第38卷第5期
2002年9月林SCIE NTI A 业科SI LVAE 学SI NIC AE V ol 138, N o 15Sep. , 20026种木材白腐菌对山杨材木质素分解能力的研究
池玉杰 于 钢
(东北林业大学森林资源与环境学院 哈尔滨150040)
摘 要: 由于不同的木材腐朽菌的生理特性不同, 所分泌的酶及酶的活性各不相同, 因此, 不同的腐朽菌分解木材的各种成分及相对速度就各不相同, 而且对于木质纤维基质会有不同的中间代谢产物。本项研究选择了火木层孔菌(Phellius igniarius ) 及另外5种木材分解能力较强的阔叶树上的白腐菌:粗毛盖菌(Funalia gallica ) 、三色革裥菌(Lenzites tricolor ) 、冬拟多孔菌(Polyporellus brumalis ) 、偏肿拟栓菌(P seudotrametes gibbosa ) 和血红密孔菌(Pyc 2noporus sanguineus ) , 研究了它们对山杨木材木质素的分解能力, 测定了经6种白腐菌分解一定时期的山杨木材木质素的含量, 作为木材白腐菌对山杨木材木质素生物降解机制的初步研究, 旨在为山杨木材生物制浆造纸提供应用基础理论研究, 同时也可为木质素合理的生物转化为有用的化学品、生物漂白、酶处理防止机械浆的返黄、废水治理、纤维素酶解糖化的微生物前处理等提供相关的借鉴研究, 以期在生产实践中减轻环境污染并充分利用木质素资源。在无菌的条件下, 将山杨木片样品分别放入以上6种白腐菌的平板培养基中受菌侵染, 一定时间后取出, 去除木片表面的菌丝体, 然后分别测定未腐朽材和受菌侵染40d 、60d 、80d 和120d 时木片样品中木质素的含量, 分析6种白腐菌对山杨木材木质素的分解能力及受菌分解后木片变黄的原因。结果表明, 这6种木材白腐菌对山杨木材木质素的分解能力不同, 依次为血红密孔菌、偏肿拟栓菌、冬拟多孔菌、三色革裥菌、粗毛盖菌和火木层孔菌。考虑白腐菌对纤维素的分解程度, 冬拟多孔菌是较多的分解木质素而较少分解纤维素的较好的木材白腐菌。
关键词: 木材白腐菌, 木质素, 分解能力
STU DY ON THE DEGRADING ABI LIT Y TO DAVI D POP LAR LIGNIN OF
SIX SPECIES OF WOOD WHITE 2R OT FUNGI
Chi Y ujie Y u G ang
(Institute o f Forest Resources and Environment o f Northeast Forestry Univer sity Harbin 150040)
Abstract : Because different w ood 2rot fungi have different physiological properties , and they can produce different enz 2ymes with different activity , different w ood 2rot fungi degrade different com positions of w ood with different velocities , and the m iddle materials degraded by different w ood 2rot fungi are different. In order to offer a applicating basic theory study to biop 2ulping with david poplar w ood , and offer a related study to m icrobial conversions of lignin to useful chem icals , biobleach 2ing , enzymes treatment preventing from becom ing yellow of mechanical pulping , wasted water control , m icrobial pretreat 2ment of cellulose sugaring by enzymes , and decrease environment pollution in paper industry and make full use of lignin re 2sources , this study selected Phellius igniarius and other 5w ood 2rot fungi with higher w ood degrading ability living on broad 2leaf trees , i. e. Funalia gallica , Lenzites tricolor , Polyporellus brumalis , P seudotrametes gibbosa , Pycnoporus sanguine 2us , tested their degrading ability to david poplar w ood lignin , measured the lignin content change of david poplar w ood after a period of time degraded by 6w ood 2rot fungi , which is the first study on the biodegradation mechanism of lignin by w ood white 2rot fungi. Under sterile conditions , the standard david poplar w ood sam ples were put plate media of 6species white 2rot fungi and degraded by them. A fter 40d , 60d , 80d and 120d , the rotted w ood sam ples were taken out respectively and the mycelium on the w ood sam ples were brushed off. Then the lignin contents of prim itive w ood sam ple and rotted w ood sam ples were measured. Results showed the lignin degrading ability of 6species of w ood white 2rot fungi is different , it is Pycnoporus sanguineus , P seudotrametes gibbbosa , Polyporellus brumalis , Lenzites tricolor , Funalia gallica and Phellius igniarius in turn. I f considering the degraded extent of cellulose , Polyporellus brumalis is the better w ood white 2rot fungi
收稿日期:2001210215。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070623号) 、黑龙江省自然科学基金资助项目(C00232号) 。
with higher ability of degrading lignin and lower ability of degrading cellulose.
K ey w ords : W ood white 2rot fungi , Lignin , Degrading ability
由于不同的木材腐朽菌生理特性不同, 所分泌的酶及酶的活性各不相同, 因此, 不同的腐朽菌所分解木材的各种成分及相对速度各不相同(Buswell ,1987) 。有些木腐菌只能分解纤维素和木质素二者之一; 有些木腐菌则可同时分解二者; 还有些菌类能以二者之一为主要分解对象, 兼或稍具分解另一物质。所以在自然界中, 木材腐朽的类型是很复杂的。如木质细胞壁中木质素被分解利用时, 仅留下纤维素, 朽材较健康材色浅, 呈白色, 就叫白腐。朽材不易粉碎解体, 且富于弹性, 木材质地变为纤维状或海绵状, 这样的白腐木材有可能用于造纸。
山杨(Populus davidiana ) , 又称中国山杨, 属白杨派, 分布于北纬25°～53°、东经100°～130°范围内, 常形成天然次生林, 与桦木类混生或成纯林, 为采伐迹地和火烧迹地天然更新的先锋树种, 是中国山区造林先锋树种之一。从造纸的特定材性指标上看, 山杨具有较好的造纸纤维形态, 纤维较长, 不易断裂; 综纤维素含量较高(80%) , 木质素含量较低(20%) , 制浆得率高; 材色洁白而易漂白, 材质轻软而易于脱除木质素, 易得高白度浆, 因此是造纸的良好材料。在自然状态下山杨活立木却极易染心材白腐病, 山杨心材白腐, 也叫阔叶树心材白腐, 广泛发生在山杨、白桦、青杨、色木槭、蒙古栎、核桃楸等许多种阔叶树上, 尤其山杨林、青杨林和白桦林最多, 遍布世界各地, 在我国东北、西北、西南和华北各地林区普遍发生。引起山杨心材白腐的木腐菌为火木层孔菌(Phellius igniarius ) 。火木层孔菌在野外状态下危害树干心材, 发病初期心材变褐色, 逐渐褪为白色, 并在其周围产生黑色线纹, 最后朽材变软, 不碎不裂, 形成典型的白色海绵状腐朽。在大风雨天, 树干常从腐朽部折断, 露出雪白松软的朽材。这种自然状态下腐朽后的木材用于造纸的情况还有待深入地研究, 因此作者选择了山杨材和火木层孔菌, 以探讨木材白腐菌对木材与木质素的生物降解机制。
作者曾在以前的研究中测定了东北林区60余种木腐菌对青杨、白桦和红松的木材分解能力, 得出了木腐菌对青杨、白桦和红松的木材分解能力排序表(池玉杰,2001) , 但木腐菌对木质素分解能力的研究在国内还未见报道(T anesaka ,1993) 。木质素是植物木质化组织的重要成分, 其化学结构相当复杂, 而且性状十分稳定, 但是在自然界中还是存在具木质素分解能力的微生物。千万年来, 森林中的枯枝落叶、倒木等未堆积成山即是证明, 只是不同的微生物对木质素的分解程度不同。根据迄今的研究结果, 在所有具分解木质素能力的微生物中, 只有引起木材白色腐朽的真菌被确切地证明了能够彻底地分解木质素, 能把复杂的木质素高分子降解成C O 2和H 2O (K irk ,1984;Paters on ,1985) 。近年来, 微生物在制浆造纸中的作用被重视起来, 提出了生物法制浆造纸的研究课题。木材造纸的一大难题是脱除木材中的木质素, 但会对水资源造成污染。如果利用微生物对木质素的降解作用脱除木材中的木质素, 就从根本上解决了造纸工业的环境污染问题。无疑地, 研究与采用无污染或少污染的制浆与漂白新技术是我国造纸业的紧迫任务, 生物制浆将是造纸工业的发展方向。有希望可以利用的是高效选择性分解木质素的白腐菌, 将木材中的木质素分解后剩下纤维素以用于造纸。
在木材中, 木质素的贮量仅次于纤维素, 但是长期以来对木质素的利用还不够深入, 不少场合如在造纸业中却作为废弃物加以排除, 不但带来严重的环境污染, 也浪费资源。因此, 提高木质素的利用效率、开发木质素的利用途径, 是解决资源、能源、环境问题的一个重要措施。从理论上讲, 控制性地对木质素进行生物降解, 可以由这一复杂的高聚物生产出现在从石油中制取的各种有用的苯酚类物质(Craw fod ,1981;T ai ,1990) , 如香草酸、二甲基硫醚、丁香酸、苯酚等。这种办法如果成功, 这将为当前与未来的化学品生产开辟新的原料来源。为此, 国外有些人做了这种以生物法从木质素中制取有用化学品的探索性研究。利用白腐菌对木质素的分解作用, 是一种很有希望的方法。因此作者选择了火木层孔菌及另外5种木材分解能力较强的阔叶树上的白腐菌:粗毛盖菌(Funalia gallica ) 、三色革裥菌(Lenzites tricolor ) 、冬拟多孔菌(Polyporellus brumalis ) 、偏肿拟栓菌(P sendotrametes gibbosa ) 和血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus ) , 研究了它们对山杨材木质素的分解能力。目的为山杨材生物制浆造纸提供应用基础理论,
同时也可为木质素合理的生物转化为有用的化学品、生物漂白、酶处理、防止机械浆的返黄、废水治理、纤维素酶解糖化的微生物前处理等提供相关的借鉴研究, 以期在生产实践上减轻环境污染并充分利用木质素资源。
1 材料与方法
111 试验材料
11111 6种木材白腐菌培养物的制备 将在东北林区采集到的有生命力的木腐菌子实体, 用组织分离法得到菌种。在无菌条件下, 将在斜面培养基上生长7d 的木腐菌菌种, 切取直径为5mm 的同质等量菌丝块, 分别接入到PDA 平板培养基的中间部应, 每一菌种多个重复, 接种后的培养基置于25℃恒温箱中培养7～15d , 使菌种长满平板或基本长满平板。
11112 采样 在冬季采伐期间进行采样。选择东北林业大学帽儿山实验林场20～30a 生山杨人工林的未腐朽材。本批样品是2000211229采自帽儿山林场新垦事业区7林班20～30a 生小径级山杨。木材样品采回后及时晾干, 以免受杂菌的侵染。
11113 木材样品的制备 根据国家标准———木材天然耐腐性实验室试验方法(G B ΠT1394211293) , 将野外采回的山杨木材, 晾干到一定程度后, 锯成2cm ×2cm ×1cm 小片。
112 试验方法
11211 木片样品受白腐菌腐朽试验 将一定数量的木片样品, 置于105℃烘箱中烘至恒重, 在高压灭菌锅中灭菌(0112MPa 下灭菌30min ) , 试样含水率达到40%～60%, 在无菌条件下将木片放入接种10d 已长满菌丝的平板培养基内, 然后将培养皿放入25℃恒温箱中培养使木片受菌侵染, 并保持一定湿度。对于每一菌种, 山杨木片样品分别被腐朽一定时期(为40d ,60d ,80d 和120d ; 不同的时间所用木片样品分别是40d —120～140块,60d —160～200块,80d —200～260块,120d —240～320块) 后, 取出附带菌丝体的小块, 用毛刷和水冲洗干净, 除去表面菌丝, 然后放入105℃烘箱中烘至恒重, 根据受菌侵染前后木片样品的重量变化计算受菌分解后木片样品重量减少百分率, 并记录受菌侵染后木片的颜色变化(国家标准,G B ΠT 1394. 1293) , 并按11212测定受菌分解后木片的木质素含量变化。根据木片样品重量变化和木质素的含量变化计算木片样品中综纤维素的含量变化。
11212 山杨木片样品木质素含量的测定 通过测定受白腐菌分解前后的木片样品中木质素的含量变化可知木质素被分解的程度, 木质素减少百分率与木片样品重量减少百分率的比率可表明木质素被分解的难易程度。按照国家标准一造纸原料分析用试样的采取(G B ΠT 267711293) 和造纸原料酸不溶木素含量的测定(G B ΠT 267718294) 进行分析侵染前后山杨材木片样品的木质素含量。本项试验测定了6种白腐菌分别分解山杨材木片样品40d 、60d 、80d 和120d 时的木质素含量及未腐朽时山杨木材木质素的含量, 共得到25项木质素含量百分率的测试数据, 最后得到木材样品中酸不溶木质素的含量
X 1=m 1Πm 0×100%
式中:m 1为烘干后的酸不溶木质素的质量(g ) ; m 0为绝干试样质量(g ) 。
2 结果与讨论
山杨木片样品受菌侵染前后木质素的含量变化结果见表1。根据山杨材受菌侵染后重量损失百分率和木质素分解百分率可得出综纤维素分解百分率。
综纤维素分解百分率=×100%腐朽前综纤维素含量
设腐朽前木片试样的绝干重为W 1, 腐朽后木片试样的绝干重为W 2, 那么腐朽前综纤维素含量=W 1-W 1×木质素含量百分率=W 1×(1-19136%) =018064W 1; 腐朽后综纤维素含量=W 2-W 2×腐朽后木质素含量百分率=W 2(1-腐朽后木质素含量百分率) 。
山杨木片样品受菌侵染后的木材分解百分率和综纤维素的含量变化结果见表2。
211 6种白腐菌对山杨木材木质素的分解能力
由于木腐菌的生理特性不同, 所分泌的酶及酶的活性各不相同, 因此, 不同的木腐菌分解木材的各种成分及相对速度就各不相同, 不同的白腐菌对于相同的木质纤维基质也有不同的中间代谢产物和途径。从表1可以看出,6种白腐菌对山杨木质素的分解能力不同。木片受白腐菌分解后的木质素减少百分率可作为评价白腐菌木质素分解能力的指标, 木质素减少百分率愈高, 说明白腐菌对木质素的分解能力愈强; 而木质素减少百分率愈低, 说明白腐菌对木质素的分解能力愈弱。根据木质素的减少百分率可以得出这6种白腐菌对山杨木质素的分解能力依次为血红密孔菌、偏肿拟栓菌、冬拟多孔菌、三色革裥菌、粗毛盖菌和火木层孔菌。
表1 木质素的含量变化结果
T ab. 1 R esults of lignin content ch ange
降解时间Degrading time Πd 木材白腐菌
W ood white 2rot fungi
粗毛盖菌Funalia gallica
三色革裥菌Lenzites tricolor
火木层孔菌Phellius igniarius
冬拟多孔菌Polyporelhus brumalis
偏肿拟栓菌P seudotrametes gibbosa
血红密孔菌Pycnoporus sanguineus 013 2319. 36 019. 36 019. 36 019. 36 019. 36 019. 36 04013 2317. 47 9. 815. 08 22. 1117. 96 7. 2315. 17 21. 6414. 74 23. 8613. 43 30. 636013 2314. 36 25. 8314. 58 24. 6917. 80 8. 0614. 51 25. 0513. 77 28. 8712. 74 34. 198013 2314. 11 27. 1213. 86 28. 4117. 69 8. 6313. 37 30. 9413. 75 28. 9811. 95 38. 2712013 2314. 09 27. 2213. 08 32. 4416. 30 15. 8112. 86 33. 5713. 36 30. 9911. 54 40. 39 13木质素含量Lignin content Π%,23木质素减少百分率Percent weight loss of lignin Π%.
表2 木材分解百分率和综纤维素的含量变化结果
T ab. 2 Percent w eight loss of w ood species and holo cellulose content ch ange
降解时间Degrading time Πd 木材白腐菌
W ood white 2rot fungi
粗毛盖菌Funalia gallica
三色革裥菌Lenzites tricolor
火木层孔菌Phellius igniarius
冬拟多孔菌Polyporelhus brumalis
偏肿拟栓菌P seudotrametes gibbosa
血红密孔菌Pycnoporus sanguineus [***********][1**********]328. 3827. 1516. 5415. 2015. 7030. [**************]2. 9612. 7111. 3011. 0115. 4117. 1610. 918. 089. 766. 3910. 5610. 6117. 9616. 6312. 5514. 1920. 1524. 1612. 8711. 6910. 869. 0214. 6117. 9422. 9820. 0916. 6428. 2434. 0037. 1317. 9715. 6014. 9122. 9029. 4131. 3432. 7832. 2919. 5821. 5221. 5437. 01
13木片样品重量减少百分率Percent weight loss of w ood specimen Π%,23综纤维素减少百分率Percent weight loss of cellulose Π%.212 6种白腐菌对山杨木材综纤维素的分解能力和最佳白腐菌的确定
在分析白腐菌对山杨材木片木质素分解能力的同时, 也要考虑白腐菌对纤维素的分解, 因为我们要寻求的是对木质素的分解能力强、尽可能少分解或不分解纤维素的选择性极高的最适于生物制浆用的白腐菌, 因此也要确定木质素被分解到什么程度时纤维素被分解的程度最低, 从而可保持最大的制浆得率。根据木片受菌分解前后的重量变化和木质素的含量变化可计算出综纤维素的含量变化。从表2可以看出, 冬拟多孔菌在分解同样多木质素时, 综纤维素的分解率最低。因此, 在本项试验的6种白腐菌中冬拟多孔菌就是较多的分解木质素而较少的分解纤维素的较好的木材白腐菌。
213 木片受菌侵染时间的确定
在自然状态下, 相对于其他的降解物来说, 微生物对处于固态环境中的木材和木质素的降解是一个较为缓慢的过程。在实验室内模拟自然状态的木材分解过程, 因此木材受菌侵染试验分别选择了40d 、60d 、80d 和120d 后测定木腐菌对木材和木质素的分解能力, 如果少于40d , 木腐菌对木材和木质素的分解百分率就很低(T anesaka ,1993) , 为了要在应用的角度进一步深入考虑工艺上的可能性, 迅速缩短微生物对木片的分解周期, 就必须要找到加速微生物对木质素分解的方法, 是否可以选择复合菌种的液体
发酵法还有待进一步深入研究。可以考虑木片在受菌类分解过程中, 在发酵罐中加入一些打磨木片的材料, 不断地搅拌, 以打磨木片和分散菌体, 从而加速分解过程。另外制浆原料木片要尽量薄一些, 以易于菌类的分解。能否找到能催化微生物对木质素分解的“催化剂”, 从而迅速加快这种酶解反应, 也是一个可以考虑的方法。从表1可以看出, 多数菌种在40d 时对木质素的分解就己达到一定程度, 而且随着时间的延长木质素被分解的程度变化不十分显著, 因此通过延长时间以获得对木质素较多的分解是不合理的, 也是不经济的。在将来的生产实际操作中, 可根据试验结果, 确定一个最佳的木片受菌侵染时间, 这时已分解足量的木质素同时纤维素被分解的程度最低, 从而在纸浆生产中可保持最大的制浆得率, 而生产周期又不至于很长。
214 受菌侵染后木片变黄的原因分析
所有受菌侵染后的木片都从白色变成了乳黄色、淡黄色, 受火木层孔菌侵染的木片还出现了黑线纹, 而变色部分主要在腐朽木片的表层受白腐菌分解的部分。这种现象产生的原因是木质素在分解过程中产生一些有色物质, 这些有色物质主要来自木质素的氧化产物, 即一些发色基因, 木质素的发色基因主要有3种类型, 即木质素的醌型结构、邻苯二酚的重金属螯合物及与结构单元的共轭结构(陈嘉翔等,1990) ; 另外, 木材中的低分子有机物和单宁等也有着色作用。正是这些具有着色作用物质, 是使受菌侵染的木片变黄的原因, 这也是制浆过程中木浆变黄的原因。若能减少在木片受菌类发酵过程中木质素降解产物的氧化作用, 就可能降低纸浆的颜色。根据这一试验结果, 可以考虑在未来的生物制浆过程中应尽量减少木质素的氧化作用, 因此需要筛选厌氧发酵木片的木材白腐菌。
215 火木层孔菌不是最佳的白腐菌
根据试验结果可以看出, 火木层孔菌不是最佳的白腐菌。在实验室条件下, 火木层孔菌的生长速度缓慢, 它的木材分解能力较弱, 木质素的分解能力也较弱, 而在野外这种木腐菌能广泛分布, 普遍生长在山杨、白桦、青杨、色木槭、蒙古栎、核桃楸等许多种阔叶树上, 引起心材腐朽的主要原因是由于火木层孔菌是具有忍耐特点的活立木心材上的腐朽菌, 它可以在其它微生物较少存在的活立木心材这一具有生存压力的特殊生境中长期生活。在活立木心材中, 最明显的压力因素是缺少易同化的营养基质, 存在着抑制性物质如单宁、树脂和芳香油等, 以及缺少氧气(程东升,1993) 。树木的心材与边材的明显区别之一就是心材中含有大量的沉积物质, 这类废弃物质是树木生命活动过程中产生的, 它们沉积在心材细胞中, 减少了心材的空隙, 并且有显著毒性, 因此一般来说心材比边材更抗腐。此外, 这些沉积物还有使心材更为稳定的趋势。火木层孔菌在培养基上的生长速度非常缓慢, 井缺少同其它微生物的竞争力, 在自然状态下多年生。这些性状都表明它的生存策略就是能够长期忍耐活立木心材这个特殊生境中的压力因素而得以生存与发展。由于具有忍耐或抵抗能力, 所以在不利因素存在的情况下, 火木层孔菌的生存能力明显大于其它非忍耐对策微生物的生存能力, 并对材积的破坏力极大。
3 结论
6种白腐菌对山杨木材木质素的分解能力不同, 根据木质素的减少百分率可以得出其分解能力依次为血红密孔菌、偏肿拟栓菌、冬拟多孔菌、三色革裥菌、粗毛盖菌和火木层孔菌。
如果考虑白腐菌对纤维素的分解, 在本项试验的6种白腐菌中冬拟多孔菌是较多的分解木质素而较少的分解纤维素的较好的木材白腐菌。
在将来的生产实际中, 可确定一个最佳的木片受菌侵染时间, 这时已分解足量的木质素同时纤维素被分解的程度最低, 从而在纸浆生产中可保持最大的制浆得率, 而生产周期又不至于很长。
所有受菌侵染后的木片均从白色变成了乳黄色、淡黄色。木质素在分解过程中, 都能产生一些有色物质, 这些有色物质主要来自木质素的氧化产物, 这些具有着色作用的物质, 是使受菌侵染的木片变黄的原因, 这也是制浆过程中木浆变黄的原因。
参考文献
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第38卷第5期
2002年9月林SCIE NTI A 业科SI LVAE 学SI NIC AE V ol 138, N o 15Sep. , 20026种木材白腐菌对山杨材木质素分解能力的研究
池玉杰 于 钢
(东北林业大学森林资源与环境学院 哈尔滨150040)
摘 要: 由于不同的木材腐朽菌的生理特性不同, 所分泌的酶及酶的活性各不相同, 因此, 不同的腐朽菌分解木材的各种成分及相对速度就各不相同, 而且对于木质纤维基质会有不同的中间代谢产物。本项研究选择了火木层孔菌(Phellius igniarius ) 及另外5种木材分解能力较强的阔叶树上的白腐菌:粗毛盖菌(Funalia gallica ) 、三色革裥菌(Lenzites tricolor ) 、冬拟多孔菌(Polyporellus brumalis ) 、偏肿拟栓菌(P seudotrametes gibbosa ) 和血红密孔菌(Pyc 2noporus sanguineus ) , 研究了它们对山杨木材木质素的分解能力, 测定了经6种白腐菌分解一定时期的山杨木材木质素的含量, 作为木材白腐菌对山杨木材木质素生物降解机制的初步研究, 旨在为山杨木材生物制浆造纸提供应用基础理论研究, 同时也可为木质素合理的生物转化为有用的化学品、生物漂白、酶处理防止机械浆的返黄、废水治理、纤维素酶解糖化的微生物前处理等提供相关的借鉴研究, 以期在生产实践中减轻环境污染并充分利用木质素资源。在无菌的条件下, 将山杨木片样品分别放入以上6种白腐菌的平板培养基中受菌侵染, 一定时间后取出, 去除木片表面的菌丝体, 然后分别测定未腐朽材和受菌侵染40d 、60d 、80d 和120d 时木片样品中木质素的含量, 分析6种白腐菌对山杨木材木质素的分解能力及受菌分解后木片变黄的原因。结果表明, 这6种木材白腐菌对山杨木材木质素的分解能力不同, 依次为血红密孔菌、偏肿拟栓菌、冬拟多孔菌、三色革裥菌、粗毛盖菌和火木层孔菌。考虑白腐菌对纤维素的分解程度, 冬拟多孔菌是较多的分解木质素而较少分解纤维素的较好的木材白腐菌。
关键词: 木材白腐菌, 木质素, 分解能力
STU DY ON THE DEGRADING ABI LIT Y TO DAVI D POP LAR LIGNIN OF
SIX SPECIES OF WOOD WHITE 2R OT FUNGI
Chi Y ujie Y u G ang
(Institute o f Forest Resources and Environment o f Northeast Forestry Univer sity Harbin 150040)
Abstract : Because different w ood 2rot fungi have different physiological properties , and they can produce different enz 2ymes with different activity , different w ood 2rot fungi degrade different com positions of w ood with different velocities , and the m iddle materials degraded by different w ood 2rot fungi are different. In order to offer a applicating basic theory study to biop 2ulping with david poplar w ood , and offer a related study to m icrobial conversions of lignin to useful chem icals , biobleach 2ing , enzymes treatment preventing from becom ing yellow of mechanical pulping , wasted water control , m icrobial pretreat 2ment of cellulose sugaring by enzymes , and decrease environment pollution in paper industry and make full use of lignin re 2sources , this study selected Phellius igniarius and other 5w ood 2rot fungi with higher w ood degrading ability living on broad 2leaf trees , i. e. Funalia gallica , Lenzites tricolor , Polyporellus brumalis , P seudotrametes gibbosa , Pycnoporus sanguine 2us , tested their degrading ability to david poplar w ood lignin , measured the lignin content change of david poplar w ood after a period of time degraded by 6w ood 2rot fungi , which is the first study on the biodegradation mechanism of lignin by w ood white 2rot fungi. Under sterile conditions , the standard david poplar w ood sam ples were put plate media of 6species white 2rot fungi and degraded by them. A fter 40d , 60d , 80d and 120d , the rotted w ood sam ples were taken out respectively and the mycelium on the w ood sam ples were brushed off. Then the lignin contents of prim itive w ood sam ple and rotted w ood sam ples were measured. Results showed the lignin degrading ability of 6species of w ood white 2rot fungi is different , it is Pycnoporus sanguineus , P seudotrametes gibbbosa , Polyporellus brumalis , Lenzites tricolor , Funalia gallica and Phellius igniarius in turn. I f considering the degraded extent of cellulose , Polyporellus brumalis is the better w ood white 2rot fungi
收稿日期:2001210215。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070623号) 、黑龙江省自然科学基金资助项目(C00232号) 。
with higher ability of degrading lignin and lower ability of degrading cellulose.
K ey w ords : W ood white 2rot fungi , Lignin , Degrading ability
由于不同的木材腐朽菌生理特性不同, 所分泌的酶及酶的活性各不相同, 因此, 不同的腐朽菌所分解木材的各种成分及相对速度各不相同(Buswell ,1987) 。有些木腐菌只能分解纤维素和木质素二者之一; 有些木腐菌则可同时分解二者; 还有些菌类能以二者之一为主要分解对象, 兼或稍具分解另一物质。所以在自然界中, 木材腐朽的类型是很复杂的。如木质细胞壁中木质素被分解利用时, 仅留下纤维素, 朽材较健康材色浅, 呈白色, 就叫白腐。朽材不易粉碎解体, 且富于弹性, 木材质地变为纤维状或海绵状, 这样的白腐木材有可能用于造纸。
山杨(Populus davidiana ) , 又称中国山杨, 属白杨派, 分布于北纬25°～53°、东经100°～130°范围内, 常形成天然次生林, 与桦木类混生或成纯林, 为采伐迹地和火烧迹地天然更新的先锋树种, 是中国山区造林先锋树种之一。从造纸的特定材性指标上看, 山杨具有较好的造纸纤维形态, 纤维较长, 不易断裂; 综纤维素含量较高(80%) , 木质素含量较低(20%) , 制浆得率高; 材色洁白而易漂白, 材质轻软而易于脱除木质素, 易得高白度浆, 因此是造纸的良好材料。在自然状态下山杨活立木却极易染心材白腐病, 山杨心材白腐, 也叫阔叶树心材白腐, 广泛发生在山杨、白桦、青杨、色木槭、蒙古栎、核桃楸等许多种阔叶树上, 尤其山杨林、青杨林和白桦林最多, 遍布世界各地, 在我国东北、西北、西南和华北各地林区普遍发生。引起山杨心材白腐的木腐菌为火木层孔菌(Phellius igniarius ) 。火木层孔菌在野外状态下危害树干心材, 发病初期心材变褐色, 逐渐褪为白色, 并在其周围产生黑色线纹, 最后朽材变软, 不碎不裂, 形成典型的白色海绵状腐朽。在大风雨天, 树干常从腐朽部折断, 露出雪白松软的朽材。这种自然状态下腐朽后的木材用于造纸的情况还有待深入地研究, 因此作者选择了山杨材和火木层孔菌, 以探讨木材白腐菌对木材与木质素的生物降解机制。
作者曾在以前的研究中测定了东北林区60余种木腐菌对青杨、白桦和红松的木材分解能力, 得出了木腐菌对青杨、白桦和红松的木材分解能力排序表(池玉杰,2001) , 但木腐菌对木质素分解能力的研究在国内还未见报道(T anesaka ,1993) 。木质素是植物木质化组织的重要成分, 其化学结构相当复杂, 而且性状十分稳定, 但是在自然界中还是存在具木质素分解能力的微生物。千万年来, 森林中的枯枝落叶、倒木等未堆积成山即是证明, 只是不同的微生物对木质素的分解程度不同。根据迄今的研究结果, 在所有具分解木质素能力的微生物中, 只有引起木材白色腐朽的真菌被确切地证明了能够彻底地分解木质素, 能把复杂的木质素高分子降解成C O 2和H 2O (K irk ,1984;Paters on ,1985) 。近年来, 微生物在制浆造纸中的作用被重视起来, 提出了生物法制浆造纸的研究课题。木材造纸的一大难题是脱除木材中的木质素, 但会对水资源造成污染。如果利用微生物对木质素的降解作用脱除木材中的木质素, 就从根本上解决了造纸工业的环境污染问题。无疑地, 研究与采用无污染或少污染的制浆与漂白新技术是我国造纸业的紧迫任务, 生物制浆将是造纸工业的发展方向。有希望可以利用的是高效选择性分解木质素的白腐菌, 将木材中的木质素分解后剩下纤维素以用于造纸。
在木材中, 木质素的贮量仅次于纤维素, 但是长期以来对木质素的利用还不够深入, 不少场合如在造纸业中却作为废弃物加以排除, 不但带来严重的环境污染, 也浪费资源。因此, 提高木质素的利用效率、开发木质素的利用途径, 是解决资源、能源、环境问题的一个重要措施。从理论上讲, 控制性地对木质素进行生物降解, 可以由这一复杂的高聚物生产出现在从石油中制取的各种有用的苯酚类物质(Craw fod ,1981;T ai ,1990) , 如香草酸、二甲基硫醚、丁香酸、苯酚等。这种办法如果成功, 这将为当前与未来的化学品生产开辟新的原料来源。为此, 国外有些人做了这种以生物法从木质素中制取有用化学品的探索性研究。利用白腐菌对木质素的分解作用, 是一种很有希望的方法。因此作者选择了火木层孔菌及另外5种木材分解能力较强的阔叶树上的白腐菌:粗毛盖菌(Funalia gallica ) 、三色革裥菌(Lenzites tricolor ) 、冬拟多孔菌(Polyporellus brumalis ) 、偏肿拟栓菌(P sendotrametes gibbosa ) 和血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus ) , 研究了它们对山杨材木质素的分解能力。目的为山杨材生物制浆造纸提供应用基础理论,
同时也可为木质素合理的生物转化为有用的化学品、生物漂白、酶处理、防止机械浆的返黄、废水治理、纤维素酶解糖化的微生物前处理等提供相关的借鉴研究, 以期在生产实践上减轻环境污染并充分利用木质素资源。
1 材料与方法
111 试验材料
11111 6种木材白腐菌培养物的制备 将在东北林区采集到的有生命力的木腐菌子实体, 用组织分离法得到菌种。在无菌条件下, 将在斜面培养基上生长7d 的木腐菌菌种, 切取直径为5mm 的同质等量菌丝块, 分别接入到PDA 平板培养基的中间部应, 每一菌种多个重复, 接种后的培养基置于25℃恒温箱中培养7～15d , 使菌种长满平板或基本长满平板。
11112 采样 在冬季采伐期间进行采样。选择东北林业大学帽儿山实验林场20～30a 生山杨人工林的未腐朽材。本批样品是2000211229采自帽儿山林场新垦事业区7林班20～30a 生小径级山杨。木材样品采回后及时晾干, 以免受杂菌的侵染。
11113 木材样品的制备 根据国家标准———木材天然耐腐性实验室试验方法(G B ΠT1394211293) , 将野外采回的山杨木材, 晾干到一定程度后, 锯成2cm ×2cm ×1cm 小片。
112 试验方法
11211 木片样品受白腐菌腐朽试验 将一定数量的木片样品, 置于105℃烘箱中烘至恒重, 在高压灭菌锅中灭菌(0112MPa 下灭菌30min ) , 试样含水率达到40%～60%, 在无菌条件下将木片放入接种10d 已长满菌丝的平板培养基内, 然后将培养皿放入25℃恒温箱中培养使木片受菌侵染, 并保持一定湿度。对于每一菌种, 山杨木片样品分别被腐朽一定时期(为40d ,60d ,80d 和120d ; 不同的时间所用木片样品分别是40d —120～140块,60d —160～200块,80d —200～260块,120d —240～320块) 后, 取出附带菌丝体的小块, 用毛刷和水冲洗干净, 除去表面菌丝, 然后放入105℃烘箱中烘至恒重, 根据受菌侵染前后木片样品的重量变化计算受菌分解后木片样品重量减少百分率, 并记录受菌侵染后木片的颜色变化(国家标准,G B ΠT 1394. 1293) , 并按11212测定受菌分解后木片的木质素含量变化。根据木片样品重量变化和木质素的含量变化计算木片样品中综纤维素的含量变化。
11212 山杨木片样品木质素含量的测定 通过测定受白腐菌分解前后的木片样品中木质素的含量变化可知木质素被分解的程度, 木质素减少百分率与木片样品重量减少百分率的比率可表明木质素被分解的难易程度。按照国家标准一造纸原料分析用试样的采取(G B ΠT 267711293) 和造纸原料酸不溶木素含量的测定(G B ΠT 267718294) 进行分析侵染前后山杨材木片样品的木质素含量。本项试验测定了6种白腐菌分别分解山杨材木片样品40d 、60d 、80d 和120d 时的木质素含量及未腐朽时山杨木材木质素的含量, 共得到25项木质素含量百分率的测试数据, 最后得到木材样品中酸不溶木质素的含量
X 1=m 1Πm 0×100%
式中:m 1为烘干后的酸不溶木质素的质量(g ) ; m 0为绝干试样质量(g ) 。
2 结果与讨论
山杨木片样品受菌侵染前后木质素的含量变化结果见表1。根据山杨材受菌侵染后重量损失百分率和木质素分解百分率可得出综纤维素分解百分率。
综纤维素分解百分率=×100%腐朽前综纤维素含量
设腐朽前木片试样的绝干重为W 1, 腐朽后木片试样的绝干重为W 2, 那么腐朽前综纤维素含量=W 1-W 1×木质素含量百分率=W 1×(1-19136%) =018064W 1; 腐朽后综纤维素含量=W 2-W 2×腐朽后木质素含量百分率=W 2(1-腐朽后木质素含量百分率) 。
山杨木片样品受菌侵染后的木材分解百分率和综纤维素的含量变化结果见表2。
211 6种白腐菌对山杨木材木质素的分解能力
由于木腐菌的生理特性不同, 所分泌的酶及酶的活性各不相同, 因此, 不同的木腐菌分解木材的各种成分及相对速度就各不相同, 不同的白腐菌对于相同的木质纤维基质也有不同的中间代谢产物和途径。从表1可以看出,6种白腐菌对山杨木质素的分解能力不同。木片受白腐菌分解后的木质素减少百分率可作为评价白腐菌木质素分解能力的指标, 木质素减少百分率愈高, 说明白腐菌对木质素的分解能力愈强; 而木质素减少百分率愈低, 说明白腐菌对木质素的分解能力愈弱。根据木质素的减少百分率可以得出这6种白腐菌对山杨木质素的分解能力依次为血红密孔菌、偏肿拟栓菌、冬拟多孔菌、三色革裥菌、粗毛盖菌和火木层孔菌。
表1 木质素的含量变化结果
T ab. 1 R esults of lignin content ch ange
降解时间Degrading time Πd 木材白腐菌
W ood white 2rot fungi
粗毛盖菌Funalia gallica
三色革裥菌Lenzites tricolor
火木层孔菌Phellius igniarius
冬拟多孔菌Polyporelhus brumalis
偏肿拟栓菌P seudotrametes gibbosa
血红密孔菌Pycnoporus sanguineus 013 2319. 36 019. 36 019. 36 019. 36 019. 36 019. 36 04013 2317. 47 9. 815. 08 22. 1117. 96 7. 2315. 17 21. 6414. 74 23. 8613. 43 30. 636013 2314. 36 25. 8314. 58 24. 6917. 80 8. 0614. 51 25. 0513. 77 28. 8712. 74 34. 198013 2314. 11 27. 1213. 86 28. 4117. 69 8. 6313. 37 30. 9413. 75 28. 9811. 95 38. 2712013 2314. 09 27. 2213. 08 32. 4416. 30 15. 8112. 86 33. 5713. 36 30. 9911. 54 40. 39 13木质素含量Lignin content Π%,23木质素减少百分率Percent weight loss of lignin Π%.
表2 木材分解百分率和综纤维素的含量变化结果
T ab. 2 Percent w eight loss of w ood species and holo cellulose content ch ange
降解时间Degrading time Πd 木材白腐菌
W ood white 2rot fungi
粗毛盖菌Funalia gallica
三色革裥菌Lenzites tricolor
火木层孔菌Phellius igniarius
冬拟多孔菌Polyporelhus brumalis
偏肿拟栓菌P seudotrametes gibbosa
血红密孔菌Pycnoporus sanguineus [***********][1**********]328. 3827. 1516. 5415. 2015. 7030. [**************]2. 9612. 7111. 3011. 0115. 4117. 1610. 918. 089. 766. 3910. 5610. 6117. 9616. 6312. 5514. 1920. 1524. 1612. 8711. 6910. 869. 0214. 6117. 9422. 9820. 0916. 6428. 2434. 0037. 1317. 9715. 6014. 9122. 9029. 4131. 3432. 7832. 2919. 5821. 5221. 5437. 01
13木片样品重量减少百分率Percent weight loss of w ood specimen Π%,23综纤维素减少百分率Percent weight loss of cellulose Π%.212 6种白腐菌对山杨木材综纤维素的分解能力和最佳白腐菌的确定
在分析白腐菌对山杨材木片木质素分解能力的同时, 也要考虑白腐菌对纤维素的分解, 因为我们要寻求的是对木质素的分解能力强、尽可能少分解或不分解纤维素的选择性极高的最适于生物制浆用的白腐菌, 因此也要确定木质素被分解到什么程度时纤维素被分解的程度最低, 从而可保持最大的制浆得率。根据木片受菌分解前后的重量变化和木质素的含量变化可计算出综纤维素的含量变化。从表2可以看出, 冬拟多孔菌在分解同样多木质素时, 综纤维素的分解率最低。因此, 在本项试验的6种白腐菌中冬拟多孔菌就是较多的分解木质素而较少的分解纤维素的较好的木材白腐菌。
213 木片受菌侵染时间的确定
在自然状态下, 相对于其他的降解物来说, 微生物对处于固态环境中的木材和木质素的降解是一个较为缓慢的过程。在实验室内模拟自然状态的木材分解过程, 因此木材受菌侵染试验分别选择了40d 、60d 、80d 和120d 后测定木腐菌对木材和木质素的分解能力, 如果少于40d , 木腐菌对木材和木质素的分解百分率就很低(T anesaka ,1993) , 为了要在应用的角度进一步深入考虑工艺上的可能性, 迅速缩短微生物对木片的分解周期, 就必须要找到加速微生物对木质素分解的方法, 是否可以选择复合菌种的液体
发酵法还有待进一步深入研究。可以考虑木片在受菌类分解过程中, 在发酵罐中加入一些打磨木片的材料, 不断地搅拌, 以打磨木片和分散菌体, 从而加速分解过程。另外制浆原料木片要尽量薄一些, 以易于菌类的分解。能否找到能催化微生物对木质素分解的“催化剂”, 从而迅速加快这种酶解反应, 也是一个可以考虑的方法。从表1可以看出, 多数菌种在40d 时对木质素的分解就己达到一定程度, 而且随着时间的延长木质素被分解的程度变化不十分显著, 因此通过延长时间以获得对木质素较多的分解是不合理的, 也是不经济的。在将来的生产实际操作中, 可根据试验结果, 确定一个最佳的木片受菌侵染时间, 这时已分解足量的木质素同时纤维素被分解的程度最低, 从而在纸浆生产中可保持最大的制浆得率, 而生产周期又不至于很长。
214 受菌侵染后木片变黄的原因分析
所有受菌侵染后的木片都从白色变成了乳黄色、淡黄色, 受火木层孔菌侵染的木片还出现了黑线纹, 而变色部分主要在腐朽木片的表层受白腐菌分解的部分。这种现象产生的原因是木质素在分解过程中产生一些有色物质, 这些有色物质主要来自木质素的氧化产物, 即一些发色基因, 木质素的发色基因主要有3种类型, 即木质素的醌型结构、邻苯二酚的重金属螯合物及与结构单元的共轭结构(陈嘉翔等,1990) ; 另外, 木材中的低分子有机物和单宁等也有着色作用。正是这些具有着色作用物质, 是使受菌侵染的木片变黄的原因, 这也是制浆过程中木浆变黄的原因。若能减少在木片受菌类发酵过程中木质素降解产物的氧化作用, 就可能降低纸浆的颜色。根据这一试验结果, 可以考虑在未来的生物制浆过程中应尽量减少木质素的氧化作用, 因此需要筛选厌氧发酵木片的木材白腐菌。
215 火木层孔菌不是最佳的白腐菌
根据试验结果可以看出, 火木层孔菌不是最佳的白腐菌。在实验室条件下, 火木层孔菌的生长速度缓慢, 它的木材分解能力较弱, 木质素的分解能力也较弱, 而在野外这种木腐菌能广泛分布, 普遍生长在山杨、白桦、青杨、色木槭、蒙古栎、核桃楸等许多种阔叶树上, 引起心材腐朽的主要原因是由于火木层孔菌是具有忍耐特点的活立木心材上的腐朽菌, 它可以在其它微生物较少存在的活立木心材这一具有生存压力的特殊生境中长期生活。在活立木心材中, 最明显的压力因素是缺少易同化的营养基质, 存在着抑制性物质如单宁、树脂和芳香油等, 以及缺少氧气(程东升,1993) 。树木的心材与边材的明显区别之一就是心材中含有大量的沉积物质, 这类废弃物质是树木生命活动过程中产生的, 它们沉积在心材细胞中, 减少了心材的空隙, 并且有显著毒性, 因此一般来说心材比边材更抗腐。此外, 这些沉积物还有使心材更为稳定的趋势。火木层孔菌在培养基上的生长速度非常缓慢, 井缺少同其它微生物的竞争力, 在自然状态下多年生。这些性状都表明它的生存策略就是能够长期忍耐活立木心材这个特殊生境中的压力因素而得以生存与发展。由于具有忍耐或抵抗能力, 所以在不利因素存在的情况下, 火木层孔菌的生存能力明显大于其它非忍耐对策微生物的生存能力, 并对材积的破坏力极大。
3 结论
6种白腐菌对山杨木材木质素的分解能力不同, 根据木质素的减少百分率可以得出其分解能力依次为血红密孔菌、偏肿拟栓菌、冬拟多孔菌、三色革裥菌、粗毛盖菌和火木层孔菌。
如果考虑白腐菌对纤维素的分解, 在本项试验的6种白腐菌中冬拟多孔菌是较多的分解木质素而较少的分解纤维素的较好的木材白腐菌。
在将来的生产实际中, 可确定一个最佳的木片受菌侵染时间, 这时已分解足量的木质素同时纤维素被分解的程度最低, 从而在纸浆生产中可保持最大的制浆得率, 而生产周期又不至于很长。
所有受菌侵染后的木片均从白色变成了乳黄色、淡黄色。木质素在分解过程中, 都能产生一些有色物质, 这些有色物质主要来自木质素的氧化产物, 这些具有着色作用的物质, 是使受菌侵染的木片变黄的原因, 这也是制浆过程中木浆变黄的原因。
参考文献
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120
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(原刊名) 是由中国科学院石家庄农业现代化研究所和中国生《中国生态农业学报》《生态农业研究》
态经济学会主办的大农业学术期刊, 科学出版社出版, 系中国科学引文数据库源刊和全国中文核心期刊。本刊旨在探索与研究生态农业的理论、方法及研究进展等, 推动学科发展, 主要刊登生态学、生态经济学、农、林、牧、副、渔及资源与环境保护等领域创新的研究学术论文、研究技术报告(包括理论与应用研究、农业生态工程技术与实用生物技术、生物多样性保护、湿地保护、城镇绿地生态建设、无公害农产品生产技术、农业环境污染防治技术及农业可持续发展技术体系研究等方面) 、研究简报及综述、生态农业建设和生态示范区典型模式与典型经验等, 适于国内外从事生态学、生态经济学、农、林、牧、副、渔、资源与环境保护等领域科技人员、高等院校有关专业师生、管理工作者和基层从事生态农业建设的广大技术人员等阅读与投稿。
《中国生态农业学报》国内外公开发行, 国内刊号:ISS N1671-3990, 国际刊号:CN13-1315ΠS , 季刊, 国际标准大16开本, 每期定价14160元, 全年58140元, 自2003年由石家庄市报刊发行局改为北京市报刊发行局发行, 敬请广大读者订户届时从北京市报刊邮局发行目录中征订本刊(新邮发代号见《中国生态农业学报》2002年第3期和第4期通知) 。全国各地邮局均可订阅, 漏订者可直接汇款至编辑部补订(若从编辑部补订全年需另加邮资12100元) 。本刊现有1993～1999年各年度《生态农业研究》合订本均为24100元Π套(含邮资) ,2000年度精装合订本34100元Π套(含邮资, 散装刊为24100元Π套) ,2001年《中国生态农业学报》散装刊32100元Π套, 需订购者请直接从邮局汇款至编辑部订阅(务请在汇款单上注明订户详细地址及需订内容) 。地址:(050021) 河北省石家庄市槐中路286号中国科学院《中国生态农业学报》编辑部, 电话:(0311) 5818007,E 2mail :editor@ms. sjziam. ac. cn