个种。
设计一对适宜的引物是应用A-B技术检测沙门氏菌的关键。除上述几种引物设计，还可根据其它保守序列来设计引物，但要注意种特异性、属特异性的区别，应根据检测目的的不同来选用。
’%CA-B检测方法
近年来，用A-B技术检测沙门氏菌得到了迅速
发展，产生了许多种A-B法。如常规A-B、套式A-B、多重A-B。也可几种方法结合使用，如李君文?’(@等将常规A-B与半套式A-B相结合，根据沙门氏菌中保守的
冲蛋白胨水UKA]V中非选择性增菌!:，然后进细胞破碎和A-B，可在接受食品样品后
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存在的问题及应用展望
A-B技术已成为调查食品源疾病暴发及鉴定相应
检测技术
病原菌的有用工具。它可提高灵敏性、缩短操作时间、提高检出率，并可有效检测致伤的沙门氏菌67，7’8。然而，A,B技术的广泛运用特别受限于6=，
但由于其快速、特异、敏感的特点，A,B技术作为一种检测手段仍有巨大的运用价值。而且随着研究的不断深入，A,B检测方法也会得以发展和完善，并将在食品沙门氏菌及其它致病菌的检测中得到更多的应用。
参考文献：
678彭丽萍，等%食品沙门氏菌检测方法进展%中
国人兽共患病杂志，7===，75C5D：;=F=76
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2OJL/G2SN$WIGIKLM%-QQ$ZOMO‘LKO$?\OKU^IKLM1VXW$aOXIJLJL^IL?J0$,$?NI?KWLKI($$XY:W$?I:LNKIWOLP$W*IKINKO$?ZVNSMKSWLML?X^$MINSMLW
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67&8徐建国%分子医学细菌学_科学出版社，
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曹泽虹，等%用A,B法快速测定食物中毒病原菌%微生物学报，
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参考文献：
678浙江药用植物志编写组%浙江药用植物志%浙江科学技术出版社
6
沈钟，王果庭%胶体与表面化学%化学工业出版社，7==@%@!
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