・144・中华检验医学杂志2004年3月第27卷第3期 Chin J Lab Med ，March 2004，Vol 27，No. 3
・临床实验诊断研究・
内蒙古地区苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测
张军力 孟峻 翟晓萍 方根 高建钢 史珉 王永祥
【摘要】 目的 了解内蒙古地区苯丙酮尿症（PKU ）病人苯丙氨酸羟化酶（PAH ）基因突变类型
和频率。方法 采用聚合酶链反应（PCR ）扩增，单链构象多态性分析（SSCP ）、DNA 直接测序的方法，对内蒙古地区22个PKU 家系PAH 基因外显子3、5、6、7、10、11、12，进行检测分析。结果 检出10种苯丙氨酸羟化酶基因的点突变。R243Q （8/44）、R252Q （1/44）、R261Q （1/44）、G239D （1/44）、IVS7nt （2）（1/44）、Y204C （5/44）、Y356X （6/44）、R413P （1/44）、R111X （1/44）、Y161S （1/44），经检索国际PAH 基因突变数据统计库，确认G239D （G →A ）为首次发现的新突变。结论 R243Q 、Y356X 、Y204C 是内蒙地区人群中PAH 基因的主要突变位点。以Y356X 的突变率明显高于、R413P 低于北方人群为特征。
【关键词】 苯丙酮尿症； 苯丙氨酸羟化酶； 聚合酶链反应； 基因突变
Determination of phenylalanine hydroxylasegene mutation of phenylketonuria in Inner Mongolia ZHANG Jun-li *，MENG Jun ，ZHAI Xiao -ping ，FANG Gen ，GAO Jian-gang ，SHI Min ，WANG Yong-xiang . *
Department of laboratory First Affiliated Hospital Inner Mongolia Medical college ，Huhehaote 010050China 【Abstract 】 Objective To determine gene mutation types and frequency of phenylalanine hydroxylase （PAH ）phenylketonuria （PKU ）patients in Inner Mongolia. Methods Exon 3、5、6、7、10、11. and 12of the phenylalanine hydroxylase （PAH ）gene was detected in 22PKU patients from inner Mongolia by using PCR-single strand conformation polymorphism （PCR-SSCP ）technique and DNA direct
（8/sequencing. Results Ten point mutation type were identified the frequencies of mutation were R243Q
44）、R252Q （1/44）、R261Q （1/44）、G239D （1/44）、IVS7nt （2）（1/44）、Y204C （5/44）、Y356X （6/44）、R413P （1/44）、R111X （1/44）respectively a novel mutation G239D （G →A ）was demonstrated in comparison with the PAH gene mutation Database. Conclusion R243Q 、Y356X 、Y204C were most frequency mutation in Inner Mongolia. The mutation frequency of Y356X is higher ，R413P is lower than Northern people.
【Key Words 】 Phenylketonuria ； Phenylalanine hydroxylase ； Polymerase chain reaction ； Gene mutation
苯丙酮尿症（phenylketonuria ，PKU ）是常染色体隐性遗传病，绝大多数是由苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase ，PAH ）基因点突变导致肝脏PAH 活性降低或丧失所致，而非基因部分缺失。中国人群发病率1/11188，截止到2002年，全世界32个国家报道已发现400多种PAH 基因突变位
［1］点，由于PAH 基因突变在种族、地域分布不同，各
［2，3］
个国家报道均有自己的突变类型、频率等特点，中国PAH 点突变至少存在南方和北方两大基础人
［4］
群的不同分布特点。
国内外研究已证明，PAH 基因全长约100kb ，共包含13个外显子和12个内含子，各个外显子和内含子的长度不同，外显子在57～892bp 之间，内
基金项目：内蒙古自治区卫生厅医药卫生科研基金资助（981118）
作者单位：010050呼和浩特，内蒙古医学院第一附属医院检验科（张军力、孟峻、高建钢、史珉、王永祥）；内蒙古血液中心（翟晓萍、方根）
含子在1～23. 5kb 之间。PAH 基因突变广泛分布在13个外显子（Exon ）和12个内含子（Inteon ）的上、下游非翻译区，根据国际PAH 研究资料，在PAH 基因外显子3、5、6、7、10、11、12的突变发生率高于其他外显子，但我国已报道的中国人群的30余种突变主要分布在外显子3、6、7、11、12。结合国际国内的研究结果，确立本研究内容为PAH 基因外显子
中华检验医学杂志2004年3月第27卷第3期 Chin J Lab Med ，March 2004，Vol 27，No. 3・145・
3、5、6、7、10、11、12共7个外显子及两侧内含子。
对象和方法
1. 对象：22例经典型PKU 患儿均来自我院门诊和住院诊疗患者，有典型的PKU 临床表现，经FeCl 3试验和Guthrie 细菌抑制试验阳性，血液苯丙氨酸浓度>20mg /d ，尿液中生物喋呤测定排除非经典型PKU 而确诊。后均经首都儿科医学研究所，北京中日友好医院验证为经典型PKU 患儿。
规扩增，产物经2%低溶点琼脂糖凝胶电泳分离回测序结果与收，在ABI377自动测序仪上进行测序，PAH 基因序列进行比较。
5. 突变基因的确定：每次不同的外显子SSCP 加阳性样品（PKU 阳性样品由首都儿科医学研究所提供）和正常样品对照，如遇到与阳性样品相同的带型首先进行核心家系重复验证，证实患儿双亲之一具有相同的异常带型，父母样品SSCP 作为家系的内对照。对患儿样品进行两次PCR 反应，分别2. DNA 提取：对已确诊为PKU 的患儿，采集本人及父母、兄弟姐妹新鲜血样或制成干血痂，采用经典的酚/氯仿方法提取DNA ，
放低温冰箱保存备用。3. PCR-SSCP-银染：将提取的DNA 分别进行外显子3、5、6、7、10、11、12的PCR 扩增（表1），PCR 引物由上海博亚公司和北京奥科生物有限公司参照
有关文献设计合成［5（外显子］5，6自己设计）。
表1 PCR 扩增的引物序列及扩增片断大小
扩增外显子引物序列
扩增片段（bp ）
3F 5'GTTAGGTTTTCCTGTTCTGG3' R 5'CTTATGTTGCAAAATTCCTC3' 3005F 5'TCATGGCTTTAGAGCCCCCA3' R 5'TCATGCTGGTATTTTCATCC3' 2616F 5'CCGACTCCCTCTGCTAACCT3' R 5'CAATCCTCCCCCACCTTTCT3' 3267F 5'CTCCTAGTGCCTCTGACTCA3' R 5'ACCAGCCAGCAAATGAACCC3' 29110F 5'CCCAGTCAAGGTGACACATA3' R 5'ACAAATAGGGTTTCAACAAT3' 25611F 5'TGAGAGAAGGGGCACAAATG3' R 5'GTAGACATTGAGTCCACTCT3' 32012
F 5'ATGCCACTGAGAACTCTCTT3' R 5'AGTCTTCGATTACTGAGAAA3'
245 PCR 反应体系25µl ，含DNA 1µmol /µl ，引物
2pmol /µl ，100µmol /L dNTP ，2. 5mmol /LMgCl 2，加1uTaqDNA 聚合酶在热循环仪上进行PCR ，反应条件97℃热变性5min ，94℃30s →55℃30s →72℃1min ，循环30次2%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的PCR 产物。分别取各外显子的PCR 产物与变性载样缓冲液混合，
97℃变性5min ，使目的基因DNA 呈单链状态，在6%～8%非变性聚丙烯酰胺凝胶49:1，含5%甘油）电泳，电泳结束后，取出凝胶用硝酸银染色，分析纪录单链DNA 泳动带型。
4. DNA 测序：对经SSCP 分析时出现与正常对照及阳性对照不同者，重新进行相关PAH 外显子常
测定正链和反链DNA 序列。如突变基因为已知突变，可以作为以后SSCP 的阳性对照，突变位点国内未见报道，为国内报道的新突变。
结
果
1. 应用PCR-SSCP 方法检测22个家系PAH 基因的7个外显子，共检出10种PAH 基因点突变。其中外显子7（Exon7）有5种点突变，R243Q 、R252Q 、R261Q 、IVS7nt （2）、G239D ，而G239D 是新发现的点突变。Exon3、5、6、11和12各检出1种PAH 基因突变位点。Exon10未检出突变位点。
在22例患儿的44条染色体中，有26条发生基因点突变，占突变率基因的59%，其中以R243Q （18. 2%）发生频率最高，Y356X （13. 6%）次主，Y204C （11. 4%）位居第三位，其余7种点突变率相同（2. 2%）（见表2）。
表2 内蒙古地区PAH 基因突变类型及频率
外显子/
突变碱基氨基酸变基内含子类型改变改变因数频率Exon 3R111X C →T Arg →Ter 11/44（0. 022）Exon 5Y161S T →C phe →Ser 11/44（0. 022）Exon 6Y204C A →G phe →Cys 55/44（0. 114）Exon 7
R243Q G →A Arg →Gln 88/44（0. 182）R252Q G →A Arg →Gln 11/44（0. 022）R261Q G →A Arg →Gln 11/44（0. 022）G239D G →A Gly →Asp 11/44（0. 022）IVS7nt2
gt →ga 基因转录异常11/44（0. 022）Exon 11Y356X C →A Tyr →Ter 66/44（0. 136）Exon 12R413P G →C
Arg →Pro
1
1/44（0. 022）
合计
10
2626/44（0. 586）
2. 22个PKU 家系基因诊断情况，患儿父母均被检出突变基因的有8个家系，父母均携带Exon7（R234Q ）突变基因有3个家系。父母均携带Exon6（Y204C ）的有1个家系。这4个家系其子为该突变
（
・146・中华检验医学杂志2004年3月第27卷第3期 Chin J Lab Med ，March 2004，Vol 27，No. 3
基因的纯合子，另有4个家系父母均携带不同的突变位点，有10个家系只检出患儿父母之一携带的突变基因，有4个家系的父母没有查出突变基因。总检出率为81. 8%（见表3）。
表3 22个PKU 家系基因诊断情况及频率
突变基因
检出情况检出2个突变基因
突变基因型R243Q /R243Q Y204C /Y204C IVS7nt （2）/R261Q 家系
数目31136. 4百分比率（%）
13个外显子中突变分布及类型，有助于提高PKU 的基因诊断率。以文献报道中国北方人群最常见突变为依据，我们选择了检测PAH 基因3、5、6、7、10、11、12，7个外显子，采用PCR-SSCP 的方法检测了内蒙古地区PKU 22个患儿，共发现了10种突变，总检出率为81. 8%。
发生突变率最高的区域是Exon7，占PAH 基因
［6］
突变的27. 2%（12/44），与文献报道一致，也进一
步证实了Exon7编码的PAH 蛋白区域在PKU 发病中起关键作用。在Exon7处又以R243Q （18. 2%）Y161S /R252Q 1Y356X /Y204C 1R243Q /Y356X
1检出1个突变基因
R243Q /▲1Y356X /▲445. 4G239D /▲1R111X /▲1R413P /▲1Y204C /▲
2未检出突变基因▲/▲
418. 2合计22
100. 0
注：▲其他未确定突变位点
3. 在做Exon7SSCP 时，发现带型与正常和阳性对照均不同的带型，可疑为其他突变或多态，将样本测序，结果显示（图1）为第51位碱基出现G →A 置换，使编码PAH 酶蛋白第239位氨基酸的密码子GGT 突变为天门冬氨酸的密码子GAT ，即为G239D G →A ）。查阅国际PAH 基因突变数据库［1］
，证实
此为国内外迄今为止尚未报道的新突变。
M （异常序列）：ACT GAT TTC CGC N （正常序列）：ACT GGT TTC CGC
G239D mutation in PAH Gene Exon7，箭头代表突变位点
图1 Eoxn7点突变基因测序图
讨论
苯丙酮尿症的分子基础是PAH 基因点突变，
PAH 基因突变的鉴定是对PKU 进行基因诊断、基因治疗的必要前提条件，全面系统了解PAH 基因的
突变率最高，占Exon7突变率（8/12）的66. 6%，再一次证明了PAH 基因Exon7处的R243Q 突变是中国PKU 基因突变中发生率最高的一种突变。但本研究的突变频率低于北京23. 3%，也低于东北地区50%，与云南地区的报道19. 2%相近。在检出的10种突变中，R243Q 仍然居于突变频率的首位，是PKU 筛查的重点。
本研究发生突变频率居第2位的是Exon11y356x 。突变频率为13. 6%，Exon11长134bp ，编码PAH 的第356到400位共44个氨基酸，Y356X TAC →TAA ）是无义突变，在内蒙古的发生频率高于我国已报道北方人群此点突变率（4%、5%、8. 1%），是内蒙古地区的PKU 主要突变类型，有别于文献报道北方人群PAH 基因突变率位居第二位的R413P 。发生突变频率排在第3位的是Exon6Y204C ，突变率为11. 4%，高于北京3. 3%，东北3. 8%，而多数报道北方人群PAH 基因突变率排在第二位的是Exon12R413P 。其突变频率为山西12%［7］，
北京10%、东北11. 5%。我们检测的数据与此差别较大，其突变频率只有2. 2%，明显低于以前文献。这也是内蒙古地区PAH 突变的一个不同点。以上研究证明内蒙古虽属于北方人群，与北方人群的PAH 基因常见突变类型相似，但突变频率有着相当大的差异，这对制定内蒙古地区PKU 的基因诊断及了解我国PAH 基因突变种族、地域分布、频
率有很大的参考价值。
在PAH 基因突变的检测中，我们采用PCR-SSCP 方法，设立测序验证的阳性、阴性对照和家系内对照，严格控制影响因素条件下使SSCP 多态性解读较为容易，它的点突变检出率达81. 8%，高于
MASPCR （68. 7%）
［7］。与文献检出率相符［8］
。我们扩增的PAH 7个外显子及两侧的内含子，扩增片断在245～326bp 之间，适合SSCP 的有效分离，所以
（（
中华检验医学杂志2004年3月第27卷第3期 Chin J Lab Med ，March 2004，Vol 27，No. 3・147・
本试验数据有一定的可信度。并且也表明在未应用基因芯片诊断点突变时，用SSCP 银染法是一种简便实用的技术，它可以同时检测已知突变和发现新突变，也是一个适用于多样品筛查的较好方法。目前以应用于结核杆菌的筛查检测就是证明。通过SSCP 筛查和DNA 测序，我们检测到Exon7区域编码PAH 第239位的氨基酸密码子突变，经检索国际PAH 基因数据库认定此位点为一个新的突变即为G239D （G →A ），频率为2. 2%。这个新位点基因型的临床表型相对较其他Exon7位点有些不同。接受低苯丙氨酸饮食治疗就诊时间晚，但在短时间内效果明显好于其他患儿。由于例数少，不能证明此基因型与表型的相关性及特殊性。
另外我们检出1例IVS7nt （2）与R 261Q 的双重杂合子，IVS7nt （2）位点突变是中国人群中较少见的一种致病点突变，在继东北地区报道后，我们是第2家。这更进一步证明此基因突变在北方人群，南方人群未见报道。
在22例PKU 家系中，有4个家系未检出突变基因，预示它们可能是较罕见的突变，中国人群中约
［6］有20%的PAH 基因突变尚未确定，也可能由于
Y356X 高、R413P 低为明显特征，有别于其他北方人群，为内蒙古地区的基因诊断、基因治疗提供科学依据，也为PKU 患者基因型与表型的相关性研究奠定了基础。
参
考
文
献
1Hoang L ，Charls Scriver C. PAH Mutation database world wide wed
revised ［07. 11. 02］，quoted ［20. 12. 02］，1ocation ：http ：//www. mcgill. . ca /pahdb.
et al. Molecular characterization 2Okano Y ，Asadam M ，Kang Y ，
ofphenylketonuria in Japanese patience. Hum Genet ，1998，103：613-618. 3Zschocke J ，Hoffmann GF. Phenylketonuria mutation in Germany. Hum genetics ，1999，104：390-398.
4Lo WH ，Wang T ，Eisensmith R ，et al. Molecular basis of PKU in
1993，8：180-185. china. Chin Med Sci J ，
5林万明，主编. PCK 技术操作和应用指南. 北京：人民军医出版
1993. 381-382. 社，
6孙桂风，姜莉，张学，等. 中国北方人苯丙氨酸羟化酶基因外显
1997，24：492-495. 子7内新突变的鉴定. 遗传学报，
7郑梅玲，丁琰. 用PCK-STR. ASPCR PCR-SSCP 技术对PKU 患者
1997，14：354-357. 进行产前基因诊断. 中华医学遗传学杂志，
8Humphries SE ，Gudnason V ，Wagener C ，et al ，Single-strand conformation polymorphism analysis with high throughput modifications ，and its use in mutation detection familial hypercholesterolemia. The IFCC scientific Division ：committee on Molecular Biology Techniques. J Int Fed Clin Chem ，1997，9：156-161.
（收稿日期：2003-08-15）
方法学本身的特性所限，但也同时表明PKU 病因的复杂性和临床表型的多样性。本试验检测结果确定了内蒙古地区PAH 基因突变的类型和频率，以
（本文编辑：张莉）
问题解答
问：何为CD 抗原？
答：CD 全称为cluster of differentiation ，CD 抗原通常指分化抗原。目前，研究最为深入的为白细胞CD 抗原，它是指在白细胞分化过程的不同阶段在白细胞上出现的组成性分子。在对白细胞CD 抗原的研究过程中，有大量相应的单克隆抗体被制备成功，到目前为止，已有200多个分化抗体群被鉴定和命名，并得到了世界卫生组织（WHO ）有关管理机 问：常用的流式细胞术白血病表型分析的系列标志有哪些？ 答： 流式细胞术白血病表型分析，又称免疫分型，是国内外公认的诊断白血病的必要指标。常用的检测和鉴别白血病各系列的特异性标志为：T 淋巴细胞白血病：胞浆抗原（c ）CD3、抗T 细胞受体（TCR ）抗TCR γδ、CD2、CD5、CD8αβ、
、CD10和CD7；B 淋巴细胞白血病：cCD79a 、CD22、CD19、CD10和CD20；髓系白血病：抗髓性过氧化物酶（cMPO ）、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和CD64；NK 淋巴细胞白血病：CD16、CD56和CD57；红白血病：血型糖蛋白A （GlyA ）和
CD36；巨核细胞白血病：CD41、CD42和CD61；其中，cCD79a 最具特异性，cMPO 是髓系特异标志，cCD3和cCD79a 分别表达于早期T 细胞和B 细胞。另外，常用的白血病系列非特异标志为：CD34和主要组织相容性抗原DR （HLA-DR ）。构的批准。这大大推进了与CD 抗原相关的临床和基础研究的发展。
（崔巍）
（收稿日期：2003-12-24）
（崔巍）
（收稿日期：2003-12-24）
・144・中华检验医学杂志2004年3月第27卷第3期 Chin J Lab Med ，March 2004，Vol 27，No. 3
・临床实验诊断研究・
内蒙古地区苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测
张军力 孟峻 翟晓萍 方根 高建钢 史珉 王永祥
【摘要】 目的 了解内蒙古地区苯丙酮尿症（PKU ）病人苯丙氨酸羟化酶（PAH ）基因突变类型
和频率。方法 采用聚合酶链反应（PCR ）扩增，单链构象多态性分析（SSCP ）、DNA 直接测序的方法，对内蒙古地区22个PKU 家系PAH 基因外显子3、5、6、7、10、11、12，进行检测分析。结果 检出10种苯丙氨酸羟化酶基因的点突变。R243Q （8/44）、R252Q （1/44）、R261Q （1/44）、G239D （1/44）、IVS7nt （2）（1/44）、Y204C （5/44）、Y356X （6/44）、R413P （1/44）、R111X （1/44）、Y161S （1/44），经检索国际PAH 基因突变数据统计库，确认G239D （G →A ）为首次发现的新突变。结论 R243Q 、Y356X 、Y204C 是内蒙地区人群中PAH 基因的主要突变位点。以Y356X 的突变率明显高于、R413P 低于北方人群为特征。
【关键词】 苯丙酮尿症； 苯丙氨酸羟化酶； 聚合酶链反应； 基因突变
Determination of phenylalanine hydroxylasegene mutation of phenylketonuria in Inner Mongolia ZHANG Jun-li *，MENG Jun ，ZHAI Xiao -ping ，FANG Gen ，GAO Jian-gang ，SHI Min ，WANG Yong-xiang . *
Department of laboratory First Affiliated Hospital Inner Mongolia Medical college ，Huhehaote 010050China 【Abstract 】 Objective To determine gene mutation types and frequency of phenylalanine hydroxylase （PAH ）phenylketonuria （PKU ）patients in Inner Mongolia. Methods Exon 3、5、6、7、10、11. and 12of the phenylalanine hydroxylase （PAH ）gene was detected in 22PKU patients from inner Mongolia by using PCR-single strand conformation polymorphism （PCR-SSCP ）technique and DNA direct
（8/sequencing. Results Ten point mutation type were identified the frequencies of mutation were R243Q
44）、R252Q （1/44）、R261Q （1/44）、G239D （1/44）、IVS7nt （2）（1/44）、Y204C （5/44）、Y356X （6/44）、R413P （1/44）、R111X （1/44）respectively a novel mutation G239D （G →A ）was demonstrated in comparison with the PAH gene mutation Database. Conclusion R243Q 、Y356X 、Y204C were most frequency mutation in Inner Mongolia. The mutation frequency of Y356X is higher ，R413P is lower than Northern people.
【Key Words 】 Phenylketonuria ； Phenylalanine hydroxylase ； Polymerase chain reaction ； Gene mutation
苯丙酮尿症（phenylketonuria ，PKU ）是常染色体隐性遗传病，绝大多数是由苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase ，PAH ）基因点突变导致肝脏PAH 活性降低或丧失所致，而非基因部分缺失。中国人群发病率1/11188，截止到2002年，全世界32个国家报道已发现400多种PAH 基因突变位
［1］点，由于PAH 基因突变在种族、地域分布不同，各
［2，3］
个国家报道均有自己的突变类型、频率等特点，中国PAH 点突变至少存在南方和北方两大基础人
［4］
群的不同分布特点。
国内外研究已证明，PAH 基因全长约100kb ，共包含13个外显子和12个内含子，各个外显子和内含子的长度不同，外显子在57～892bp 之间，内
基金项目：内蒙古自治区卫生厅医药卫生科研基金资助（981118）
作者单位：010050呼和浩特，内蒙古医学院第一附属医院检验科（张军力、孟峻、高建钢、史珉、王永祥）；内蒙古血液中心（翟晓萍、方根）
含子在1～23. 5kb 之间。PAH 基因突变广泛分布在13个外显子（Exon ）和12个内含子（Inteon ）的上、下游非翻译区，根据国际PAH 研究资料，在PAH 基因外显子3、5、6、7、10、11、12的突变发生率高于其他外显子，但我国已报道的中国人群的30余种突变主要分布在外显子3、6、7、11、12。结合国际国内的研究结果，确立本研究内容为PAH 基因外显子
中华检验医学杂志2004年3月第27卷第3期 Chin J Lab Med ，March 2004，Vol 27，No. 3・145・
3、5、6、7、10、11、12共7个外显子及两侧内含子。
对象和方法
1. 对象：22例经典型PKU 患儿均来自我院门诊和住院诊疗患者，有典型的PKU 临床表现，经FeCl 3试验和Guthrie 细菌抑制试验阳性，血液苯丙氨酸浓度>20mg /d ，尿液中生物喋呤测定排除非经典型PKU 而确诊。后均经首都儿科医学研究所，北京中日友好医院验证为经典型PKU 患儿。
规扩增，产物经2%低溶点琼脂糖凝胶电泳分离回测序结果与收，在ABI377自动测序仪上进行测序，PAH 基因序列进行比较。
5. 突变基因的确定：每次不同的外显子SSCP 加阳性样品（PKU 阳性样品由首都儿科医学研究所提供）和正常样品对照，如遇到与阳性样品相同的带型首先进行核心家系重复验证，证实患儿双亲之一具有相同的异常带型，父母样品SSCP 作为家系的内对照。对患儿样品进行两次PCR 反应，分别2. DNA 提取：对已确诊为PKU 的患儿，采集本人及父母、兄弟姐妹新鲜血样或制成干血痂，采用经典的酚/氯仿方法提取DNA ，
放低温冰箱保存备用。3. PCR-SSCP-银染：将提取的DNA 分别进行外显子3、5、6、7、10、11、12的PCR 扩增（表1），PCR 引物由上海博亚公司和北京奥科生物有限公司参照
有关文献设计合成［5（外显子］5，6自己设计）。
表1 PCR 扩增的引物序列及扩增片断大小
扩增外显子引物序列
扩增片段（bp ）
3F 5'GTTAGGTTTTCCTGTTCTGG3' R 5'CTTATGTTGCAAAATTCCTC3' 3005F 5'TCATGGCTTTAGAGCCCCCA3' R 5'TCATGCTGGTATTTTCATCC3' 2616F 5'CCGACTCCCTCTGCTAACCT3' R 5'CAATCCTCCCCCACCTTTCT3' 3267F 5'CTCCTAGTGCCTCTGACTCA3' R 5'ACCAGCCAGCAAATGAACCC3' 29110F 5'CCCAGTCAAGGTGACACATA3' R 5'ACAAATAGGGTTTCAACAAT3' 25611F 5'TGAGAGAAGGGGCACAAATG3' R 5'GTAGACATTGAGTCCACTCT3' 32012
F 5'ATGCCACTGAGAACTCTCTT3' R 5'AGTCTTCGATTACTGAGAAA3'
245 PCR 反应体系25µl ，含DNA 1µmol /µl ，引物
2pmol /µl ，100µmol /L dNTP ，2. 5mmol /LMgCl 2，加1uTaqDNA 聚合酶在热循环仪上进行PCR ，反应条件97℃热变性5min ，94℃30s →55℃30s →72℃1min ，循环30次2%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的PCR 产物。分别取各外显子的PCR 产物与变性载样缓冲液混合，
97℃变性5min ，使目的基因DNA 呈单链状态，在6%～8%非变性聚丙烯酰胺凝胶49:1，含5%甘油）电泳，电泳结束后，取出凝胶用硝酸银染色，分析纪录单链DNA 泳动带型。
4. DNA 测序：对经SSCP 分析时出现与正常对照及阳性对照不同者，重新进行相关PAH 外显子常
测定正链和反链DNA 序列。如突变基因为已知突变，可以作为以后SSCP 的阳性对照，突变位点国内未见报道，为国内报道的新突变。
结
果
1. 应用PCR-SSCP 方法检测22个家系PAH 基因的7个外显子，共检出10种PAH 基因点突变。其中外显子7（Exon7）有5种点突变，R243Q 、R252Q 、R261Q 、IVS7nt （2）、G239D ，而G239D 是新发现的点突变。Exon3、5、6、11和12各检出1种PAH 基因突变位点。Exon10未检出突变位点。
在22例患儿的44条染色体中，有26条发生基因点突变，占突变率基因的59%，其中以R243Q （18. 2%）发生频率最高，Y356X （13. 6%）次主，Y204C （11. 4%）位居第三位，其余7种点突变率相同（2. 2%）（见表2）。
表2 内蒙古地区PAH 基因突变类型及频率
外显子/
突变碱基氨基酸变基内含子类型改变改变因数频率Exon 3R111X C →T Arg →Ter 11/44（0. 022）Exon 5Y161S T →C phe →Ser 11/44（0. 022）Exon 6Y204C A →G phe →Cys 55/44（0. 114）Exon 7
R243Q G →A Arg →Gln 88/44（0. 182）R252Q G →A Arg →Gln 11/44（0. 022）R261Q G →A Arg →Gln 11/44（0. 022）G239D G →A Gly →Asp 11/44（0. 022）IVS7nt2
gt →ga 基因转录异常11/44（0. 022）Exon 11Y356X C →A Tyr →Ter 66/44（0. 136）Exon 12R413P G →C
Arg →Pro
1
1/44（0. 022）
合计
10
2626/44（0. 586）
2. 22个PKU 家系基因诊断情况，患儿父母均被检出突变基因的有8个家系，父母均携带Exon7（R234Q ）突变基因有3个家系。父母均携带Exon6（Y204C ）的有1个家系。这4个家系其子为该突变
（
・146・中华检验医学杂志2004年3月第27卷第3期 Chin J Lab Med ，March 2004，Vol 27，No. 3
基因的纯合子，另有4个家系父母均携带不同的突变位点，有10个家系只检出患儿父母之一携带的突变基因，有4个家系的父母没有查出突变基因。总检出率为81. 8%（见表3）。
表3 22个PKU 家系基因诊断情况及频率
突变基因
检出情况检出2个突变基因
突变基因型R243Q /R243Q Y204C /Y204C IVS7nt （2）/R261Q 家系
数目31136. 4百分比率（%）
13个外显子中突变分布及类型，有助于提高PKU 的基因诊断率。以文献报道中国北方人群最常见突变为依据，我们选择了检测PAH 基因3、5、6、7、10、11、12，7个外显子，采用PCR-SSCP 的方法检测了内蒙古地区PKU 22个患儿，共发现了10种突变，总检出率为81. 8%。
发生突变率最高的区域是Exon7，占PAH 基因
［6］
突变的27. 2%（12/44），与文献报道一致，也进一
步证实了Exon7编码的PAH 蛋白区域在PKU 发病中起关键作用。在Exon7处又以R243Q （18. 2%）Y161S /R252Q 1Y356X /Y204C 1R243Q /Y356X
1检出1个突变基因
R243Q /▲1Y356X /▲445. 4G239D /▲1R111X /▲1R413P /▲1Y204C /▲
2未检出突变基因▲/▲
418. 2合计22
100. 0
注：▲其他未确定突变位点
3. 在做Exon7SSCP 时，发现带型与正常和阳性对照均不同的带型，可疑为其他突变或多态，将样本测序，结果显示（图1）为第51位碱基出现G →A 置换，使编码PAH 酶蛋白第239位氨基酸的密码子GGT 突变为天门冬氨酸的密码子GAT ，即为G239D G →A ）。查阅国际PAH 基因突变数据库［1］
，证实
此为国内外迄今为止尚未报道的新突变。
M （异常序列）：ACT GAT TTC CGC N （正常序列）：ACT GGT TTC CGC
G239D mutation in PAH Gene Exon7，箭头代表突变位点
图1 Eoxn7点突变基因测序图
讨论
苯丙酮尿症的分子基础是PAH 基因点突变，
PAH 基因突变的鉴定是对PKU 进行基因诊断、基因治疗的必要前提条件，全面系统了解PAH 基因的
突变率最高，占Exon7突变率（8/12）的66. 6%，再一次证明了PAH 基因Exon7处的R243Q 突变是中国PKU 基因突变中发生率最高的一种突变。但本研究的突变频率低于北京23. 3%，也低于东北地区50%，与云南地区的报道19. 2%相近。在检出的10种突变中，R243Q 仍然居于突变频率的首位，是PKU 筛查的重点。
本研究发生突变频率居第2位的是Exon11y356x 。突变频率为13. 6%，Exon11长134bp ，编码PAH 的第356到400位共44个氨基酸，Y356X TAC →TAA ）是无义突变，在内蒙古的发生频率高于我国已报道北方人群此点突变率（4%、5%、8. 1%），是内蒙古地区的PKU 主要突变类型，有别于文献报道北方人群PAH 基因突变率位居第二位的R413P 。发生突变频率排在第3位的是Exon6Y204C ，突变率为11. 4%，高于北京3. 3%，东北3. 8%，而多数报道北方人群PAH 基因突变率排在第二位的是Exon12R413P 。其突变频率为山西12%［7］，
北京10%、东北11. 5%。我们检测的数据与此差别较大，其突变频率只有2. 2%，明显低于以前文献。这也是内蒙古地区PAH 突变的一个不同点。以上研究证明内蒙古虽属于北方人群，与北方人群的PAH 基因常见突变类型相似，但突变频率有着相当大的差异，这对制定内蒙古地区PKU 的基因诊断及了解我国PAH 基因突变种族、地域分布、频
率有很大的参考价值。
在PAH 基因突变的检测中，我们采用PCR-SSCP 方法，设立测序验证的阳性、阴性对照和家系内对照，严格控制影响因素条件下使SSCP 多态性解读较为容易，它的点突变检出率达81. 8%，高于
MASPCR （68. 7%）
［7］。与文献检出率相符［8］
。我们扩增的PAH 7个外显子及两侧的内含子，扩增片断在245～326bp 之间，适合SSCP 的有效分离，所以
（（
中华检验医学杂志2004年3月第27卷第3期 Chin J Lab Med ，March 2004，Vol 27，No. 3・147・
本试验数据有一定的可信度。并且也表明在未应用基因芯片诊断点突变时，用SSCP 银染法是一种简便实用的技术，它可以同时检测已知突变和发现新突变，也是一个适用于多样品筛查的较好方法。目前以应用于结核杆菌的筛查检测就是证明。通过SSCP 筛查和DNA 测序，我们检测到Exon7区域编码PAH 第239位的氨基酸密码子突变，经检索国际PAH 基因数据库认定此位点为一个新的突变即为G239D （G →A ），频率为2. 2%。这个新位点基因型的临床表型相对较其他Exon7位点有些不同。接受低苯丙氨酸饮食治疗就诊时间晚，但在短时间内效果明显好于其他患儿。由于例数少，不能证明此基因型与表型的相关性及特殊性。
另外我们检出1例IVS7nt （2）与R 261Q 的双重杂合子，IVS7nt （2）位点突变是中国人群中较少见的一种致病点突变，在继东北地区报道后，我们是第2家。这更进一步证明此基因突变在北方人群，南方人群未见报道。
在22例PKU 家系中，有4个家系未检出突变基因，预示它们可能是较罕见的突变，中国人群中约
［6］有20%的PAH 基因突变尚未确定，也可能由于
Y356X 高、R413P 低为明显特征，有别于其他北方人群，为内蒙古地区的基因诊断、基因治疗提供科学依据，也为PKU 患者基因型与表型的相关性研究奠定了基础。
参
考
文
献
1Hoang L ，Charls Scriver C. PAH Mutation database world wide wed
revised ［07. 11. 02］，quoted ［20. 12. 02］，1ocation ：http ：//www. mcgill. . ca /pahdb.
et al. Molecular characterization 2Okano Y ，Asadam M ，Kang Y ，
ofphenylketonuria in Japanese patience. Hum Genet ，1998，103：613-618. 3Zschocke J ，Hoffmann GF. Phenylketonuria mutation in Germany. Hum genetics ，1999，104：390-398.
4Lo WH ，Wang T ，Eisensmith R ，et al. Molecular basis of PKU in
1993，8：180-185. china. Chin Med Sci J ，
5林万明，主编. PCK 技术操作和应用指南. 北京：人民军医出版
1993. 381-382. 社，
6孙桂风，姜莉，张学，等. 中国北方人苯丙氨酸羟化酶基因外显
1997，24：492-495. 子7内新突变的鉴定. 遗传学报，
7郑梅玲，丁琰. 用PCK-STR. ASPCR PCR-SSCP 技术对PKU 患者
1997，14：354-357. 进行产前基因诊断. 中华医学遗传学杂志，
8Humphries SE ，Gudnason V ，Wagener C ，et al ，Single-strand conformation polymorphism analysis with high throughput modifications ，and its use in mutation detection familial hypercholesterolemia. The IFCC scientific Division ：committee on Molecular Biology Techniques. J Int Fed Clin Chem ，1997，9：156-161.
（收稿日期：2003-08-15）
方法学本身的特性所限，但也同时表明PKU 病因的复杂性和临床表型的多样性。本试验检测结果确定了内蒙古地区PAH 基因突变的类型和频率，以
（本文编辑：张莉）
问题解答
问：何为CD 抗原？
答：CD 全称为cluster of differentiation ，CD 抗原通常指分化抗原。目前，研究最为深入的为白细胞CD 抗原，它是指在白细胞分化过程的不同阶段在白细胞上出现的组成性分子。在对白细胞CD 抗原的研究过程中，有大量相应的单克隆抗体被制备成功，到目前为止，已有200多个分化抗体群被鉴定和命名，并得到了世界卫生组织（WHO ）有关管理机 问：常用的流式细胞术白血病表型分析的系列标志有哪些？ 答： 流式细胞术白血病表型分析，又称免疫分型，是国内外公认的诊断白血病的必要指标。常用的检测和鉴别白血病各系列的特异性标志为：T 淋巴细胞白血病：胞浆抗原（c ）CD3、抗T 细胞受体（TCR ）抗TCR γδ、CD2、CD5、CD8αβ、
、CD10和CD7；B 淋巴细胞白血病：cCD79a 、CD22、CD19、CD10和CD20；髓系白血病：抗髓性过氧化物酶（cMPO ）、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和CD64；NK 淋巴细胞白血病：CD16、CD56和CD57；红白血病：血型糖蛋白A （GlyA ）和
CD36；巨核细胞白血病：CD41、CD42和CD61；其中，cCD79a 最具特异性，cMPO 是髓系特异标志，cCD3和cCD79a 分别表达于早期T 细胞和B 细胞。另外，常用的白血病系列非特异标志为：CD34和主要组织相容性抗原DR （HLA-DR ）。构的批准。这大大推进了与CD 抗原相关的临床和基础研究的发展。
（崔巍）
（收稿日期：2003-12-24）
（崔巍）
（收稿日期：2003-12-24）