氨基酸和生物资源 2005, 27(4) :48～49
Am ino Acids &B iotic R esources
通过改变代谢途径选育谷氨酸生产菌株
周 盛, 李家洲, 武波
1
1
2
(1. 广西玉林师范学院化生系广西玉林5370002. 广西大学生命科学院530004)
摘要:经化学诱变, 通过改变谷氨酸棒杆菌B1的代谢途径, 筛选出以甘油, 琥珀酰CoA 和乙醛酸为碳源的营养缺陷型, 该突变菌株B4的产酸率和转化率分别比出发菌株高18. 1%和12. 7%。
关键词:代谢途径; 诱变育种; 谷氨酸中图分类号:Q591
文献标识码:A
[1]
文章编号:1006-8376(2005) 04-0048-02
依据对谷氨酸生物合成途径的研究, 选育营
养突变型菌株可有效提高谷氨酸生物合成的能力, 提高产酸率。营养缺陷型突变型菌株选育是通过诱发突变, 阻断或弱化一些有关途径, 以利谷氨酸的有效积累。谷氨酸的合成
[2]
亚硝基胍(NTG ) 西德进口; 亚硝基甲基脲(NMU ) 西德进口; 其它试剂均为国产化学纯试剂。1. 3仪器
72型分光光度计测定分光光度值; 台式离心机80-1型上海手术器械厂; 150r ・m in
-如图
1:
, 冲程. 6. 1葡萄糖0. 1%, 牛肉膏1. 0%, 蛋白胨1. 0%, 氯化钠0. 5%, 琼脂2. 0%。1. 4. 2 基本培养基
(HH 4) 2S O 41g, K 2HP O 410. 5g, KH 2P O 44. 5g, 柠檬酸钠0. 5g, 葡萄糖5g, MgS O 4・7H 2O 0. 1g, 琼脂15～20g, 蒸馏水加至1000mL 1. 4. 3 筛选培养基
图1 谷氨酸生物合成途径
基本培养基+乙醛酸+甘油+琥珀酰CoA 1. 4. 4 摇瓶发酵培养基/g ・L
-1
当微生物细胞中因某种理化因素诱变阻断了α-酮戊二酸到琥珀酰CoA 和乙醛酸两条代谢途径
时
[3]
淀粉水解糖160, 磷酸二氢钾1. 6, 硫酸镁1, 硫酸锰2×10
-3
, 微生物的三羧酸循环只能沿着谷氨酸代谢方
向合成, 但当细胞内的谷氨酸量过多时, 将会反馈抑制E MP 途径中从葡萄糖到丙酮酸的关键酶1-磷酸果糖酶活性, 故必须通过诱变, 筛选到一个细胞渗漏型的营养缺陷型。让谷氨酸有效外漏, 解除其对1-磷酸果糖激酶的抑制。1 材料和方法1. 1 菌种
, 甘蔗糖蜜2. 3, pH7. 0
1. 5 生长曲线
为控制种龄, 获得生长旺盛的细胞, 对B1的生长曲线进行测定如图2。从图2以看出, B1的对数生长期为3～7h 。选用培养6h 的菌体制成悬浮液进行诱变。1. 6 诱变方法
收集在液体培养基中培养了6h 的菌体, 用灭菌生理盐水洗涤一次。菌体经玻璃分散(振荡15m in ) , 生理盐水洗涤后, 用pH 为7. 0的磷酸缓冲液制成10
8
谷氨酸棒杆菌B1从上海工业微生物所购买。1. 2 试剂
收稿日期:2005-09-15
作者简介:周盛, 男(1972-) 讲师, E -mail; zhousheng1234@t o m . co m . 基金来源:广西玉林师范院校重点科研项目(项目编号05Z DHS03) 资助.
个/mL的菌悬液。取菌悬液5mL 加入至15mm ×150mm 的无菌试管中, 加入0. 5%NTG+0. 5%NMU 的稀
释液振荡10m in, 20m in, 30m in, 40m in, 50m in, 60m in 致死曲线如图3。由图3致死曲线可以看出当处理时
周 盛等:通过改变代谢途径选育谷氨酸生产菌株
・49・
间在40m in 时,B1致死率达80%, 因此, 正式试验选用
40m in 诱变处理适当稀释后分别涂布于筛选培养基上, 在30℃下培养3d
.
2. 2 摇瓶发酵
B2. B3. B4. B5. B6菌株在相同条件下, 摇床发
酵结果列表1
表1 摇瓶发酵结果
菌号
B2B3B4B5B6
发酵温度/℃初糖/g・L -1产酸/g・L -1转化率/%
[***********][***********][***********][**************]81
图2
谷氨酸棒杆菌生长曲线
从上表摇瓶发酵结果看B4产酸率最高
2. 3 B4和B1发酵比较
在同一条件下对B4和B1进行发酵试验, 将统计平均值列于表2。由表2可以看出, 经诱变筛选得到的营养缺陷型突变株B4比其出发菌株B1提高产酸率18. 1%和转化率12. 7%。该突变菌株由于使用了选择性平板培养基筛选而得, 具有确定的遗传标记, 。
表2发酵对比
B4B1
糖质量分数/%
13. 513. 5
产酸/%
8. 5037. 2
糖转化/%
61. 99555. 01
图3 NTG 和对谷氨酸棒杆菌致死曲线
3 结论
1. 7 测定方法
谷氨酸:瓦勃氏呼吸计测定法
[5]
还原糖:斐林氏滴定;
[4]
α-酮戊二酸向乙醛酸代谢和α-3. 1 通过对B1
;
菌体生长量检测:25倍稀释, 660n m 的吸光度
值。
pH 检测:精密pH 试纸(pH6. 4～8. 0) 2 结果与讨论2. 1 初筛结果
酮戊二酸向琥珀酰CoA 代谢途径进行切断, 同时诱
变出一个甘油渗漏型的突变型, 能有效地让谷氨酸从细胞内外漏。缺陷型菌株B4产酸量有所提高。3. 2 B4营养缺陷型突变株尚待进一步对其发酵工
艺条件进行测定和优化。参考文献
[1] 姚汝华主编《微生物工程工艺原理》
[2] 陈碧娥. 谷氨酸生产菌的选育[J ]华侨大学学报2004[3] 高焕春PG DHL 生化突变型谷氨酸生产菌株选育的生
由平板筛选能在(甘油+乙醛酸+琥珀酰CoA
+基本培养基) 选择培养基上生长菌株有9株, 再经5次传代试验仅有5株B2. B3. B4. B5. B6能稳定传代。
化模式[J ]生物化学杂志1997
[4] 王镜岩等, 生物化学实验指导. [M]人民出版社, 1979[5] D ix on G .. H . and K ornberg H . L . B i oche m J . , 1959, 72(3) .
Breedi n g of M ut ant Stra i n for Glul amate Producti on
by Changi n g ItsM et aboli c Passway
ZHOU Sheng , L I J ia -zhou , WU Bo
1
1
2
氨基酸和生物资源 2005, 27(4) :50～53
Am ino Acids &B iotic R esources
离子交换法与氨基酸的分离纯化
武彩莲, 郭长江
(军事医学科学院卫生学环境医学研究所, 天津300050)
摘要:离子交换法广泛用于氨基酸的分离纯化。文章综述了离子交换法与氨基酸的分离纯化, 包括分离纯化单一氨基酸及对氨基酸混合物进行分组分离纯化。
关键词:离子交换; 氨基酸; 分离纯化中图分类号:0503
文献标识码:A
文章编号:1006-8376(2005) 04-0050-04
氨基酸是组成蛋白质的基本单元, 具有极其重要的生理功能, 广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品工业等领域, 因此, 研究有效的氨基酸分离纯化方法, 对于氨基酸工业的发展是非常必要的。
目前, 用于氨基酸分离纯化的方法有沉淀法、膜分离法、萃取法以及离子交换法等, 其中以离子交换法应用最为广泛。一特性, I 差异, 不同进行分离纯化酸的工业生产中, 例如味精厂采用强酸性阳离子交换树脂对L -谷氨酸阳离子进行选择性吸附, 以使发酵液中影响L -谷氨酸结晶的杂质得以分离; 日本味之素公司研究的氨基酸提纯技术采用逆流多级交换, 可以大大减少树脂用量和洗涤树脂用水[1]
量。由于离子交换法连续分离效率较高, 通常1～2m 的树脂层就相当于数千块塔板, 故是一种高效低耗的单元操作。我们可以根据待处理混合物的特点, 调节混和液的pH, 选用适当的离子交换树脂,
配合相应的交换基团和选择合适的工艺方法, 达到理想的分离纯化效果。本文回顾了有关利用离子交换树脂对氨基酸进行分离纯化的国内外报道, 以供大家参考。1收稿日期:2005-08-18
作者简介:武彩莲, 女(1980-) 硕士研究生。基金来源:天津市科技攻关项目(No . 033182711) 。
L -谷氨酸L -谷氨酸的吸附有抑制作用, 为了减少这种抑制作
[2]
用, Na mpoothiri 等采用Amberlite I R -120阳离子交换树脂对L -谷氨酸进行吸附, 并在吸附前将发酵液的pH 调节为1. 8～2. 0, 这样可使L -谷氨酸与杂质离子得到有效分离, 从而提高了L -谷氨酸的收率。氨基酸在离子交换树脂上的吸附平衡对分
[3]
离纯化氨基酸具有显著的影响。Yoshida 等报道了L -谷氨酸在PE I -CH 弱碱性阴离子交换树脂上的吸附平衡, 认为L -谷氨酸的吸附平衡决定于L -谷氨酸与PE I -CH 树脂上四个不同铵基之间的酸碱中和反应, 并且给出了吸附平衡的热力学方程, 为L -谷氨酸的分离纯化提供了理论依据。H ir oyu 2
[4]
ki 等研究了L -谷氨酸在D I A I O N WA30弱碱性阴离子交换树脂上的吸附平衡, 结果显示, L -谷氨酸的吸附平衡受溶液pH 的影响较大, 而与溶液中L
(1. Guangxiyulin Teachers College, Yulin 537000, China
2. L ife science college of Guangxi un iversity, Guangxi 530004, China )
Abstract:After che m ical mutagenizing , the glula mate -p r oducing bacterial metabolic pass way was changed . The mutant strain B4gre w on the medium with glycer ol, a mber acid and aldehyde acid as carbon s ource was select 2ed . The mutant strain B4showed a gluta mate p r oductivity of 11. 1%higher and a gluta mate /glucose conversi on rate of 8. 7%higher than those of starting strain B1.
Key words:metabolic pass way; che m ical mutagenizing; glula mate
氨基酸和生物资源 2005, 27(4) :48～49
Am ino Acids &B iotic R esources
通过改变代谢途径选育谷氨酸生产菌株
周 盛, 李家洲, 武波
1
1
2
(1. 广西玉林师范学院化生系广西玉林5370002. 广西大学生命科学院530004)
摘要:经化学诱变, 通过改变谷氨酸棒杆菌B1的代谢途径, 筛选出以甘油, 琥珀酰CoA 和乙醛酸为碳源的营养缺陷型, 该突变菌株B4的产酸率和转化率分别比出发菌株高18. 1%和12. 7%。
关键词:代谢途径; 诱变育种; 谷氨酸中图分类号:Q591
文献标识码:A
[1]
文章编号:1006-8376(2005) 04-0048-02
依据对谷氨酸生物合成途径的研究, 选育营
养突变型菌株可有效提高谷氨酸生物合成的能力, 提高产酸率。营养缺陷型突变型菌株选育是通过诱发突变, 阻断或弱化一些有关途径, 以利谷氨酸的有效积累。谷氨酸的合成
[2]
亚硝基胍(NTG ) 西德进口; 亚硝基甲基脲(NMU ) 西德进口; 其它试剂均为国产化学纯试剂。1. 3仪器
72型分光光度计测定分光光度值; 台式离心机80-1型上海手术器械厂; 150r ・m in
-如图
1:
, 冲程. 6. 1葡萄糖0. 1%, 牛肉膏1. 0%, 蛋白胨1. 0%, 氯化钠0. 5%, 琼脂2. 0%。1. 4. 2 基本培养基
(HH 4) 2S O 41g, K 2HP O 410. 5g, KH 2P O 44. 5g, 柠檬酸钠0. 5g, 葡萄糖5g, MgS O 4・7H 2O 0. 1g, 琼脂15～20g, 蒸馏水加至1000mL 1. 4. 3 筛选培养基
图1 谷氨酸生物合成途径
基本培养基+乙醛酸+甘油+琥珀酰CoA 1. 4. 4 摇瓶发酵培养基/g ・L
-1
当微生物细胞中因某种理化因素诱变阻断了α-酮戊二酸到琥珀酰CoA 和乙醛酸两条代谢途径
时
[3]
淀粉水解糖160, 磷酸二氢钾1. 6, 硫酸镁1, 硫酸锰2×10
-3
, 微生物的三羧酸循环只能沿着谷氨酸代谢方
向合成, 但当细胞内的谷氨酸量过多时, 将会反馈抑制E MP 途径中从葡萄糖到丙酮酸的关键酶1-磷酸果糖酶活性, 故必须通过诱变, 筛选到一个细胞渗漏型的营养缺陷型。让谷氨酸有效外漏, 解除其对1-磷酸果糖激酶的抑制。1 材料和方法1. 1 菌种
, 甘蔗糖蜜2. 3, pH7. 0
1. 5 生长曲线
为控制种龄, 获得生长旺盛的细胞, 对B1的生长曲线进行测定如图2。从图2以看出, B1的对数生长期为3～7h 。选用培养6h 的菌体制成悬浮液进行诱变。1. 6 诱变方法
收集在液体培养基中培养了6h 的菌体, 用灭菌生理盐水洗涤一次。菌体经玻璃分散(振荡15m in ) , 生理盐水洗涤后, 用pH 为7. 0的磷酸缓冲液制成10
8
谷氨酸棒杆菌B1从上海工业微生物所购买。1. 2 试剂
收稿日期:2005-09-15
作者简介:周盛, 男(1972-) 讲师, E -mail; zhousheng1234@t o m . co m . 基金来源:广西玉林师范院校重点科研项目(项目编号05Z DHS03) 资助.
个/mL的菌悬液。取菌悬液5mL 加入至15mm ×150mm 的无菌试管中, 加入0. 5%NTG+0. 5%NMU 的稀
释液振荡10m in, 20m in, 30m in, 40m in, 50m in, 60m in 致死曲线如图3。由图3致死曲线可以看出当处理时
周 盛等:通过改变代谢途径选育谷氨酸生产菌株
・49・
间在40m in 时,B1致死率达80%, 因此, 正式试验选用
40m in 诱变处理适当稀释后分别涂布于筛选培养基上, 在30℃下培养3d
.
2. 2 摇瓶发酵
B2. B3. B4. B5. B6菌株在相同条件下, 摇床发
酵结果列表1
表1 摇瓶发酵结果
菌号
B2B3B4B5B6
发酵温度/℃初糖/g・L -1产酸/g・L -1转化率/%
[***********][***********][***********][**************]81
图2
谷氨酸棒杆菌生长曲线
从上表摇瓶发酵结果看B4产酸率最高
2. 3 B4和B1发酵比较
在同一条件下对B4和B1进行发酵试验, 将统计平均值列于表2。由表2可以看出, 经诱变筛选得到的营养缺陷型突变株B4比其出发菌株B1提高产酸率18. 1%和转化率12. 7%。该突变菌株由于使用了选择性平板培养基筛选而得, 具有确定的遗传标记, 。
表2发酵对比
B4B1
糖质量分数/%
13. 513. 5
产酸/%
8. 5037. 2
糖转化/%
61. 99555. 01
图3 NTG 和对谷氨酸棒杆菌致死曲线
3 结论
1. 7 测定方法
谷氨酸:瓦勃氏呼吸计测定法
[5]
还原糖:斐林氏滴定;
[4]
α-酮戊二酸向乙醛酸代谢和α-3. 1 通过对B1
;
菌体生长量检测:25倍稀释, 660n m 的吸光度
值。
pH 检测:精密pH 试纸(pH6. 4～8. 0) 2 结果与讨论2. 1 初筛结果
酮戊二酸向琥珀酰CoA 代谢途径进行切断, 同时诱
变出一个甘油渗漏型的突变型, 能有效地让谷氨酸从细胞内外漏。缺陷型菌株B4产酸量有所提高。3. 2 B4营养缺陷型突变株尚待进一步对其发酵工
艺条件进行测定和优化。参考文献
[1] 姚汝华主编《微生物工程工艺原理》
[2] 陈碧娥. 谷氨酸生产菌的选育[J ]华侨大学学报2004[3] 高焕春PG DHL 生化突变型谷氨酸生产菌株选育的生
由平板筛选能在(甘油+乙醛酸+琥珀酰CoA
+基本培养基) 选择培养基上生长菌株有9株, 再经5次传代试验仅有5株B2. B3. B4. B5. B6能稳定传代。
化模式[J ]生物化学杂志1997
[4] 王镜岩等, 生物化学实验指导. [M]人民出版社, 1979[5] D ix on G .. H . and K ornberg H . L . B i oche m J . , 1959, 72(3) .
Breedi n g of M ut ant Stra i n for Glul amate Producti on
by Changi n g ItsM et aboli c Passway
ZHOU Sheng , L I J ia -zhou , WU Bo
1
1
2
氨基酸和生物资源 2005, 27(4) :50～53
Am ino Acids &B iotic R esources
离子交换法与氨基酸的分离纯化
武彩莲, 郭长江
(军事医学科学院卫生学环境医学研究所, 天津300050)
摘要:离子交换法广泛用于氨基酸的分离纯化。文章综述了离子交换法与氨基酸的分离纯化, 包括分离纯化单一氨基酸及对氨基酸混合物进行分组分离纯化。
关键词:离子交换; 氨基酸; 分离纯化中图分类号:0503
文献标识码:A
文章编号:1006-8376(2005) 04-0050-04
氨基酸是组成蛋白质的基本单元, 具有极其重要的生理功能, 广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品工业等领域, 因此, 研究有效的氨基酸分离纯化方法, 对于氨基酸工业的发展是非常必要的。
目前, 用于氨基酸分离纯化的方法有沉淀法、膜分离法、萃取法以及离子交换法等, 其中以离子交换法应用最为广泛。一特性, I 差异, 不同进行分离纯化酸的工业生产中, 例如味精厂采用强酸性阳离子交换树脂对L -谷氨酸阳离子进行选择性吸附, 以使发酵液中影响L -谷氨酸结晶的杂质得以分离; 日本味之素公司研究的氨基酸提纯技术采用逆流多级交换, 可以大大减少树脂用量和洗涤树脂用水[1]
量。由于离子交换法连续分离效率较高, 通常1～2m 的树脂层就相当于数千块塔板, 故是一种高效低耗的单元操作。我们可以根据待处理混合物的特点, 调节混和液的pH, 选用适当的离子交换树脂,
配合相应的交换基团和选择合适的工艺方法, 达到理想的分离纯化效果。本文回顾了有关利用离子交换树脂对氨基酸进行分离纯化的国内外报道, 以供大家参考。1收稿日期:2005-08-18
作者简介:武彩莲, 女(1980-) 硕士研究生。基金来源:天津市科技攻关项目(No . 033182711) 。
L -谷氨酸L -谷氨酸的吸附有抑制作用, 为了减少这种抑制作
[2]
用, Na mpoothiri 等采用Amberlite I R -120阳离子交换树脂对L -谷氨酸进行吸附, 并在吸附前将发酵液的pH 调节为1. 8～2. 0, 这样可使L -谷氨酸与杂质离子得到有效分离, 从而提高了L -谷氨酸的收率。氨基酸在离子交换树脂上的吸附平衡对分
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离纯化氨基酸具有显著的影响。Yoshida 等报道了L -谷氨酸在PE I -CH 弱碱性阴离子交换树脂上的吸附平衡, 认为L -谷氨酸的吸附平衡决定于L -谷氨酸与PE I -CH 树脂上四个不同铵基之间的酸碱中和反应, 并且给出了吸附平衡的热力学方程, 为L -谷氨酸的分离纯化提供了理论依据。H ir oyu 2
[4]
ki 等研究了L -谷氨酸在D I A I O N WA30弱碱性阴离子交换树脂上的吸附平衡, 结果显示, L -谷氨酸的吸附平衡受溶液pH 的影响较大, 而与溶液中L
(1. Guangxiyulin Teachers College, Yulin 537000, China
2. L ife science college of Guangxi un iversity, Guangxi 530004, China )
Abstract:After che m ical mutagenizing , the glula mate -p r oducing bacterial metabolic pass way was changed . The mutant strain B4gre w on the medium with glycer ol, a mber acid and aldehyde acid as carbon s ource was select 2ed . The mutant strain B4showed a gluta mate p r oductivity of 11. 1%higher and a gluta mate /glucose conversi on rate of 8. 7%higher than those of starting strain B1.
Key words:metabolic pass way; che m ical mutagenizing; glula mate