天然糖蛋白的提取_分离与纯化

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　542页　

　542　2006, Vol . 30, No . 12　　Progress in Pharmaceutical Sciences 　

2003,18(5) :91529241

[50]Vella S , Palmisano L. The global status of resistance to an 2

tiretroviral drugs [J].Clin Infect Dis , 2005, 41(Suppl ) :S23922461

[51]G onzalez E , K ulkarni H , Bolivar H , et al. The in fluence of

CC L3L1gene 2containing segmental duplications on HI V 21ΠAI DS susceptibility[J].Science , , 307(5714) :1434214401

[47]G ulick R M. New antiretroviral drugs[J].Clin Microbiol In 2

fect , 2003,9(3) :18621931

[48]Lu N Q , Zha S W. Inhibitory effects of human seminal plas 2

ma on an E LIS A used to detect anti 2sperm antibodies :im pli 2cation for the determination of sperm quality [J].J Reprod Immunol , 2000, 47(1) :332401

[49]Bohring C , K rause W. Immune in fertility :towards a better

understanding of sperm (auto ) 2immunity [J].Hum Reprod ,

刘兴华, 　赵浩如

(中国药科大学中药制剂教研室, 江苏南京210038)

[摘　要]　概述天然糖蛋白的提取、分离、纯化及纯度鉴定方法研究。糖蛋白具有调节免疫、抗肿瘤等多种生理和

药理活性, 国内外学者对多种天然糖蛋白的提取、分离与纯化进行了大量研究, 推动了糖蛋白药物的发展。

[关键词]　糖蛋白; 提取; 分离; 纯化; 纯度鉴定

[中图分类号]　R28412　　[文献标识码]　A 　　[文章编号]1001-5094(2006) 12-0542-06

Extraction , Separation and Purification of Natural G lycoproteins

LI U X ing 2hua , 　ZH AO Hao 2ru

(Department o f TCM Pharmaceutics , China Pharmaceutical Univer sity , Nanjing 210038, China ) [Abstract ]:Theresearches on methods of the extraction , separation , purification and purity identification of natural glycoproteins were summarized. G lycoproteins have multiple physiological and pharmacological activities such as immunoregulation and anti 2tum or. The extraction , separation and purification of natural glycoproteins have been widely studied to prom ote the development of glycoprotein drugs.

[K ey w ords ]:G lycoprotein ; Extraction ; Separation ; Purification ; Purity identification

　　糖蛋白(glycoprotein ) 是一类由糖类与多肽或蛋白质以共价键连接而形成的结合蛋白, 是生物体内重要的一类大分子, 种类繁多, 分布广泛, 具有多种重要功能。有文献报道, 从天然植物中分离得到的糖蛋白具有调节免疫、抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂、抗氧化、防衰老等功效。国内外对多种天然糖蛋

[接受日期]　2006209218

白进行了研究并取得了一定的成果, 尤其菌类药物

更是人们研究的热点, 如香菇、云芝、金针菇、巴氏蘑菇、松口蘑、小球藻、靶齿菌、莲子、枸杞、甘薯、天门冬、山茱萸、白头翁、茶树叶等。随着糖生物学研究、现代分离纯化技术和鉴定技术的迅猛发展, 吸引了医药、化工、生物学、生物化学以及食品科学等诸多

　通讯作者:　赵浩如, 教授;

研究方向:　中药新剂型、新工艺研究;

T el :[1**********]2; 　E 2m ail :zhaohaoruchina@yahoo. com. cn

　2006, Vol . 30, No . 12　　543　Progress in Pharmaceutical Sciences

学科的研究者从事糖蛋白研究, 促进了糖蛋白药物的发展。

本文对天然糖蛋白的提取、分离、纯化及纯度鉴定方法作一概述, 为糖蛋白药物研发提供参考。1　糖蛋白的提取

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　543页　

化钠溶液浸泡并机械捣烂, 于4℃放置过夜, 离心,

上清液加018倍的冰冷丙酮沉淀, 离心, 上清液再以112倍的冰冷丙酮沉淀, 离心, 沉淀用双蒸水浸泡,

[10]

透析, 冻干即得苦瓜子糖蛋白粗品。高佐群等在提取牛膝糖肽时, 加入碱式盐粉末搅拌后浸泡, 这样有利于除去生药中的杂质, 也可防止糖肽在浸泡过

[11]

程中分解。程玉祥等好的、, 抽提液

[12]

。Zhu 等将T ris 2,4℃浸泡过夜, 搅拌2小时, 离心, 盐析, 透析, 冷冻干燥, 再经二乙氨基乙基纤维素(DE AE 2纤维素) 柱层析和葡聚糖凝胶G 2100(Sepha 2dex G 2100) 柱层析即得麦胚水溶性蛋白。Machiah 等将催眠睡茄根洗净, 阴干, 粉碎, 加入pH 618的柠檬酸-磷酸盐缓冲液, 搅拌,4℃放置过夜, 上清液过滤, 浓缩, 冻干, 即得糖蛋白粗提物。11114　酸碱溶液提取　蛋白质是具有等电点的两性电解质, 提取液的pH 值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。一般来说, 碱性和酸性蛋白质可分别用偏酸性和偏碱性提取液提取。但用稀酸或稀碱溶液提取时, 应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化, 导致蛋白质构象的不可逆变化

[14]

及生物活性的丧失。柯丽霞等将金针菇菌丝体先用热水提取, 再用碱水提取, 然后经硫酸铵盐析、Sephadex G 275柱层析、透析及冻干而获得金针菇菌

[15]

丝体糖蛋白。杜千有等在提取云芝糖肽时, 采用氨水调节pH 值的方法, 将野生云芝子实体粉碎, 加入5～15倍体积的水后, 再用氨水调节pH 至10～14, 加热保持微沸1～3小时, 经100～140目筛过

[13]

糖蛋白的提取就是将糖蛋白从原料中分离出来的过程, 其步骤一般为:原料→粉碎→提取→浓缩→沉淀→干燥。糖蛋白是一类结合蛋白, 兼有多糖和蛋白质的某些性质, 大多可溶于水及稀盐、碱溶液等, 离糖蛋白。但要注意, 、有机溶剂、高温、。111　提取11111　水提取　由于糖蛋白中糖链的高度亲水性(组成膜的糖蛋白除外) , 因此可用不同温度的水提取糖蛋白。有时在提取之前需要对原料进行脱脂处理, 常用的方法是醚或醇回流。魏元青等将松口蘑发酵液经8层纱布过滤后用自来水充分洗涤, 取菌丝体加20倍水(以干重计) , 匀浆,4℃浸提24小时, 离心, 收集上清液, 经盐析、透析、超滤等步骤

[2]504

获得糖蛋白粗品。李亚娜等用水浸提小球藻3次, 提取液再经醇沉、透析、干燥等步骤即获得小球

[3]91

藻糖蛋白粗品。林玉满等将短裙竹荪菌粉用蒸馏水于95℃左右提取2次, 离心, 去残渣, 上清液用3倍体积的95%乙醇沉淀, 即得糖蛋白粗品。黎其

[4]

万等将巴氏蘑菇菌丝体加入5～6倍量水, 加热至沸腾提取4小时, 过滤, 滤渣重复提取2次, 合并滤液, 浓缩至适量, 然后经醇沉等步骤即得蛋白多糖。

[5]

11112　醇提取　K o 等将漆树果实粉碎, 在黑暗的地下室用99%乙醇浸渍数月, 然后用滤纸过滤乙醇浸提物, 经旋转蒸发仪浓缩, 冷冻干燥, 并经硅胶柱层析, 收集70%乙醇洗脱液, 再经冻干、盐析、透

[628]

析等步骤获得糖蛋白。Lee 等采用上述同样方法对龙葵、栀子、黑榆等进行了提取研究。11113　稀盐溶液或缓冲溶液浸提　糖蛋白在稀盐溶液和缓冲溶液中稳定性好、溶解度大, 这两种溶液是提取糖蛋白最常用的溶剂。叶国杰等将新鲜采集的苦瓜子去壳取仁后, 按一定比例加入019%氯

[9]

[1]650

滤, 收集滤液即提取液, 残渣再重复提取1或2次; 合并提取液, 即得云芝糖肽粗提物。

[16]

11115　酶解法提取　王淦等通过酶解的方式, 使水仙子中不溶性糖蛋白转化为可溶性糖肽、游离肽或氨基酸, 从而提高提取率, 且无环境污染。具体方法是:将水仙子中蛋白质凝固, 制成熟水仙子, 加水打浆成浆液, 然后进行酶解, 灭活酶解液, 离心, 上清液经过真空浓缩, 离心除渣, 上清液醇沉, 沉淀用水溶解, 得到的水溶液再离心除渣, 上清液在120℃下喷雾干燥即得水仙子糖肽。黄寿祺等采用酶解法提取大米草多糖蛋白, 即将大米草粉碎成粉, 热水

[17]

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　544页　

　544　2006, Vol . 30, No . 12　　Progress in Pharmaceutical Sciences 　

品冷冻干燥是一个多步骤过程, 所产生的多种应力

可能会使药品变性, 为了保护药品的活性, 通常在药

[21]

品配方中添加活性物质的保护剂。

也有人采用有机溶剂干燥法和喷雾干燥法干燥糖蛋白产品, 其中有机溶剂干燥法通常是将产品用无水乙醇、丙酮和乙醚各洗涤两次, 最后将乙醚挥发

[22]

即可。张玉杰白, , , 提取液减压, 乙醇沉淀,4℃8, , 喷雾干燥制得枸杞子。2　糖蛋白的分离纯化

浸提获得原浆液, 酶解, 过滤, 浓缩, 醇沉, 再经酒精

洗涤及冷冻减压干燥制得多糖蛋白。112　浓缩

获得的糖蛋白提取液通常需先进行减压浓缩或膜分离技术浓缩, 然后再进行干燥或用有机溶剂来沉淀(一般在低温下进行) , 常用的有机溶剂是乙醇和丙酮。

虽然糖蛋白在引入糖基之后比通常的蛋白质稳定, 但它们一般还是不耐热的生物大分子。通过降低提取液液面压力, 使液体沸点降低, 减压的真空度

]

越高, 液体沸点降得越低, 蒸发越快将烘干的巴戟天粉碎过筛, 60℃2, , , 减压浓缩, 加入乙醇沉淀, 低温静置过夜, 离心, , 再重复2次乙醇沉淀步骤, 最后1次得到的沉淀用少量水溶解, 按一定的体积比加入Sevage 试剂脱蛋白5次, 浓缩, 冷冻干燥, 即得紫褐色的巴戟天粗多糖样品。

膜分离技术是使用一种特别的膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法, 即溶液在一定压力下通过膜时, 溶剂和小分子透过, 大分子受阻保留, 从而达到分离。这是近年来发展起来的新的分离技术, 最适用于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩, 成本低, 操作方便, 条件温和, 能较好地保持生物大分子的活性。林志彬等将灵芝粉碎, 经乙醇回流后用水提取, 提取液静置, 过滤并浓缩至一定程度, 加入澄清剂, 澄清液超滤浓缩, 醇沉, 离心, 将沉淀物低温干燥即得灵芝多糖蛋白。113　干燥为了防止变质、易于保存, 制备所得糖蛋白产品常需要干燥处理, 最常用的方法是真空干燥法和冷

[20]

冻干燥法。陈哲超等在干燥香菇多糖蛋白的浓缩液时, 为避免高温干燥法和真空干燥法致使多糖蛋白的活性及得率降低, 在糖蛋白的浓缩液中添加了7%～15%的糊精, 搅拌均匀后低温冷冻约4小时, 形成冻结块, 然后在30～50℃接近常温的条件下减压干燥, 即获得香菇多糖蛋白的干性物质。

冷冻干燥法是干燥蛋白质的一种较好的办法, 既不易使蛋白质变性, 又可保持蛋白质中固有的成分, 且干燥后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点, 适用于各类生物大分子的干燥。但药

[19]

糖蛋白分离纯化的方法基本上类似于蛋白质或活性多糖的分离纯化。糖蛋白的分离纯化是指除去糖蛋白粗品中的杂质成分而获得单一糖蛋白组分的过程, 一般经除杂和分级两个步骤。除杂即将糖蛋白粗品中的非糖蛋白组分除去, 一般是先脱游离蛋白质, 再除去其他小分子杂质。常用的脱蛋白方法为Sevage 试剂法和酶法, 两种方法常可结合使用, 也

[23]

有人采用其他方法, 例如, 殷钢等在分离纯化螺旋藻糖蛋白时采用了环流泡沫分离技术去除杂质蛋白质。有的糖蛋白含糖量很少, 为了不将这种糖蛋白除去, 通常是在分级步骤中除掉游离蛋白质。对于粗蛋白中的一些小分子杂质, 如无机盐、色素、低聚糖等, 可通过透析法、膜分离法、离子交换树脂法或凝胶过滤法等将其除去。糖蛋白的分级就是将糖蛋白粗品中的单一组分逐一分离。

天然糖蛋白含量低、种类多、分布广, 目前尚无成熟的、简单快捷的糖蛋白分离纯化方法, 分离纯化方法的选择要根据糖蛋白的具体性质和研究目的来确定。用于科研目的的糖蛋白分离纯化, 其分辨度的要求较高, 可以牺牲得率, 不计成本; 而用于临床研究或规模性生产, 用量较大, 成本的问题就上升到重要位置, 分离纯化的步骤不宜过多, 因为每一步都会带来损失, 若每一步的收率为80%, 经过4步之后只有40%左右的总得率。虽然说要尽量减少纯化步骤, 但也决不能以牺牲目标产品的质量为代价。

常用的糖蛋白分离纯化方法是:先将糖蛋白粗提取物分级处理, 然后应用阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和柱层析或其他方法进行进一步分离纯

　2006, Vol . 30, No . 12　　545　Progress in Pharmaceutical Sciences

化。其他用于糖蛋白分离纯化的方法还有超滤法、超离心法、区带电泳法、金属络合法等。211　阴离子交换柱层析法

阴离子交换柱层析法常用的交换介质有DE AE 2纤维素、DE AE 2葡萄糖凝胶、DE AE 2琼脂糖凝胶(DE AE 2Sepharose ) 等, 此法适用于分离各种酸性、中性或碱性的糖蛋白, 即先将含各种糖蛋白的粗品吸附于层析柱, 然后用不同的洗脱液将与层析介质结合力不同的糖蛋白分别洗脱下来而达到分离纯化。

[1]650

魏元青等将所得糖蛋白浓缩液上DE AE 2rose Fast Flow 柱, 上样量20m L , 流速2L , 用蒸馏水和011、013、0160洗脱, 每次300, , 冷冻干燥, 212　凝胶柱层析法是根据糖蛋白分子大小和形状的差异而实现对糖蛋白的分离纯化, 因凝胶价格昂贵, 一般先用其他柱层析处理糖蛋白粗品, 再用凝胶柱层析进一步纯化。常用的凝胶介质有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶以及丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl ) 等, 洗脱液常用蒸馏水、各种浓度的盐溶液或缓冲溶液。

[24]

李亚娜等将所得糖蛋白粗品先经DE AE 2纤维素52柱层析(116cm ×20cm ) , 用0105、0110、0150m ol ΠL 碳酸氢钠溶液阶段洗脱, 再经Sephadex G 2100柱层析(116cm ×80cm ) , 用0102m ol ΠL 的T ris 2HCl 溶液(pH 712) 洗脱, 检测得到一陡峭的洗脱峰, 收集此峰

[25]148

即得甘薯糖蛋白纯品。唐成康等先采用D 101大孔吸附树脂, 从山茱萸干果中提取得到粗提物, 再经SP Sepharose 和Sephacryl S 2300柱层析, 得到一种具

[26]

有抑制α2淀粉酶活性的糖蛋白。殷钢等采用Sephacryl S 2200凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻的藻蓝蛋白进行分离和纯化, 得到了藻蓝蛋白纯品。213　亲和柱层析法亲和柱层析法是根据凝集素能专一、可逆地与游离的或复合糖类中的单糖或寡糖结合的性质, 利用固定化凝集素亲和层析来分离纯化糖蛋白的手段。例如用伴刀豆凝集素A 2琼脂糖凝胶(C onA 2Sepharose ) 作为亲和层析, 因为C onA 可特异性结合α2D 2葡萄糖基和α2D 2甘露糖基, 所以含有这些糖基的糖蛋白、多糖、酶以及抗原等就能与C onA 2Sepha 2

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　545页　

rose 发生亲和吸附, 而不能形成特异结合的杂质则

很快随洗脱液流出, 然后再用含某种糖或甲基糖苷

的缓冲溶液洗脱, 释放出被吸附的糖蛋白, 这是制备

[27]

植物糖蛋白的一种有效方法。高居易等将糖蛋白粗品10g 溶于pH 712的110mm ol ΠL 磷酸盐缓冲液中, 蒸馏水透析12小时,4℃离心去除少量不溶物, 将内透析液上已活化的C 4B 亲和层析柱(21×15的0105m ol ΠL T ris 2mm ol ΠL α2甲基2L 2D 2葡萄糖的T ris 2HCl 缓冲, , 取收集液015m L 上Sepha 2G 2150凝胶层析柱(210cm ×100cm ) 洗脱, 经苯酚-硫酸反应检测, 发现2个有活性的洗脱峰(Ⅰ和) , 分别将峰ⅠⅡ和峰Ⅱ的收集液用去离子水透析18小时, 冷冻干燥, 得到两部分纯化了的莲子糖蛋

白。

3　糖蛋白的纯度鉴定

糖蛋白是大分子化合物, 其纯度标准不能用通常的小分子化合物纯度标准来衡量, 因为即便是糖蛋白纯品, 在微观上也是不均一的。糖蛋白的纯度只代表某一糖蛋白相似链长的平均分布, 糖蛋白的纯品实际上是指一定分子质量范围内的糖蛋白均一组分。

糖蛋白纯度鉴定常用的方法有凝胶层析法、亲和层析法、高效液相色谱法、高压电泳法、超速离心法、旋光法和毛细管电泳法等。凝胶柱层析法准确度较高, 易于操作, 是糖蛋白纯度鉴定中最常用的方法, 若糖蛋白经凝胶层析得到单一对称洗脱峰, 则证明该糖蛋白是均一组分。用于糖蛋白纯度鉴定的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳和醋酸纤维膜电泳等, 若电泳后显色, 糖和蛋白质的电泳图谱重合, 呈单一色斑, 则糖蛋白为均一组分。纯度检查一般要求应用两种以上方法鉴定, 结果才能肯定。

[2]505

李亚娜等采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对小球藻糖蛋白纯品进行了分子质量测定, 电泳后, 只出现唯一的染色带, 表明所得小球

[3]92

藻糖蛋白已得到纯化。林玉满等将分离得到的短裙竹荪菌丝体糖蛋白进行醋酸纤维膜电泳, 分别用阿利新兰和考马斯亮兰染色, 结果两者均显示单

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　546页　

　546　2006, Vol . 30, No . 12　　Progress in Pharmaceutical Sciences 　

through nuclear factor 2kappa B in NIH Π3T 3cells[J].Toxicol Lett , 2004, 146(2) :15921741

一斑带, 且两者泳动距离相近; 再将同样的菌丝体糖蛋白纯品经Sephadex G 2200柱层析处理, 分别测定蛋白峰和糖峰, 结果显示蛋白质和糖的吸收峰分别只有一个, 且吸收峰位置重合, 峰形对称。两种方法测定结果表明该糖蛋白为均一物质。唐成康等法证明所得糖蛋白为单一组分。4　结　语

[25]149

[7]　Lee S J , K o J H , Lim K, et al. 150kDa glycoprotein is olat 2

ed from S olanum nigrum Linne enhances activities of detoxi 2cant enzymes and lowers plasmic cholesterol in m ouse [J].Pharm Res , 2005, 51(5) :39924081

用Sephacryl S 2300柱层析法和聚丙稀酰胺凝胶电泳

[8]　Lee S J , Oh P S , K o J H , et al. lycoprotein is olated from

G ardenia jasminoides E llis activity against oxygen radical 2induced pro 2kappa B in NIH Π3T 3Pharm , 2006, 21(1) :82211[9, , 卢保元, 等. 苦瓜子蛋白的分离纯化

天然糖蛋白具有多种生理功能, 在药学、学、识。定技术的发展, 。

本课题组对一种具有抗癌作用的菌类药物进行了研究, 文献报道其有效成分是糖蛋白, 本课题研究的目的是分离得到较高纯度的具有抗癌活性的糖蛋白并进行制剂研究。经过提取、前处理、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析等步骤, 我们从该菌类药物中分离得到了几种糖蛋白, 接下来将结合药理筛选对其进行精细分离, 预期可发现具有良好抗癌活性的糖蛋白。

[参考文献]

[1]　魏元青, 许泓瑜, 万彩霞, 等. 松口蘑发酵菌丝体中抗

及性质研究[J].化学学报, 1998, 56(11) :1135211441

[10]高佐群, 陶艳艳. 一种牛漆糖肽制剂及制备方法:中

国, 1287008A [P].[1**********]

[11]程玉祥, 柳参奎. 茶树叶糖蛋白分离及鉴定的初步研

究[J].植物研究, 2005, 25(2) :18121851

[12]Zhu K X , Zhou H M. Purification and characterization of a

novel glycoprotein from wheat germ water 2s oluble extracts[J].Proc Biochem , 2005, 40(324) :1469214741

[13]Machiah D K, G irish K S , G owda T V. A glycoprotein from

a folk medicinal plant , Withania s omnifera , inhibits hyalu 2ronidase activity of snake venoms[J].Comp Biochem Physiol C , 2006,143(2) :15821611

[14]柯丽霞, 杨晓彤. 金针菇菌丝体糖蛋白(F MG P ) 的提取

及其理化特征[J].中国食用菌, 1998, 17(4) :402421

[15]杜千有, 关秀清. 一种生产云芝糖肽的方法:中国,

1552732A [P].[1**********]

肿瘤糖蛋白的分离纯化及组成分析[J].中国医药工业杂志, 2004, 35(11) :65026521

[2]　李亚娜, 林永成, 余志刚, 等. 小球藻糖蛋白的分离、

[16]王淦, 宋淑玉, 宋波, 等. 水仙子糖肽的提取方法:中

国, 1443852A [P].[1**********]

[17]黄寿祺, 杨秀英, 黄怀宜. 大米草多糖蛋白提取工艺:

中国, 1569938A [P].[1**********]

[18]何传波, 陈玲, 李琳, 等. 巴戟天多糖的分级纯化及结

纯化和结构分析[J].天然产物研究与开发, 2004, 14

(6) :50325061

[3]　林玉满, 余萍. 短裙竹荪菌丝体糖蛋白DdG P 23P3纯化

构分析[J].华南理工大学学报(自然科学版) , 2005,

33(12) :292331

[19]林志彬, 林树钱, 王赛贞, 等. 灵芝多糖蛋白及其制备

及性质研究[J].福建师范大学学报(自然科学版) ,

2003, 19(1) :912941

[4]　黎其万, 李绍平. 一种真菌蛋白多糖的分离与理化特

方法与用途:中国, 1629186A [P].[1**********]

[20]陈哲超, 黄寿祺. 香菇多糖蛋白的加工方法:中国,

1240137A [P].[1**********]

性[J].西南农业学报, 2003, 16(3) :302331

[5]　K o J H , Lee SJ , Lim K T. 36kDa G lycoprotein is olated from

Rhus verniciflua S tokes fruit has a protective activity to glu 2cose Πglucose oxidase 2induced apoptosis in NIH Π3T 3cells[J].Toxicol in Vitro , 2005, 19(3) :35323631

[21]Dean Allis on S , Randolph T W , Manning M C , et al. E ffects

of drying methods and additives on structure and function of actin :mechanisms of dehydration 2induced damage and its in 2hibition[J].Arch Biochem Biophys , 1998, 358(1) :17121811

[22]张玉杰. 枸杞阿拉伯半乳聚糖蛋白、制备工艺、用途及

[6]　Lee S J , Heo K S , Oh P S , et al. G lycoprotein is olated from

Ulmus davidiana Nakai inhibits TPA 2induced apoptosis

　2006, Vol . 30, No . 12　　547　Progress in Pharmaceutical Sciences

其组合物:中国, 1675530A [P].[1**********]

[23]殷钢, 刘铮, 李琛, 等. 螺旋藻糖蛋白的分离纯化及其

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　547页　

部分理化性质研究[J].天然产物研究与开发, 2005,

17(2) :14721511

[26]殷钢, 刘铮, 刘飞, 等. 钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离

性质研究[J].高等学校化学学报, 1999, 20(4) :5652

5681

[24]李亚娜, 林永成, 余志刚. 甘薯糖蛋白的分离、纯化和

纯化及特性研究[J].清华大学学报(自然科学版) ,

1999, 39(6) :202221

[27]高居易, 陈彦武. 建宁莲子糖蛋白的分离、纯化及清除

结构分析[J].华南理工大学学报(自然科学版) ,

2004, 32(9) ; 592621

[25]唐成康, 高小平, 徐大勇, 等. 山茱萸糖蛋白的纯化及

自由基作用[J]., 2003, 21(2) :1752

1781

薛文静, 朱家壁

, 杜凤梅

(1. 中国药科大学药物制剂研究所, 江苏南京210009;2. 山东博士伦福瑞达制药有限公司, 山东济南250014)

[摘　要]　介绍近年来国内外有关含药干乳的研究概况, 综述干乳的若干制备方法(包括喷雾干燥法、冷冻干燥

法、减压蒸馏法和吸干法) 、稳定性影响因素及应用前景, 为干乳这种新型药物传递系统的研究提供参考。

[关键词]　干乳; 喷干; 冻干; 吸干; 减压蒸馏; 稳定性; 应用

[中图分类号]　R944117　　[文献标识码]　A 　　[文章编号]1001-5094(2006) 12-0547-05

A Survey of Dry Emulsions

X UE Wen 2jing , 　ZH U Jia 2bi

, 　DU Feng 2mei

(1. Pharmaceutical Research Institute , China Pharmaceutical Univer sity , Nanjing 210009, China ; 2. Shan 2

Dong Bausch &LombFreda Pharmaceutical Co . Ltd . , Jinan 250014, China )

[Abstract ]　The researches on dry emulsions reported in recent years at home and abroad were introduced. The preparation method , including spray drying , freeze drying , vacuum distillation and ads orbed drying , the influences on stability and application of dry emulsions were reviewed for reference in the research on the new drug 2carrier system.

[K ey Word ]　Dry emulsion ; S pray drying ; Freeze drying ; Ads orbed drying ; Vacuum distillation ; Stability ; Application

　　乳剂作为一种药物传递系统, 口服可以改善难溶性药物的吸收, 提高药物生物利用度; 静注则起效快, 无首过效应, 且可增强药物靶向性。但作为一种

[接受日期]　2006209218

热力学不稳定体系, 乳剂易发生分层、絮凝甚至破乳等物理不稳定现象, 给生产、贮存、运输和应用带来

了极大不便和不良影响, 而将液态乳转变为干乳则

　通讯作者:　朱家壁, 教授, 博士生导师; 研究方向:　药物新剂型与药物动力学;

T el :[1**********]7

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　542页　

　542　2006, Vol . 30, No . 12　　Progress in Pharmaceutical Sciences 　

2003,18(5) :91529241

[50]Vella S , Palmisano L. The global status of resistance to an 2

tiretroviral drugs [J].Clin Infect Dis , 2005, 41(Suppl ) :S23922461

[51]G onzalez E , K ulkarni H , Bolivar H , et al. The in fluence of

CC L3L1gene 2containing segmental duplications on HI V 21ΠAI DS susceptibility[J].Science , , 307(5714) :1434214401

[47]G ulick R M. New antiretroviral drugs[J].Clin Microbiol In 2

fect , 2003,9(3) :18621931

[48]Lu N Q , Zha S W. Inhibitory effects of human seminal plas 2

ma on an E LIS A used to detect anti 2sperm antibodies :im pli 2cation for the determination of sperm quality [J].J Reprod Immunol , 2000, 47(1) :332401

[49]Bohring C , K rause W. Immune in fertility :towards a better

understanding of sperm (auto ) 2immunity [J].Hum Reprod ,

刘兴华, 　赵浩如

(中国药科大学中药制剂教研室, 江苏南京210038)

[摘　要]　概述天然糖蛋白的提取、分离、纯化及纯度鉴定方法研究。糖蛋白具有调节免疫、抗肿瘤等多种生理和

药理活性, 国内外学者对多种天然糖蛋白的提取、分离与纯化进行了大量研究, 推动了糖蛋白药物的发展。

[关键词]　糖蛋白; 提取; 分离; 纯化; 纯度鉴定

[中图分类号]　R28412　　[文献标识码]　A 　　[文章编号]1001-5094(2006) 12-0542-06

Extraction , Separation and Purification of Natural G lycoproteins

LI U X ing 2hua , 　ZH AO Hao 2ru

[K ey w ords ]:G lycoprotein ; Extraction ; Separation ; Purification ; Purity identification

[接受日期]　2006209218

白进行了研究并取得了一定的成果, 尤其菌类药物

　通讯作者:　赵浩如, 教授;

研究方向:　中药新剂型、新工艺研究;

T el :[1**********]2; 　E 2m ail :zhaohaoruchina@yahoo. com. cn

　2006, Vol . 30, No . 12　　543　Progress in Pharmaceutical Sciences

学科的研究者从事糖蛋白研究, 促进了糖蛋白药物的发展。

本文对天然糖蛋白的提取、分离、纯化及纯度鉴定方法作一概述, 为糖蛋白药物研发提供参考。1　糖蛋白的提取

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　543页　

化钠溶液浸泡并机械捣烂, 于4℃放置过夜, 离心,

上清液加018倍的冰冷丙酮沉淀, 离心, 上清液再以112倍的冰冷丙酮沉淀, 离心, 沉淀用双蒸水浸泡,

[10]

透析, 冻干即得苦瓜子糖蛋白粗品。高佐群等在提取牛膝糖肽时, 加入碱式盐粉末搅拌后浸泡, 这样有利于除去生药中的杂质, 也可防止糖肽在浸泡过

[11]

程中分解。程玉祥等好的、, 抽提液

[12]

[14]

及生物活性的丧失。柯丽霞等将金针菇菌丝体先用热水提取, 再用碱水提取, 然后经硫酸铵盐析、Sephadex G 275柱层析、透析及冻干而获得金针菇菌

[15]

[13]

[2]504

获得糖蛋白粗品。李亚娜等用水浸提小球藻3次, 提取液再经醇沉、透析、干燥等步骤即获得小球

[3]91

藻糖蛋白粗品。林玉满等将短裙竹荪菌粉用蒸馏水于95℃左右提取2次, 离心, 去残渣, 上清液用3倍体积的95%乙醇沉淀, 即得糖蛋白粗品。黎其

[4]

万等将巴氏蘑菇菌丝体加入5～6倍量水, 加热至沸腾提取4小时, 过滤, 滤渣重复提取2次, 合并滤液, 浓缩至适量, 然后经醇沉等步骤即得蛋白多糖。

[5]

[628]

[9]

[1]650

滤, 收集滤液即提取液, 残渣再重复提取1或2次; 合并提取液, 即得云芝糖肽粗提物。

[16]

[17]

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　544页　

　544　2006, Vol . 30, No . 12　　Progress in Pharmaceutical Sciences 　

品冷冻干燥是一个多步骤过程, 所产生的多种应力

可能会使药品变性, 为了保护药品的活性, 通常在药

[21]

品配方中添加活性物质的保护剂。

也有人采用有机溶剂干燥法和喷雾干燥法干燥糖蛋白产品, 其中有机溶剂干燥法通常是将产品用无水乙醇、丙酮和乙醚各洗涤两次, 最后将乙醚挥发

[22]

即可。张玉杰白, , , 提取液减压, 乙醇沉淀,4℃8, , 喷雾干燥制得枸杞子。2　糖蛋白的分离纯化

浸提获得原浆液, 酶解, 过滤, 浓缩, 醇沉, 再经酒精

洗涤及冷冻减压干燥制得多糖蛋白。112　浓缩

虽然糖蛋白在引入糖基之后比通常的蛋白质稳定, 但它们一般还是不耐热的生物大分子。通过降低提取液液面压力, 使液体沸点降低, 减压的真空度

]

[20]

[19]

[23]

常用的糖蛋白分离纯化方法是:先将糖蛋白粗提取物分级处理, 然后应用阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和柱层析或其他方法进行进一步分离纯

　2006, Vol . 30, No . 12　　545　Progress in Pharmaceutical Sciences

化。其他用于糖蛋白分离纯化的方法还有超滤法、超离心法、区带电泳法、金属络合法等。211　阴离子交换柱层析法

[1]650

[24]

[25]148

即得甘薯糖蛋白纯品。唐成康等先采用D 101大孔吸附树脂, 从山茱萸干果中提取得到粗提物, 再经SP Sepharose 和Sephacryl S 2300柱层析, 得到一种具

[26]

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　545页　

rose 发生亲和吸附, 而不能形成特异结合的杂质则

很快随洗脱液流出, 然后再用含某种糖或甲基糖苷

的缓冲溶液洗脱, 释放出被吸附的糖蛋白, 这是制备

[27]

白。

3　糖蛋白的纯度鉴定

[2]505

李亚娜等采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对小球藻糖蛋白纯品进行了分子质量测定, 电泳后, 只出现唯一的染色带, 表明所得小球

[3]92

藻糖蛋白已得到纯化。林玉满等将分离得到的短裙竹荪菌丝体糖蛋白进行醋酸纤维膜电泳, 分别用阿利新兰和考马斯亮兰染色, 结果两者均显示单

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　546页　

　546　2006, Vol . 30, No . 12　　Progress in Pharmaceutical Sciences 　

through nuclear factor 2kappa B in NIH Π3T 3cells[J].Toxicol Lett , 2004, 146(2) :15921741

[25]149

[7]　Lee S J , K o J H , Lim K, et al. 150kDa glycoprotein is olat 2

ed from S olanum nigrum Linne enhances activities of detoxi 2cant enzymes and lowers plasmic cholesterol in m ouse [J].Pharm Res , 2005, 51(5) :39924081

用Sephacryl S 2300柱层析法和聚丙稀酰胺凝胶电泳

[8]　Lee S J , Oh P S , K o J H , et al. lycoprotein is olated from

G ardenia jasminoides E llis activity against oxygen radical 2induced pro 2kappa B in NIH Π3T 3Pharm , 2006, 21(1) :82211[9, , 卢保元, 等. 苦瓜子蛋白的分离纯化

天然糖蛋白具有多种生理功能, 在药学、学、识。定技术的发展, 。

[参考文献]

[1]　魏元青, 许泓瑜, 万彩霞, 等. 松口蘑发酵菌丝体中抗

及性质研究[J].化学学报, 1998, 56(11) :1135211441

[10]高佐群, 陶艳艳. 一种牛漆糖肽制剂及制备方法:中

国, 1287008A [P].[1**********]

[11]程玉祥, 柳参奎. 茶树叶糖蛋白分离及鉴定的初步研

究[J].植物研究, 2005, 25(2) :18121851

[12]Zhu K X , Zhou H M. Purification and characterization of a

novel glycoprotein from wheat germ water 2s oluble extracts[J].Proc Biochem , 2005, 40(324) :1469214741

[13]Machiah D K, G irish K S , G owda T V. A glycoprotein from

a folk medicinal plant , Withania s omnifera , inhibits hyalu 2ronidase activity of snake venoms[J].Comp Biochem Physiol C , 2006,143(2) :15821611

[14]柯丽霞, 杨晓彤. 金针菇菌丝体糖蛋白(F MG P ) 的提取

及其理化特征[J].中国食用菌, 1998, 17(4) :402421

[15]杜千有, 关秀清. 一种生产云芝糖肽的方法:中国,

1552732A [P].[1**********]

肿瘤糖蛋白的分离纯化及组成分析[J].中国医药工业杂志, 2004, 35(11) :65026521

[2]　李亚娜, 林永成, 余志刚, 等. 小球藻糖蛋白的分离、

[16]王淦, 宋淑玉, 宋波, 等. 水仙子糖肽的提取方法:中

国, 1443852A [P].[1**********]

[17]黄寿祺, 杨秀英, 黄怀宜. 大米草多糖蛋白提取工艺:

中国, 1569938A [P].[1**********]

[18]何传波, 陈玲, 李琳, 等. 巴戟天多糖的分级纯化及结

纯化和结构分析[J].天然产物研究与开发, 2004, 14

(6) :50325061

[3]　林玉满, 余萍. 短裙竹荪菌丝体糖蛋白DdG P 23P3纯化

构分析[J].华南理工大学学报(自然科学版) , 2005,

33(12) :292331

[19]林志彬, 林树钱, 王赛贞, 等. 灵芝多糖蛋白及其制备

及性质研究[J].福建师范大学学报(自然科学版) ,

2003, 19(1) :912941

[4]　黎其万, 李绍平. 一种真菌蛋白多糖的分离与理化特

方法与用途:中国, 1629186A [P].[1**********]

[20]陈哲超, 黄寿祺. 香菇多糖蛋白的加工方法:中国,

1240137A [P].[1**********]

性[J].西南农业学报, 2003, 16(3) :302331

[5]　K o J H , Lee SJ , Lim K T. 36kDa G lycoprotein is olated from

Rhus verniciflua S tokes fruit has a protective activity to glu 2cose Πglucose oxidase 2induced apoptosis in NIH Π3T 3cells[J].Toxicol in Vitro , 2005, 19(3) :35323631

[21]Dean Allis on S , Randolph T W , Manning M C , et al. E ffects

of drying methods and additives on structure and function of actin :mechanisms of dehydration 2induced damage and its in 2hibition[J].Arch Biochem Biophys , 1998, 358(1) :17121811

[22]张玉杰. 枸杞阿拉伯半乳聚糖蛋白、制备工艺、用途及

[6]　Lee S J , Heo K S , Oh P S , et al. G lycoprotein is olated from

Ulmus davidiana Nakai inhibits TPA 2induced apoptosis

　2006, Vol . 30, No . 12　　547　Progress in Pharmaceutical Sciences

其组合物:中国, 1675530A [P].[1**********]

[23]殷钢, 刘铮, 李琛, 等. 螺旋藻糖蛋白的分离纯化及其

・综述与专论・

　2006年第30卷　第12期　第　547页　

部分理化性质研究[J].天然产物研究与开发, 2005,

17(2) :14721511

[26]殷钢, 刘铮, 刘飞, 等. 钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离

性质研究[J].高等学校化学学报, 1999, 20(4) :5652

5681

[24]李亚娜, 林永成, 余志刚. 甘薯糖蛋白的分离、纯化和

纯化及特性研究[J].清华大学学报(自然科学版) ,

1999, 39(6) :202221

[27]高居易, 陈彦武. 建宁莲子糖蛋白的分离、纯化及清除

结构分析[J].华南理工大学学报(自然科学版) ,

2004, 32(9) ; 592621

[25]唐成康, 高小平, 徐大勇, 等. 山茱萸糖蛋白的纯化及

自由基作用[J]., 2003, 21(2) :1752

1781

薛文静, 朱家壁

, 杜凤梅

(1. 中国药科大学药物制剂研究所, 江苏南京210009;2. 山东博士伦福瑞达制药有限公司, 山东济南250014)

[摘　要]　介绍近年来国内外有关含药干乳的研究概况, 综述干乳的若干制备方法(包括喷雾干燥法、冷冻干燥

法、减压蒸馏法和吸干法) 、稳定性影响因素及应用前景, 为干乳这种新型药物传递系统的研究提供参考。

[关键词]　干乳; 喷干; 冻干; 吸干; 减压蒸馏; 稳定性; 应用

[中图分类号]　R944117　　[文献标识码]　A 　　[文章编号]1001-5094(2006) 12-0547-05

A Survey of Dry Emulsions

X UE Wen 2jing , 　ZH U Jia 2bi

, 　DU Feng 2mei

(1. Pharmaceutical Research Institute , China Pharmaceutical Univer sity , Nanjing 210009, China ; 2. Shan 2

Dong Bausch &LombFreda Pharmaceutical Co . Ltd . , Jinan 250014, China )

[K ey Word ]　Dry emulsion ; S pray drying ; Freeze drying ; Ads orbed drying ; Vacuum distillation ; Stability ; Application

　　乳剂作为一种药物传递系统, 口服可以改善难溶性药物的吸收, 提高药物生物利用度; 静注则起效快, 无首过效应, 且可增强药物靶向性。但作为一种

[接受日期]　2006209218

热力学不稳定体系, 乳剂易发生分层、絮凝甚至破乳等物理不稳定现象, 给生产、贮存、运输和应用带来

了极大不便和不良影响, 而将液态乳转变为干乳则

　通讯作者:　朱家壁, 教授, 博士生导师; 研究方向:　药物新剂型与药物动力学;

T el :[1**********]7

天然糖蛋白的提取_分离与纯化

相关文章