第２９卷，第４期２００９年４月
光谱学与光谱分析
ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄＳｐｅｃｔｒａｌＡｎａｌｙｓｉｓ
Ｖ０１．２９。Ｎｏ．４．ｐｐｌ０９３—１０９９
Ａｐｒｉｌ，２００９
羟基和超氧自由基的检测研究进展
张昊，任发政。
中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部一北京市功能乳品实验室，北京１０００８３
摘要活细胞在必需的新陈代谢过程中会产生自由基，越来越多的研究证据表明，这些自由基涉及到许多体内调控系统，然而一旦有过多的自由基生成便会氧化细胞脂膜、蛋白质、ＤＮＡ和酶，进而对细胞造成致命性的损伤。此外，研究还表明许多疾病与自由基密切相关，例如，有研究报道海氏默症病人脑中生物分子的氧化损伤程度明显高于正常值，另外癌症可能也是ＤＮＡ受到氧化损伤的结果。因此，测定自由基的方法就显得十分必需和重要。文章重点对羟基和超氧自由基检测技术的发展情况进行了讨论，涉及的自由基检测技术主要有分光光度法、荧光法、化学发光法和电子自旋共振技术，并评价了各种方法的优缺点。关键词羟基自由基；超氧自由基；检测技术；评述中图分类号：０６５７．３
文献标识码：Ａ
ＤＯＩ：１０．３９６４／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－０５９３（２００９）０４－１０９３－０７
羟基苯甲酸，用其在５１０ｎｌＴＩ处的吸光度值表示ｏＨ・的多
引
言
羟基自由基（ＯＨ・）和超氧自由基（０２一・）是生物体内
少，吸光度值与ｏＨ・的量成正比［１］。１．１．２铁氧化邻二氮菲法
Ｆｅｎｔｏｎ反应产生ＯＨ・，羟自由基使邻二氮菲一附＋氧
化为邻二氮菲一Ｆｅ３＋，使邻二氮菲一Ｆｅ２＋在５３６ｎｌｎ处的最大吸收峰消失。根据５３６
活性氧代谢产生的物质，其中Ｑ一・经一系列反应最终会生成０Ｈ・，而ｏＨ・是一种氧化性很强的自由基，可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使糖类、蛋白质、核酸及脂类等发生氧化损伤。研究表明肿瘤、心血管、衰老等许多疾病与自由基相关。
因此，近些年来人们为了预防这类疾病的发生，自由基的研究已逐渐成为热点。而快速、灵敏和实用的自由基检测方法就显得十分重要。本文主要介绍了目前常见的测定羟基和超氧自由基的检测方法：包括分光光度法、荧光法、化学发光法、电子自旋共振技术等，并评价了各种方法的优缺点和应用范围。
ｍ处吸光度变化判断受试物清除
ＯＨ・的能力。需要注意的是，测定时加样方法对结果有重要影响，需先将邻二氮菲、ＰＢＳ及水混匀，并且每管加入ＦｅＳ０４后立即混匀，否则会使局部颜色过浓，影响结果的重复性‘２１。
１．１．３细胞色素Ｃ氧化法
其反应机理为ｏＨ・能使还原型细胞色素Ｃ（浅红色）氧化成氧化型细胞色素Ｃ（浅黄色）通过测定反应体系中吸光度的减少量（５５０ｎｍ），间接测得ｏＨ・的含量。１．１．４脱氧核糖法
采用Ｆｅ３＋一ＥＤＴＡ－抗坏血酸一过氧化氢体系产生ＯＨ・。
１分光光度法
利用自由基使显色剂发生颜色变化，根据吸光度的变化值而间接测得自由基的含量是分光光度法的基本原理，下面将分别介绍几种常见的羟基和超氧自由基的测定方法。１．１羟基自由基１．１．１水杨酸法
Ｆｅｎｔｏｎ反应产生０Ｈ・，ＯＨ・氧化水杨酸得到２，３－－－
收稿日期：２００７一ＩＩ一２８。修订日期：２００８－０３－０６
基金项目：国家“十一五”科技支撵项目（２００６Ｂ伽）０５Ａ１６）资助
此方法中脱氧核糖作为ＯＨ・的攻击目标。脱氧核糖受ＯＨ・攻击后裂解，在酸性、加热的条件下可与硫代巴比妥酸反应生成红色化合物。可根据在５３２ｎｌＴｌ处测定的吸光度值来间接反映ｏＨ・的含量【３】。１．１．５萃取一催化氧化光度法
．
利用混合稀土溶液催化Ｈ。Ｑ产生０Ｈ・，ｏＨ・氧化
二苯基碳酰肼，生成红色二苯基碳酰腙，其最大吸收波长是
５６３
ｎｌｎ。当二苯基碳酰肼浓度一定时，吸光度值与（）Ｈ・呈
作者简介：张昊，１９８４年生。中国农业大学食品科学与营养工程学院硕士研究生
＊通讯联系人ｅ－ｍｍｌ：ｒｅｎｆａｚｈｅｎｇ＠２６３．ｎｅｔ
ｅ－ｍａｉｌ：ｄａｖｉｄｌｈａｏ＠ｓｉｎａ．ＯＤＩｎ
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量效关系，从而间接反映ＯＨ・的含量‘“。
另外还有许多研究者利用不同显色剂检测ＯＨ・，详细介绍见表１。
在酸性条件下，亚硝酸与氨基苯磺酸和Ｎ－甲奈基二氨基乙烯反应生成红色化合物，后者在５５０ｎｉ－ｎ处有最大吸收峰，测定在５５０ｍ＇ｎ处的吸光度变化，可以间接的反映Ｑ一・的含量，但是该方法存在一定的缺点，如甲萘胺溶液不稳定、空白值较大等。
总体上来说，分光光度法操作简单，费用少，仪器设备价格低廉，但存在检测的灵敏度较低，检测限较高，专一性不强等缺点。
Ｔａｂｌｅ１
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ
１．２超氧自由基
超氧自由基的分光光度法测定，最常用的方法有细胞色素Ｃ的超氧自由基还原法【１２Ｊ和硝基阴氮唑篮（ｎｉｔｒｏ
ｂｌｕｅ
ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＮＢＴ）还原法Ｌｌ３｜。具有氧化活性的细胞色素Ｃ被０２一・还原后，形成了在波长５５０ｕｒｎ处有强吸收的亚铁细胞色素，可以用于（）２一・的测定［１“。但是，细胞色素Ｃ还原法的体系中如果存在着其他还原性物质便会对结果造成干扰，如还原性酶的干扰。同样，ＮＢＴ在０２一・的作用下，还原生成不溶于水、蓝色的二甲替（Ｄｉｆｏｒｍａｚａｎ）［１３］，它的最大吸收波长５６０ｎｎｌ，吸光系数达１００００以上，测定灵敏度相当高。有研究者在进行Ｋ１０４一Ｈｚ０２化学发光反应体系的机理过程中，使用ＮＢＴ反应测定０２一．・获得良好的结５１。但是，由于二甲替不溶于水，长时间放置会出现沉淀近些年，还不断有研究者报道新的测定方法。比如田益ｒｕｘｌ、
另外分光光度法测定（）２一・的方法还有邻苯三酚自氧・反应，从而
７．４）环境下测定，而缺点在于６一羟多巴胺氧ｎｎｌ处。肾上腺索红的产量可间接测出反应体系的（）２一・
用荧光光度法来检测自由基的含量时，使用的捕获剂
荧光减弱的捕获荆
方光荣等研究了ＯＨ・与Ｃｅｓ＋的反应，表明在酸性条ｎｎｌ，Ｍｎ２＋一Ｈｚ０２体系在碱性介质中产生的羟自由基０２荧光法测定羟自由基的新体系，激发波长和发
张海容等通过Ｃｕ＋催化过氧化氢一抗坏血酸反应体系产２荧光法
２．Ｉ荧光光度法
在捕获自由基后会发生荧光强度的变化。在常见的捕获剂中，荧光强度减弱的捕获剂有Ｃｅｓ＋、罗丹明６Ｇ、水杨基荧光酮，而荧光增强的有苯甲酸、Ｈａｎｔｚｓｅｈ反应等，下面就分别从这两方面介绍常见捕获剂的应用。
２．１．１
果［１现象，难以应用于测定（）２一・随时间增长其动态的变化。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等报道了利用水溶性ＮＢＴ衍生物测定０２一・的方法，解决了生成物沉淀所导致的测定困难问题Ｌｌ引。
玲等建立了一种利用动力学分光光度法测定中药对超氧阴离子自由基清除率的新方法。研究表明：当波长为５２０
件下，有强荧光的Ｃｅ３＋被氧化生成无荧光的Ｃｅ４＋。测定反应前后荧光强度的下降可间接测定羟基自由基的含量，该方法可作为筛选抗氧化剂的方法［ｚ１１。碱性介质中罗丹明６Ｇ能产生特征荧光，其最大激发波长和发射波长分别为３５０和５５０可以迅速氧化罗丹明６Ｇ使其荧光猝灭，如果存在抗氧化物质可以清除羟自由基，便会使溶液的荧光猝灭程度降低，据此建立了测定抗氧化活性的方法［２２１。任凤莲等人的实验发现Ｃｏｚ＋与Ｈｚ（）２反应生成羟自由基的产率比Ｆｅｎｔｏｎ试剂高１００倍以上。采用水杨基荧光酮（ｓａｌｉｃｙｌｆｌｕｏｒｏｎｅ，ＳＡＦ）一
Ｃｏｚ＋＿Ｈｚ射波长为５１０和５００咖，测定体系在反应前后的荧光变化，
可间接测定羟自由基的产生量ｍ】。除了这几种常见的捕获剂外，还有一些研究者采用了其他的试剂，荧光素钠本身能产生特征荧光，其激发波长和发射波长分别为４９１和５１２ｎｎｌ。在碱性介质中，Ｍｎｚ＋。Ｈ：０２体系产生的羟自由基可以迅速氧化荧光素钠使荧光猝灭［２４］。张爱梅等提出检测Ｆｅｎ—ｔｏｎ反应产生羟自由基的方法。羟自由基与吖啶红发生反应后，吖啶红的荧光强度减弱，测定其荧光强度的变化，可问接测定羟自由基的产生量［ｚ５１。２．１．２荧光增强的捕获剂
生羟自由基模型，根据羟基苯甲酸的荧光大小对比研究了亚硝酸钠、槲皮素和红色素对羟自由基的清除能力。结果表明：高粱红色素、亚硝酸钠、槲皮素对ＯＨ・自由基的清除能力呈一定的量效关系，亚硝酸钠、槲皮素优于红色素对羟
黄嘌呤氧化酶浓度为４×１０１越・ｎ１Ｌ一１，反应时间在２～７
ｍｉｎ时，可得到最佳测定条件［１”。
化［１８１、没食子酸自氧化Ｌ１９Ｊ、６一羟多巴胺自氧化、肾上腺素氧化法Ｌ２０ｊ和羟胺氧化法等。其中邻苯三酚自氧化是最经典的方法，但其机理十分复杂。没食子酸自氧化的测定受ｐＨ与没食子酸的浓度影响较显著，所以测定时要严格控制ｐＨ且要准确配制规定浓度的没食子酸溶液。此外样品中的其他低分子量氧化还原性物质也会直接与（）２
影响测定结果的准确性。６一羟多巴胺自氧化的优点是可在生理ｐＨ值（ｐＨ化的线性区间非常有限，而且ＯＨ・和Ｑ一・都可以使６一羟多巴胺自氧化，因此测定的专一性不高。肾上腺素氧化法以肾上腺素氧化为肾上腺素红作为（）２一・生成的指标。测定
３１０
自由基的清除能力。探讨了红色素、槲皮素、亚硝酸钠的猝
灭机理，表明红色素、亚硝酸钠为动态猝灭，槲皮素为静态猝灭过程‘２６］。谷学新等利用Ｆｅｎｔｏｎ反应产生的羟基自由基氧化ＤＭＳ０生成的甲醛与乙酰丙酮、氨发生Ｈａｎｔｚｓｅｈ反应，产物３，５－Ｚ．乙酰一１，４－－－氢吡啶产生特征荧光，其最大
含量。该法操作简便，而且灵敏度可以设法增加，但干扰因素较多。在羟胺氧化法中．０２一・可氧化羟胺生成亚硝酸根，
第４期
光谱学与光谱分析
激发波长和最大发射波长分别为４１９．４和５０５．５ｎｎ］。通过测定荧光强度的变化可以间接定量测定羟基自由基的产生量‘２７１。
２．２荧光探针法
随着科学技术的发展，目前在自由基的研究领域中很多情况下需要测定细胞内自由基的含量，应用荧光探针法便可以达到这一目的。荧光探针法测定技术的核心是荧光探针，探针本身应该没有荧光或只有很弱的荧光，能很容易通过细胞膜，但在细胞或细胞器内被自由基氧化后发出较强的荧光。此法的优点是操作简便、快速、方便且重复性好，可在单细胞水平对细胞内活性氧进行定位定量的动态监测，因此这一方法最近发展最为迅速。但该方法目前尚未完全成熟及标准化，所使用的设备较为昂贵。
常用的荧光探针有２，７－－－氯荧光黄乙酰乙酸（２，７－ｄｉ－
ｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏ－ｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＤＣＦ－ＤＡ）、双氢罗丹明
１２３（ＤＨＲ）、二氢乙锭（ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｎｅ，ＨＥ）等。ＤＣＦ－ＤＡ具有亲脂性，很容易通过细胞膜，进入细胞后在细胞内脂酶
的作用下脱去乙酸盐基团成为有极性的Ⅸ：ＦＨ，但ＤＣＦＨ
不产生荧光，细胞胞浆中的氧化物能够氧化ＩＸ３ＦＨ为能发出很强荧光的２，７－－＂氯荧光素（ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ＤＣＦ），ＤＣＦ形成量与细胞氧化物水平成正比例关系，因此，其荧光强度间接代表细胞内过氧化物的水平。研究表明，ＩＸ；Ｆ－ＤＡ探针可被多种活性氧如（）２一・、０Ｈ・、过氧化亚硝基等氧化形成ＤＣＦ，因此ＤＣＦ的荧光强度应是细胞内活性氧产生的总体状况的反映。ＨＥ能自由透入细胞内被０２一・直接氧化成溴化乙锭（ＥＢ），ＥＢ的荧光强度与（）２一・浓度成正比，从而间接反映（）２一・的含量。Ｃａｔｔｅｒ等（ＣａｔｔｅｒＷ
０，ｅｔ
ａ１．Ｊ．Ｌｃｕｋｏｅ．Ｂｉ０１．，１９９４，５５（２）：２５３．）用ＨＥ作探针测得的结果表征０２一・的含量。使用ＤＣＦＨ－ＤＡ与ＤＨＲ时，仪器的激发波长４８８ｎｌｎ，发射波长在５２５或５３０ｎｌｎ左右；使用ＨＥ时，仪器的激发波长４８８ｎｌＴＩ，发射波长在６１０或
６５０
ｎ／ｎ左右。测胞浆内自由基，往往用ＤＣＦＨ—ＤＡ探针；而
测线粒体内的自由基，则常用ＤＨＲ作荧光探针［２８。。
Ｔａｎｇ等合成了用于（）２一・识别的新型荧光探针试剂２一吡啶甲醛苯并噻唑啉，该探针试剂只能被（）２一・氧化，而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在测定波长下的荧光发生变化，所以探针试剂对Ｑ一・具有专一性，由此建立了流动注射荧光法测定０２一・的方法［２９。。之后他们又合成了新的荧光探针试剂香草醛缩－８－氨基喹啉，建立了新的测定０２～・的方法，并用于一串红植物衰老过程中０２一・产生速率的测定［３０］。
荧光探针法的实际操作中，应注意以下几个问题：（１）探针在水溶液中易水解，应用无水乙醇或ＤＭＳＯ配制，４℃保存，１周内使用；（２）荧光探针在光线的照射下易被氧化。另外，还受孵育温度的影响，所以染色时需要３７℃避光孵育。样品应在染色２ｈ内上机检测，避免荧光减弱，影响实验结果；（３）细胞与探针的孵育时间必需足够，因为细胞内自由基的绝对水平很低，孵育时间过短很难显示出不同细胞间自由基水平的差异；（４）实验中应设立阴性对照，以避免细胞自身荧光对实验结果的干扰；（５）细胞应保持良好的
活性状态，贴壁细胞在消化处理时要尽量温和、快速。ＰＢＳ漂洗时间不必过长，以保持细胞活性，并且保证细胞内游离探针有一定的浓度。
３化学发光技术
化学发光测定法是仪器分析中灵敏度最高的方法之一，已在医学、环境以及工业分析等许多领域里得到广泛的应用‘ｓ¨。自由基的化学发光研究也是自由基测定法研究领域中比较活跃的分支之一。化学发光的原理是从一个化学反应（一般是氧化反应）中获得能量，使反应物或产物分子的电子激发，形成电子激发态，当返回基态时，以发射光子的形式释放能量，这一过程称为化学发光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，
ＣＬ）。
常利用化学发光技术间接检测食品、药品以及生物制剂中自由基清除剂，评价它们的抗氧化能力。其优势是利用了发光试剂与自由基反应后能直接发光的原理，根据光强度，确定自由基的含量。
最常用的发光试剂为鲁米诺（Ｌｕｍｉｎ０１），鲁米诺在碱性溶液中（ｐＨ１０左右），首先形成单价阴离子，然后在催化剂，如酶，Ｆｅｚ十，Ｃｏｚ＋，Ｎｉ２＋和Ｃｕ２十等过渡金属离子或者金属络合物的催化下与溶液中的溶解氧或者过氧化氢发生氧化还原反应，生成激发态的两价阴离子氨基肽酸盐（ＡＰＤ），ＡＰＤ经非辐射性跃迁回到基态时。放出光子。检测光的强度就可以确定自由基含量。Ｚｈａｏ等以Ｌｕｍｉｎｏｌ为发光试剂，检测茶叶中的茶色素清除超氧自由基与羟基自由基的能力，并将其清除能力与茶多酚进行比较。研究表明，茶色素清除（）２一・和ＯＨ・的半数清除浓度达到０．０８和０．００３ｍｇ・ｍＥ－１，其清除能力以及动力学过程与茶多酚相似［３２。。
自从Ａｌｂｒｅｃｈｔ报道了鲁米诺的化学发光现象以来∞３。，直到今天鲁米诺的化学发光反应机理仍然没有得到令人满意的阐释。近年来，有研究者在研究金属过氧化物的化学发光时发现，在不存在任何催化剂的条件下，向ＢａＯ或者ＭｇＯ固体粉末中注入鲁米诺溶液，仍然可以观察到很强的发光现象Ｌ３“，这一发现已被应用于以鲁米诺衍生物ＡＢＥｌ作为标记物的化学发光柱后测定法［３引。利用固一液非均相化学发光体系，在弱酸性或者非缓冲介质条件下，同样能够观
察到鲁米诺与过氧化氢的发光现象。这些结果表明，鲁米诺
发光与否与鲁米诺溶液的酸碱度似乎没有直接的关系，介质的酸碱度只会影响激发态ＡＰＤ的发光强度和发光波长，发光与否更多地取决于活性氧的生成条件【３引，所以从理论上来说，鲁米诺化学发光法可以应用于各种不同介质中０２一・和０Ｈ・的测定，但同时这就导致了测定选择性差的问题。
另一种较常用的发光试剂是光泽精（Ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ），在发现鲁米诺化学发光后不久，Ｇｌｅｕ等首次报道了光泽精化学发光‘３７］。在碱性条件下，光泽精与（】２一・等过氧化物作用形成激发态Ｎ－甲基吖啶（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄａｎ）。利用光泽精化学发光法也可检测细胞线粒体内特定种类的自由基：光泽精通过其本身的正电荷与线粒体内膜上负电荷之间的作用
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通过线粒体膜线粒体内膜后首先被还原成单价光泽精自由基，然后光泽精自由基与０２一・反应生成不稳定的中间物并分解出激发态分子，激发态分子跃迁到基态的过程中释放光子，通过微弱发光仪测定发光强度，以此间接测定（】２一・的生成及数量。相比之下，光泽精对于自由基测定的选择性较高，有许多报道光泽精只有在超氧活性自由基存在下才发生发光现象。但是在实际应用中，ＨｚＱ的分解过程同样会产生（＿）２一・自由基，可能会影响结果的准确性。
还有一类特殊的化学发光试剂，化学名称为２－ｍｅｔｈｙｌ一６－ｐｈｅｎｙｌ一３，７－ｄｉｈｙｄｒｏｉｍｉｄａｚｏ－［１，２－ａ］ｐｙｒａｚｉｎ－３－ｏｎｅ，简称
ＣＬＡ，早先是由Ｓｕｇｉｕｒａ等合成Ｌ３８ｊ的。ＣＩＡ的特点是不与生物机体内的Ｈｚ０２或者ｏＨ・发生反应，只与咙・发生
特异性的化学发光反应，发光波长为３８０ｎｍ［３９］。Ｏｓｍａｎ等在ＣＬＡ化学发光系统中加入吐温２０，在０．６％（ｐ）的浓度时，ＣＬＡ的发光强度增加了２．７倍，使检测黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶体系产生０２一・的灵敏度提高到ｎｍｏｌ・Ｌ１［４…。Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ等还开发了ＣＬＡ的衍生物ＭＣＬＡ和ＦＣＬＡＥ４ｌＪ，Ｎａｋａｎｏ和Ｆｕｊｉｍｏｒｉ等对这一类试剂的化学发光机理和反应动力学作了详细的研究，报道了ＣＩ。Ａ和ＭＣＬＡ与活性氧的化学反应机理Ｌ４２“引。ＦＣＬＡ是目前化学发光试剂中发光波长（５３２ｎｍ）最长的试剂，发光效率比ＣＩ．Ａ高出近１０倍，由于这一特点，在进行生物样品中０２一・测定时，能够有效地降低酶、ＯＨ・等干扰物质的影响。
其他用于检测自由基的化学发光试剂还有ＰｈｏｌａｓｉｎＥ“］和Ｌｕｍｉｎｏｌ类似物等Ｌ４５“６｜。
２０世纪６０年代发展的电子顺磁共振（ｅｌｅｃｔｒｏｎｐａｒａｍａｇ—
ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＰＲ）（也称电子白旋共振（ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｓｐｉｎ
Ｙｅｓ—
对于亚硝基类化合物，被捕集的自由基直接加到亚硝“等利用了ＭＮＰ的这一优点，通过ＥＰＲ检测ＭＮＰ自捕集所产生的自由基的超精细耦合常数的改变，研究了硝酮类自旋捕集剂主要有ＤＭＰＯ和ＰＢＮ，自由基加在卜灶０＋《——Ｒ＿Ｎ＿０
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（ａ）亚硝基类
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Ｆｉｇ．１
Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｓｏｆｔｒａｐｐｉｎｇｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓ
ｏｆ刚ｎ
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ＤＭＰＯ具有良好的水溶性，利于实验操作和溶液配制，更重要的是ＤＭＰＯ与（）２一・和ＯＨ・反应后，所测定到的ＥＳＲ谱图有明显的差别，能够快速地鉴别出（）２一・和ＯＨ・。但是这个方法也存在着它的不足之处，与（）２一・形成的自由基附加生成物ＤＭＰＯ－ＯＯＨ在生理条件下，会逐渐地转变为与ＯＨ・的自由基附加生成物ＤＭＰＯ－ＯＨ类似的ＥＳＲ信号，使得（）２一・和ＯＨ・的判断成为困难，Ｋｏｈｎｏ等采用向测定体系中添加ＤＭＳＯ的方法良好地解决了这一问题［４８］。Ｈｏｊｏ等以ＤＭＰＯ作为体内ＯＨ・捕集剂，用ＥＳＲ自旋捕集技术间接检测小鼠血液中的体内ＯＨ・［４９３。Ｒｏｕｂａｎｄ等报道一种新的ＤＭＰＯ的衍生物，ＤＥＰＭＯ这一试剂可与０２一・形成稳定的自由基附加生成物（半衰期约１５ｍｉｎ），这种生成物具有特征性的１２个峰的ＥＳＲ信号，易于定性判
断嘲。
Ｒｈｏｄｅｓ等以ＰＢＮ为甲基自由基的捕获剂，检测一系列常数Ｌ５１ｊ。当所要研究的自由基为羟自由基时，由于羟自由的甲基自由基，然后再用自旋捕集剂捕获甲基自由基，并用ＥＰＲ技术进行研究。Ｔａｋｅｓｈｉｔａ等用ＤＭＳＯ来捕获大鼠体内获甲基自由基，通过ＥＰＲ间接检测了羟自由基的含量，该自由基不能用ＥＰＲ检测Ｌ５３｜。
自旋捕集技术的局限性是：有些自旋捕获剂对生物体随着自由基在生物体系中研究的不断深入，人们更需ｓｐｉｎ
ｒｅｓｏｎａｎｃｅ
ｉｍａｇｉｎｇ，ＥｓＲｌ）应
维生素Ｅ型的抗氧化剂与自旋捕集剂竞争甲基自由基的反应，快速测定了不同物质的活性大小以及与自由基的结合基极不稳定，因此通常用ＤＭＳＯ来捕获它产生一种较稳定通过ｘ＿射线产生的羟自由基，生成甲基自由基，以ＰＢＮ捕结果为研究人类受辐射伤害的程度提供了一定的参考Ｌ５２。。过去大多数研究认为ＤＭＳＯ被自由基氧化只生成了一种更稳定的甲基自由基，但是Ｑｉａｎ等的研究表明。甲基自由基不是ＤＭＳＯ被氧化产生的唯一的碳自由基，除了・ＣＨ３，还有・０ＣＨ。，・ＣＨ２（）Ｈ和・ＣＨ２Ｓ（（））ＣＨｓ，只是后几种有毒，有些易受到血脑屏障限制，无法到达自由基生成的组织部位；捕集产物不稳定，寿命不长（只有几分钟到几十分钟），易被猝灭，必须在捕获自由基后立即对其检测；被捕获的自由基不专一，ＥＳＲ信号随时问衰减不稳定，噪声干扰严重。
４．２电子自旋共振成像
要了解自由基在生物组织、器官中的空间分布信息，电子自旋共振成像技术（ｅｌｅｃｔｒｏｎ
４电子自旋共振
４．１自旋捕集
ｎｅｔｉｃ
ｏｎａｎｅｅ，ＥＳＲ））技术在光化学、电化学、高聚物、核辐射以及生物学领域中已得到广泛的应用。其检测自由基的原理
是用某一反磁性化合物——自旋捕捉剂与不稳定的自由基
反应产生一种相对稳定的可用ＥＰＲ检测的自由基，一般称之为自旋加合物，利用自旋加合物的ＥＰＲ常数来研究自由基的电子结构。常用的自旋捕集剂为氮氧化合物，主要为亚硝基类和硝酮类。
基的氮上［见图１（ａ）］。所形成的自旋加合物的ＥＰＲ谱可以反映被捕自由基的超精细结构，对鉴别被捕自由基十分有利。常用的捕集剂是２一甲基一２一亚硝丁烷（ＭＮＰ）。
对一叔丁基环芳烃与自由基相互作用的情况。此类捕集剂存在的缺点是对热和光不稳定，并容易二聚而失去捕集作用。而且以（）为中心的自旋加合物极不稳定‘４７］。
捕集剂的碳原子上形成加合物［见图ｌ（ｂ）］。
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光谱学与光谱分析
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运而生。根据成像的方式不同可分为：三维（３Ｄ）梯度磁场法、扫描ＥＰＲ显微镜法、轴向检测ＥＰＲ法和双共振成像法。
利用３Ｄ－ＥＰＲＩ技术，以ＴＰＩ。氮氧自由基为标记物，可清晰地获得自由基浓度随主动脉血管距心脏间的距离增加而减弱，对心脏的分辨率可达到亚毫米水平［５“。Ｓｈｉｎ－ｉｃｈｉ等给大鼠腹腔内注射一种稳定的氮氧自由基一３一氨甲酰基一２，２，５，５－四甲基一ｌ一氧一吡咯啶（氨甲酰基－ＰＲＯＸＹＩ。），在大鼠脑部获得一个持续的自由基信号，然后将大鼠头部置于ＥＳ－ＲＩ系统的谐振腔中，通过磁场扫描，获得了大鼠脑部的３Ｄ切片ＥＳＲＩ图像［ｓｓ３。Ｔｏｇａｓｈｉ等对大鼠尾静脉注射氨甲酰基一ＰＲＯＸＹＬ，利用ＥＳＲＩ系统观察了大鼠腹腔氨甲酰基一ＰＲ（）ＸＹＬ分布的２Ｄ和３Ｄ图像。在此基础上，通过ＣＣＩＡ诱导肝损伤，使氨甲酰基一ＰＲＯＸＹＩ。的代谢速率降低，又成功获得了活体大鼠肝脏的２Ｄ和３Ｄ图像口引。Ｍａｓｕｍｉｚｕ等用氮氧自由基溶剂给大鼠灌胃，观察到这种自由基首先到达胃部，然后被转运到肝、肾和心脏的动态图像【５引。另外Ｐａｎａｇｉｏｔｅｌｉｓ等利用射频轴向ＥＳＲＩ技术观察了肝、肾、膀胱等不同组织的氧分布图像［５引。ＥＳＲＩ不仅可以观察自由基在组织的空间分布，还可以观察自旋标记物在组织中的代谢情况。如Ｓａｎｏ等采用该技术研究小鼠静脉注射不同结构的亲脂性氮氧自旋探针，获得了不同结构化合物透过血脑屏障的速度与规律，从而为活体动态研究脑组织中的自由基或药物代谢提供了新途径。
尽管ＥＳＲＩ技术在生物医学领域中应用已有诸多报道，
参
１Ｉ＝ｌ
基于其成像原理和技术本身特点，仍有许多不利因素限制了ＥＳＲＩ的应用。比如，样本自由基的谱线较宽，为达到一定的分辨率所需的梯度场强度高；生物体内含有各向异性的顺磁性物质，从不同方向进行磁场扫描时所获得的谱线易发生偏移；由于电子与原子核的相互作用，易产生超精细结构的ＥＳＲ谱线等。但这些困难必然随着人们研究的深入而逐步被克服，其发展前景非常广阔。
５展望
自由基研究已经与许多研究领域结合在一起。在食品科学领域，自由基研究可为食品中的抗氧化成分及其作用机理的研究提供有价值的参考，筛选抗氧化剂；在医学领域，生物机体的某些疾病与自由基密切相关，研究自由基的
产生、消亡过程可以进一步探讨疾病的发生原理，从而为疾
病诊断治疗提供理论依据；在药学领域，研究药物与自由基的相互作用、动力学过程，可为新药物的开发提供理论基础；在环境科学领域，能够利用自由基的强氧化性来实现环境中有机物的降解、转化等过程，为治理环境污染提供了一条新途径。然而从以上介绍的各种方法来看。能够直接测定自由基的方法相当有限，且到目前为止化学反应法和捕获法的分析选择性和可信度还难以令人满意。因而迫切需要开发高灵敏度、高选择性的自由基测定方法，特别是体内自由基的测定，对于解释生命机体的各种生理、病状等有着重要的意义。
考文
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Ｆａ－ｚｈｅｎｇ。
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１０００８３，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
ｉＳｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｆｏｒｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｃｅｌｌｓｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓ．ＴｈｅｒｅｉＳｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒ
ａ
ｔｈｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｓｕｃｈｓｐｅｃｉｅｓｉｎ
ｖａｒｉｅｔｙｏｆｎｏｒｍａｌｉｎｖｉｖｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｙｓｔｅｍｓ．Ｗｈｅｎａｎ
ｅｘｃｅｓｓ
ｏｆｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｉｓｆｏｒｍｅｄ．ｔｈｅｙ
ｃａｕｓｅｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅａｎｄｌｅｔｈａｌｃｅｌｌｕｌａｒｅｆｆｅｃｔｓｂｙｏｘｉｄｉｚｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅｌｉｐｉｄｓ，ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＤＮＡｈａｓｂｅｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｔｈａｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｐｌａｙｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｐｒｏｂａｂｌｙ
ａ
ａ
ａｎｄ
ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｉｔ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｒｏｌｅｉｎ
ａ
ｎｕｎｌｂｅｒｏｆｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆｏｒｅｘａｍｐｌｅ，ｍａｎｙｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｓｈｏｗｎ
ｔｏ
ａｌｌｔｈｅｍａｊｏｒｃｌａｓｓｅｓｏｆｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｔｈｅｂｒａｉｎｓｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｃａｎｃｅｒｉＳ
ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡｄａｍａｇｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌ
ａｒｅ
ｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ａｎｄ
ｎｅｃｅｓｓａｒｙ．Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｈｙｄｒｏｘｙｌａｎｄｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｒａｄｉｃａｌｓｗａｓｒｅｖｉｅｗｅｄｗｉｔｈ６２ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｐａｐｅｒ，ｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍａｉｎｌｙｉｎｃｌｕｄｅｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ，ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ，ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｎｓｐｉｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｉｒａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＨｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ；Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ
ｒａｄｉｃａｌ；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
Ｒｅｖｉｅｗ
（ＲｅｃｅｉｖｅｄＮｏｖ．２８，２００７；ａｃｃｅｐｔｅｄＭａｒ．６，２００８）
＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ａｕｔｈｏｒ
敬告读者——《光谱学与光谱分析》已全文上网
从２００８年第７期开始在《光谱学与光谱分析》网站（ｗｗｗ．ｇｐｘｙｇｐｆｘ．ｃｏｍ）“在线期刊’’栏内发布《光谱学与光谱分析》期刊全文，读者可方便地免费下载摘要和ＰＤＦ全文，欢迎浏览、检索本刊＂－３期的全部内容；并陆续刊出自２００６年以后出版的各期摘要和ＰＤＦ全文内容。２００９年起《光谱学与光谱分析》每期出版日期改为每月１日。
光谱学与光谱分析期刊社
羟基和超氧自由基的检测研究进展
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
张昊， 任发政， ZHANG Hao， REN Fa-zheng
中国农业大学食品科学与营养工程学院,教育部-北京市功能乳品实验室,北京,100083光谱学与光谱分析
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目的 检测Prousion矿粉对羟基自由基和超氧自由基的清除作用.方法 采用D-脱氧核糖法检测Prousion对羟基自由基的作用,采用黄嘌呤氧化酶法检测对超氧自由基的作用,并采用电子自旋共振(ESR)测定仪分别测定Prousion对这两种氧自由基的作用.结果 研究结果显示,Prousion-A、B、C清除羟基自由基(·OH)的IC50分别为0.2209、0.2962和0.2183g/L,其作用强弱顺序为P-C>P-A>P-B.Prousion-A、B、C清除超氧自由基(O2·)的IC50分别为0.4025、0.3854和0.3626g/L,其作用强弱顺序为P-C>P-B>P-A.ESR测定为这些结果提供了较为一致的佐证.结论 Prousion具有一定的清除氧自由基的作用.
2.期刊论文 赫春香. 王杨. 曹璨. 王世盛. HE Chun-xiang. WANG Yang. CAO Can. WANG Shi-sheng 荧光动力学分析法测定5种(口山)酮清除超氧自由基和羟基自由基的活性 -高师理科学刊2005,25(4)
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3.学位论文 殷日祥 天然抗氧化剂的筛选及艾叶的抗氧化活性的初步研究 2004
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6.学位论文 崔英杰 Fenton技术降解非水相有机污染物的实验研究 2008
由于对有机化合物尤其是四氯乙烯(PCE)和三氯乙烯(TCE)等含氯有机污染物的广泛使用和不适当的处理，导致有机物成为土壤和地下水的主要污染物之一。含氯有机污染物十分稳定并具有生物拮抗特性，在环境中不易被分解而受到关注。Fenton氧化法作为一种高级氧化技术，在废水处理领域已经得到深入的研究，而最近在土壤和地下水有机污染修复中也受到越来越多的重视。本论文针对目前仍备受争议的Fenton试剂对非水相有机污染物降解的反应机理，包括反应活性粒子(羟基自由基和超氧自由基)的贡献、反应的位点等关键问题进行了探讨，并系统地考察了温度、催化剂浓度和氧化剂浓度对降解反应的影响，及在Fenton试剂中添加非离子表面活性剂曲拉通TX100和阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，形成表面活性剂-Fenton系统，并初步研究了该系统对非水相有机污染物的降解。本论文采用硫酸铁和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)配制的铁螯合剂(Fe(Ⅲ)-EDTA)作催化剂，在对土壤和地下水中的微生态系统生长有利的中性环境条件下进行研究。研究的主要内容包括三部分：
第一，在降解的反应机理方面，反应中是否产生还原性活性粒子超氧自由基；降解反应是以羟基自由基还是以超氧自由基起决定作用；反应发生在重非水相流体DNAPLs(dense non-aqueous phase liquids)的水溶液中，还是可以直接在DNAPLs的非水相降解等问题，目前还存在很大争议。本研究以四氯乙烯(PCE)和三氯乙烯(TCE)为目标有机污染物，采用异丙醇和氯仿分别作为羟基自由基和超氧自由基的俘获剂，来验证降解反应中是否产生超氧自由基以及何种活性粒子起决定作用。
结果发现：在Fenton试剂降解PCE/TCE DNAPLs的反应中，不仅产生羟基自由基，还产生超氧自由基，并以羟基自由基的贡献为主，羟基自由基的产生与否与氧化剂量的多少没有必然联系；采用气相色谱法，分析比较反应30 min时降解反应与挥发溶解实验中PCE剩余量，计算得出，除催化剂与氧化剂浓度皆很低及与PCE的配比很小的情况外，Fenton试剂可以直接降解非水相的PCE。
第二，研究了温度、催化剂浓度、氧化剂浓度对Fenton试剂降解PCE DNAPL的影响，优化了反应条件。 实验表明：
1.同一反应时间时，20、40和60℃的环境温度中，从降解效果和经济上考虑，40℃时为最佳反应温度。
2.在有机物、氧化剂浓度一定时，0.5、5和10 mM催化剂浓度中，5mM催化剂浓度为最佳反应浓度；而在有机物、催化剂浓度一定时，50、100和200mM氧化剂浓度中，100mM氧化剂浓度为最佳反应浓度。浓度过高或过低都不利于降解反应的进行。
第三，首次在反应体系中添加非离子表面活性剂曲拉通(TX100)或阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，构成表面活性剂-Fenton体系，对PCEDNAPL的降解进行了探讨。 结果发现：
1.添加TX100或SDBS，都能显著促进Fenton试剂对PCE DNAPL的降解效果，且TX100对降解反应的促进性要高于SDBS。
2.表面活性剂的添加量及反应初始浓度与该体系的降解效果成反向关系，在表面活性剂少量且反应初始浓度较低时，该体系的降解效果更好。 3.系统温度在0～60℃时，与非离子表面活性剂-Fenton体系的降解效果成反比关系：系统温度在4～38℃时，与阴离子表面活性剂-Fenton体系的降解效果成反比关系。
4.表面活性剂-Fenton体系降解PCE DNAPL的反应中羟基自由基起主要作用，且在降解反应过程中有超氧自由基生成。
7.期刊论文 沈巍. 王建新. 赵成英. SHEN Wei. WANG Jian-xin. ZHAO Cheng-ying 壳聚糖季铵盐合成及其抗氧化性能研究 -天然产物研究与开发2007,19(3)
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8.学位论文 李加冕 杯芳烃衍生物的合成与性质研究 2006
本文合成了5种杯[4]芳烃下缘修饰的衍生物，其中3种属新化合物。L1和L2属于羧酸类杯[4]芳烃衍生物，已见文献报道，但没有任何相关性质研究。L3、L4、L5属于下缘氮杂杯[4]芳烃衍生物，未见文献报道，特别是L3、L4更属于杯芳冠醚类衍生物。五种化合物都经过熔点、红外光谱、核磁氢谱、元素分析进行了表征。本论文的目的在于研究这五种化合物的体外抗氧化生物活性、自组装作用和对金属离子及有机小分子的分子识别、超分子相互作用的能力。
在体外抗氧化生物活性方面，主要研究了L2～L5四种配体样品的抗超氧阴离子自由基、抗自由基诱导红细胞氧化性溶血和抗羟基自由基的活性。研究抗超氧阴离子自由基的时候，分别采取了固定浓度的配体样品随时间变化清除自由基的实验和不同浓度的配体样品在固定反应时间里清除自由基的实验两种实验方法。分别作出吸光度-时间工作曲线和清除率-样品浓度工作曲线，并拟合工作曲线计算出EC50值。通过研究知道它们都具有很好的清除超氧自由基的能力，并且这种清除能力随样品浓度的增加而不断增强。通过它们清除自由基的速率和EC50值的比较，得出它们清除超氧自由基的能力大小为：L4＞L3＞L2＞L5。研究抗自由基诱导红细胞氧化性溶血的时候，分别采取了不同浓度的同一配体的抑制作用比较和同浓度的不同配体的抑制作用的比较两种比较方法。通过做溶血度-时间工作曲线，可以清楚地知道它们都具有一定的抗氧化性溶血的作用，并且随着样品浓度的增加其活性不断增强。最后得出它们抗氧化性溶血的活性强弱为：L4＞L2＞L3＞L5。研究抗羟基自由基的时候，采用了不同浓度的配体样品对自由基的清除作用的实验方法。通过做清除率-样品浓度工作曲线，拟合出回归方程，从而计算得到EC50值。通过研究知道它们都具有非常好的清除羟基自由基的能力，并且随样品浓度的增加而不断增强。最后通过EC50值的比较得出它们清除羟基自由基的能力为：L5＞L3＞L4＞L2。
在分子识别实验方面，利用荧光光谱法分别研究了L1～L5五种配体对各种各样金属离子的荧光识别作用。发现它们对金属离子的识别是不受金属盐的酸根离子干扰的。通过荧光滴定实验，可以计算出它们对可识别的金属离子的相互作用稳定常数K值，并判断它们的荧光猝灭是静态的还是动态的。与此同时，还通过化学软件hyperchem，优化了L1～L5五种配体的能量最低时采取的结构构型，并且从理论上模拟了L1～L5与它们可以识别的金属离子的配位模式构型，计算了它们配位的单点能，通过单点能的比较，从理论上验证了它们与金属离子相互作用的强弱。L1可以选择性地识别Fe3+、Cr3+、Co2+，K(Fe3+)=1.44×104M-1，K(Cr3+)=3.17×103M-1。L2可以选择性地识别Fe3+、Ce3+、Al3+、Cu2+，K(Fe3+)=7.58×104M-1，(Al3+)=7.10×103M-1，K(Cu2+)=4.47×103M-1,K(Ce3+)=3.08×104M-1。L3可以选择性地识别Fe3+、Cu2+，K(Fe3+)=2.46×104M-1，K(Cu2+)=9.52×103M-1。L4可以选择性地识别Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Ru3+，K(Fe3+)=1.1×106M-1，K(Ru3+)=1.26×104M-1，K(Co2+)=6.79×103M-1，K(Cu2+)=1.17×104M-1。L5可以选择性地识别Fe3+、Cr2+、Cu2+，K(Cu2+)=3.11×104M-1，K(Fe3+)=3.4×104M-1，K(Cr3+)=1.61×104M-1。
在晶体自组装方面，培养了L1和L3的单晶，通过X射线衍射实验研究了L1和L3的晶体结构。主要发现两个配体分子晶体中都存在着CH/π相互作用，而且这种相互作用在形成超分子晶体结构方面起着相当重要的作用。
最后通过目前最新的应用比较少的核磁共振扩散实验，通过测定L1、L3、L5三种主体大分子与各种有机客体小分子在溶液中的扩散系数D的变化，从原子水平研究了它们与有机小分子之间的主客体的超分子作用。并且通过得到的D值，可以方便计算出它们与客体小分子相互作用的稳定常数Ka。通过Ka比较了它们与客体小分子相互作用的强弱。
9.期刊论文 赫春香. 张淑敏. 周丹红. 王杨. 王世盛 当药醇甙的伏安行为及其抗氧活性研究 -辽宁师范大学学报(自
然科学版)2003,26(2)
研究了当药醇甙的极谱伏安特性及其清除超氧自由基(O-2@)及羟基自由基(@OH)的作用.在磷酸盐缓冲溶液(pH=8.2)中,当药醇甙有一个不可逆吸附还原波,峰电位为-1.61 V(Vs.SCE),有2个电子和2个质子参与了此电极反应.采用经典邻苯三酚自氧化法及Fenton法试验,表明当药醇甙对O-2@及@OH有明显的抑制作用,50%抑制率时当药醇甙的用量分别为12.8和0.22mg@L-1.
10.学位论文 李燕华 黄酮类希夫碱配合物的合成、表征、抗氧化活性以及与DNA结合的研究 2006
本文主要报道了具有生物活性的黄酮类希夫碱及其金属配合物的合成、表征及抗氧化活性和与DNA结合的性质研究。很多黄酮类希夫碱及其配合物具有良好的抗癌性、抗菌性及抗氧化性方面性质，使其在生物学和医药学方面具有重要的意义。基于我们小组研究希夫碱及其配合物在清除超氧自由基和羟基自由基方面的前期工作，本论文设计合成柚皮素(苯甲酰基)腙及其过渡金属配合物和色酮(苯甲酰基)腙及其稀土配合物，用元素分析、摩尔电导、差热分析、红外和核磁共振对其结构进行分析表征，测定其在清除超氧自由基和羟基自由基方面的活性，并研究其与DNA作用方式。
第一章，介绍了希夫碱配合物和黄酮类化合物的发展，对它们的抗氧化活性及与DNA结合等生物活性的原理及进展进行了系统地论述。
第二章中设计合成柚皮素(苯甲酰基)腙(H3L)及其过渡金属配合物，并用元素分析、质谱、摩尔电导、差热分析、红外和核磁共振对其结构进行分析表征。推测配合物的结构MHL·nH2O(M=CuandZn，n=1)和NiH2LOAc·3.5H2O。使用721分光光度计法测定了配体及配合物清除超氧自由基和羟基自由基的能力，并计算其清除率，结果表明，相比较于配体，金属配合物清除超氧自由基和羟基自由基的能力较为强些。
第三章对柚皮素(苯甲酰基)腙及其过渡金属配合物和配体PMBPH及La配合物与小牛胸DNA(ctDNA)的相互作用方式进行了研究。结果表明所研究化合物与ctDNA的作用方式均为插入作用，但金属配合物与ctDNA的结合亲合力明显高于配体。
第四章中设计合成色酮(苯甲酰基)腙及其稀土配合物。由于时间关系，配体和配合物的表征都不完善。
引证文献(1条)
1. 熊何健. 庞杰. 谢主兴 太子参提取物体外抗氧化活性研究[期刊论文]-南开大学学报（自然科学版） 2009(6)
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第２９卷，第４期２００９年４月
光谱学与光谱分析
ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄＳｐｅｃｔｒａｌＡｎａｌｙｓｉｓ
Ｖ０１．２９。Ｎｏ．４．ｐｐｌ０９３—１０９９
Ａｐｒｉｌ，２００９
羟基和超氧自由基的检测研究进展
张昊，任发政。
中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部一北京市功能乳品实验室，北京１０００８３
摘要活细胞在必需的新陈代谢过程中会产生自由基，越来越多的研究证据表明，这些自由基涉及到许多体内调控系统，然而一旦有过多的自由基生成便会氧化细胞脂膜、蛋白质、ＤＮＡ和酶，进而对细胞造成致命性的损伤。此外，研究还表明许多疾病与自由基密切相关，例如，有研究报道海氏默症病人脑中生物分子的氧化损伤程度明显高于正常值，另外癌症可能也是ＤＮＡ受到氧化损伤的结果。因此，测定自由基的方法就显得十分必需和重要。文章重点对羟基和超氧自由基检测技术的发展情况进行了讨论，涉及的自由基检测技术主要有分光光度法、荧光法、化学发光法和电子自旋共振技术，并评价了各种方法的优缺点。关键词羟基自由基；超氧自由基；检测技术；评述中图分类号：０６５７．３
文献标识码：Ａ
ＤＯＩ：１０．３９６４／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－０５９３（２００９）０４－１０９３－０７
羟基苯甲酸，用其在５１０ｎｌＴＩ处的吸光度值表示ｏＨ・的多
引
言
羟基自由基（ＯＨ・）和超氧自由基（０２一・）是生物体内
少，吸光度值与ｏＨ・的量成正比［１］。１．１．２铁氧化邻二氮菲法
Ｆｅｎｔｏｎ反应产生ＯＨ・，羟自由基使邻二氮菲一附＋氧
化为邻二氮菲一Ｆｅ３＋，使邻二氮菲一Ｆｅ２＋在５３６ｎｌｎ处的最大吸收峰消失。根据５３６
活性氧代谢产生的物质，其中Ｑ一・经一系列反应最终会生成０Ｈ・，而ｏＨ・是一种氧化性很强的自由基，可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使糖类、蛋白质、核酸及脂类等发生氧化损伤。研究表明肿瘤、心血管、衰老等许多疾病与自由基相关。
因此，近些年来人们为了预防这类疾病的发生，自由基的研究已逐渐成为热点。而快速、灵敏和实用的自由基检测方法就显得十分重要。本文主要介绍了目前常见的测定羟基和超氧自由基的检测方法：包括分光光度法、荧光法、化学发光法、电子自旋共振技术等，并评价了各种方法的优缺点和应用范围。
ｍ处吸光度变化判断受试物清除
ＯＨ・的能力。需要注意的是，测定时加样方法对结果有重要影响，需先将邻二氮菲、ＰＢＳ及水混匀，并且每管加入ＦｅＳ０４后立即混匀，否则会使局部颜色过浓，影响结果的重复性‘２１。
１．１．３细胞色素Ｃ氧化法
其反应机理为ｏＨ・能使还原型细胞色素Ｃ（浅红色）氧化成氧化型细胞色素Ｃ（浅黄色）通过测定反应体系中吸光度的减少量（５５０ｎｍ），间接测得ｏＨ・的含量。１．１．４脱氧核糖法
采用Ｆｅ３＋一ＥＤＴＡ－抗坏血酸一过氧化氢体系产生ＯＨ・。
１分光光度法
利用自由基使显色剂发生颜色变化，根据吸光度的变化值而间接测得自由基的含量是分光光度法的基本原理，下面将分别介绍几种常见的羟基和超氧自由基的测定方法。１．１羟基自由基１．１．１水杨酸法
Ｆｅｎｔｏｎ反应产生０Ｈ・，ＯＨ・氧化水杨酸得到２，３－－－
收稿日期：２００７一ＩＩ一２８。修订日期：２００８－０３－０６
基金项目：国家“十一五”科技支撵项目（２００６Ｂ伽）０５Ａ１６）资助
此方法中脱氧核糖作为ＯＨ・的攻击目标。脱氧核糖受ＯＨ・攻击后裂解，在酸性、加热的条件下可与硫代巴比妥酸反应生成红色化合物。可根据在５３２ｎｌＴｌ处测定的吸光度值来间接反映ｏＨ・的含量【３】。１．１．５萃取一催化氧化光度法
．
利用混合稀土溶液催化Ｈ。Ｑ产生０Ｈ・，ｏＨ・氧化
二苯基碳酰肼，生成红色二苯基碳酰腙，其最大吸收波长是
５６３
ｎｌｎ。当二苯基碳酰肼浓度一定时，吸光度值与（）Ｈ・呈
作者简介：张昊，１９８４年生。中国农业大学食品科学与营养工程学院硕士研究生
＊通讯联系人ｅ－ｍｍｌ：ｒｅｎｆａｚｈｅｎｇ＠２６３．ｎｅｔ
ｅ－ｍａｉｌ：ｄａｖｉｄｌｈａｏ＠ｓｉｎａ．ＯＤＩｎ
１０９４
光谱学与光谱分析
第２９卷
量效关系，从而间接反映ＯＨ・的含量‘“。
另外还有许多研究者利用不同显色剂检测ＯＨ・，详细介绍见表１。
在酸性条件下，亚硝酸与氨基苯磺酸和Ｎ－甲奈基二氨基乙烯反应生成红色化合物，后者在５５０ｎｉ－ｎ处有最大吸收峰，测定在５５０ｍ＇ｎ处的吸光度变化，可以间接的反映Ｑ一・的含量，但是该方法存在一定的缺点，如甲萘胺溶液不稳定、空白值较大等。
总体上来说，分光光度法操作简单，费用少，仪器设备价格低廉，但存在检测的灵敏度较低，检测限较高，专一性不强等缺点。
Ｔａｂｌｅ１
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ
１．２超氧自由基
超氧自由基的分光光度法测定，最常用的方法有细胞色素Ｃ的超氧自由基还原法【１２Ｊ和硝基阴氮唑篮（ｎｉｔｒｏ
ｂｌｕｅ
ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＮＢＴ）还原法Ｌｌ３｜。具有氧化活性的细胞色素Ｃ被０２一・还原后，形成了在波长５５０ｕｒｎ处有强吸收的亚铁细胞色素，可以用于（）２一・的测定［１“。但是，细胞色素Ｃ还原法的体系中如果存在着其他还原性物质便会对结果造成干扰，如还原性酶的干扰。同样，ＮＢＴ在０２一・的作用下，还原生成不溶于水、蓝色的二甲替（Ｄｉｆｏｒｍａｚａｎ）［１３］，它的最大吸收波长５６０ｎｎｌ，吸光系数达１００００以上，测定灵敏度相当高。有研究者在进行Ｋ１０４一Ｈｚ０２化学发光反应体系的机理过程中，使用ＮＢＴ反应测定０２一．・获得良好的结５１。但是，由于二甲替不溶于水，长时间放置会出现沉淀近些年，还不断有研究者报道新的测定方法。比如田益ｒｕｘｌ、
另外分光光度法测定（）２一・的方法还有邻苯三酚自氧・反应，从而
７．４）环境下测定，而缺点在于６一羟多巴胺氧ｎｎｌ处。肾上腺索红的产量可间接测出反应体系的（）２一・
用荧光光度法来检测自由基的含量时，使用的捕获剂
荧光减弱的捕获荆
方光荣等研究了ＯＨ・与Ｃｅｓ＋的反应，表明在酸性条ｎｎｌ，Ｍｎ２＋一Ｈｚ０２体系在碱性介质中产生的羟自由基０２荧光法测定羟自由基的新体系，激发波长和发
张海容等通过Ｃｕ＋催化过氧化氢一抗坏血酸反应体系产２荧光法
２．Ｉ荧光光度法
在捕获自由基后会发生荧光强度的变化。在常见的捕获剂中，荧光强度减弱的捕获剂有Ｃｅｓ＋、罗丹明６Ｇ、水杨基荧光酮，而荧光增强的有苯甲酸、Ｈａｎｔｚｓｅｈ反应等，下面就分别从这两方面介绍常见捕获剂的应用。
２．１．１
果［１现象，难以应用于测定（）２一・随时间增长其动态的变化。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等报道了利用水溶性ＮＢＴ衍生物测定０２一・的方法，解决了生成物沉淀所导致的测定困难问题Ｌｌ引。
玲等建立了一种利用动力学分光光度法测定中药对超氧阴离子自由基清除率的新方法。研究表明：当波长为５２０
件下，有强荧光的Ｃｅ３＋被氧化生成无荧光的Ｃｅ４＋。测定反应前后荧光强度的下降可间接测定羟基自由基的含量，该方法可作为筛选抗氧化剂的方法［ｚ１１。碱性介质中罗丹明６Ｇ能产生特征荧光，其最大激发波长和发射波长分别为３５０和５５０可以迅速氧化罗丹明６Ｇ使其荧光猝灭，如果存在抗氧化物质可以清除羟自由基，便会使溶液的荧光猝灭程度降低，据此建立了测定抗氧化活性的方法［２２１。任凤莲等人的实验发现Ｃｏｚ＋与Ｈｚ（）２反应生成羟自由基的产率比Ｆｅｎｔｏｎ试剂高１００倍以上。采用水杨基荧光酮（ｓａｌｉｃｙｌｆｌｕｏｒｏｎｅ，ＳＡＦ）一
Ｃｏｚ＋＿Ｈｚ射波长为５１０和５００咖，测定体系在反应前后的荧光变化，
可间接测定羟自由基的产生量ｍ】。除了这几种常见的捕获剂外，还有一些研究者采用了其他的试剂，荧光素钠本身能产生特征荧光，其激发波长和发射波长分别为４９１和５１２ｎｎｌ。在碱性介质中，Ｍｎｚ＋。Ｈ：０２体系产生的羟自由基可以迅速氧化荧光素钠使荧光猝灭［２４］。张爱梅等提出检测Ｆｅｎ—ｔｏｎ反应产生羟自由基的方法。羟自由基与吖啶红发生反应后，吖啶红的荧光强度减弱，测定其荧光强度的变化，可问接测定羟自由基的产生量［ｚ５１。２．１．２荧光增强的捕获剂
生羟自由基模型，根据羟基苯甲酸的荧光大小对比研究了亚硝酸钠、槲皮素和红色素对羟自由基的清除能力。结果表明：高粱红色素、亚硝酸钠、槲皮素对ＯＨ・自由基的清除能力呈一定的量效关系，亚硝酸钠、槲皮素优于红色素对羟
黄嘌呤氧化酶浓度为４×１０１越・ｎ１Ｌ一１，反应时间在２～７
ｍｉｎ时，可得到最佳测定条件［１”。
化［１８１、没食子酸自氧化Ｌ１９Ｊ、６一羟多巴胺自氧化、肾上腺素氧化法Ｌ２０ｊ和羟胺氧化法等。其中邻苯三酚自氧化是最经典的方法，但其机理十分复杂。没食子酸自氧化的测定受ｐＨ与没食子酸的浓度影响较显著，所以测定时要严格控制ｐＨ且要准确配制规定浓度的没食子酸溶液。此外样品中的其他低分子量氧化还原性物质也会直接与（）２
影响测定结果的准确性。６一羟多巴胺自氧化的优点是可在生理ｐＨ值（ｐＨ化的线性区间非常有限，而且ＯＨ・和Ｑ一・都可以使６一羟多巴胺自氧化，因此测定的专一性不高。肾上腺素氧化法以肾上腺素氧化为肾上腺素红作为（）２一・生成的指标。测定
３１０
自由基的清除能力。探讨了红色素、槲皮素、亚硝酸钠的猝
灭机理，表明红色素、亚硝酸钠为动态猝灭，槲皮素为静态猝灭过程‘２６］。谷学新等利用Ｆｅｎｔｏｎ反应产生的羟基自由基氧化ＤＭＳ０生成的甲醛与乙酰丙酮、氨发生Ｈａｎｔｚｓｅｈ反应，产物３，５－Ｚ．乙酰一１，４－－－氢吡啶产生特征荧光，其最大
含量。该法操作简便，而且灵敏度可以设法增加，但干扰因素较多。在羟胺氧化法中．０２一・可氧化羟胺生成亚硝酸根，
第４期
光谱学与光谱分析
激发波长和最大发射波长分别为４１９．４和５０５．５ｎｎ］。通过测定荧光强度的变化可以间接定量测定羟基自由基的产生量‘２７１。
２．２荧光探针法
随着科学技术的发展，目前在自由基的研究领域中很多情况下需要测定细胞内自由基的含量，应用荧光探针法便可以达到这一目的。荧光探针法测定技术的核心是荧光探针，探针本身应该没有荧光或只有很弱的荧光，能很容易通过细胞膜，但在细胞或细胞器内被自由基氧化后发出较强的荧光。此法的优点是操作简便、快速、方便且重复性好，可在单细胞水平对细胞内活性氧进行定位定量的动态监测，因此这一方法最近发展最为迅速。但该方法目前尚未完全成熟及标准化，所使用的设备较为昂贵。
常用的荧光探针有２，７－－－氯荧光黄乙酰乙酸（２，７－ｄｉ－
ｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏ－ｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＤＣＦ－ＤＡ）、双氢罗丹明
１２３（ＤＨＲ）、二氢乙锭（ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｎｅ，ＨＥ）等。ＤＣＦ－ＤＡ具有亲脂性，很容易通过细胞膜，进入细胞后在细胞内脂酶
的作用下脱去乙酸盐基团成为有极性的Ⅸ：ＦＨ，但ＤＣＦＨ
不产生荧光，细胞胞浆中的氧化物能够氧化ＩＸ３ＦＨ为能发出很强荧光的２，７－－＂氯荧光素（ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ＤＣＦ），ＤＣＦ形成量与细胞氧化物水平成正比例关系，因此，其荧光强度间接代表细胞内过氧化物的水平。研究表明，ＩＸ；Ｆ－ＤＡ探针可被多种活性氧如（）２一・、０Ｈ・、过氧化亚硝基等氧化形成ＤＣＦ，因此ＤＣＦ的荧光强度应是细胞内活性氧产生的总体状况的反映。ＨＥ能自由透入细胞内被０２一・直接氧化成溴化乙锭（ＥＢ），ＥＢ的荧光强度与（）２一・浓度成正比，从而间接反映（）２一・的含量。Ｃａｔｔｅｒ等（ＣａｔｔｅｒＷ
０，ｅｔ
ａ１．Ｊ．Ｌｃｕｋｏｅ．Ｂｉ０１．，１９９４，５５（２）：２５３．）用ＨＥ作探针测得的结果表征０２一・的含量。使用ＤＣＦＨ－ＤＡ与ＤＨＲ时，仪器的激发波长４８８ｎｌｎ，发射波长在５２５或５３０ｎｌｎ左右；使用ＨＥ时，仪器的激发波长４８８ｎｌＴＩ，发射波长在６１０或
６５０
ｎ／ｎ左右。测胞浆内自由基，往往用ＤＣＦＨ—ＤＡ探针；而
测线粒体内的自由基，则常用ＤＨＲ作荧光探针［２８。。
Ｔａｎｇ等合成了用于（）２一・识别的新型荧光探针试剂２一吡啶甲醛苯并噻唑啉，该探针试剂只能被（）２一・氧化，而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在测定波长下的荧光发生变化，所以探针试剂对Ｑ一・具有专一性，由此建立了流动注射荧光法测定０２一・的方法［２９。。之后他们又合成了新的荧光探针试剂香草醛缩－８－氨基喹啉，建立了新的测定０２～・的方法，并用于一串红植物衰老过程中０２一・产生速率的测定［３０］。
荧光探针法的实际操作中，应注意以下几个问题：（１）探针在水溶液中易水解，应用无水乙醇或ＤＭＳＯ配制，４℃保存，１周内使用；（２）荧光探针在光线的照射下易被氧化。另外，还受孵育温度的影响，所以染色时需要３７℃避光孵育。样品应在染色２ｈ内上机检测，避免荧光减弱，影响实验结果；（３）细胞与探针的孵育时间必需足够，因为细胞内自由基的绝对水平很低，孵育时间过短很难显示出不同细胞间自由基水平的差异；（４）实验中应设立阴性对照，以避免细胞自身荧光对实验结果的干扰；（５）细胞应保持良好的
活性状态，贴壁细胞在消化处理时要尽量温和、快速。ＰＢＳ漂洗时间不必过长，以保持细胞活性，并且保证细胞内游离探针有一定的浓度。
３化学发光技术
化学发光测定法是仪器分析中灵敏度最高的方法之一，已在医学、环境以及工业分析等许多领域里得到广泛的应用‘ｓ¨。自由基的化学发光研究也是自由基测定法研究领域中比较活跃的分支之一。化学发光的原理是从一个化学反应（一般是氧化反应）中获得能量，使反应物或产物分子的电子激发，形成电子激发态，当返回基态时，以发射光子的形式释放能量，这一过程称为化学发光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，
ＣＬ）。
常利用化学发光技术间接检测食品、药品以及生物制剂中自由基清除剂，评价它们的抗氧化能力。其优势是利用了发光试剂与自由基反应后能直接发光的原理，根据光强度，确定自由基的含量。
最常用的发光试剂为鲁米诺（Ｌｕｍｉｎ０１），鲁米诺在碱性溶液中（ｐＨ１０左右），首先形成单价阴离子，然后在催化剂，如酶，Ｆｅｚ十，Ｃｏｚ＋，Ｎｉ２＋和Ｃｕ２十等过渡金属离子或者金属络合物的催化下与溶液中的溶解氧或者过氧化氢发生氧化还原反应，生成激发态的两价阴离子氨基肽酸盐（ＡＰＤ），ＡＰＤ经非辐射性跃迁回到基态时。放出光子。检测光的强度就可以确定自由基含量。Ｚｈａｏ等以Ｌｕｍｉｎｏｌ为发光试剂，检测茶叶中的茶色素清除超氧自由基与羟基自由基的能力，并将其清除能力与茶多酚进行比较。研究表明，茶色素清除（）２一・和ＯＨ・的半数清除浓度达到０．０８和０．００３ｍｇ・ｍＥ－１，其清除能力以及动力学过程与茶多酚相似［３２。。
自从Ａｌｂｒｅｃｈｔ报道了鲁米诺的化学发光现象以来∞３。，直到今天鲁米诺的化学发光反应机理仍然没有得到令人满意的阐释。近年来，有研究者在研究金属过氧化物的化学发光时发现，在不存在任何催化剂的条件下，向ＢａＯ或者ＭｇＯ固体粉末中注入鲁米诺溶液，仍然可以观察到很强的发光现象Ｌ３“，这一发现已被应用于以鲁米诺衍生物ＡＢＥｌ作为标记物的化学发光柱后测定法［３引。利用固一液非均相化学发光体系，在弱酸性或者非缓冲介质条件下，同样能够观
察到鲁米诺与过氧化氢的发光现象。这些结果表明，鲁米诺
发光与否与鲁米诺溶液的酸碱度似乎没有直接的关系，介质的酸碱度只会影响激发态ＡＰＤ的发光强度和发光波长，发光与否更多地取决于活性氧的生成条件【３引，所以从理论上来说，鲁米诺化学发光法可以应用于各种不同介质中０２一・和０Ｈ・的测定，但同时这就导致了测定选择性差的问题。
另一种较常用的发光试剂是光泽精（Ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ），在发现鲁米诺化学发光后不久，Ｇｌｅｕ等首次报道了光泽精化学发光‘３７］。在碱性条件下，光泽精与（】２一・等过氧化物作用形成激发态Ｎ－甲基吖啶（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄａｎ）。利用光泽精化学发光法也可检测细胞线粒体内特定种类的自由基：光泽精通过其本身的正电荷与线粒体内膜上负电荷之间的作用
１０９６
光谱学与光谱分析
第２９卷
通过线粒体膜线粒体内膜后首先被还原成单价光泽精自由基，然后光泽精自由基与０２一・反应生成不稳定的中间物并分解出激发态分子，激发态分子跃迁到基态的过程中释放光子，通过微弱发光仪测定发光强度，以此间接测定（】２一・的生成及数量。相比之下，光泽精对于自由基测定的选择性较高，有许多报道光泽精只有在超氧活性自由基存在下才发生发光现象。但是在实际应用中，ＨｚＱ的分解过程同样会产生（＿）２一・自由基，可能会影响结果的准确性。
还有一类特殊的化学发光试剂，化学名称为２－ｍｅｔｈｙｌ一６－ｐｈｅｎｙｌ一３，７－ｄｉｈｙｄｒｏｉｍｉｄａｚｏ－［１，２－ａ］ｐｙｒａｚｉｎ－３－ｏｎｅ，简称
ＣＬＡ，早先是由Ｓｕｇｉｕｒａ等合成Ｌ３８ｊ的。ＣＩＡ的特点是不与生物机体内的Ｈｚ０２或者ｏＨ・发生反应，只与咙・发生
特异性的化学发光反应，发光波长为３８０ｎｍ［３９］。Ｏｓｍａｎ等在ＣＬＡ化学发光系统中加入吐温２０，在０．６％（ｐ）的浓度时，ＣＬＡ的发光强度增加了２．７倍，使检测黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶体系产生０２一・的灵敏度提高到ｎｍｏｌ・Ｌ１［４…。Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ等还开发了ＣＬＡ的衍生物ＭＣＬＡ和ＦＣＬＡＥ４ｌＪ，Ｎａｋａｎｏ和Ｆｕｊｉｍｏｒｉ等对这一类试剂的化学发光机理和反应动力学作了详细的研究，报道了ＣＩ。Ａ和ＭＣＬＡ与活性氧的化学反应机理Ｌ４２“引。ＦＣＬＡ是目前化学发光试剂中发光波长（５３２ｎｍ）最长的试剂，发光效率比ＣＩ．Ａ高出近１０倍，由于这一特点，在进行生物样品中０２一・测定时，能够有效地降低酶、ＯＨ・等干扰物质的影响。
其他用于检测自由基的化学发光试剂还有ＰｈｏｌａｓｉｎＥ“］和Ｌｕｍｉｎｏｌ类似物等Ｌ４５“６｜。
２０世纪６０年代发展的电子顺磁共振（ｅｌｅｃｔｒｏｎｐａｒａｍａｇ—
ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＰＲ）（也称电子白旋共振（ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｓｐｉｎ
Ｙｅｓ—
对于亚硝基类化合物，被捕集的自由基直接加到亚硝“等利用了ＭＮＰ的这一优点，通过ＥＰＲ检测ＭＮＰ自捕集所产生的自由基的超精细耦合常数的改变，研究了硝酮类自旋捕集剂主要有ＤＭＰＯ和ＰＢＮ，自由基加在卜灶０＋《——Ｒ＿Ｎ＿０
Ｒ
（ａ）亚硝基类
。
。
＞一ｋ一
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一
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黾
‘‘
（ｂ）硝酮类
Ｆｉｇ．１
Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｓｏｆｔｒａｐｐｉｎｇｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓ
ｏｆ刚ｎ
ｔｒａｐｓ【蜘
ＤＭＰＯ具有良好的水溶性，利于实验操作和溶液配制，更重要的是ＤＭＰＯ与（）２一・和ＯＨ・反应后，所测定到的ＥＳＲ谱图有明显的差别，能够快速地鉴别出（）２一・和ＯＨ・。但是这个方法也存在着它的不足之处，与（）２一・形成的自由基附加生成物ＤＭＰＯ－ＯＯＨ在生理条件下，会逐渐地转变为与ＯＨ・的自由基附加生成物ＤＭＰＯ－ＯＨ类似的ＥＳＲ信号，使得（）２一・和ＯＨ・的判断成为困难，Ｋｏｈｎｏ等采用向测定体系中添加ＤＭＳＯ的方法良好地解决了这一问题［４８］。Ｈｏｊｏ等以ＤＭＰＯ作为体内ＯＨ・捕集剂，用ＥＳＲ自旋捕集技术间接检测小鼠血液中的体内ＯＨ・［４９３。Ｒｏｕｂａｎｄ等报道一种新的ＤＭＰＯ的衍生物，ＤＥＰＭＯ这一试剂可与０２一・形成稳定的自由基附加生成物（半衰期约１５ｍｉｎ），这种生成物具有特征性的１２个峰的ＥＳＲ信号，易于定性判
断嘲。
Ｒｈｏｄｅｓ等以ＰＢＮ为甲基自由基的捕获剂，检测一系列常数Ｌ５１ｊ。当所要研究的自由基为羟自由基时，由于羟自由的甲基自由基，然后再用自旋捕集剂捕获甲基自由基，并用ＥＰＲ技术进行研究。Ｔａｋｅｓｈｉｔａ等用ＤＭＳＯ来捕获大鼠体内获甲基自由基，通过ＥＰＲ间接检测了羟自由基的含量，该自由基不能用ＥＰＲ检测Ｌ５３｜。
自旋捕集技术的局限性是：有些自旋捕获剂对生物体随着自由基在生物体系中研究的不断深入，人们更需ｓｐｉｎ
ｒｅｓｏｎａｎｃｅ
ｉｍａｇｉｎｇ，ＥｓＲｌ）应
维生素Ｅ型的抗氧化剂与自旋捕集剂竞争甲基自由基的反应，快速测定了不同物质的活性大小以及与自由基的结合基极不稳定，因此通常用ＤＭＳＯ来捕获它产生一种较稳定通过ｘ＿射线产生的羟自由基，生成甲基自由基，以ＰＢＮ捕结果为研究人类受辐射伤害的程度提供了一定的参考Ｌ５２。。过去大多数研究认为ＤＭＳＯ被自由基氧化只生成了一种更稳定的甲基自由基，但是Ｑｉａｎ等的研究表明。甲基自由基不是ＤＭＳＯ被氧化产生的唯一的碳自由基，除了・ＣＨ３，还有・０ＣＨ。，・ＣＨ２（）Ｈ和・ＣＨ２Ｓ（（））ＣＨｓ，只是后几种有毒，有些易受到血脑屏障限制，无法到达自由基生成的组织部位；捕集产物不稳定，寿命不长（只有几分钟到几十分钟），易被猝灭，必须在捕获自由基后立即对其检测；被捕获的自由基不专一，ＥＳＲ信号随时问衰减不稳定，噪声干扰严重。
４．２电子自旋共振成像
要了解自由基在生物组织、器官中的空间分布信息，电子自旋共振成像技术（ｅｌｅｃｔｒｏｎ
４电子自旋共振
４．１自旋捕集
ｎｅｔｉｃ
ｏｎａｎｅｅ，ＥＳＲ））技术在光化学、电化学、高聚物、核辐射以及生物学领域中已得到广泛的应用。其检测自由基的原理
是用某一反磁性化合物——自旋捕捉剂与不稳定的自由基
反应产生一种相对稳定的可用ＥＰＲ检测的自由基，一般称之为自旋加合物，利用自旋加合物的ＥＰＲ常数来研究自由基的电子结构。常用的自旋捕集剂为氮氧化合物，主要为亚硝基类和硝酮类。
基的氮上［见图１（ａ）］。所形成的自旋加合物的ＥＰＲ谱可以反映被捕自由基的超精细结构，对鉴别被捕自由基十分有利。常用的捕集剂是２一甲基一２一亚硝丁烷（ＭＮＰ）。
对一叔丁基环芳烃与自由基相互作用的情况。此类捕集剂存在的缺点是对热和光不稳定，并容易二聚而失去捕集作用。而且以（）为中心的自旋加合物极不稳定‘４７］。
捕集剂的碳原子上形成加合物［见图ｌ（ｂ）］。
第４期
光谱学与光谱分析
１０９７
运而生。根据成像的方式不同可分为：三维（３Ｄ）梯度磁场法、扫描ＥＰＲ显微镜法、轴向检测ＥＰＲ法和双共振成像法。
利用３Ｄ－ＥＰＲＩ技术，以ＴＰＩ。氮氧自由基为标记物，可清晰地获得自由基浓度随主动脉血管距心脏间的距离增加而减弱，对心脏的分辨率可达到亚毫米水平［５“。Ｓｈｉｎ－ｉｃｈｉ等给大鼠腹腔内注射一种稳定的氮氧自由基一３一氨甲酰基一２，２，５，５－四甲基一ｌ一氧一吡咯啶（氨甲酰基－ＰＲＯＸＹＩ。），在大鼠脑部获得一个持续的自由基信号，然后将大鼠头部置于ＥＳ－ＲＩ系统的谐振腔中，通过磁场扫描，获得了大鼠脑部的３Ｄ切片ＥＳＲＩ图像［ｓｓ３。Ｔｏｇａｓｈｉ等对大鼠尾静脉注射氨甲酰基一ＰＲＯＸＹＬ，利用ＥＳＲＩ系统观察了大鼠腹腔氨甲酰基一ＰＲ（）ＸＹＬ分布的２Ｄ和３Ｄ图像。在此基础上，通过ＣＣＩＡ诱导肝损伤，使氨甲酰基一ＰＲＯＸＹＩ。的代谢速率降低，又成功获得了活体大鼠肝脏的２Ｄ和３Ｄ图像口引。Ｍａｓｕｍｉｚｕ等用氮氧自由基溶剂给大鼠灌胃，观察到这种自由基首先到达胃部，然后被转运到肝、肾和心脏的动态图像【５引。另外Ｐａｎａｇｉｏｔｅｌｉｓ等利用射频轴向ＥＳＲＩ技术观察了肝、肾、膀胱等不同组织的氧分布图像［５引。ＥＳＲＩ不仅可以观察自由基在组织的空间分布，还可以观察自旋标记物在组织中的代谢情况。如Ｓａｎｏ等采用该技术研究小鼠静脉注射不同结构的亲脂性氮氧自旋探针，获得了不同结构化合物透过血脑屏障的速度与规律，从而为活体动态研究脑组织中的自由基或药物代谢提供了新途径。
尽管ＥＳＲＩ技术在生物医学领域中应用已有诸多报道，
参
１Ｉ＝ｌ
基于其成像原理和技术本身特点，仍有许多不利因素限制了ＥＳＲＩ的应用。比如，样本自由基的谱线较宽，为达到一定的分辨率所需的梯度场强度高；生物体内含有各向异性的顺磁性物质，从不同方向进行磁场扫描时所获得的谱线易发生偏移；由于电子与原子核的相互作用，易产生超精细结构的ＥＳＲ谱线等。但这些困难必然随着人们研究的深入而逐步被克服，其发展前景非常广阔。
５展望
自由基研究已经与许多研究领域结合在一起。在食品科学领域，自由基研究可为食品中的抗氧化成分及其作用机理的研究提供有价值的参考，筛选抗氧化剂；在医学领域，生物机体的某些疾病与自由基密切相关，研究自由基的
产生、消亡过程可以进一步探讨疾病的发生原理，从而为疾
病诊断治疗提供理论依据；在药学领域，研究药物与自由基的相互作用、动力学过程，可为新药物的开发提供理论基础；在环境科学领域，能够利用自由基的强氧化性来实现环境中有机物的降解、转化等过程，为治理环境污染提供了一条新途径。然而从以上介绍的各种方法来看。能够直接测定自由基的方法相当有限，且到目前为止化学反应法和捕获法的分析选择性和可信度还难以令人满意。因而迫切需要开发高灵敏度、高选择性的自由基测定方法，特别是体内自由基的测定，对于解释生命机体的各种生理、病状等有着重要的意义。
考文
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第４期光谱学与光谱分析
１０９９
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１０００８３，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
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ｆｏｒｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｃｅｌｌｓｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓ．ＴｈｅｒｅｉＳｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒ
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ｒａｄｉｃａｌ；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
Ｒｅｖｉｅｗ
（ＲｅｃｅｉｖｅｄＮｏｖ．２８，２００７；ａｃｃｅｐｔｅｄＭａｒ．６，２００８）
＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ａｕｔｈｏｒ
敬告读者——《光谱学与光谱分析》已全文上网
从２００８年第７期开始在《光谱学与光谱分析》网站（ｗｗｗ．ｇｐｘｙｇｐｆｘ．ｃｏｍ）“在线期刊’’栏内发布《光谱学与光谱分析》期刊全文，读者可方便地免费下载摘要和ＰＤＦ全文，欢迎浏览、检索本刊＂－３期的全部内容；并陆续刊出自２００６年以后出版的各期摘要和ＰＤＦ全文内容。２００９年起《光谱学与光谱分析》每期出版日期改为每月１日。
光谱学与光谱分析期刊社
羟基和超氧自由基的检测研究进展
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
张昊， 任发政， ZHANG Hao， REN Fa-zheng
中国农业大学食品科学与营养工程学院,教育部-北京市功能乳品实验室,北京,100083光谱学与光谱分析
SPECTROSCOPY AND SPECTRAL ANALYSIS2009，29(4)1次
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2.期刊论文 赫春香. 王杨. 曹璨. 王世盛. HE Chun-xiang. WANG Yang. CAO Can. WANG Shi-sheng 荧光动力学分析法测定5种(口山)酮清除超氧自由基和羟基自由基的活性 -高师理科学刊2005,25(4)
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皮肤衰老与自由基有着密切关系.利用邻苯三酚自氧化产生超氧自由基(O-2), Fenton 反应产生羟基自由基(-OH);以比色法测定了一些天然提取物对这二种自由基的清除作用.结果表明;这些提取物大都具有清除作用,其中以芦丁、槲皮素、黄芪总黄酮较强.
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结果发现：在Fenton试剂降解PCE/TCE DNAPLs的反应中，不仅产生羟基自由基，还产生超氧自由基，并以羟基自由基的贡献为主，羟基自由基的产生与否与氧化剂量的多少没有必然联系；采用气相色谱法，分析比较反应30 min时降解反应与挥发溶解实验中PCE剩余量，计算得出，除催化剂与氧化剂浓度皆很低及与PCE的配比很小的情况外，Fenton试剂可以直接降解非水相的PCE。
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1.同一反应时间时，20、40和60℃的环境温度中，从降解效果和经济上考虑，40℃时为最佳反应温度。
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第三，首次在反应体系中添加非离子表面活性剂曲拉通(TX100)或阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，构成表面活性剂-Fenton体系，对PCEDNAPL的降解进行了探讨。 结果发现：
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2.表面活性剂的添加量及反应初始浓度与该体系的降解效果成反向关系，在表面活性剂少量且反应初始浓度较低时，该体系的降解效果更好。 3.系统温度在0～60℃时，与非离子表面活性剂-Fenton体系的降解效果成反比关系：系统温度在4～38℃时，与阴离子表面活性剂-Fenton体系的降解效果成反比关系。
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通过Eschweiler Clarke反应得到N,N-二甲基壳聚糖中间体.然后与碘甲烷反应生成水溶性的壳聚糖季铵盐:N,N,N-三甲基壳聚糖碘化铵(TMCI).检测三种不同取代度的季铵盐产品对羟基自由基(·OH)、超氧自由基(O2-·)的清除率.结果发现:取代度为33.9%时,对·OH的最大清除率为40.2%,对O2-·的最大抑制率为65.6%.并且季铵盐产品对两种自由基的清除率都随着取代度的增大而减小,取代度为80.3%的产品对这两种自由基几乎无清除作用.
8.学位论文 李加冕 杯芳烃衍生物的合成与性质研究 2006
本文合成了5种杯[4]芳烃下缘修饰的衍生物，其中3种属新化合物。L1和L2属于羧酸类杯[4]芳烃衍生物，已见文献报道，但没有任何相关性质研究。L3、L4、L5属于下缘氮杂杯[4]芳烃衍生物，未见文献报道，特别是L3、L4更属于杯芳冠醚类衍生物。五种化合物都经过熔点、红外光谱、核磁氢谱、元素分析进行了表征。本论文的目的在于研究这五种化合物的体外抗氧化生物活性、自组装作用和对金属离子及有机小分子的分子识别、超分子相互作用的能力。
在体外抗氧化生物活性方面，主要研究了L2～L5四种配体样品的抗超氧阴离子自由基、抗自由基诱导红细胞氧化性溶血和抗羟基自由基的活性。研究抗超氧阴离子自由基的时候，分别采取了固定浓度的配体样品随时间变化清除自由基的实验和不同浓度的配体样品在固定反应时间里清除自由基的实验两种实验方法。分别作出吸光度-时间工作曲线和清除率-样品浓度工作曲线，并拟合工作曲线计算出EC50值。通过研究知道它们都具有很好的清除超氧自由基的能力，并且这种清除能力随样品浓度的增加而不断增强。通过它们清除自由基的速率和EC50值的比较，得出它们清除超氧自由基的能力大小为：L4＞L3＞L2＞L5。研究抗自由基诱导红细胞氧化性溶血的时候，分别采取了不同浓度的同一配体的抑制作用比较和同浓度的不同配体的抑制作用的比较两种比较方法。通过做溶血度-时间工作曲线，可以清楚地知道它们都具有一定的抗氧化性溶血的作用，并且随着样品浓度的增加其活性不断增强。最后得出它们抗氧化性溶血的活性强弱为：L4＞L2＞L3＞L5。研究抗羟基自由基的时候，采用了不同浓度的配体样品对自由基的清除作用的实验方法。通过做清除率-样品浓度工作曲线，拟合出回归方程，从而计算得到EC50值。通过研究知道它们都具有非常好的清除羟基自由基的能力，并且随样品浓度的增加而不断增强。最后通过EC50值的比较得出它们清除羟基自由基的能力为：L5＞L3＞L4＞L2。
在分子识别实验方面，利用荧光光谱法分别研究了L1～L5五种配体对各种各样金属离子的荧光识别作用。发现它们对金属离子的识别是不受金属盐的酸根离子干扰的。通过荧光滴定实验，可以计算出它们对可识别的金属离子的相互作用稳定常数K值，并判断它们的荧光猝灭是静态的还是动态的。与此同时，还通过化学软件hyperchem，优化了L1～L5五种配体的能量最低时采取的结构构型，并且从理论上模拟了L1～L5与它们可以识别的金属离子的配位模式构型，计算了它们配位的单点能，通过单点能的比较，从理论上验证了它们与金属离子相互作用的强弱。L1可以选择性地识别Fe3+、Cr3+、Co2+，K(Fe3+)=1.44×104M-1，K(Cr3+)=3.17×103M-1。L2可以选择性地识别Fe3+、Ce3+、Al3+、Cu2+，K(Fe3+)=7.58×104M-1，(Al3+)=7.10×103M-1，K(Cu2+)=4.47×103M-1,K(Ce3+)=3.08×104M-1。L3可以选择性地识别Fe3+、Cu2+，K(Fe3+)=2.46×104M-1，K(Cu2+)=9.52×103M-1。L4可以选择性地识别Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Ru3+，K(Fe3+)=1.1×106M-1，K(Ru3+)=1.26×104M-1，K(Co2+)=6.79×103M-1，K(Cu2+)=1.17×104M-1。L5可以选择性地识别Fe3+、Cr2+、Cu2+，K(Cu2+)=3.11×104M-1，K(Fe3+)=3.4×104M-1，K(Cr3+)=1.61×104M-1。
在晶体自组装方面，培养了L1和L3的单晶，通过X射线衍射实验研究了L1和L3的晶体结构。主要发现两个配体分子晶体中都存在着CH/π相互作用，而且这种相互作用在形成超分子晶体结构方面起着相当重要的作用。
最后通过目前最新的应用比较少的核磁共振扩散实验，通过测定L1、L3、L5三种主体大分子与各种有机客体小分子在溶液中的扩散系数D的变化，从原子水平研究了它们与有机小分子之间的主客体的超分子作用。并且通过得到的D值，可以方便计算出它们与客体小分子相互作用的稳定常数Ka。通过Ka比较了它们与客体小分子相互作用的强弱。
9.期刊论文 赫春香. 张淑敏. 周丹红. 王杨. 王世盛 当药醇甙的伏安行为及其抗氧活性研究 -辽宁师范大学学报(自
然科学版)2003,26(2)
研究了当药醇甙的极谱伏安特性及其清除超氧自由基(O-2@)及羟基自由基(@OH)的作用.在磷酸盐缓冲溶液(pH=8.2)中,当药醇甙有一个不可逆吸附还原波,峰电位为-1.61 V(Vs.SCE),有2个电子和2个质子参与了此电极反应.采用经典邻苯三酚自氧化法及Fenton法试验,表明当药醇甙对O-2@及@OH有明显的抑制作用,50%抑制率时当药醇甙的用量分别为12.8和0.22mg@L-1.
10.学位论文 李燕华 黄酮类希夫碱配合物的合成、表征、抗氧化活性以及与DNA结合的研究 2006
本文主要报道了具有生物活性的黄酮类希夫碱及其金属配合物的合成、表征及抗氧化活性和与DNA结合的性质研究。很多黄酮类希夫碱及其配合物具有良好的抗癌性、抗菌性及抗氧化性方面性质，使其在生物学和医药学方面具有重要的意义。基于我们小组研究希夫碱及其配合物在清除超氧自由基和羟基自由基方面的前期工作，本论文设计合成柚皮素(苯甲酰基)腙及其过渡金属配合物和色酮(苯甲酰基)腙及其稀土配合物，用元素分析、摩尔电导、差热分析、红外和核磁共振对其结构进行分析表征，测定其在清除超氧自由基和羟基自由基方面的活性，并研究其与DNA作用方式。
第一章，介绍了希夫碱配合物和黄酮类化合物的发展，对它们的抗氧化活性及与DNA结合等生物活性的原理及进展进行了系统地论述。
第二章中设计合成柚皮素(苯甲酰基)腙(H3L)及其过渡金属配合物，并用元素分析、质谱、摩尔电导、差热分析、红外和核磁共振对其结构进行分析表征。推测配合物的结构MHL·nH2O(M=CuandZn，n=1)和NiH2LOAc·3.5H2O。使用721分光光度计法测定了配体及配合物清除超氧自由基和羟基自由基的能力，并计算其清除率，结果表明，相比较于配体，金属配合物清除超氧自由基和羟基自由基的能力较为强些。
第三章对柚皮素(苯甲酰基)腙及其过渡金属配合物和配体PMBPH及La配合物与小牛胸DNA(ctDNA)的相互作用方式进行了研究。结果表明所研究化合物与ctDNA的作用方式均为插入作用，但金属配合物与ctDNA的结合亲合力明显高于配体。
第四章中设计合成色酮(苯甲酰基)腙及其稀土配合物。由于时间关系，配体和配合物的表征都不完善。
引证文献(1条)
1. 熊何健. 庞杰. 谢主兴 太子参提取物体外抗氧化活性研究[期刊论文]-南开大学学报（自然科学版） 2009(6)
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